Alel Monomorfik Gen Osteopontin (OPN|BsrI) pada Sapi Bali dengan Metode PCR-RFLP
ALEL MONOMORFIK GEN OSTEOPONTIN (OPN|BsrI)
PADA SAPI BALI DENGAN METODE PCR-RFLP
KOMANG ALIT PARAMITASARI
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN
FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Alel Monomorfik Gen
Osteopontin (OPN|BsrI) pada Sapi Bali dengan Metode PCR-RFLP adalah benar
karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Mei 2013
Komang Alit Paramitasari
NIM D14090089
ABSTRAK
KOMANG ALIT PARAMITASARI. Alel Monomorfik Gen Osteopontin
(OPN|BsrI) pada Sapi Bali dengan Metode PCR-RFLP. Dibimbing oleh
JAKARIA dan CECE SUMANTRI.
Bangsa sapi bali sebagai sumberdaya genetik ternak asli Indonesia
memiliki keunggulan, salah satunya adalah daya reproduksi yang tinggi. Gen
osteopontin (OPN) merupakan anggota dari alur POU class 1 homeobox 1
(POU1F1) yang berkaitan dengan sifat reproduksi. Penelitian ini bertujuan untuk
mengidentifikasi ada tidaknya polimorfisme gen osteopontin (OPN) sebagai
pengontrol sifat reproduksi pada sapi bali di Pulau Bali dengan menggunakan
metode PCR-RFLP. Sampel sapi bali sebanyak 100 sampel yang berasal dari
BPTU sapi bali dideteksi keberadaan keragaman genetiknya pada gen OPN
menggunakan enzim restriksi BsrI yang memotong sekuens basa ACTGG|N.
Amplifikasi gen OPN menghasilkan fragmen dengan panjang 290 bp yang
terletak pada intron 4 dengan suhu annealing 60 oC selama 20 detik. Hasil
analisis PCR-RFLP menunjukkan sapi bali yang dianalisis memiliki alel
monomorfik T adalah 100%. Hasil sekuens fragmen gen OPN intron 4
menunjukkan terdapat mutasi antara basa sitosin (C) dengan timin (T).
Kata kunci: gen osteopontin (OPN), PCR-RFLP, sapi bali
ABSTRACT
KOMANG ALIT PARAMITASARI. Monomorphic Allele Osteopontin Gene
(OPN|BsrI) in Bali Cattle Using PCR-RFLP Method. Supervised by JAKARIA
and CECE SUMANTRI.
Bali cattle as one of Indonesian animal genetic resources has advantages,
one of which is its high reproductive ability. Osteopontin gene (OPN) is a
member of POU class 1 homeobox 1 (POU1F1) related to reproductive traits.
The aim of this research was to identify the existence of OPN gene
polymorphisms in bali cattle at Bali Island using the PCR-RFLP method. A total
of 100 bali cattle from BPTU bali cattle were identified using BsrI restriction
enzyme that cuts the sequence of ACTGG|N bases. OPN gene amplification was
performed with annealing temperature of 60 oC for 20 seconds resulting in a
fragment with the length of 290 bp which is located at intron 4. The results of
PCR-RFLP analysis indicated that the analyzed bali cattles which have
monomorphic T allele was 100%. OPN gene fragment intron 4 sequences showed
that there was a mutation between cytosine (C) base with thymine (T).
