Survei Konsumsi Pangan Jajanan Berbasis Ikan Dan Identifikasi Listeria Spp

SURVEI KONSUMSI PANGAN JAJANAN BERBASIS IKAN

DAN IDENTIFIKASI

Listeria

spp.

ELIA YUSWITA

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2016

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Survei Konsumi Pangan Jajanan Berbasis Ikan dan Identifikasi Listeria spp. adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.

Bogor, Juni 2016

Elia Yuswita

RINGKASAN

ELIA YUSWITA. Survei Konsumsi Pangan Jajanan Berbasis Ikan dan Identifikasi

Listeria spp. Dibimbing oleh WINIATI P. RAHAYU dan SITI NURJANAH.

Kontaminasi L. monocytogenes pada pangan jajanan berbasis ikan diduga berasal dari bahan baku yang tercemar, proses pengolahan yang tidak sempurna, atau dari tahap persiapan sebelum pangan dikonsumsi. Keberadaan L. monocytogenes

pada pangan dapat menyebabkan gangguan kesehatan konsumen. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui jumlah konsumsi pangan jajanan berbasis ikan masyarakat di lingkungan sekolah daerah Bogor, mendeteksi dan mengidentifikasi

Listeria spp. pada pangan jajanan berbasis ikan di daerah Bogor dengan metode biokimiawi, mendeteksi L. monocytogenes pada pangan jajanan berbasis ikan di daerah Bogor dengan metode PCR, dan memprediksi peluang listeriosis akibat konsumsi ikan asap yang tercemar L. monocytogenes.

Penelitian ini dilakukan dalam tiga tahap, yaitu survei konsumsi pangan jajanan berbasis ikan, identifikasi Listeria spp. pada pangan jajanan berbasis ikan, dan prediksi peluang listeriosis pada ikan asap. Survei pangan jajanan berbasis ikan dilakukan dengan wawancara terhadap 770 responden di lingkungan sekolah. Identifikasi Listeria spp. dilakukan terhadap 65 sampel pangan jajanan berbasis ikan dengan metode biokimiawi dan metode real-time PCR (rt-PCR). Prediksi peluang listeriosis pada ikan asap dilakukan dengan menggunakan data sekunder.

Pangan jajanan berbasis ikan yang ditemukan di lingkungan sekolah adalah siomay, otak-otak, batagor, satai olahan (bakso ikan, bakso udang, takoyaki, dan nuget ikan), masakan (ikan goreng dan udang goreng), pempek, dan bakso goreng. Responden lebih banyak mengonsumsi siomay dibandingkan pangan jajanan berbasis ikan lainnya yaitu 514/770 responden (66.7 %) dengan rata-rata konsumsi 33.4 g/hari. Berdasarkan pengelompokkan responden menjadi tiga kategori yaitu jenis kelamin (laki-laki dan perempuan), umur (5-13, 14-18, dan 19-50 tahun), dan uang saku ( Rp. 30000 dan ≥ Rp. 31000), juga diketahui bahwa siomay merupakan produk jajanan berbasis ikan yang banyak dikonsumsi oleh responden. Besaran rata-rata konsumsi harian siomay oleh responden laki-laki dan perempuan adalah 37.7 dan 30.9 g/hari. Kemudian, besaran rata-rata konsumsi harian siomay responden berdasarkan umur (5-13, 14-18, dan 19-50 tahun) adalah 32.2, 32.9, dan 41.8 g/hari. Berikutnya dari pengelompokan responden berdasarkan uang saku ( Rp. 30000 dan ≥ Rp. 31000), diketahui besaran konsumsi harian siomay masing-masingnya adalah 33.4 dan 34.0 g/hari. Berdasarkan identifikasi Listeria spp. secara biokimiawi maupun deteksi secara PCR, L. monocytogenes tidak terdeteksi pada 65 sampel pangan jajanan berbasis ikan. L. grayi dan L. innocua terdeteksi dengan prevalensi yang rendah yaitu 6.2 dan 3.1 %. Besaran limit deteksi yang diperoleh dari pengujian

L. monocytogenes dengan rt-PCR yang di spike ke sampel bakso ikan bakar dan otak-otak, masing-masing sebesar 8.3x102 dan 2.9x102 CFU/g. Berdasarkan data literatur sampel ikan asap dengan cemaran ≥102-103 CFU/g dan prevalensi cemaran pada level tersebut sebesar 0.8 %, maka dapat dihitung peluang listeriosis akibat cemaran

tersebut. Besaran peluang sakit adalah 0.0000022, artinya satu porsi dari 454 545 porsi ikan asap yang disajikan memiliki peluang menyebabkan satu kasus

listeriosis.

SUMMARY

ELIA YUSWITA. Survey Consumption of Fish-Based Snack and Identification

Listeria spp. Supervised by WINIATI P. RAHAYU and SITI NURJANAH.

L. monocytogenes contamination in fish-based snack is caused by contaminated raw materials, underprocessed or preparation step before consumption.

L. monocytogenes can cause health problems to consumer. The objectives of this study were to detect the total consumption of fish-based snack in Bogor city school area, detected and identified Listeria spp. in fish-based snack in Bogor with biochemichal method, detected L. monocytogenes in fish-based snack in Bogor with PCR method, and predicted listeriosis probability due to the consumption of smoked fish which is contaminated by L. monocytogenes.

This study was conducted of 3 steps: (1) survey of fish-based snack, (2) identification of Listeria spp. in fish-based snack, and (3) prediction of listeriosis

probability on smoked fish. Survey of fish-based snack was conducted by interviews to 770 respondents. Identification of Listeria spp. was conducted toward 65 samples of fish-based snack were analyzed using biochemical methods and real-time PCR (rt-PCR). Prediction of listeriosis probability on smoked fish was conducted using secondary data.

Fish-based snack which found in school area is siomay, otak-otak, batagor, grilled snack (fish meatballs, shrimp meatballs, takoyaki, and fish nuget), ready-to-eat food (fried fish and shrimp fish), pempek, and fried meatballs. Respondent for siomay

was 66.7 %, which is higher than another fish-based snack and the average of siomay

consumption was 33.4 g/day. According to the group of respondents, it devides into three categories: sex (male and female), age (5-13, 14-18, and 19-50 years), and allowance ( Rp. 30000 and ≥ Rp. 31000), siomay is the most consumed. The average of siomay daily consumption by male and female respondent was 37.7 and 30.9 g/day. Afterwards, the average of siomay daily consumption according age (5-13, 14-18, dan 19-50 years) was 32.2, 32.9, and 41.8 g/day. The average of

siomay daily consumption according allowance ( Rp. 30000 and ≥ Rp. 31000) was 33.4 and 34.0 g/day. Based on identification of Listeria spp. biochemically and detection of PCR L. monocytogenes was not detected in 65 samples of fish-based snack food. L. grayi and L. innocua was detected with low prevalence (6.2 and 3.1 %). The limit detection acquired from analysis of L. monocytogenes with rt-PCR which is spiked in grilled fish meatballs and otak-otak samples was 8.3x102 and 2.9x102 CFU/g, respectively. According to the literature data smoked fish sample with contamination of ≥102-103 CFU/g and prevalence contamination on the level as big as 0.8 % could be used to determine the listeriosis probability due to contamination. The listeriosis probability was 0.0000022, meaning that one serving of 454 545 servings of smoked fish has a probability to cause one case of listeriosis.

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016

Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB

Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

Tesis

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains

pada

Program Studi Ilmu Pangan

SURVEI KONSUMSI PANGAN JAJANAN BERBASIS IKAN

DAN IDENTIFIKASI

Listeria

spp.

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2016

Judul Tesis : Survei Konsumsi Pangan Jajanan Berbasis Ikan dan Identifikasi

Listeria spp. Nama : Elia Yuswita NIM : F251130221

Disetujui oleh Komisi Pembimbing

Prof Dr Winiati P Rahayu Ketua

Dr Siti Nurjanah, STP MSi Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi Ilmu Pangan

Dr Ir Harsi Dewantari Kusumaningrum

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

PRAKATA

Segala puji bagi Allah SWT yang telah memberi pertolongan sehingga dapat terselesaikannya tesis yang berjudul Survei Konsumsi Pangan Jajanan Berbasis Ikan dan Identifikasi Listeria spp. yang merupakan bagian dari penelitian Kajian Risiko Listeria monocytogenes pada Pangan Jajanan Anak Sekolah yang dibiayai oleh Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi melalui Program Hibah Kompetensi.

Penulis menyampaikan penghargaan dan ucapan terima kasih yang tidak terhingga kepada :

1. Ibu Prof. Dr. Winiati P Rahayu dan Ibu Dr. Siti Nurjanah, S.TP, M.Si yang telah memberikan bimbingan, waktu dan perhatian selama penelitian dan penulisan tesis ini.

2. Ibu Prof. Dr. Betty Sri Laksmi Jenie selaku penguji yang telah memberikan saran-saran guna menyempurnakan penulisan tesis ini.

3. Seluruh pengajar di Program Studi Ilmu Pangan Departemen ITP yang telah memberikan bekal ilmu bagi penulis.

4. Program pascasarjana IPB yang telah membantu selama proses studi.

5. Pimpinan SEAFAST Center dan Departemen ITP yang telah menyediakan fasilitas laboratorium.

6. Direktorat Pendidikan Tinggi (DIKTI) yang telah memberikan kesempatan dan dukungan dana selama menempuh studi di program studi Ilmu Pangan, Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.

7. Para teknisi di laboratorium SEAFAST Center dan di laboratorium ITP yang telah memberikan bantuan selama penulis melakukan penelitian.

8. Ibu Retnani Rozak yang telah memberikan bantuan, bimbingan, dan arahan selama penelitian dan penulisan tesis ini.

9. Ibu dan Bapak yang telah memberi doa, semangat dan dukungan selama menyelesaikan studi S2.

10.Rekan-rekan mahasiswa IPN 2013 atas bantuan dan kerjasamanya selama menempuh studi di program studi Ilmu Pangan.

Penulis berharap tesis ini dapat bermanfaat. Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu kritik dan saran yang membangun sangat diharapkan.

