Proses RT-PCR CP CMV. Kloning dan Konstruksi Gen CP CMV pada Plasmid Vektor.

Metode Penelitian a. Disain Primer oligonukleotida gen CP CMV Disain primer oligonukleotida gen CP CMV spesifik sebanyak 20 pasang basa dirancang berdasarkan urutan nukleotida spesifik CP CMV yang telah dipublikasikan Namba et al., 1991. Untuk itu digunakan data dasar urutan nukeotida dari CP CMV dan akan ditentukan sekuen yang spesifik untuk CP CMV. Selain itu, prosedur ini akan membantu untuk mengoptimalkan proses pembentukan cDNA CP CMV dengan teknik RT-PCR. Tabel 1. Primer Spesifik yang Digunakan untuk Mengamplifikasi CP CMV Namba et al., 1991. Primer Urutan Nukleotida Primer F 5’ AGCTAACCATGGACAAATCTGGATGTCCCAAT 3’ Primer R 5’ AGCATTCCATGGGGCAGTTTGAAGCAATACTACC 3’ b. Ekstraksi RNA total dari sampel tanaman Daun tanaman tembaku terinfeksi CMV 0.1 g digerus dalam 600 µl larutan 3 ml STE 2X, 0.03 g SDS, dan 30 µl mercaptoethanol sampai hancur dan larut. Larutan sap yang diperoleh disentrifugasi pada 12 000 rpm pada suhu 4 C selama 5 menit. Supernatan diambil 200 µl dan ditambah 200 µl PCI, divorteks sampai homogen dan kemudian disentrifugasi 12 000 rpm selama 5 menit diulang sampai 2 kali. Supernatan sebanyak 200 µl dan ditambahkan 200 µl chloroform, divorteks sampai homogen dan kemudian disentrifugasi 12 000 rpm selama 5 menit diulang sampai 2 kali. Supernatan yang diperoleh ditambah 0.1 volume supernatan dengan 3M NaOc dan tiga kali volume supernatan dengan larutan ethanol 99 dingin. Setelah dibolak-balik suspensi disimpan pada -20 C selama 2 jam. Selanjutnya disentrifugasi 12 000 rpm selama 5 menit pada suhu 4 C. Pelet yang diperoleh dicuci dengan 150 µl ethanol 70 dingin, kemudian disentrifugasi 12 000 rpm selama 5 menit pada suhu 4 C. Ethanol diambil secara perlahan dan dicakum sampai kering selama 20 menit, kemudian ditambahkan 10 µl aquabidest. Setelah divorteks sampai larut, suspensi RNA dipindahkan ke PCR tube dan siap digunakan untuk RT-PCR atau disimpan pada suhu -20 C.

c. Proses RT-PCR CP CMV.

Proses RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction atau reaksi transkripsi balik dilakukan menurut Bohringer Mannheim RT-PCR kit. Komposisi yang dibuat dalam RT-PCR adalah 5 µl RNA hasil ekstraksi, satu PCR bead 50 µl, 1.0 µl primer F, 1.0 µl primer R, dan 43 µl aquabidest. Inkubasi dilakukan pada suhu 95 C selama 5 menit untuk denaturasi, kemudian dilanjutkan pada suhu 42 C selama 1 jam untuk reaksi pemanjangan untai cDNA bayangan dari RNA genom virus. PCR dilakukan dalam volume 50 µl dengan siklus sebagai berikut : satu siklus untuk denaturasi inisiasi pada 95 C selama 5 menit, 30 siklus untuk denaturasi pada 94 C selama 30 detik, annealing 50 C selama 30 detik, dan ekstensi 72 C selama 1 menit, serta 5 e-USU Repository ©2005 Universitas Sumatera Utara satu siklus untuk ektensi akhir pada 72 C selama 5 menit. Hasil amplifikasi PCR dengan pasangan primer yang digunakan diperkirakan sekitar pada bagian CP CMV. Setelah amplifikasi dilakukan, sekitar 10-15 µl produk PCR diseparasi dengan elektroforesis pada 1.2 agarose dalam buffer TBE 90 mM Tris-borate, pH 8.0. Setelah elektroforesis gel distaining dengan ethidium bromide dan divisualisasi dengn UV transilluminator.

d. Kloning dan Konstruksi Gen CP CMV pada Plasmid Vektor.

Kloning bertujuan untuk memperoleh klon bakteri yang mengandung plasmid rekombinan antara cDNA CP CMV dengan plasmid vektor. Awal kloning cDNA CP CMV dilakukan dengan meligasikannya ke dalam plasmid vektor. Plasmid vektor yang digunakan adalah pGEM-T Easy berukuran 3018 bp Promega yang mempunyai kelebihan nukleotida T T-overhang pada kedua ujung situs kloning. Ligasi fragmen cDNA CP CMV pada plasmid vector dilakukan untuik membentuk rekombinan plasmid yang terdiri atas DNA plasmid dan cDNA CP CMV. Prosedur ligasi dilakukan mengikuti prosedur pGEM-T Easy dengan komposisi reaksi ligasi untuk 10 ul adalah 7 ul cDNA CP CMV, 1 ul 10 x buffer ligasi, 1 ul plasmid vektor pGEM-T Easy. Campuran tersebut diinkubasikan semalam pada suhu 10 C.

e. Transformasi Plasmid Rekombinan.