Keywords: bali cattle, osteopontin gene (OPN), PCR-RFLP
ALEL MONOMORFIK GEN OSTEOPONTIN (OPN|BsrI)
PADA SAPI BALI DENGAN METODE PCR-RFLP
KOMANG ALIT PARAMITASARI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Peternakan
pada
Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN
FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi : Alel Monomorfik Gen Osteopontin (OPN|BsrI) pada Sapi Bali
dengan Metode PCR-RFLP
Nama
: Komang Alit Paramitasari
NIM
: D14090089
Disetujui oleh
Dr Jakaria, SPt MSi
Pembimbing I
Prof Dr Ir Cece Sumantri, MAgr Sc
Pembimbing II
Diketahui oleh
Prof Dr Ir Cece Sumantri, MAgr Sc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan atas segala karunia-Nya
sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam
penelitian yang dilaksanakan pada bulan Desember 2012 sampai Maret 2013 ini
adalah gen reproduksi pada sapi bali, dengan judul Alel Monomorfik Gen
Osteopontin (OPN|BsrI) pada Sapi Bali dengan Metode PCR-RFLP.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr Jakaria, SPt MSi selaku
pembimbing akademik dan pembimbing skripsi, Prof Dr Ir Cece Sumantri,
MAgrSc selaku pembimbing skripsi, Ir Rini H. Mulyono, MSi dan Dr Iwan
Prihantoro, SPt MSi selaku penguji ujian akhir, dan Dr Ir Sri Darwati, MSi selaku
perwakilan departemen dalam ujian akhir sarjana penulis. Ungkapan terima kasih
juga disampaikan kepada kedua orang tua, I Nyoman Arnaya dan Putu Agustini
Eliyati, kedua kakak, Putu Indira Pradnyawati dan Kadek Noni Lokasari, serta
seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya. Di samping itu, penulis
sampaikan terima kasih kepada I Putu Arimbawa Pande, Kak Eryk, Kak Ferdy,
Kak Irine, Kak Isyana, Rany Pratiwi, Roaslein Putri, Opak, Adit, Eja, Lusiana,
Tasya, dan teman-teman laboratorium genetika molekuler ternak, serta keluarga
besar Golden Ranch IPTP 46 atas segala dukungannya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Mei 2013
Komang Alit Paramitasari
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
METODE
Lokasi dan Waktu Penelitian
Bahan
Alat
Prosedur
Ekstraksi DNA
Amplifikasi DNA
Genotyping Gen OPN
Sekuens Fragmen Gen OPN Intron 4
Analisis Data
Frekuensi Alel Gen OPN
Sekuens Fragmen Gen OPN Intron 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Amplifikasi Gen Osteopontin (OPN)
Identifikasi Genotipe Gen Osteopontin (OPN)
Frekuensi Alel Gen Osteopontin (OPN)
Homologi dan Deteksi Mutasi Gen Osteopontin (OPN)
SIMPULAN DAN SARAN
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
viii
viii
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
4
4
4
4
5
5
5
6
6
7
9
9
11
DAFTAR GAMBAR
1 Posisi penempelan primer pada fragmen gen OPN dan situs
pemotongan enzim BsrI
2 Hasil amplifikasi gen osteopontin pada gel agarose 1.5%
3 Hasil PCR-RFLP fragmen gen osteopontin (OPN|BsrI) pada gel
agarose 2%
4 Hasil alignment nukleotida sekuens gen OPN|BsrI intron 4 sapi bali
dengan GenBank Bos taurus (kode akses GU143824)
5 Rekonstruksi struktur gen OPN pada sapi dengan SNP (single nuclotide
polymorphism) pada intron 4
3
5
6
8
8
DAFTAR LAMPIRAN
1 Sekuens gen osteopontin (OPN) yang diakses di GenBank kode akses
GU143824
2 Hasil BLAST nukleotida sekuens gen OPN sapi bali dengan sekuens
GenBank kode akses GU143824
3 Hasil analisis sekuens fragmen gen OPN pada sapi bali
11
12
12
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Sapi bali (Bos javanicus) merupakan salah satu ternak asli Indonesia hasil
domestikasi banteng (Bibos banteng) (Talib 2002) yang merupakan sumberdaya
genetik ternak yang tidak ternilai harganya dan telah diakui oleh FAO sebagai
salah satu bangsa ternak di dunia (DGLS 2003). Sapi bali memiliki beberapa
keunggulan yaitu mampu beradaptasi terhadap lingkungan marginal, selain itu
memiliki persentase karkas tinggi (56%-57%) serta angka kelahiran tinggi
(69%-83%) (Talib 2002). Sapi bali memiliki daya reproduksi yang tinggi
dibandingkan dengan bangsa-bangsa sapi lain yang dikembangkan di Indonesia.
Oleh karena itu, sapi bali merupakan bangsa sapi yang potensial untuk
dikembangkan dan dimanfaatkan untuk memenuhi kebutuhan daging secara
nasional.
