Aktivitas GR
ditentukan melalui
pengukuran menggunakan
spektrofotometer berdasarkan kepada oksidasi NADPH pada panjang gelombang 340 nm.
Aktivitas enzim diekspresikan sebagai nmol dari NADPH yang dioksidasi per mg protein per menit.
c. Enzim Superoxida Dismutase SOD Pengamatan aktifitas enzim SOD dilakukan berdasarkan metode yang
dilakukan oleh Jiang dan Huang 2001. Untuk mengukur aktivitas enzim SOD, 0,05 ml supernatan ditambahkan kedalam tabung reaksi yang telah
berisi 0,2 mL EDTA 0,1 M, 0,1 mL Nitroblue tetrazolium NBT, serta buffer fosfat 0,0067 M pada pH 7,8. hingga diperoleh campuran sebanyak 3 ml.
Setelah itu campuran tersebut diinkubasikan kedalam kotak cahaya dengan diberi penerangan lampu Neon 20 watt selama 3 menit, dimana
sebelumnya kotak telah dipanaskan selama 15 menit. Setelah itu campuran ditambahkan 0,05 ml riboflavin 0,12 mM dan diinkubasikan kembali.
Pengukuran dilakukan setiap 1 menit dengan mengukur tingkat absorbansinya pada panjang gelombang 560 nm.
6. Analisis prolin
Analisis prolin dilakukan menggunakan metode modifikasi Bates 1973, dengan menggunakan spektrofotometer dengan prolin murni sebagai standar.
Asam ninhydrin disiapkan sebagai pereaksi dengan melarutkan 1 g ninhidrin dalam 30 ml asam asetat glasial dan 20 ml 6 mol asam asetat. Larutan
didinginkan dan disimpan selama 24 jam hingga pereaksi ini siap digunakan. Daun sampel tanaman sebanyak 0,05 g, diekstraksi dalam 10 ml asam
sulfosalisilik 3 menggunakan mortar, lalu disentrifuse dengan kecepatan 6000 rpm selama 5 menit dan diambil supernatannya.
Setelah dipisahkan, supernatan diterra sebanyak 10 ml, 2 ml cairan sampel diambil dan direaksikan dengan 2 ml asam ninhidrin dan 2 ml asam asetat glasial.
Setelah itu tabung reaksi dipanaskan selama 1 jam pada suhu 100 C, kemudian
proses reaksi diakhiri dalam ice-bath. Campuran ini selanjutnya diekstraksi dengan 4 ml toluen, dikocok menggunakan test tube stirrer selama 15 – 20 detik.
Larutan toluen dipisahkan dari endapan yang terbentuk, lalu diukur absorbansinya
= µg prolinml x ml toluen 115,5 µg µmol g sampel 5
= µ mol prolin g bobot basah pada panjang gelombang 520 nm, untuk blanko digunakan toluen. Konsentrasi
prolin ditentukan dari kurva standar dan dihitung berdasarkan berat segar yaitu :
[
7. Analisis klorofil
Analisis klorofil dilakukan ketika tanaman yang diberi perlakuan cekaman sudah mencapai tahap kritis yaitu pada hari ke 14 sebelum dilakukan recovery.
Daun tanaman diambil dan ditimbang menggunakan timbangan analitik seberat 0,05 g, lalu daun dihaluskan menggunakan mortar setelah ditambahkan 2 ml
aseton 80. Selanjutnya homogenat diambil sebanyak 2 ml dan dimasukkan kedalam mikrofilter dan di sentrifuse pada 5.410 g selama 20 detik untuk
memisahkan supernatan dari bahan tanaman daun. Ekstraksi dilakukan
beberapa kali sampai bahan tidak berwarna lagi. Supernatan ditera sebanyak 10 ml dan diamati menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 645 nm
untuk mengamati klorofil A dan 663 nm untuk klorofil B. Kandungan klorofil A dan B diketahui dengan menggunakan rumus :
klorofil A mgmg sampel = {12,7 x A 663 – 2,69 x A 645} x Fp Bobot sampel mg
klorofil B mgmg sampel = {22,9 x A 645 – 4,68 x A 645} x Fp Bobot sampel mg
dimana Fp faktor pengencer = 10 ml x 1 liter 1000 ml
8. Produksi