Bogor, Juni 2016

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL vi

DAFTAR GAMBAR vi

DAFTAR LAMPIRAN vi

1 PENDAHULUAN 1

Latar Belakang 1

Perumusan Masalah 2

Tujuan Penelitian 2

Hipotesis 3

Manfaat Penelitian 3

2 TINJAUAN PUSTAKA 4

Pangan Jajanan Berbasis Ikan 4

Karakteristik Listeria spp dan Sumber Cemaran 5

Listeriosis 6

Metode Deteksi Mikroba Patogen secara Biokimiawi 8

Metode Deteksi Mikroba Patogen denganPCR 8

Prediksi Peluang Listeriosis dan Kajian Risiko 10

3 METODE 12

Waktu dan Tempat Penelitian 12

Bahan dan Alat 12

Tahapan Penelitian 12

4 HASIL DAN PEMBAHASAN 20

Survei Konsumsi Pangan Jajanan Berbasis Ikan 20

Identifikasi Listeria spp. pada Pangan Jajanan Berbasis Ikan 25

Prediksi Peluang Listeriosis pada Ikan Asap 30

5 SIMPULAN DAN SARAN 33

Simpulan 33

Saran 33

DAFTAR PUSTAKA 34

LAMPIRAN 38

DAFTAR TABEL

1 Perbedaan antar spesies Listeria spp. 5 2 Kondisi pertumbuhan untuk L. monocytogenes 6 3 Jenis dan jumlah sampel pangan jajanan berbasis ikan 12

4 Konsep penelitian 13

5 Jumlah responden 14

6 Komposisi bahan untuk rt-PCR dengan primer DG69/DG74 18 7 Kondisi running rt-PCR dengan primer DG69/DG74 18 8 Rata-rata konsumsi harian pangan jajanan berbasis ikan di kota Bogor 20 9a Rata-rata konsumsi harian pangan jajanan berbasis ikan di kota Bogor

berdasarkan jenis kelamin (laki-laki) 21 9b Rata-rata konsumsi harian pangan jajanan berbasis ikan di kota

Bogor berdasarkan jenis kelamin (perempuan) 21 10a Rata-rata konsumsi harian pangan jajanan berbasis ikan di kota Bogor

berdasarkan umur (5-13 tahun) 22

10b Rata-rata konsumsi harian pangan jajanan berbasis ikan di kota

Bogor berdasarkan umur (14-18 tahun) 22 10c Rata-rata konsumsi harian pangan jajanan berbasis ikan di kota

Bogor berdasarkan umur (19-50 tahun) 23 11a Rata-rata konsumsi harian pangan jajanan berbasis ikan di kota Bogor

berdasarkan uang saku ( Rp. 30000) 23 11b Rata-rata konsumsi harian pangan jajanan berbasis ikan di kota

Bogor berdasarkan uang saku (≥ Rp. 31000) 24 12 Konfirmasi uji morfologi dan biokimia Listeria spp. sampel pangan

jajanan berbasis ikan 25

13 Prevalensi Listeria spp. pada pangan jajanan berbasis ikan secara

biokimiawi 26

14 Hasil analisis limit deteksi DNA L. monocytogenes pada sampel bakso ikan bakar dan otak-otak berdasarkan nilai CT menggunakan rt-PCR 27 15 Hasil analisis cemaran L. monocytogenes pada sampel pangan jajanan

berbasis ikan menggunakan rt-PCR 29

16 Cemaran L. monocytogenes pada ikan asap 31 17 Perkiraan peluang listeriosis (Pi) per porsi sajian ikan asap yang

tercemar 31

18 Perkiraan peluang listeriosis (PI) per porsi sajian ikan asap 32

DAFTAR GAMBAR

1 Tahap proses invasi dan penyebaran intraseluler

L. monocytogenes (Hamon et al. 2006) 7

2 Grafik sigmoidal proses amplifikasi dengan real-time PCR (rt-PCR)

(Edwards et al. 2004) 9

3 Skema kegiatan penelitan 12

4 Kurva standar hubungan nilai CT dan log konsentrasi

L. monocytogenes pada : A. Bakso ikan bakar, dan B. Otak-otak 28

5 Hasil amplifikasi sampel pada rt-PCR (a) sampel 1-6 (deteksi secara kuantitatif terhadap sampel tanpa perlakuan enrichment), (b) sampel 7-30 (deteksi secara kualitatif terhadap sampel dengan perlakuan enrichment) (c) sampel 31-65 (deteksi secara kualitatif terhadap sampel dengan perlakuan enrichment), A= kontrol positif L. monocytogenes

1

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Listeria spp. merupakan salah satu bakteri yang tersebar luas di alam. Keberadaannya yang tersebar luas di alam patut dicermati mengingat kemampuannya untuk tumbuh pada berbagai kondisi ekstrim, dan banyak mengontaminasi berbagai bahan pangan. Beberapa spesies dari genus Listeria yang tersebar di alam adalah L. monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri,

L. ivanovii, dan L. grayi. Diantara spesies ini, yang bersifat patogenik terhadap manusia adalah L. monocytogenes (Janzten et al. 2006). Bakteri ini ditemukan pada produk pangan seperti susu dan produk olahan susu, daging dan produk olahan daging, sayuran segar, ikan dan produk olahan ikan (Rivoal et al. 2010). Pangan jajanan berbasis ikan dapat tercemar Listeria dari bahan dasar yang digunakan seperti ikan. Kontaminasi juga dapat terjadi dari proses pengolahan yang tidak sempurna, atau dari tahap persiapan sebelum pangan dikonsumsi.

Berdasarkan observasi terhadap 100 jenis produk pangan jajanan berbasis ikan dari 63 pedagang yang terdapat pada 50 sekolah di kota Bogor, diketahui bahwa sebanyak 26 % pedagang belum menerapkan good processing practices.

Beberapa sumber masalah yang ditemukan yaitu, tidak tersedianya fasilitas air mengalir untuk mencuci tangan ataupun peralatan di lokasi berjualan (100 %), pedagang tidak menggunakan celemek untuk menjaga kebersihan pada saat berjualan (92 %), kondisi tempat berjualan yang kotor (65 %), dan tangan pedagang yang tidak bersih (73 %), (Rahayu et al. 2015a). Hal ini berpotensi untuk terjadinya kontaminasi Listeria pada produk pangan jajanan berbasis ikan yang dijual di lingkungan sekolah kota Bogor.

Kontaminasi Listeria yang bersifat patogen ataupun tidak, dapat menyebabkan penurunan mutu mikrobiologis pangan. Adanya bakteri patogen (L. monocytogenes) pada pangan dapat menyebakan gangguan kesehatan konsumen atau sakit yang disebut dengan listeriosis. Gejala listeriosis umumnya adalah demam, dan nyeri otot disertai mual atau diare. Apabila infeksi menyebar ke sistem saraf pusat, gejala dapat mencakup sakit kepala, kaku pada leher, bingung, kehilangan keseimbangan, dan terkadang mengalami kejang. Gejala listeriosis dapat muncul 3-70 hari pasca infeksi bakteri, rata-rata biasanya sekitar 21 hari (Bhunia 2008).

Studi tentang Listeria pada produk pangan jajanan berbasis ikan masih belum banyak dilakukan, maka dari itu perlu dilakukan penelitian untuk menguji keberadaan

Listeria dalam rangka tindakan pencegahan wabah listeriosis pada pangan jajanan berbasis ikan. Keberadaan bakteri Listeria dapat diidentifikasi dengan melakukan analisis secara biokimiawi maupun secara molekuler. Analisis secara biokimiawi dilakukan untuk mengidentifikasi dan mendeterminasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi dari media tumbuh spesifik Listeria melalui sifat-sifat fisiologinya. Identifikasi dilanjutkan hingga ke tahap konfirmasi melalui uji-uji biokemik seperti uji katalase, motilitas, hemolitik, dan fermentasi karbohidrat. Analisis secara molekuler dilakukan dengan menggunakan real-time PCR (rt-PCR) seperti yang telah dilakukan oleh Mutsyahidan et al. (2015), karena lebih cepat dan spesifik untuk mendeteksi L. monocytogenes melalui amplifikasi gen hly A (gen penentu virulensi yang menghasilkan listeriolysin O).

2

Perumusan Masalah

Perumusan masalah didasarkan pada asumsi adanya cemaran Listeria spp., khususnya spesies L. monocytogenes pada pangan jajanan berbasis ikan. Tocmo et al. (2014) mengatakan bahwa ikan atau produk olahannya dapat terkontaminasi oleh polusi limbah baik dari lingkungan hidup ikan tersebut atau pada saat proses pengolahan. Ikan merupakan salah satu bahan pangan yang dapat dengan mudah terkontaminasi bakteri. Cemaran Listeria spp. dan L. monocytogenes pada ikan adalah 22.1 dan 16.3 % (Gudmundsdottir et al. 2005). Keberadaan Listeria spp.

dapat menyebabkan penurunan mutu mikrobiologis pangan, khusus

L. monocytogenes dapat menyebabkan keracunan pangan. Beberapa pangan olahan berbasis ikan yang umumnya ditemukan di lingkungan sekolah adalah siomay, otak-otak, bakso udang, bakso ikan, takoyaki, pempek, dan bakso goreng. Cemaran dapat bersumber dari ikan yang digunakan ataupun selama dan pasca proses pengolahan. Keberadaan L. monocytogenes pada produk pangan dapat menyebabkan gangguan kesehatan konsumen. Sakit yang disebabkan oleh bakteri ini disebut dengan listeriosis.

Kasus listeriosis jarang terjadi tetapi memiliki tingkat kefatalan yang tinggi (20-30 %). Dosis infeksi L. monocytogenes untuk dapat menyebabkan listeriosis adalah 102 CFU/g (Bhunia 2008), untuk memperkirakan peluang terjadinya listeriosis pada produk pangan perlu dilakukan estimasi risiko dengan cara memprediksi probabilitas peluang listeriosis dengan melakukan kajian risiko. Kajian risiko dapat dilakukan berlandaskan data-data ilmiah, seperti data tingkat cemaran L. monocytogenes, data konsumsi pangan tercemar, dan data prevalensi

L. monocytogenes pada pangan tercemar. Berdasarkan studi literatur, data yang cukup tersedia adalah data cemaran L. monocytogenes pada produk ikan asap. Data ini dapat digunakan dalam perhitungan untuk memprediksi peluang listeriosis. Perhitungan ini dapat dijadikan sebagai contoh dalam melakukan prediksi peluang listeriosis pada produk pangan lain yang tercemar L. monocytogenes

Tujuan Penelitian Tujuan dari penelitian ini adalah:

1. Mengetahui jumlah konsumsi pangan jajanan berbasis ikan masyarakat di lingkungan sekolah daerah Bogor.

2. Mendeteksi dan mengidentifikasi Listeria spp. pada pangan jajanan berbasis ikan di daerah Bogor dengan metode biokimiawi.

3. Mendeteksi L. monocytogenes pada pangan jajanan berbasis ikan di daerah Bogor dengan metode PCR.

4. Memprediksi peluang listeriosis akibat konsumsi ikan asap yang tercemar

3 Hipotesis

Hipotesis dari penelitian ini adalah :

1. Pangan jajanan berbasis ikan dapat terkontaminasi Listeria spp. termasuk

L. monocytogenes.

2. Besarnya peluang listeriosis akibat bakteri L. monocytogenes pada pangan bervariasi bergantung dari banyaknya jumlah dan prevalensi bakteri, dan besaran konsumsi pangan.

Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai jumlah konsumsi pangan jajanan berbasis ikan yang dapat digunakan sebagai dasar dalam penentuan sampel, dan juga dapat digunakan untuk perhitungan pada kajian paparan. Data identitas dan prevalensi Listeria spp. dapat digunakan sebagai dasar ilmiah bagi pengembangan program keamanan pangan. Kemudian perhitungan peluang listeriosis berguna sebagai model percontohan untuk memprediksi pemaparan dan risiko listeriosis akibat mengonsumsi pangan yang tercemar

4

2

TINJAUAN PUSTAKA

Pangan Jajanan Berbasis Ikan

Pangan jajanan berbasis ikan merupakan pangan jajanan berbahan dasar ikan yang dijual oleh pedagang kaki lima di jalanan dan di tempat-tempat keramaian umum lainnya seperti di lingkungan sekolah, dan dapat dikonsumsi langsung ditempat pembelian. Pangan jajanan berbasis ikan yang umum ditemukan di lingkungan sekolah adalah siomay, otak-otak, bakso ikan, bakso udang, takoyaki, pempek, dan bakso goreng. Masing-masing pangan terbuat dari bahan dan cara pengolahan yang berbeda-beda. Siomay dibuat dari bahan-bahan seperti ikan segar yang telah digiling halus, tepung terigu, tepung tapioka, bawang putih, air, dan garam. Siomay dibuat dengan cara mencampur semua bahan, diaduk hingga rata, dan dicetak lalu dikukus sebelum disajikan.

Otak-otak dibuat dari bahan-bahan seperti ikan segar yang telah digiling halus, santan kelapa, telur, tepung tapioka, bawang merah halus, bawang putih halus, merica bubuk, dan garam. Otak-otak dibuat dengan cara mencampur semua bahan, diaduk hingga rata, dan dicetak memanjang. Kemudian adonan dikukus sebelum disajikan.