Upaya peningkatan mutu genetik ternak sapi bali dapat dilakukan melalui
seleksi yaitu mempertahankan sifat-sifat unggul yang terdapat pada sapi bali
seperti kemampuan sifat reproduksi tinggi. Seleksi sifat reproduksi sapi bali pada
tingkat molekuler DNA dapat dilakukan dengan cara menganalisis gen-gen utama
pengontrol sifat reproduksi.
Khatib et al. (2009) menyatakan bahwa sifat reproduksi dikontrol oleh
beberapa gen, salah satunya adalah gen osteopontin (OPN). Gen osteopontin
(OPN) atau sering disebut sebagai secreted phospoprotein 1 (SPP1) pada sapi
terletak pada kromosom 6 (Leonard et al. 2005) yang terdiri atas tujuh exon dan
enam intron dengan ukuran sekitar 7 000 basa dari total genom (Pareek et al.
2008). Keragaman gen OPN di intron 4 telah ditemukan oleh beberapa hasil
penelitian seperti sifat produksi susu pada sapi FH (Leonard et al. 2005), sifat
pertumbuhan pasca sapih pada sapi pedaging (White et al. 2007), sifat fertilitas
pada embrio sapi (Khatib et al. 2009), dan sifat kembar pada sapi FH (Anggraeni
et al. 2012). Keragaman atau polimorfisme gen OPN pada sapi bali dapat
diketahui dengan menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction-Restriction
Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP).
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi ada tidaknya polimorfisme
gen osteopontin (OPN) pada sapi bali di Pulau Bali dengan menggunakan metode
PCR-RFLP. Selain itu, tujuan penelitian ini adalah untuk mendeteksi ada
tidaknya mutasi pada situs enzim pemotong BsrI gen OPN intron 4.
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini meliputi analisis pada 100 ekor sapi bali yang terdapat di
Balai Pembibitan Ternak Unggul (BPTU) sapi bali, Pulau Bali. Keragaman gen
OPN dianalisis menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction-Restriction
Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP). Ada tidaknya mutasi di fragmen
2
gen OPN intron 4 dianalisis melalui teknik sequencer. Analisis data dilakukan
melalui pendekatan frekuensi alel dan analisis Basic Local Alignment Search
Tools (BLAST) nukleotida.
METODE
Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak,
Bagian Pemuliaan dan Genetika, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor.
Penelitian ini berlangsung dari bulan Desember 2012 sampai dengan Maret 2013.
Bahan
Sampel DNA yang dianalisis berasal dari sampel darah 100 ekor sapi bali
di BPTU Bali yang merupakan koleksi Laboratorium Genetika Molekuler Ternak.
Bahan-bahan yang digunakan untuk ekstraksi DNA adalah NaCl 0.2%, Sodium
Dodecyl Sulfat (SDS) 10%, enzim Proteinase-K (5 mg/ml), 1 x STE (NaCl 5 M,
tris HCl 2 M, EDTA 0.2 M), chlorofom isoamil alkohol (CIAA), phenol, EtOH
96%, EtOH 70%, dan buffer Tris EDTA (TE) 80%. Bahan yang digunakan untuk
amplifikasi, elektroforesis dan analisis RFLP adalah sampel DNA hasil ekstraksi,
destilation water (DW), 10 x buffer, MgCl2, pasangan primer forward dan reverse
fragmen gen OPN, enzim Taq polymerase (Fermentas), deoxy Nucleotide
Triphospat (dNTPs), produk PCR, serbuk agarose, 0.5 x Tris-Borat EDTA (TBE),
Ethidium Bromide (EtBr), loading dye (0.01% Xylene Cyanol, 0.01% Bromthymol
blue dan 50% gliserol), marker 100 bp, enzim restriksi BsrI, dan buffer B.
Bahan yang digunakan untuk analisis sekuensing adalah produk PCR dan
primer forward fragmen gen OPN.
Primer yang digunakan untuk
mengamplifikasi gen osteopontin (OPN|BsrI) berdasarkan Leonard et al. (2005)
adalah forward: 5´-GCAAAT-CAGAAGTGTGATAGAC-3´ dan reverse: 5´
CCAAGCCAAACGTATGAGTT-3´.