Bahan utama yang digunakan dalam membuat pangan jajanan berbasis ikan lainnya seperti bakso ikan adalah ikan segar yang telah digiling halus, sedangkan untuk bakso udang menggunakan udang segar yang telah dihaluskan. Bahan-bahan lain yang digunakan adalah tepung tepung tapioka, bawang putih, garam, dan air es. Semua bahan dicampur dan diaduk hingga rata, kemudian dibuat membentuk bulatan-bulatan kecil. Selanjutnya direbus hingga mengapung, diangkat, lalu ditiriskan. Bakso ikan dan bakso udang disajikan dengan cara dibakar terlebih dahulu.

Takoyaki dibuat dari bahan-bahan seperti telur ayam, tepung terigu, gurita sebagai bahan pengisi, kaldu cair, baking powder, dan garam. Takoyaki dibuat dengan cara mengocok telur dan ditambahkan kaldu cair hingga rata. Tepung terigu, baking powder, dan garam diaduk hingga rata, ditambahkan kedalam campuran kaldu dan telur, kemudian adonan diaduk hingga kental dan tercampur rata. Selanjutnya cetakan takoyaki dipanaskan, adonan dituang kedalam cetakan dan ditambah potongan gurita. Adonan dimasak hingga mengembang dan dibalik agar bentuknya tetap bulat. Takoyaki dimasak hingga kedua sisi mengembang (umumnya ½ matang) ± 3 menit.

Pempek dibuat dari bahan-bahan seperti tepung sagu, ikan segar yang telah digiling halus (umumnya tenggiri), bawang putih halus, garam, dan air es. Pempek dibuat dengan cara mencampur ikan giling dengan air es, garam, dan bawang putih. Kemudian ditambahkan tepung sagu dan diaduk hingga tercampur rata. Selanjutnya adonan dicetak, dan direbus hingga adonan pempek mengapung, diangkat, lalu ditiriskan. Pempek disajikan dengan cara digoreng terlebih dahulu.

Bakso goreng dibuat dari bahan-bahan seperti ikan segar yang telah digiling halus, telur ayam, tepung sagu, garam, dan merica bubuk. Bakso goreng dibuat dengan cara mencampur ikan, telur, garam, merica, dan tepung hingga rata. Kemudian adonan dibuat bulat dan digoreng sebelum disajikan.

5 Karakteristik Listeria sppdan Sumber Cemaran

Listeria spp. berbentuk batang dengan ujung yang membulat. Sel Listeria

ditemukan dalam bentuk tunggal, rantai pendek atau membentuk huruf V dan Y.

Listeria spp. berukuran kecil dengan diameter 0.5 m dan panjang 1-2 m. Bakteri

ini bersifat Gram positif, katalase positif, berbentuk batang pendek, motil, dan tidak membentuk spora (Garrido et al. 2010). Listeria spp. mampu tumbuh pada berbagai kondisi ekstrim, seperti pada media dengan konsentrasi garam tinggi (10 %) (Campos et al. 2011), pH dengan kisaran 4.3 – 9.4 (Nadal et al. 2007) dan mampu hidup dalam waktu yang lama pada suhu 4 C (Kim dan Cho 2010).

Listeria spp. dapat ditemukan di lingkungan seperti tanah, air, tanaman, hewan liar dan domestik, dan makanan hewan termasuk silase. Produk pangan seperti daging, sayur, ikan, dan susu yang terkontaminasi berpotensi sebagai sumber penyebaran dari Listeria spp.

Genus Listeria terdiri dari enam spesies yaitu L. monocytogenes, L. innocua,

L. seeligeri, L. welshimeri, L. ivanovii, dan L. grayi. Perbedaan antar spesies

Listeria spp. dapat dilihat pada Tabel 1. Diantara spesies ini, yang bersifat patogenik terhadap manusia adalah L. monocytogenes (Janzten et al. 2006).

Kondisi pertumbuhan untuk L. monocytogenes dapat dilihat pada Tabel 2.

L. monocytogenes dapat menyebabkan penyakit listeriosis. Proses pengolahan yang minimalis (produk tidak dipanaskan kembali pada saat akan dikonsumsi) dapat berpotensi menjadi penyebab listeriosis (Bhunia 2008).

Tabel 1 Perbedaan antar spesies Listeria spp.

Spesies β-Hemolysis Manitol Rhamnosa Xylosa Virulen

L. monocytogenes + - +a - +

L. ivanovii + - - + +

L. innocua - - Vc - -

L. welshimeri - - Vc + -

L. seeligeri + - - + -

L. grayi - + Vc - -

a

Strain L. monocytogenes, yang terkait dengan listeriosis hewan bersifat rhamnosa negatif b

Strain fermentasi ribosa diklasifikasikan sebagai L. ivanovii subsp. Ivanovii dan non fermentasi ribosa sebagai L. ivanovii subsp. Londiniensis

c

V, variasi, lebih dari 10 % strain mempunyai sifat ini d

Termasuk dua subspesies: L. grayi subsp. Murrayi mereduksi nitrat dan L.grayi subsp. Grayi tidak mereduksi nitrat

Sumber : FDA (2011)

Listeria spp. memiliki ketahanan terhadap garam hingga 20 %, dan tumbuh pada suhu 1-45 C, tumbuh optimum pada suhu 30-37 C dan mampu tumbuh normal pada suhu 4 C. Spesies Listeria spp. seperti L. innocua dan L. grayi

memiliki suhu minimum pertumbuhan 1.7 dan 3.0 C, sedangkan L. monocytogenes

mampu tumbuh pada suhu minimum -1.5 C (Ryser dan Marth 2007). Spesies

Listeria spp. seperti L. innocua memiliki ketahanan panas yang lebih tinggi dibandingkan L. monocytogenes. Hal ini dilaporkan oleh O’Bryan et al. (2006)

6

yang mengatakan bahwa proses pemanasan pada suhu 60 C selama 25.13 menit dapat membunuh 90 % populasi L. innocua, sedangkan waktu untuk membunuh 90 % populasi L. monocytogenes pada suhu 60 C lebih cepat yaitu 16.70 menit. Sorqvist (2003) juga melaporkan bahwa L. innocua memiliki ketahanan panas yang lebih tinggi dibandingkan L. monocytogenes, diketahui dari proses pemanasan pada pada suhu 65 C, dibutuhkan waktu untuk membunuh 90 % populasi L. innocua

yang lebih lama (16 menit) dibandingkan waktu untuk membunuh 90 % populasi

L. monocytogenes (12 menit).

Tabel 2 Kondisi pertumbuhan untuk L. monocytogenes

Parameter Minimum Optimum Maximum Mampu bertahan (tetapi tidak tumbuh)

Suhu (°C) -0.4 37 45.0 -18

pH 4.4 7.0 9.4 3.3 - 4.2

Ketahanan terhadap garam (%)

 0.5 - 12-16 ≥ 20

Ketersediaan oksigen (%)

- 5.0 - -

Aktivitas air (aw) 0.90 0.92 0.97 0.90 Sumber : FSAI (2005) dan Beverly (2004)

Listeriosis

Listeriosis merupakan penyakit yang disebabkan karena infeksi bakteri

L. monocytogenes. Sumber infeksi utamanya adalah melalui makanan yang terkontaminasi. Kasus listeriosis jarang terjadi tetapi memiliki tingkat kefatalan yang tinggi, yaitu berkisar 20-30 %. L. monocytogenes dapat menginfeksi semua populasi, tetapi menyebabkan penyakit yang lebih parah bagi kelompok manusia yang berisiko tinggi (kelompok individu yang memiliki sistem kekebalan rendah) seperti orangtua (berusia 60 tahun atau lebih), wanita hamil, bayi, penderita

cardiovascular disease, penderita diabetes, dan terapi kartikosteroid (Nadal et al.

2007; Esteban et al. 2009).

Makanan yang berpotensial sekali sebagai sumber listeriosis adalah makanan siap santap seperti produk susu yang tidak dipasteurisasi dan produk daging yang disimpan pada waktu lama pada suhu 4 oC. Hal ini berkaitan dengan yang dilaporkan oleh Nadal et al (2007), bahwasanya L. monocytogenes mampu bertahan hidup pada perlakuan pasteurisasi dengan suhu 72 oC selama 15 detik.

Serotipe dari L. monocytogenes terdapat sebanyak 13 jenis yaitu ½a, ½b, ½c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e, dan 7. Serotipe ½a, ½b, ½c, dan 4b merupakan serotipe yang umum menyebabkan kasus listeriosis pada manusia (Ragon et al.

2008). L. monocytogenes merupakan patogen fakultatif intraseluler yang mampu bertahan dalam makrofag dan menyerang berbagai sel nonphagocytic seperti sel-sel epitel, hepatosit dan sel endotel (Cossart et al. 2003). Makanan yang terkontaminasi

L. monocytogenes masuk ke saluran pencernaan, kemudian bakteri ini menyerang

mukosa saluran pencernaan dan berlekatan dengan sel usus dibantu oleh D-galaktosa yang ada pada permukaan sel (Gambar 1a). Bakteri kemudian

7 menginvasi makrofag (sel parenkim) dan terperangkap dalam vakuola yang disebut fagosom (Gambar 1b). Selanjutnya bakteri tersebut menghasilkan toksin listeriolysin O (LLO), dua phospholipases C yaitu phosphatidylinositol- specific phospholipases C (PI-PLC) dan phosphatidylcholine-specific phospholipase C (PC-PLC) mempunyai kemampuan sitolitik untuk merusak fagosom agar dapat masuk ke dalam sitoplasma (Gambar 1c). Ketiga toksin tersebut juga mencegah pencernaan bakteri oleh enzim hidrolitik yang dihasilkan oleh lisosom. Bakteri berkembang biak dengan cepat di dalam sitoplasma dan membentuk F-aktin (Gambar 1d), dan akan menginvasi sel lain dengan bantuan F-aktin yang mengakibatkan kerusakan sel dan septikemia (Gambar 1e). Setelah berhasil menginvasi sel lain, bakteri berada dalam vakuola dengan membran ganda dan melanjutkan siklus hidup dengan terus menginvasi sel lain (Gambar 1f) (Lovett dan Twedt 2004).

Lima hari hingga tiga minggu setelah tertelan, bakteri ini menyebar ke seluruh tubuh dan mengakibatkan kerusakan sistem syaraf, jantung, mata, organ lain dan fetus. Infeksi L. monocytogenes pada sistem syaraf menimbulkan meningitis, ensefalitis dan abses dengan tingkat kematian 70 %. Infeksi pada wanita hamil dapat mengakibatkan aborsi dan kematian bayi setelah lahir dengan rata-rata tingkat kematian sebesar 80 %. Data epidemiologi menunjukkan bahwa invasive listeriosis dapat terjadi sebagai kasus sporadis dan epidemi. Kematian jarang terjadi pada kelompok usia dewasa dengan kondisi baik, namun angka kematian 50 % dapat terjadi pada kelompok usia dewasa dengan kekebalan rendah. Kemampuan L. monocytogenes untuk menimbulkan septikemia tergantung beberapa faktor seperti jumlah bakteri yang tertelan, status kekebalan tubuh induk semang dan keganasan galur bakteri yang menginfeksi (Lovett dan Twedt 2004).

Gambar 1 Tahap proses invasi dan penyebaran intraseluler L. monocytogenes (Hamon

et al. 2006)

Sindrom klinis yang ditimbulkan oleh strain bakteri L. monocytogenes

umumnya bertanggung jawab atas dua tipe infeksi pada manusia, yaitu bersifat invasif dan non-invasif. Listeriosis non-invasif atau disebut juga listerial gastroenteritis

(listeriosis bentuk saluran pencernaan) menunjukkan gejala penyakit yang ringan seperti mual, muntah, kram perut, dan diare yang terlihat setelah menelan bakteri selama lebih dari 12 jam. Listeriosis invasif diakui sebagai foodborne disease yang serius karena tingkat keparahan gejala dan tingkat kematian yang tinggi (20-30 %) (Garrido et al. 2008). Masa inkubasi penyakit invasif pada umumnya jauh lebih lama dari listeriosis bentuk saluran pencernaan yaitu antara 20-30 hari (Garrido et al. 2010).

8

Metode Deteksi Mikroba Patogen secara Biokimiawi

Metode ini memiliki kelemahan yaitu memerlukan waktu yang lama (lebih dari 1 minggu), beberapa media selektif yang mahal, dan membutuhkan peralatan gelas yang banyak (Liu 2008). Beberapa tahapan yang umumnya harus dilalui adalah pemupukan pada media pengayaan misalnya LEB dan selanjutnya dilakukan isolasi pada media agar selektif Listeria spp. seperti Oxford agar, PALCAM, Modified Oxford Agar, dan Cromocult ® Listeria selective agar acc to Ottaviani Agosti (ALOA). Selanjutnya konfirmasi dengan melakukan identifikasi secara fisik maupun biokemik melalui uji hemolitik, motilitas, katalase, pewarnaan Gram dan fermentasi karbohidrat (FDA 2011).

Media pengayaan (enrichment) berfungsi untuk mendukung pertumbuhan bakteri sampai ke tingkat yang dapat dideteksi (Donnelly 2002). Listeria spp. mungkin ada pada pangan dengan tingkat yang sangat rendah sehingga media pengayaan harus dapat mengamplifikasi populasi awal bakteri yang rendah sampai pada batas yang dapat dideteksi. Listeria spp. mungkin juga ada pada pangan dalam keadaan kerusakan subletal sebagai akibat dari proses pemanasan sehingga media pengayaan biasanya digunakan untuk pemulihan Listeria spp. yang mengalami kerusakan sublethal.

Media LEB merupakan media pertumbuhan yang baik untuk L. monocytogenes

karena mengandung tryptone soya broth, yeast extract, potassium di-hydrogen orthophosphate dan disodium hydrogen orthophosphate dengan pH 7.3 ± 0.2. Penghambatan pertumbuhan mikroba selain Listeria spp. juga disikapi dengan penambahan zat antimikroba (agen selektif) pada LEB seperti acriflavine hydrochloride yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif lainnya,

nalidixic acid yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram negatif dan

cycloheximide yang dapat menghambat pertumbuhan cendawan (fungi).

Pertumbuhan Listeria spp. pada media tumbuh agar selektif seperti Oxford agar, PALCAM, dan Modified Oxford Agar berupa bentuk koloni yang kecil, bulat, halus, dan adanya zona hitam disekeliling koloni bakteri karena terdapat degradasi aeskulin. Pada media tumbuh lain seperti Cromocult ® Listeria selective agar acc to Ottaviani Agosti (ALOA), koloni yang tumbuh kecil, bulat, halus dan bewarna hijau-biru. Hal ini terjadi karena media tumbuh ALOA mengandung substrat chromogenic X-glucoside (5-bromo-4chloro-3-indolyl-β-D-glucopyrano) yang berfungsi untuk mendeteksi beta-glucosidase yang terdapat pada Listeria spp.

Metode Deteksi Mikroba Patogen dengan PCR

Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 (Yuwono 2006). Teknik ini dapat menghasilkan DNA dalam jumlah besar dan waktu relatif singkat, sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekuler, karena relatif mudah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil.

Real-time PCR (rt-PCR) adalah bagian dari perkembangan teknologi PCR konvensional dimana penghitungan jumlah DNA dapat diketahui selama proses berlangsung. Data dan informasi fragmen DNA hasil PCR dapat diperoleh langsung berdasarkan kurva hasil amplifikasi DNA. Kurva amplifikasi pada reaksi real-time

9

Gambar 2 Grafik sigmoidal proses amplifikasi dengan real-time PCR (rt-PCR) (Edwards et al. 2004)

Amplifikasi ditetapkan berdasarkan intensitas fluoresens, semakin banyak produk amplifikasi yang dihasilkan, semakin besar akumulasi fluoresens yang terbaca. Peningkatan fluoresens tersebut ditandai dengan terbentuknya grafik sigmoidal, seperti yang tergambar pada Gambar 2 (garis hijau). Grafik sigmoid akan berpotongan dengan

base line threshold yang telah ditentukan secara otomatis oleh program. Titik perpotongan antara grafik sigmoid dan base line threshold jika direfleksikan terhadap sumbu x (Cycle) adalah threshold cycle (CT) bagi sampel yang diamplifikasi. Garis ungu pada Gambar 2 akan terbentuk jika tidak terjadi amplifikasi pada thermal cycler. Nilai CT adalah besarnya nilai siklus yang diperoleh dari perpotongan base line

threshold dengan DNA yang teramplifikasi, dimana akumulasi produk terbaca pertama kali pada fase eksponensial. Nilai CT digunakan dalam kurva standar sebagai fungsi terhadap log konsentrasi bakteri. Nilai CT berbanding terbalik dengan jumlah kopi dari target. Semakin tinggi jumlah awal kopi target asam nukleat, semakin cepat peningkatan fluoresens sehingga semakin rendah nilai CT. Korelasi linear antara produk PCR dan intensitas fluoresens ini dapat digunakan untuk menentukan jumlah DNA cetakan pada awal reaksi (Bustin 2005).

Keunggulan rt-PCR adalah pendeteksian diukur tepat pada saat target amplifikasi terdeteksi pertama kali di setiap siklus (fase eksponensial), bukan di fase akhir amplifikasi (fase pluto) seperti yang terjadi pada PCR standar. Analisis dapat dilakukan tanpa membuka tabung sehingga mengurangi risiko kontaminasi amplikon PCR atau molekul target lainnya. Aplikasi teknologi rt-PCR mengurangi waktu penanganan atau pengujian dan meningkatkan keakuratan kuantifikasi metode PCR, dengan demikian penggunaan teknik rt-PCR lebih efisien dan efeketif dibandingkan PCR standar (Edwards et al. 2004).

Tahap penting dari metode PCR adalah tahap ekstraksi DNA. Hal ini disebabkan pada matriks sampel pangan, khususnya yang berbasis daging, mengandung beberapa komponen seperti produk reaksi mailard, glikogen, lemak, kolagen, dan besi yang bisa saja ikut terpurifikasi bersama DNA target, sehingga keberadaan komponen-komponen tersebut memungkinkan terjadinya penghambatan amplifikasi asam nukleat dengan PCR (Camma et al. 2011). Oleh karena itu, tahap ekstraksi penting dilakukan untuk memisahkan DNA dari komponen-komponen sel lainnya yang nantinya sangat mempengaruhi kemurnian akhir dari DNA yang diisolasi.

Prinsip dasar isolasi DNA adalah serangkaian proses untuk memisahkan DNA dari komponen-komponen sel lainnya. Hasil ekstraksi merupakan tahapan penting untuk langkah berikutnya. Oleh sebab itu, tahapan ini harus dilakukan dengan baik dan bebas kontaminasi. Terdapat enam tahap dalam mengisolasi DNA, yaitu (1) preparasi sampel, (2) lisis sel yang umumnya menggunakan buffer yang mengandung Tris.HCl pH 8.0; EDTA pH 8.0; CTAB, proteinase K, dan SDS

10

(sodium dodecylsulphate), (3) proteksi dan stabilisasi DNA dengan menggunakan buffer TE yang mengandung Tris.HCl dan EDTA pH 8.0 dan juga ditambahkan NaCl, (4) pemisahan DNA dari debris sel dilakukan dengan cara sentrifugasi dan juga ditambahkan dengan fenol, kloroform, dan isoamil alkohol dengan perbandingan tertentu atau dengan dididihkan pada air suhu 100 oC, (5) presipitasi DNA dengan menambahkan etanol 96 % atau isopropanol, dan (6) pemekatan DNA dengan pencucian menggunakan etanol 70 % dan ditambahkan dengan buffer TE (Tris.HCl dan EDTA). Berdasarkan prinsip tersebut, banyak metode untuk mengekstraksi DNA dari sel mikroba, seperti metode fenol:kloroform, metode pendidihan, dan metode kit.

Tahapan isolasi DNA dengan metode fenol:kloroform pada dasarnya bertujuan untuk memisahkan DNA dari molekul-molekul lain seperti protein, lipid, dan polisakarida. Metode fenol:kloroform digunakan untuk mengekstraksi DNA dari sel mikroba dengan menggunakan fenol:kloroform yang berfungsi untuk mendenaturasi protein sel mikroba. Fenol:kloroform merupakan pelarut organik yang tidak dapat mendenaturasi DNA dan RNA, karena molekul ini tidak dapat larut dalam pelarut organik seperti fenol:kloroform. Diharapkan nantinya akan diperoleh supernatant berisi DNA yang bebas dari kontaminan. Dalam tahapan ekstraksi DNA menggunakan fenol:kloroform sangat penting dilakukan presipitasi DNA dengan menggunakan etanol. Hal ini bertujuan untuk menghilangkan fenol:kloroform supaya kerja enzim-enzim restriksi atau enzim lain yang digunakan dalam analisis molekuler tidak terhambat (Sambrook and Russel 2001). Teknik ekstraksi fenol:kloroform menghasilkan kualitas yang lebih baik dibandingkan dengan metode pemanasan (Fricker et al. 2007).

Prediksi Peluang Listeriosis dan Kajian Risiko

Prediksi adalah suatu kegiatan untuk memprediksi atau memperkirakan suatu kejadian ataupun peristiwa berdasarkan data-data ilmiah. Peluang adalah harapan terjadinya suatu kejadian yang dikuantitatifkan. Prediksi peluang listeriosis merupakan perkiraan terhadap probabilitas peluang terjadinya listeriosis akibat konsumsi pangan yang tercemar bakteri L. monocytogenes. Estimasi probabilitas peluang listeriosis dapat ditentukan jika data-data ilmiah seperti data tingkat cemaran mikroba (CFU/g), data prevalensi cemaran (%), dan data konsumsi pangan yang tercemar (g) cukup tersedia. Dalam melakukan estimasi probabilitas peluang listeriosis dibutuhkan suatu kajian risiko, dalam hal ini adalah kajian risiko mikrobiologis. Kajian risiko mikrobiologis merupakan suatu proses penentuan tingkat risiko yang berlandaskan data-data ilmiah, dimulai dengan penetapan tujuan dilanjutkan dengan identifikasi bahaya, kajian paparan, karakterisasi bahaya dan karakterisasi risiko.

Identifikasi bahaya merupakan salah satu langkah dalam rangkaian proses yang sistematis untuk mengidentifikasi probabilitas bahaya mikrobiologis yang timbul dari konsumsi pangan yang mungkin terkontaminasi oleh mikroba patogen. Kajian paparan berupa evaluasi kemungkinan terjadinya pemaparan dan tingkat paparan akibat konsumsi pangan yang tercemar mikroba patogen. Karakterisasi bahaya merupakan evaluasi pengaruh bahaya yang mungkin terdapat dalam pangan terhadap kesehatan dan kajian dosis respon. Kajian dosis respon dilakukan untuk mengestimasi peluang sakit per sajian produk yang tercemar mikroba patogen. Perhitungan peluang sakit per

11 sajian dapat dilakukan dengan bantuan program komputer seperti software @Risk

dengan cara berikut (Rahayu 2016):

1. Penentuan distribusi yang tepat untuk data jumlah bakteri patogen per gram pangan diperoleh dari hasil analisis cemaran bakteri patogen pada pangan. Penentuan distribusi dilakukan menggunakan fitting distribution yang terdapat di software @Risk. Jenis distribusi yang diperoleh selanjutnya digunakan pada langkah 2. 2. Penentuan nilai rata-rata dari data jumlah bakteri patogen per gram pangan. Nilai

rata-rata diperoleh dengan menggunakan jenis distribusi pada langkah 1. Selanjutnya ditentukan batas bawah dari data yaitu 0. Batas bawah 0 dipilih karena jumlah cemaran bakteri patogen pada sampel tidak mungkin berjumlah minus. Pada langkah ini diperoleh rata-rata jumlah cemaran bakteri patogen per gram sampel pangan (CFU/g).