Alat
Alat-alat yang digunakan untuk ekstraksi DNA, amplifikasi dan analisis
penciri RFLP adalah tabung eppendorf 1.5 ml, satu set mikro pipet, tip pipet,
vortex, inkubator, rotary mixer, microsentrifuge, refrigerator, freezer, mesin PCR
Applied Biosystems, tabung PCR, dan tabung RFLP. Alat yang digunakan dalam
prosedur elektroforesis adalah satu set gel tray, magnetic stirrer, microwave,
power supply electrophoresis 100 volt, dan UV Transiluminator.
3
Prosedur
Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA dilakukan berdasarkan metode Sambrook et al. (1989)
yang dimodifikasi. Sampel darah diambil sebanyak 200 µl dan ditambahkan
dengan 1 000 µl NaCl 0.2%, kemudian dihomogenkan menggunakan vortex dan
didiamkan selama lima menit. Sampel disentrifugasi pada kecepatan 8 000 rpm
selama lima menit dan bagian supernatan dibuang. Endapan sampel ditambahkan
dengan 10 µl Proteinase-K (5mg/ml), 350 µl 1 x STE dan 40 µl SDS 10%,
kemudian diinkubasi pada suhu 55 oC selama dua jam. Larutan yang telah
diinkubasi ditambahkan 40 µl NaCl 5 M, 400 µl phenol dan 400 µl CIAA
kemudian dikocok perlahan pada suhu ruang selama satu jam. Tahap selanjutnya
adalah larutan disentrifugasi dengan kecepatan 12 000 rpm selama lima menit
sehingga terbentuk fase DNA. Fase DNA yang terbentuk diambil sebanyak 40 µl
dan dipindahkan ke tabung 1.5 ml baru, ditambahkan dengan 40 µl NaCl 5 M dan
800 µl EtOH 96%, dihomogenkan, kemudian diistirahatkan overnight pada suhu
-20 oC. Sampel DNA disentrifugasi pada kecepatan 12 000 rpm selama lima
menit dan supernatan yang terbentuk dibuang, kemudian endapan ditiriskan
sampai kering dan dilarutkan dalam 100 µl buffer TE 80%.
Amplifikasi DNA
Sampel DNA hasil ekstraksi sebanyak 1 µl dan pereaksi amplifikasi DNA
yang terdiri dari 10.95 µl DW, 0.2 µl primer, 0.05 µl Taq polymerase, 1.5 µl
buffer, 0.3 µl dNTPs dan 1 µl MgCl2 dimasukkan ke dalam tabung PCR kemudian
dihomogenkan. Amplifikasi DNA berlangsung di dalam mesin PCR Applied
Biosystems dengan kondisi suhu predenaturasi 95 oC selama lima menit, 35 siklus
untuk tahapan denaturasi 95 oC selama 10 detik, annealing pada suhu 60 oC
selama 20 detik, dan elongasi pada suhu 72 oC selama 30 detik dan elongasi akhir
pada suhu 72 oC selama lima menit dalam satu siklus.
Produk PCR
dielektroforesis menggunakan agarose 1.5%. Posisi penempelan primer pada
amplifikasi DNA dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1
Posisi penempelan primer pada fragmen gen OPN dan situs
pemotongan enzim BsrI
4
Genotyping Gen OPN
Produk PCR sebanyak 5 μl ditambahkan dengan 1 μl DW, 0.3 μl enzim
restriksi BsrI, dan 0.7 μl buffer B, kemudian diinkubasi di dalam inkubator pada
suhu 65 °C selama 16 jam (overnight). Elektroforesis produk PCR-RFLP diawali
dengan membuat gel agarose 2% yang dibuat dengan cara melarutkan 0.6 g
agarose dalam larutan 0.5 x TBE sebanyak 30 ml kemudian dipanaskan dalam
microwave selama lima menit, dikocok menggunakan magnetic stirrer dan
ditambahkan 2.5 μl EtBr. Larutan dalam bentuk cair dituangkan ke dalam
pencetak gel, sisir ditempatkan di dekat tepian gel dan dibiarkan hingga mengeras.