3. Simulasi Monte-Carlo (10.000 iteration). Simulasi Monte-Carlo dilakukan terhadap nilai rata-rata cemaran bakteri patogen per gram pangan sehingga diperoleh nilai rata-rata cemaran bakteri patogen per pangan yang telah disimulasikan.

4. Penentuan nilai rata-rata berat pangan per sajian yang telah disimulasikan. Nilai ini diperoleh dengan melakukan langkah 1-3 dengan menggunakan data berat pangan per sajian (g).

5. Penentuan dosis bakteri patogen per sajian pangan. Dosis bakteri patogen per sajian pangan diperoleh dengan cara mengalikan antara jumlah bakteri patogen per satu gram pangan (CFU/g) dengan berat pangan per sajian (g).

6. Simulasi Monte-Carlo (10.000 iteration). Simulasi Monte-Carlo dilakukan terhadap nilai dosis bakteri patogen per gram pangan sehingga diperoleh nilai dosis bakteri patogen per pangan yang telah disimulasikan.

7. Peluang sakit akibat bakteri patogen per sajian pangan diperoleh dengan cara memasukkan nilai dosis bakteri patogen per sajian pangan ke dalam model dosis respon yang telah dipilih berdasarkan studi literatur.

8. Simulasi Monte-Carlo (10.000 iteration). Simulasi Monte-Carlo dilakukan terhadap peluang sakit bakteri patogen per sajian pangan sehingga diperoleh peluang sakit bakteri patogen per pangan yang telah disimulasikan.

Karakterisasi risiko adalah upaya untuk mengetahui perkiraan risiko karena mengonsumsi pangan tertentu yang mengandung bahaya tertentu. Karakterisasi risiko merupakan integrasi identifikasi bahaya, kajian paparan, dan karakterisasi bahaya. Dalam melakukan karakterisasi risiko dan mengestimasi peluang terjadinya listeriosis per porsi dapat dilakukan dengan mengumpulkan data prevalensi pangan yang tercemar (Pv), tingkat cemaran pada pangan (Cv), dosis patogen per porsi (Cp) yang diketahui dari kajian paparan. Estimasi peluang listeriosis per porsi pangan yang tercemar (Pi) dapat dihitung menggunakan model eksponensial, yaitu Pi = 1 – exp (-r*N). Kemudian peluang listeriosis per porsi dapat dihitung menggunakan persamaan PI = Pi x Pv (Rahayu dan Sparringa 2004).

Luaran dari karakterisasi risiko dapat berupa perkiraan risiko per juta porsi untuk populasi yang sehat dan rentan. Misalnya, jumlah kejadian luar biasa per tahun ; jumlah yang sakit per tahun atau per jumlah tertentu (misal 100.000) populasi, atau jumlah yang sakit per jumlah tertentu (misal 100.000) porsi pangan (Rahayu dan Sparringa 2004).

12

3

METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan dari bulan Maret 2015 sampai Januari 2016. Penelitian ini dilaksanakan di daerah Bogor dan di Laboratorium Mikrobiologi Pangan dan Laboratorium Bioteknologi SEAFAST Center IPB.

Bahan dan Alat

Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel pangan jajanan berbasis ikan (Tabel 3). Kultur bakteri L. monocytogenes strain ATCC 7644 (ATCC, USA). Bahan media selektif untuk isolasi adalah Cromocult ® Listeria selective agar acc to Ottaviani Agosti (ALOA). Listeria Enrichment Broth Base (LEB) sebagai media enrichment. Untuk identifikasi spesies Listeria menggunakan media blood agar, Purple Broth Base, mannitol, rhamnosa, xylosa, glukosa, water H2O2, dan Sulfide Indole Motility (SIM) medium. Primer yang digunakan yaitu primer forward DG69 (GTG CCG CCA AGA AAA GGT TA), dan primer reverse DG74 (CGC CAC ACT TGA GAT AT) untuk gen (hlyA).

Alat utama yang digunakan adalah rt-PCR Swift™ Spectrum 48, sentrifus, water bath, magnetic stirrer, oven, inkubator, autoklaf, dan peralatan gelas (cawan petri, gelas erlemenyer, dan lainnya).

Tabel 3 Jenis dan jumlah sampel pangan jajanan berbasis ikan

No Jenis sampel Jumlah sampel Nomor sampel

1 Siomay 17 1, 2, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 54, 55, 56, 57

2 Otak-otak 15 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 58, 59, 60, 61, 62, 63

3 Bakso udang 12 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 4 Bakso ikan 11 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 5 Takoyaki 5 24, 25, 26, 64, 65

6 Pempek 3 27, 28, 29

7 Bakso goreng 2 6, 30

Total 65

Tahapan Penelitian

Tahapan penelitian secara umum disajikan dalam diagram alir seperti pada Gambar 3.

Gambar 3 Skema kegiatan penelitan

Tahap 1. Survei konsumsi pangan jajanan berbasis ikan

Tahap 2. Identifikasi Listeria

spp. pada pangan jajanan berbasis ikan

Tahap 3. Prediksi peluang listeriosis pada ikan asap

- Identifikasi Listeria spp. dengan metode biokimiawi

- Identifikasi L. monocytogenes dengan rt-PCR

- Menghitung peluang listeriosis per porsi ikan asap menggunakan persamaan: PI = Pi x Pv - Survei di lingkungan sekolah

13 Berdasarkan tahapan penelitian pada Gambar 3 maka terdapat beberapa prosedur yang harus dilakukan dalam setiap metode penelitian. Kegiatan, prosedur dan luaran yang diharapkan dari penelitian ditampilkan pada Tabel 4.

Tabel 4 Konsep penelitian

Kegiatan Prosedur Referensi Luaran Survei konsumsi

pangan jajanan berbasis ikan: - Survei di

lingkungan sekolah - Wawancara responden dan pengisian kuesioner dengan metode SQ-FFQ (Semi Quantitative Food Frequency Questionnaire) Gibson (2005)

Jumlah konsumsi pangan jajanan berbasis ikan

Identifikasi Listeria spp. pada pangan jajanan berbasis ikan : - Identifikasi Listeria

spp. dengan metode biokimiawi - Identifikasi L.monocytogenes dengan rt-PCR a. Deteksi L. monocytogenes secara kuantitatif (penentuan limit deteksi dan deteksi L. monocytogenes tanpa perlakuan enrichment) b. Deteksi L. monocytogenes secara kualitatif

- Persiapan sampel - Penumbuhan

Listeria spp. pada media ALOA - Isolasi terhadap

isolat terduga Listeria spp. - Konfirmasi isolat

- Persiapan - Ekstraksi DNA

menggunakan metode

fenol:klofororm - Amplifikasi DNA

menggunakan rt-PCR

- Persiapan sampel - Ekstraksi DNA

menggunakan metode

fenol:klofororm - Deteksi DNA

menggunakan rt-PCR

BAM (2011)

Mutsyahidan et al. (2015)

BAM (2011) Mutsyahidan et al. (2015)

Prevalensi Listeria spp.

Limit deteksi DNA L.monocytogenes dan prevalensi L.monocytogenes Prevalensi L.monocytogenes Prediksi peluang listeriosis pada ikan asap

- Menggunakan persamaan :

PI = Pi x Pv

Rahayu dan Sparringa (2004)

Peluang listeriosis jika terjadi cemaran L. monocytogenes

14

Survei konsumsi pangan jajanan berbasis ikan

Kegiatan survei dilakukan dengan tahapan pengembangan kuesioner (Lampiran 1), dilanjutkan dengan wawancara responden. Wawancara dan pengisian kuesioner untuk mengukur jumlah konsumsi pangan jajanan berbasis ikan di lingkungan sekolah kota Bogor dilakukan dengan metode SQ-FFQ (Semi Quantitative Food Frequency Questionnaire), (Gibson 2005). Responden adalah masyarakat yang berada di lingkungan sekolah, yaitu siswa dan mahasiswa kota Bogor. Jumlah responden (siswa) ditentukan berdasarkan data referensi dari Sistem Informasi Manajemen Pelaporan dan Statistik Bappeda Kota Bogor (SIMPATIK), sedangkan untuk jumlah responden (mahasiswa) ditentukan berdasarkan perkiraan jumlah mahasiswa di masing-masing PT yang dipilih (Tabel 5). Selanjutnya data jumlah responden diformulasikan menggunakan rumus Slovin (Umar 2004), yaitu:

n = N 1+Ne2 n = jumlah responden

e = batas toleransi kesalahan / error tolerance (5 % error tolerance memiliki tingkat akurasi 95%)

N = populasi (jumlah siswa dan mahasiswa di Kota Bogor) Tabel 5 Jumlah responden

Tingkat pendidikan Jumlah siswa / mahasiswa

Sekolah Dasar 111 747

Sekolah Menengah Pertama 46 256

Sekolah Menengah atas/sederajat 58 715

Perguruan tinggi* 10 000

Total 226 718

*Berdasarkan perkiraan sesuai PT yang dipilih Sumber : SIMPATIK (2015)

Jumlah responden didasarkan pada perhitungan menggunakan persamaan Slovin, adalah : n = N / ( 1 + N e² ) = 226718 / (1 + 226718 x 0.05²) = 399.29  399.

Responden ditentukan langsung sesuai dengan izin dari sekolah dan kesediaan responden dalam mengisi kuesioner. Data konsumsi berisi porsi konsumsi, frekuensi konsumsi, dan jumlah konsumsi (g/hari). Frekuensi konsumsi pangan jajanan anak sekolah per harinya didapat dengan membagi frekuensi konsumsi pangan jajanan tersebut selama 6 hari. Perhitungan konsumsi pangan dilakukan menggunakan persamaan berikut :

Jumlah Konsumsi = Berat (porsi) Konsumsi x Frekuensi Konsumsi

Sampel yang akan dianalisis ditentukan dari urutan jumlah konsumsi sampel pangan jajanan berbasis ikan terbesar. Selain itu, penentuan sampel juga dilakukan berdasarkan ketersediaan sampel di lingkungan sekolah yang diketahui dari hasil penelitian sebelumnya.

15 Identifikasi Listeria spp. pada pangan jajanan berbasis ikan

Identifikasi Listeria spp. pada sampel pangan jajanan berbasis ikan dilakukan secara paralel menggunakan metode biokimiawi dan metode PCR. Metode biokimiawi dilakukan hingga ke tahap konfirmasi melalui uji morfologi (pewarnaan Gram) dan uji-uji biokemik seperti, uji katalase, motilitas, hemolitik, dan fermentasi karbohidrat. Metode PCR dilakukan dengan menggunakan rt-PCR untuk mendeteksi L. monocytogenes menggunakan primer spesifik melalui amplifikasi gen hly A (gen penentu virulensi listeriolysin O) seperti yang dilakukan Mutsyahisan et al. (2015).

Identifikasi Listeria spp. dengan Metode Biokimiawi (BAM 2011) - Persiapan sampel (BAM 2011)

Persiapan sampel mengacu pada BAM (2011) dengan modifikasi. Modifikasi yang dilakukan adalah jumlah media Listeria Enrichment Broth Base

yang digunakan (dari 225 menjadi 75mL), dan modifikasi waktu inkubasi (dari 24 menjadi 18 jam). Sampel pangan jajanan berbasis ikan sebanyak 25 g dimasukkan ke dalam kantong steril secara aseptis, dihancurkan, dan ditambah dengan 75 mL media Listeria Enrichment Broth Base (Oxoid, Inggris), dikocok hingga homogen. Berikutnya larutan sampel dipindahkan ke dalam botol bertutup steril dan diinkubasi pada suhu 30 C selama 4 jam dan ditambah 1 mL Listeria Selective Enrichment Supplement (Oxoid, Inggris). Inkubasi dilanjutkan pada suhu 30 C selama 18 jam.

Sebanyak 100 L dari kultur pengayaan ditumbuhkan pada media ALOA dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 48 jam. Listeria spp. diisolasi dari koloni bewarna hijau-biru yang tumbuh pada media ALOA. Isolat terduga Listeria spp selanjutnya diuji dengan uji morfologi (pewarnaan Gram), uji katalase, uji motilitas, uji hemolitik, dan uji fermentasi karbohidrat.

- Pewarnaan Gram (BAM 2001)

Dua tetes aquades steril ditempatkan pada gelas objek. Kemudian satu koloni bakteri diambil dan di tempatkan pada aquades steril tersebut. Suspensi diratakan dan dikeringkan pada suhu ruang dan dilewatkan di atas api untuk fiksasi bakteri. Satu tetes crystal violet diteteskan pada apusan bakteri dan dibiarkan selama 1 menit. Kemudian dicuci perlahan dengan aquades dan di keringkan. Selanjutnya permukaan bakteri tersebut ditetesi larutan iodin dan didiamkan selama satu menit, dicuci perlahan dengan aquades dan dikeringkan. Setelah itu permukaan bakteri tersebut disiram dengan etanol 95 % sampai warna biru menghilang (30 detik) dan dicuci perlahan dengan aquades dan dikeringkan. Selanjutnya permukaan bakteri ditetesi dengan zat warna safranin dan dibiarkan selama 20 detik dan dicuci perlahan dengan aquades dan dikeringkan. Kemudian preparat diamati dengan mikroskop. Bakteri Gram positif akan berwarna ungu sedangkan bakteri Gram negatif akan berwarna merah.

- Uji katalase (Purwohadisanto et al. 2009)

Isolat bakteri dari agar miring diambil satu ose, kemudian dioleskan pada gelas preparat. Isolat tersebut kemudian ditetesi dengan laruan H2O2. Uji positif ditandai dengan terbentuknya gelembung gas.

16

- Uji motilitas (BSN 2009)

Isolat diambil dengan jarum ose dan diinokulasikan dengan menusukkannya pada medium SIM kemudian diinkubasi pada suhu 25-28 C selama 18-24 jam. Reaksi positif ditandai dengan adanya pertumbuhan bakteri yang menyebar.

- Uji hemolitik (BAM 2011)

Koloni dari TSBye diteteskan pada 5 % media agar darah. Dasar cawan di beri kisi-kisi antara 20-25 ruang. Masing-masing kultur diinokulasi pada setiap ruang kisi-kisi. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 C selama 24-48 jam dan diamati adanya reaksi hemolisis atau tidak.

- Uji fermentasi karbohidrat (BAM 2011)

Isolat yang berasal dari TSBye diinokulasi ke dalam tabung reaksi yang berisi media purple carbohydrate broth. Kemudian ke dalam masing-masing tabung ditambahkan glukosa, rhamnosa, mannitol dan xylose sebanyak 0.5 % (w/v). Kultur diinkubasi selama 7 hari pada suhu 37 C. Reaksi positif fermentasi karbohidrat ditandai dengan perubahan warna media menjadi kuning.

Identifikasi L. monocytogenes dengan rt-PCR

Identifikasi L. monocytogenes dengan rt-PCR dilakukan secara kuantitatif dan kualitatif. Deteksi L. monocytogenes secara kuantitatif diawali dengan pembuatan kurva standar melalui penentuan limit deteksi DNA L. monocytogenes, selanjutnya dilakukan deteksi L. monocytogenes terhadap sampel pangan jajanan berbasis ikan tanpa perlakuan enrichment. Deteksi L. monocytogenes secara kualitatif dilakukan terhadap sampel pangan jajanan berbasis ikan yang diperlakukan dengan enrichment terlebih dahulu.

Deteksi L. monocytogenes secara kuantitatif

a. Penentuan limit deteksi DNA L. monocytogenes (Mutsyahidan et al. 2015) Pengujian limit deteksi DNA L. monocytogenes dilakukan untuk

mengetahui sensitivitas metode yang digunakan untuk mendeteksi DNA

L. monocytogenes yang di spike ke sampel pangan. Sampel pangan digolongkan dalam tiga kategori yaitu dibakar (bakso udang, bakso ikan, dan takoyaki), direbus/dikukus (siomay dan otak-otak), dan digoreng (pempek dan bakso goreng). Limit deteksi dihitung untuk pangan yang dibakar dan direbus/dikukus. Sampel pangan yang diolah dengan cara dibakar diwakili oleh bakso ikan, dan sampel pangan yang diolah dengan cara direbus/dikukus diwakili oleh otak-otak. Limit deteksi untuk pangan yang digoreng diwakili oleh pempek dan telah dihitung oleh Mutsyahidan et al. (2015).

Penentuan limit deteksi diawali dengan menyegarkan 0.1 mL kultur bakteri

L. monocytogenes strain ATCC 7644 (ATCC, USA) dengan konsentrasi 102 CFU/mL ke dalam 8.9 mL Tryptone Soy Broth yeast extract (TSBye) (Oxoid,

Inggris) dan diinkubasi dalam inkubator (Memmert, German) pada suhu 37 C selama 18 jam. Suspensi bakteri tersebut (108 CFU/mL) ditambahkan ke dalam media BPW (Buffered Peptone Water) (Oxoid, Inggris) steril dan dikocok hingga homogen. Berikutnya masing-masing sampel bakso ikan dan otak-otak sebanyak

17 (107 CFU/mL) dan dikocok hingga homogen. Selanjutnya dari masing-masing larutan sampel tersebut diambil sebanyak 1 mL dan dipindahkan ke dalam

microtube (ExtraGene, Taiwan) untuk dilakukan ekstraksi DNAnya. Ekstraksi DNA dilakukan dengan metode fenol klorofom dan hasil ekstraksi diamplifikasi dengan real-time PCR (rt-PCR) SwiftTM Spectro 48 (ESCO, Singapura). Amplifikasi DNA secara otomatis akan digambarkan dalam bentuk grafik amplifikasi dan kurva standar menggunakan software IQ-5 (Bio-Rad).

Limit deteksi ditentukan berdasarkan nilai threshold cycle (CT) amplikon. Nilai CT adalah siklus diatas noise (background fluorescence) dimana akumulasi produk (senilai 2n, n ialah jumlah pengulangan siklus amplifikasi) terbaca pertama kali pada fase eksponensial. Kurva standar menghasilkan persamaan linear hubungan antara log konsentrasi bakteri dan threshold cycle (CT). Persamaan linear kurva standar digunakan untuk menghitung konsentrasi bakteri yang belum diketahui dalam sampel pangan. Konsentrasi L. monocytogenes pada sampel pangan jajanan berbasis ikan dapat dihitung dengan memasukkan nilai CT hasil amplifikasi sebagai nilai y pada persamaan linear (y = ax + b), kemudian nilai x yang diperoleh dicari nilai inverse (kebalikan) dari nilai log konsentrasi bakterinya. Selanjutnya dari masing-masing larutan sampel tersebut sebanyak 1 mL dibuat seri pengenceran hingga diperoleh suspensi dengan konsentrasi bakteri 101-106 CFU/mL, dan ditumbuhkan (37 C, 48 jam) pada media Cromocult ® Listeria Selective Agar Base acc Ottaviani and Agosti (ALOA) (Merck, Jerman). b. Deteksi L. monocytogenes pada sampel pangan jajanan berbasis ikan tanpa

perlakuan enrichment

Deteksi L. monocytogenes tanpa perlakuan enrichment merupakan pengujian pendahuluan yang dilakukan terhadap 6 sampel pangan jajanan berbasis ikan. Tahapan ini diawali dengan melakukan persiapan sampel. Persiapan sampel mengacu pada BAM (2011) dengan modifikasi. Sebanyak 25 g sampel dimasukkan ke dalam kantong steril secara aseptis, dihancurkan, dan ditambah dengan 75 mL media Listeria Enrichment Broth Base yang mengandung Listeria Selective Enrichment Supplement. Kemudian dilakukan ekstraksi DNA dengan mengambil 1 mL kultur sampel tersebut dan disentrifus dengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu 25 C selama 3 menit. Selanjutnya supernatan dibuang dan pelet diresuspensi dengan 500 L buffer tris-edta (TE) 1x untuk memisahkan komponen pangan dengan DNA bakteri target.

Tahapan berikutnya adalah pelisisan sampel dengan menggunakan 100 L lisozim, 25 L larutan sodium dodecyl sulfate 10 %, 50 l NaCl 5M, dan 100 l proteinase K. Pada tahapan ini juga ditambahkan 500 L buffer TE 1x untuk proteksi dan stabilisasi DNA. Kemudian ditambahkan 250 L fenol dan 250 L kloroform, disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm pada suhu 4C selama 10 menit untuk memisahkan DNA dari debris sel. Setelah itu dilakukan tahapan presipitasi DNA dengan menambahkan 500 L isopropanol dan 150 L amonium asetat 10 M pH 7.4. Selanjutnya dilakukan pencucian DNA menggunakan 500 L etanol 70 %. Pelet yang diperoleh dikering udarakan, ditambah dengan 50 L buffer TE 1x, dan siap untuk dilakukan amplifikasi DNA. Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan alat rt-PCR yang mengacu pada Mutsyahidan et al. (2015). Komposisi bahan dan kondisi running yang digunakan untuk pengujian dengan

18

rt-PCR disajikan dalam Tabel 6 dan 7 (Mutsyahidan et al. 2015). Amplifikasi DNA secara otomatis akan digambarkan dalam bentuk grafik amplifikasi (grafik sigmoidal).

Tabel 6 Komposisi bahan untuk rt-PCR dengan primer DG69/DG74

Bahan Jumlah

DyNAmoTM ColorFlash SYBR® Green qPCR Kit 10 µL

H2O (Nuclease Free) 6 µL

Template DNA 2 µL

Primer forward DG69 (GTGCCGCCAAGAAAAGGTTA) 1 µL (0.5 M) Primer reverse DG74 (CGCCACACTTGAGATAT) 1 µL (0.5 M) Tabel 7 Kondisi running rt-PCR dengan primer DG69/DG74

Tahap Suhu ( C ) Waktu Jumlah Siklus

Denaturasi awal 94 5 menit 1

Tahap amplifikasi : 30

Denaturasi 94 45 detik

Annealing 55 45 detik

Extension 72 45 detik

Entension Akhir 72 7 menit 1

Tahap Melting 72 – 94 ( kenaikan suhu

tiap 0.5 C)

10 detik (tiap kenaikan suhu

0.5 C)

1

Deteksi L. monocytogenessecara kualitatif

Deteksi L. monocytogenes secara kualitatif dilakukan terhadap 59 sampel pangan jajanan berbasis ikan dengan perlakuan enrichment sebelum diekstraksi DNA-nya. Tahapan ini diawali dengan melakukan persiapan sampel, persiapan sampel mengacu pada BAM (2011) dengan modifikasi. Modifikasi yang dilakukan

adalah jumlah media Listeria Enrichment Broth Base yang digunakan (dari 225 menjadi 75mL), dan modifikasi waktu inkubasi (dari 24 menjadi 18 jam).