Sisir dicabut setelah gel mengeras sehingga terbentuk sumur-sumur. Tahap
selanjutnya gel ditempatkan ke dalam gel tray elektroforesis yang sudah berisi
larutan buffer. Produk PCR-RFLP sebanyak 5 μl dicampur dengan 1 μl loading
dye kemudian dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel. Marker DNA 100 bp
sebanyak 2 μl ditaruh ke dalam sumur paling kiri sebagai penanda. Gel dialiri
listrik 100 volt selama 30-45 menit. Molekul DNA yang bermuatan negatif pada
pH netral akan bergerak ke arah positif (anode). Setelah elektroforesis selesai, gel
agarose diambil untuk dilihat panjang pita DNA dengan menggunakan sinar
ultraviolet dalam mesin UV Transiluminator.
Pita-pita DNA yang muncul dibandingkan dengan marker untuk diketahui
panjang fragmennya dan jumlah pita DNA dari setiap sampel dibandingkan untuk
menentukan genotipe pita DNA. Alel T tidak memiliki titik potong dan hanya
menunjukkan satu fragmen yang panjangnya sama dengan produk PCR yaitu 290
bp. Alel C memiliki titik potong enzim BsrI (ACTGG|N) dan menunjukkan
adanya dua fragmen yang masing-masing memiliki panjang 200 bp dan 90 bp.
Sekuens Fragmen Gen OPN Intron 4
Sekuens fragmen gen OPN intron 4 dilakukan pada individu sapi bali
yang bergenotipe TT dengan jumlah dua sampel. Primer yang digunakan untuk
sekuens fragmen gen OPN hanya primer forward. Sekuensing gen OPN
dilakukan dengan menggunakan mesin sekuenser (ABI Prims 3100-Avant Genetic
Analyzer) di perusahaan sekuensing 1st Base, Selangor, Malaysia.
Analisis Data
Frekuensi Alel Gen OPN
Keragaman alel yang terdapat pada populasi sapi bali di BPTU sapi bali,
Pulau Bali dianalisis dengan pendekatan frekuensi alel. Frekuensi alel adalah
rasio suatu alel terhadap keseluruhan alel pada suatu lokus dalam populasi.
Frekuensi alel (
gen OPN yang dihitung berdasarkan rumus sebagai berikut
(Nei dan Kumar 2000):
2nii nij
2
Keterangan :
= frekuensi alel ke-i
nii
= jumlah individu bergenotipe ii
nij
= jumlah individu bergenotipe ij
N
= jumlah individu sampel
5
Sekuens Fragmen Gen OPN Intron 4
Hasil sekuens dianalisis dengan program BioEdit (Hall 1999). Selanjutnya
untuk mengetahui kesamaan dengan gen OPN yang terdapat di GenBank
dianalisis menggunakan metode BLAST (www.ncbi.nhl.nih.gov./BLAST). Ada
tidaknya mutasi pada sekuens fragmen gen OPN intron 4 dilakukan analisis
dengan menggunakan program Molecular Evolutionary Genetic Analysis
(MEGA5) dengan metode ClustalW (Tamura et al. 2011).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Amplifikasi Gen Osteopontin (OPN)
Amplifikasi fragmen gen OPN pada sapi bali dengan menggunakan mesin
thermocycler pada suhu annealing 60 oC selama 20 detik menghasilkan panjang
produk PCR 290 base pair (bp) (Gambar 2). Sebanyak 100 sampel sapi bali
berhasil diamplifikasi dengan tingkat keberhasilan 100%.
Gambar 2
Hasil amplifikasi gen osteopontin pada gel
agarose 1.5%. Keterangan: M = marker DNA
100 bp. Sampel 1-16 = produk amplifikasi
gen OPN.