Sebanyak 25 g sampel dimasukkan ke dalam kantong steril secara aseptis, dihancurkan, dan ditambah dengan 75 mL media Listeria Enrichment Broth Base, dikocok hingga homogen. Berikutnya larutan sampel dipindahkan ke dalam botol bertutup steril dan diinkubasi pada suhu 30 C selama 4 jam dan ditambah 1 mL

Listeria Selective Enrichment Supplement. Inkubasi dilanjutkan pada suhu 30 C selama 18 jam. Sampel siap diekstrak DNAnya.

Ekstraksi DNA dilakukan dengan metode fenol:kloroform yang mengacu pada Mutsyahidan et al. (2015). Sebanyak 1 mL kultur sampel yang telah dikayakan pada media Listeria Enrichment Broth Base disentrifus dengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu 25 C selama 3 menit. Selanjutnya supernatan dibuang dan pelet diresuspensi dengan 500 L buffer tris-edta (TE) 1x untuk memisahkan komponen pangan dengan DNA bakteri target. Selanjutnya dilakukan

19 pelisisan sampel dengan menggunakan 100 L lisozim, 25 L larutan sodium

dodecyl sulfate 10 %, 50 l NaCl 5M, dan 100 l proteinase K. Pada tahapan ini juga ditambahkan 500 L buffer TE 1x untuk proteksi dan stabilisasi DNA. Kemudian ditambahkan 250 L fenol dan 250 L kloroform, disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm pada suhu 4C selama 10 menit untuk memisahkan DNA dari debris sel. Setelah itu dilakukan tahapan presipitasi DNA dengan menambahkan 500 L isopropanol dan 150 L amonium asetat 10 M pH 7.4. Selanjutnya dilakukan pencucian DNA menggunakan 500 L etanol 70 %. Pelet yang diperoleh dikering udarakan, ditambah dengan 50 L buffer TE 1x, dan siap untuk dilakukan amplifikasi DNA menggunakan alat rt-PCR. Komposisi bahan dan kondisi running yang digunakan untuk pengujian dengan rt-PCR disajikan dalam Tabel 5 dan 6. Hasil positif deteksi L. monocytogenes pada sampel ditandai dengan terbentuknya grafik sigmoidal proses amplifikasi seperti dijelaskan pada penentuan limit deteksi. Prediksi peluang listeriosis pada ikan asap

Prediksi peluang listeriosis pada ikan asap dilakukan dengan tujuan untuk mengembangkan suatu model kajian risiko kuantitatif yang memperkirakan pemaparan dan risiko listeriosis yang diperoleh akibat mengonsumsi ikan asap. Ikan asap dipilih sebagai model pangan tercemar L. monoytogenes karena ikan asap merupakan produk pangan yang populer sebagai pangan siap saji. Produk ikan asap seringkali diidentifikasi sebagai sumber potensial listeriosis pada manusia. Peluang listeriosis dapat diperkirakan melalui estimasi risiko berdasarkan kajian risiko.

Kajian risiko dapat dilakukan berlandaskan data-data ilmiah, seperti data prevalensi

L. monocytogenes pada pangan, data tingkat cemaran L. monocytogenes, dan data konsumsi pangan. Distribusi risiko dalam suatu populasi ditentukan dengan melakukan analisis terhadap sebaran distribusi dari nilai data. Analisis nilai-nilai data dilakukan dengan menggunakan simulasi Monte-Carlo menggunakan software @Risk (http://www.palisade.com/risk/) pada komputer.

Dalam memprediksi peluang listeriosis, langkah awal yang dilakukan adalah mengumpulkan data prevalensi pangan yang tercemar (Pv), tingkat cemaran pada pangan, dan dosis patogen per porsi yang diketahui dari kajian paparan. Estimasi peluang listeriosis per porsi pangan yang tercemar (Pi) dapat dihitung menggunakan model eksponensial, yaitu Pi = 1 – exp (-r*N). Pi adalah peluang sakit setelah konsumsi per porsi pangan yang terkontaminasi L. monocytogenes.

N adalah total mikroba yang dikonsumsi (dosis paparan). Dosis paparan diperoleh dari hasil perkalian rata-rata jumlah L. monocytogenes (CFU/g) dengan rata-rata ukuran sajian (g) per porsi. Nilai r merupakan suatu tetapan (konstanta), spesifik untuk setiap patogen pada kurva dosis respon. Tetapan nilai r yang digunakan adalah 1.18x10-10 untuk bakteri patogen L. monocytogenes (Buchanan et al. 1997). Model dosis respon eksponensial dipilih karena model ini merupakan model dosis respon yang sederhana dengan paramater tunggal dan sering digunakan untuk mikroba patogen seperti L. monocytogenes (FAO/WHO 2004).

Perkiraan risiko karena mengonsumsi ikan asap yang tercemar

L. monocytogenes dapat diketahui dengan melakukan karakterisasi risiko. Karakterisasi risiko merupakan integrasi identifikasi bahaya, kajian paparan, dan karakterisasi bahaya. Estimasi peluang listeriosis per porsi dapat dihitung menggunakan persamaan PI = Pi x Pv (Rahayu dan Sparringa 2004).

20

4

HASIL DAN PEMBAHASAN

Survei Konsumsi Pangan Jajanan Berbasis Ikan

Survei konsumsi pangan jajanan berbasis ikan di lingkungan sekolah kota Bogor dilakukan untuk mengetahui jumlah konsumsi pangan jajanan berbasis ikan masyarakat (siswa dan mahasiswa) di lingkungan sekolah tersebut. Selain itu, hasil kegiatan survei juga berguna sebagai dasar dalam penetapan sampel untuk analisis

Listeria spp. Berdasarkan wawancara dan pengisian kuesioner terhadap 770 responden, diketahui ada 22 jenis pangan jajanan berbasis ikan yang

dikonsumsi yaitu siomay, otak-otak, pempek, bakso ikan, bakso udang, bakso goreng, takoyaki, batagor, ikan goreng, udang goreng, nuget ikan, dimsum, kerang, stik kepiting, cumi goreng, cumi asam manis, ikan bakar, ikan presto, ikan bumbu kuning, ikan pepes, ikan pindang, dan kepiting saus tiram. Kemudian, dipilih pangan jajanan berbasis ikan yang memiliki jumlah responden melebihi 2.5 % dari total responden untuk dihitung jumlah konsumsinya (g/hari). Beberapa jenis dan jumlah pangan jajanan berbasis ikan yang dikonsumsi oleh responden disajikan dalam Tabel 8.

Tabel 8 Rata-rata konsumsi harian pangan jajanan berbasis ikan di kota Bogor No Nama pangan jajanan

berbasis ikan

Rata-rata konsumsi harian (g/hari) (range)

Jumlah responden (%)*

1 Takoyaki 36.5 (4.2-104.2) 21 (2.7)

2 Bakso goreng 34.1 (6.7-93.3) 34 (4.4)

3 Siomay 33.4 (3.3-180.0) 514 (66.8)

4 Batagor 28.5 (2.6-160.0) 466 (60.5)

5 Pempek 27.1 (4.2-150.0) 426 (55.3)

6 Otak-otak 22.8 (4.2-125.0) 292 (37.9) 7 Bakso Ikan 20.2 (2.0-83.3) 237 (30.8) 8 Bakso udang 19.1 (3.0-75.0) 67 (8.7) 9 Ikan goreng 18.0 (6.7-32.5) 33 (4.2) 10 Udang goreng 17.6 (5.0-45.0) 33 (4.2) 11 Nuget ikan 14.6 (3.3-20.0) 24 (3.1) *

Jumlah total : 770 orang

Responden hasil survei jumlah kosumsi pangan jajanan berbasis ikan dapat dikelompokkan menjadi tiga kriteria, yaitu responden berdasarkan jenis kelamin, umur, dan uang saku. Rata-rata jumlah konsumsi harian responden sesuai dengan kriteria tersebut disajikan dalam Tabel 9a, 9b, 10a, 10b, 10c, 11a, dan 11b.

21 Tabel 9a Rata-rata konsumsi harian pangan jajanan berbasis ikan di kota Bogor

berdasarkan jenis kelamin (laki-laki) No Nama pangan jajanan

berbasis ikan

Laki-laki* Rata-rata konsumsi harian (g/hari)

(range)

Jumlah responden (%)

1 Siomay 37.7 (3.3-180.0) 173 (59.2)

2 Bakso goreng 33.1 (6.7-93.3) 12 (4.1)

3 Pempek 32.0 (4.2-150.0) 149 (51.0)

4 Batagor 30.6 (2.6-160.0) 190 (65.1) 5 Otak-otak 25.0 (4.2-125.0) 104 (35.6) 6 Bakso udang 21.2 (3.0-70.0) 21 (7.2) 7 Bakso ikan 21.1 (2.2-83.3) 88 (30.1) 8 Udang goreng 19.5 (5.0-40.0) 11 (3.8)

9 Takoyaki 18.0 (-) 1 (0.3)

10 Ikan goreng 14.7 (6.7-20.0) 11 (3.8) 11 Nuget ikan 14.6 (3.3-20.0) 7 (2.4) *

Jumlah total : 292 orang

Tabel 9b 1Rata-rata konsumsi harian pangan jajanan berbasis ikan di kota Bogor berdasarkan jenis kelamin (perempuan)

No Nama pangan jajanan berbasis ikan

Perempuan* Rata-rata konsumsi harian (g/hari)

(range)

Jumlah responden (%)

1 Takoyaki 37.4 (4.2-104.2) 20 (4.2)

2 Bakso goreng 33.2 (6.7-80.0) 23 (4.8)

3 Siomay 30.9 (4.2-150.0) 345 (72.2)

4 Batagor 27.1 (3.3-150.0) 276 (57.7)

5 Pempek 24.6 (5.0-100.0) 276 (57.7)

6 Otak-otak 21.6 (4.2-89.0) 188 (39.3) 7 Bakso ikan 19.7 (2.0-80.0) 148 (31.0) 8 Ikan goreng 19.5 (6.7-32.5) 23 (4.8) 9 Bakso udang 18.2 (3.0-75.0) 46 (9.6) 10 Udang goreng 16.6 (5.0-45.0) 22 (4.6) 11 Nuget ikan 14.6 (3.3-20.0) 17 (3.6) *

Jumlah total : 478 orang

Berdasarkan jenis kelamin (Tabel 9a) diketahui bahwa dari 292 responden laki-laki, 59.2 % mengonsumsi siomay dengan jumlah rata-rata 37.7 g/hari. Jumlah ini merupakan jumlah konsumsi pangan jajanan berbasis ikan terbesar dari jumlah konsumsi pangan jajanan berbasis ikan lainnya. Hal ini disebabkan karena siomay merupakan pangan jajanan berbasis ikan yang pada umumnya selalu ada disetiap

22

lingkungan responden. Responden laki-laki lebih banyak mengonsumsi batagor (65.1 %), selanjutnya siomay (59.2 %), pempek (51.0 %), otak-otak (35.6 %), bakso ikan (30.1 %), bakso udang (7.2 %), bakso goreng (4.1 %), udang goreng (3.8 %), ikan goreng (3.8 %), nuget ikan (2.4 %), dan takoyaki (0.3 %).

Kemudian, rata-rata jumlah konsumsi harian pangan jajanan berbasis ikan responden perempuan (Tabel 9b) paling banyak adalah konsumsi takoyaki yaitu 37.4 g/hari. Akan tetapi, siomay merupakan pangan jajanan berbasis ikan yang banyak dikonsumsi oleh responden perempuan (72.2 %) dengan jumlah rata-rata konsumsi 37.4 g/hari. Produk ini banyak dikonsumsi karena ada di setiap lingkungan sekolah, dan harganya juga terjangkau oleh responden.