Berdasarkan hasil amplifikasi yang dilakukan oleh Leonard et al. (2005)
bahwa kondisi annealing fragmen gen OPN|BsrI berlangsung pada suhu
touchdown 63 oC ke 50 oC selama 45 detik. Suhu annealing adalah suhu
optimum untuk berlangsungnya penempelan primer sesuai dengan sekuens DNA
komplementer yang akan diperbanyak selama proses amplifikasi DNA
berlangsung. Penelitian ini menggunakan suhu penempelan pasangan primer
yang berbeda dengan suhu yang disarankan oleh Leonard et al. (2005). Hal
tersebut disebabkan oleh perbedaan kondisi mesin PCR dan campuran komponen
pereaksi PCR. Viljoen et al. (2005) menyatakan bahwa suhu annealing berkisar
antara 55-72 oC, selain itu suhu optimal annealing salah satunya bergantung pada
konsentrasi MgCl2. Pelt-Verkuil et al. (2008) menyatakan bahwa waktu
annealing yang dibutuhkan supaya primer dapat berkomplemen dan menempel
dengan targetnya bergantung pada kapasitas pemanasan mesin thermocycler yang
digunakan, volume campuran PCR serta konsentrasi primer dan gen target.
6
Identifikasi Genotipe Gen Osteopontin (OPN)
Hasil pemotongan dengan enzim BsrI terhadap fragmen gen OPN sapi bali
diperoleh hanya satu macam genotipe yaitu genotipe TT (satu pita) dengan
panjang 290 bp (Gambar 3). Individu-individu sapi bali yang tidak dapat
dipotong fragmen gen OPN-nya berarti mengalami mutasi pada situs pemotong
sekuens enzim BsrI.
Berdasarkan hasil penelitian gen OPN dengan situs polimorfik intron 4 pada
sapi FH oleh Leonard et al. (2005) diperoleh tiga macam genotipe yaitu genotipe
TT, genotipe CC (dua pita), dan genotipe CT (tiga pita). Ketiga genotipe tersebut
juga diperoleh dari hasil penelitian Boleckova et al. (2012) pada bangsa sapi
Czech Fleckvieh dengan proporsi genotipe CC, CT, dan TT masing-masing
sebesar 0.04, 0.28, dan 0.68. Khatib et al. (2009) menyatakan bahwa genotipe TT
memiliki angka fertilitas yang lebih tinggi (70%) dibandingkan dengan genotipe
CC (62%) pada embrio in vitro fertilization (IVF) sapi.
Gambar 3 Hasil PCR-RFLP fragmen gen osteopontin
(OPN|BsrI) pada gel agarose 2%. Keterangan:
M = marker DNA 100 bp, 1-16 = sampel sapi
bali.
Frekuensi Alel Gen Osteopontin (OPN)
Hasil analisis frekuensi alel gen OPN pada sapi bali menunjukkan bahwa
hanya ditemukan satu macam alel yaitu alel T (100%) dan tidak ditemukan alel C.
Gen OPN pada sapi bali bersifat seragam atau monomorfik. Nei (1987)
menyatakan bahwa suatu alel tergolong polimorfik jika memiliki frekuensi alel
sama dengan atau kurang dari 0.99. Frekuensi alel sapi bali dan beberapa bangsa
sapi lainnya disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1 Frekuensi alel gen OPN pada sapi bali dan beberapa bangsa sapi
Bangsa
Jumlah sampel
Sapi bali
100
FH
214
27
Czech Fleckvieh
505
Frekuensi Alel
C
T
0.00
1.00
0.49
0.51
0.57
0.18
0.43
0.82
Sumber
Hasil penelitian
Leonard et al. (2005)
Anggraeni et al. (2012)
Boleckova et al. (2012)
7
Keragaman genetik atau polimorfisme genetik adalah terdapatnya lebih dari
satu bentuk atau macam genotipe di dalam populasi. Sumber keragaman genetik
disebabkan oleh adanya pengulangan urutan sekuen, insersi, delesi dan
rekombinasi di dalam runutan DNA antar individu, kelompok atau suatu populasi
(Nei dan Kumar 2000). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa gen OPN|BsrI
pada sapi bali bersifat monomorfik karena hanya ditemukan satu tipe alel yaitu
alel T.