Tabel 10a Rata-rata konsumsi harian pangan jajanan berbasis ikan di kota Bogor berdasarkan umur (5-13 tahun)

No Nama pangan jajanan berbasis ikan

Anak-anak (5-13 tahun)* Rata-rata konsumsi harian (g/hari)

(range)

Jumlah responden (%) 1 Bakso goreng 40.8 (6.6-93.3) 17 (4.5)

2 Siomay 32.2 (4.2-150.0) 250 (66.6)

3 Takoyaki 29.8 (4.2-50.0) 7 (1.8)

4 Batagor 28.8 (3.3-160.0) 250 (66.6)

5 Pempek 28.3 (5.0-150.0) 248 (66.1)

6 Otak-otak 23.7 (4.2-125.0) 147 (39.2) 7 Bakso ikan 21.0 (3.3-83.3) 118 (31.4) 8 Bakso udang 20.5 (3.0-75.0) 39 (10.4) 9 Udang goreng 18.5 (5.0-45.0) 10 (2.6) 10 Nuget ikan 14.2 (3.3-20.0) 15 (4)

11 Ikan goreng 0 0

*

Jumlah total : 375 orang

Tabel 10b Rata-rata konsumsi harian pangan jajanan berbasis ikan di kota Bogor berdasarkan umur (14-18 tahun)

No Nama pangan jajanan berbasis ikan

Remaja (14-18 tahun)* Rata-rata konsumsi harian (g/hari)

(range)

Jumlah responden (%) 1 Takoyaki 41.8 (4.2-104.2) 13 (4.1)

2 Siomay 32.9 (3.3-180.0) 209 (65.3)

3 Bakso goreng 27.4 (6.7-40.0) 17 (5.3) 4 Pempek 25.3 (4.2-100.0) 145 (45.3) 5 Batagor 21.9 (3.3-120.0) 170 (53.1) 6 Otak-otak 20.5 (4.2-83.3) 133 (41.6) 7 Bakso ikan 19.2 (2.2-80.0) 106 (33.1) 8 Bakso udang 17.2 (3.3-70.0) 27 (8.4) 9 Udang goreng 16.8 (5.0-40.0) 20 (6.2) 10 Ikan goreng 16.0 (6.7-32.5) 15 (4.7) 11 Nuget ikan 15.2 (6.0-20.0) 9 (2.8) *

37 Rahayu WP, Utari IW, Nurwitri CC, Nurjanah S. 2015a. Fish-based Food Vendor Compliance to Good Processing Practices. International Conference on Food Agriculture and Culinary Tourism. (2015 Aug 5); Samarinda. Indonesia.

Rahayu WP, Nurjanah S, Nurwitri CC. 2015b. Kajian Risiko Listeria monocytogenes pada Pangan Jajanan Anak Sekolah Berbasis Ikan. Laporan Akhir Hibah Kompetensi.

Rahayu WP. 2016. Listeria monocytogenes: Karakteristik, analisis, dan kajian risiko. Bogor (ID): IPB Press.

Rivoal K, Queguiner S, Boscher E, Bougeard S, Ermel G, Salvat M, Federighi M, Jugiau F, Protais J. 2010. Detection of Listeria monocytogenes in raw and pasteurized liquid whole eggs and characterization by PFGE. Int J Food Microbiol. 138:56-62.doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2010. 01.013.

Ryser ET, Marth EH. 2007. Listeria, Listeriosis and Food Safety 3ed. New York (US): CRC Press.

Sambrook J and Russel DW. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

Shi Y, Tang J, Yue T, Rasco B, Wang S. 2015. Pasteurizing cold smoked salmon (Onchorynchus nerka): thermal inactivation kinetics of Listeria monocytogenes and Listeria innocua. J Aqua Food Prod T. 24(7): 712-722.doi:10.1080/10498850. 2013.808 303.

[SIMPATIK] Sistem Informasi Manajemen Pelaporan dan Statistik Bappeda Kota Bogor. [Internet]. [diunduh 5 Mei 2015]. Tersedia pada: http://simpatik. kotabogor.go.id/.

Sorqvist S. 2003. Heat resistance in liquids of Enterococcus spp., Listeria spp., Escherichia coli, Yersinia enterocoliticai, Salmonella spp. and Campylobacter spp. Acta vet scand. 44:1-2.

Swaminathan B, Gerner-Smidt P. 2007. The epidemiology of human listeriosis. Microbes and Infection. 9:1236-1243.doi:10.1016/j.micinf.2007.05.011. Tocmo R, Krizman K, Khoo WJ, Phua LK, Kim M, Yuk H. 2014. Listeria

monocytogenes in vacuum-packed smoked fish products: occurrence, routes of contamination, and potential intervention measures. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 13:172-189.doi:10.1111/1541-4337.12052.

Umar. 2004. Metode Riset Bisnis Panduan Mahasiswa untuk Melaksanakan Riset Dilengkapi Contoh Proposal dan Hasil Riset Bidang Manajemen dan Akuntansi. Jakarta (ID): Raja Grafindo.

Vogel BF, Huss HH, Ojeniyi B, Ahrens P, Gram L. 2004. Elucidation of Listeria monocytogenes contamination routes in cold-smoked salmon processing plants detected by DNA-based typing methods. Appl Environ Microbiol. 67(6):2586-2595.doi:10.1128/AEM.67.6.2586-2595.2001.

Yuwono T. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Yogyakarta (ID): Andi.

Zilelidou EA, Rychli K, Manthou E, Ciolacu L, Wagner M, Skandamis PN. 2015. Highly invasive listeria monocytogenes strains have growth and invasion advantages in strain competition. Plos One. 10(11):e0141617. doi:10.1371/journal.pone.0141617.

38

39 Lampiran 1 Desain Kuesioner

Lembar Survei Responden (Siswa/i-Mahasiswa/i) Kajian Mikrobiologi Pangan Jajanan Berbasis Perikanan

Tujuan: Memperoleh informasi mengenai pola konsumsi pangan jajanan para siswa/i-mahasiswa/i di Kota Bogor

Petunjuk Pengisian Lembar Data Konsumsi PJAS

Berikut ini Saudara dimohon menuliskan data pangan jajanan yang dikonsumsi oleh Saudara selama disekolah hingga usai sekolah pada lembar data konsumsi makanan jajanan yang tersedia. Survei ini bertujuan untuk memperoleh data konsumsi makanan jajanan Saudara selama disekolah.

Petunjuk umum

- Bacalah terlebih dahulu petunjuk pengisian sebelum anda melakukan pengisian pada lembar data konsumsi pangan

- Gunakan pinsil/pena untuk mengisi lembar data konsumsi makanan - Lembar survei digunakan untuk 1 (satu) responden

- Lembar survei dibagi dalam 2 blok, yaitu: (1) data responden, dan (2) data konsumsi PJAS

- Responden menuliskan jawaban atau memberi tanda silang (X) dan (√) pada pilihan jawaban

- Setiap pertanyaan dengan pilihan jawaban ganda boleh diisi lebih dari satu jawaban

Kode kuesioner

Blok 1. Data Responden 1. Nama Responden :

2. Umur :

3. Jenis Kelamin : L/P* 4. Berat Badan (kg) : 5. Tinggi Badan (cm) :

6. Uang Saku : Rp

7. Nama Sekolah/PT : *Pilih salah satu

40

Blok 2. Data Konsumsi Pangan Jajanan Berbasis Perikanan

1. Apa saja jenis pangan jajanan yang saudara/i konsumsi selama di sekolah: (boleh>1 jawaban)

a. Pempek b. Siomay c. Otak-otak d. Batagor e. Bakso ikan

f. Olahan ikan yaitu ………

g. Olahan hasil laut selain ikan yaitu ………...

h. Yang tidak termasuk dalam a s/d g yaitu ……… 2. Berapa banyak pangan jajanan yang diatas (poin 1) dikonsumsi perhari:

a. Pempek: 1 potong 2 potong 3 potong 4 potong 5 potong > 5 potong (……... potong)

b. Siomay: 1 potong 2 potong 3 potong 4 potong 5 potong > 5 potong (……... potong)

c. Otak-otak: 1 potong 2 potong 3 potong 4 potong 5 potong > 5 potong (……... potong)

d. Batagor: 1 potong 2 potong 3 potong 4 potong 5 potong > 5 potong (……... potong)

e. Bakso ikan: 1 potong 2 potong 3 potong 4 potong 5 potong > 5 potong (……... potong)

f. Olahan ikan yaitu ………..

1 potong 2 potong 3 potong 4 potong 5 potong > 5 potong (……... potong)

g. Olahan hasil laut selain ikan yaitu ………...

1 potong 2 potong 3 potong 4 potong 5 potong > 5 potong (……... potong)

h. Yang tidak termasuk dalam a s/d g yaitu ………. 1 potong 2 potong 3 potong 4 potong 5 potong > 5 potong (……... potong)

3. Seberapa sering anda mengonsumsi pangan jananan yang diatas (poin 1) perhari:

a. Pempek: 1 potong 2 potong 3 potong 4 potong 5 potong > 5 potong (……... potong)

b. Siomay: 1 potong 2 potong 3 potong 4 potong 5 potong > 5 potong (……... potong)

c. Otak-otak: 1 potong 2 potong 3 potong 4 potong 5 potong > 5 potong (……... potong)

41 d. Batagor: 1 potong 2 potong 3 potong 4 potong

5 potong > 5 potong (……... potong)

e. Bakso ikan: 1 potong 2 potong 3 potong 4 potong 5 potong > 5 potong (……... potong)

f. Olahan ikan yaitu ………..

1 potong 2 potong 3 potong 4 potong 5 potong > 5 potong (……... potong)

g. Olahan hasil laut selain ikan yaitu ………...

1 potong 2 potong 3 potong 4 potong 5 potong > 5 potong (……... potong)

h. Yang tidak termasuk dalam a s/d g yaitu ………. 1 potong 2 potong 3 potong 4 potong 5 potong > 5 potong (……... potong)

4. Seberapa sering anda mengonsumsi pangan jananan yang diatas (poin 1) setiap minggu (6 hari)

a. Pempek: 1 kali 2 kali 3 kali 4 kali 5 kali > 5 kali (……...kali)

b. Siomay: 1 kali 2 kali 3 kali 4 kali 5 kali > 5 kali (……...kali)

c. Otak-otak: 1 kali 2 kali 3 kali 4 kali 5 kali > 5 kali (……...kali)

d. Batagor: 1 kali 2 kali 3 kali 4 kali 5 kali > 5 kali (……...kali)

e. Bakso ikan: 1 kali 2 kali 3 kali 4 kali 5 kali > 5 kali (……...kali)

f. Olahan ikan yaitu ………

1 kali 2 kali 3 kali 4 kali 5 kali > 5 kali (……...kali)

g. Olahan hasil laut selain ikan yaitu ………...

1 kali 2 kali 3 kali 4 kali 5 kali > 5 kali (……...kali)

h. Yang tidak termasuk dalam a s/d g yaitu ………. 1 kali 2 kali 3 kali 4 kali

5 kali > 5 kali (……...kali)

42

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Kabupaten Pasaman Barat Provinsi Sumatera Barat pada tanggal 12 Januari 1989 sebagai anak kelima dari enam bersaudara dari orang tua Bapak Bustamar dan Ibu Yusnimar. Penulis menempuh pendidikan dasar di SDN 16 Pasaman, pendidikan menengah di MTsN Simpang Empat Pasaman Barat dan SMKN 1 Talamau Pasaman Barat. Penulis menempuh pendidikan S1 di program studi Teknologi Hasil Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Andalas. Kesempatan untuk melanjutkan ke program magister pada program studi Ilmu Pangan IPB diperoleh pada tahun 2013 dengan beasiswa dari Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi (Beasiswa Pendidikan Pascasarjana Dalam Negeri-Direktorat Pendidikan Tinggi/ BPPDN-DIKTI).