Fenomena monomorfisme pada sapi bali juga ditemukan pada beberapa
hasil penelitian yaitu gen GHR|AluI (Zulkharnaim et al. 2010) dan gen GH MspI
dan AluI (Jakaria et al. 2009; Jakaria dan Noor 2011). Program nasional
pemurnian dan peningkatan mutu genetik ternak telah dilakukan pada sapi bali
sejak tahun 1976 di Pulau Bali berdasarkan Surat Keputusan (SK) Menteri
Pertanian nomor 776/Kpts/Um/12/1976. Kegiatan yang dilakukan oleh Proyek
Pengembangan dan Pembibitan sapi bali (P3Bali) adalah pemuliaan sapi bali
dengan melakukan seleksi dalam bangsa sehingga diperoleh bibit sapi bali yang
bermutu baik (Soehadji 1990). Pemusatan dan pemurnian genetik sapi bali di
daerah tertentu dalam jangka waktu yang cukup panjang menyebabkan terjadinya
silang dalam. Noor (2008) menyatakan bahwa silang dalam adalah salah satu
bentuk isolasi secara genetik karena pada suatu populasi yang terisolasi akan
menyebabkan keterbatasan pilihan dalam proses perkawinan. Konservasi di
BPTU sapi bali berkaitan dengan pewarisan sifat dari tetua yang menyumbangkan
alel homozigot kepada keturunannya sehingga keragaman genotipe pada populasi
bersifat monomorfik.
Homologi dan Deteksi Mutasi Gen Osteopontin (OPN)
Hasil analisis sekuens fragmen gen OPN|BsrI menunjukkan bahwa sapi bali
memiliki kesamaan yang tinggi terhadap sekuens gen OPN Bos taurus yang
terdapat di GenBank (kode akses GU143284) dengan tingkat kesamaan
(homologi) yang tinggi yaitu sebesar 100%. Selain itu, ditemukan bahwa terjadi
mutasi antara basa C dan T pada sekuens gen OPN intron 4 (Gambar 4, Lampiran
2).
Mutasi transisi basa sitosin (C) menjadi timin (T) menyebabkan perubahan
sekuens situs pemotong enzim BsrI ACTGG|N menjadi ATTGG|N sehingga
enzim BsrI tidak dapat mengenali situs pemotongnya dan menghasilkan satu pita
pada 290 bp. Mutasi transisi adalah mutasi titik yang disebabkan oleh perubahan
basa purin menjadi purin (AG, GA) dan basa pirimidin menjadi basa
pirimidin (CT, TC) (Brown 2002). Mutasi antara basa pirimidin sitosin
dengan timin pada sekuens gen OPN intron 4 Bos taurus berdasarkan GenBank
(kode akses GU143824) sesuai dengan mutasi yang terjadi pada seluruh sapi bali
di penelitian ini.
Gen OPN berada pada daerah non-coding intron 4 yang akan hilang pada
saat transkripsi, dengan demikian mutasi yang terjadi pada bagian intron tidak
berpengaruh terhadap ekspresi dan fungsi gen yang disebut silent mutation
(Brown 2002). Deteksi single nucleotide polymorphism (SNP) gen OPN telah
dilaporkan pada beberapa penelitian seperti Pareek et al. (2008) yang menyatakan
bahwa OPN C>T SNP terdapat pada posisi basa ke-8514 gen OPN dan dapat
8
dijadikan penciri sifat bobot badan dan produksi susu pada sapi Polish HF dan
Polish Red, White et al. (2007) yang menyatakan bahwa terdapat alel fungsional
pada gen OPN yang mempengaruhi bobot sapih dan bobot lahir sapi, dan Leonard
et al. (2005) menyatakan bahwa alel C berhubungan dengan peningkatan
kandungan protein dan lemak dalam susu pada sapi FH.
Gambar 4 Hasil alignment nukleotida sekuens gen OPN|BsrI intron 4 sapi bali
dengan GenBank Bos taurus (kode akses GU143824)
Osteopontin pertama kali dilaporkan terdapat pada jaringan tulang
termineralisasi dan protein OPN yang disintesis oleh sel sertoli pada tubulus
seminiferus berpotensi terlibat pada adhesi dan migrasi sel (Moura 2005). Khatib
et al. (2009) menyatakan bahwa OPN berperan dalam proses binding antara
sperma dengan sel telur dan tahap awal perkembangan embrionik, selain itu OPN
berpengaruh terhadap kapasitasi sperma in vitro (Monaco et al. 2009). Williams
et al. (2011) menyatakan bahwa SNPs pada gen OPN berpotensi sebagai penciri
fertilitas sapi pejantan. Struktur gen OPN yang telah dimodifikasi berdasarkan
Pareek et al. (2008) dapat dilihat pada Gambar 5.
Gambar 5 Rekonstruksi struktur gen OPN pada sapi dengan SNP (single nuclotide
polymorphism) pada intron 4
9
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Gen osteopontin (OPN|BsrI) intron 4 pada sapi bali diperoleh hanya satu
macam genotipe dan alel yaitu genotipe TT dan alel T (100%). Mutasi yang
terjadi pada sapi bali adalah mutasi antara basa sitosin (C) dengan timin (T). Gen
OPN intron 4 pada sapi bali yang terdapat di BPTU sapi bali, Pulau Bali bersifat
monomorfik.
Saran
Perlu dilakukan penelitian pada sampel sapi bali yang terdapat di daerah
pengembangan sapi bali lainnya di Indonesia. Selain itu, diperlukan analisis gengen lain yang terkait dengan sifat reproduksi.
DAFTAR PUSTAKA
Anggraeni A, Hasinah H, Arta SA, Tiesnamurti B, Misrianti R, Andreas E. 2012.
Genetic variation of the IGF1 and OPN genes in Holstein-Friesian dairy cattle
of historical and non-historical twins. [Editor tidak diketahui]. 2nd
International Seminar on Animal Industry[Internet]; 2012 Jan 5-6; Jakarta,
Indonesia. Jakarta (ID): [penerbit tidak diketahui] hlm 91-96; [diunduh 2013
Apr 5]. Tersedia pada: http//www.repository.ipb.ac.id.
Boleckova J, Matejickova J, Stipkova M, Kyselova J, Barton L. 2012. The
association of five polymorphisms with milk production traits in Czech
Fleckvieh cattle. Czech J Anim Sci. 57(2): 45–53.
Brown TA. 2002. Genomes 3. 3rd ed. New York (US): Garland Sci.
[DGLS] Directorate Generale of Livestock Services. 2003. National Report on
Animal Genetic Resources in Indonesia. Directorate Generale of Livestock
Services, Directorate of Livestock Breeding (ID).
Hall, TA. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor
and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl Acids Symp. Ser. 41: 9598.
Jakaria, Noor RR, Martojo H, Duryadi D, Tappa B. 2009. Identification of
growth hormone (Gh) gene MspI and AluI loci polymorphism in beef cattles.
The 1st International Seminar on Animal Industry. Bogor, Indonesia.
Jakaria, Noor RR. 2011. Analysis on Alu-I growth hormone (GH Alu-I) gene in
bali cattle. J. Indones Trop Anim Agric. 1: 1-6.
Khatib H, Huang W, Wang X, Tran AH, Bindrim AB, Schutzkus V, Monson RL,
Yandell BS. 2009. Single gene and gene interaction effects on fertilization
and embryonic survival rates in cattle. J Dairy Sci. 92: 2238-22447.
doi:10.3168/jds.2008-1767.
10
Leonard S, Khatib H, Schutzkus V, Chang YM, Maltecca C. 2005. Effects of the
osteopontin gene variants on milk production traits in dairy cattle. J Dairy Sci.
88: 4083-4086.
Monaco E, Gasparrini B, Boccia L, De Rosa A, Attanasio L, Zicarelli L, Killian G.
2009. Effect of osteopontin (OPN) on in vitro embryo development in cattle. J
Theriogenology. 71: 450-457. doi:10.1016/j.theriogenology.2008.08.012.
Moura AA. 2005. Seminal plasma proteins and fertility indexes in the bull: the
case for osteopontin. Anim Reprod. 2(1): 3-10.
Nei M. 1987. Molecular Evolutionary Genetics. New York (US): Columbia
Univ Pr.
Nei M, Kumar S. 2000. Molecular Evolution and Phylogenetics. New York
(US): Oxford Univ Pr.
Noor RR. 2008. Genetika Ternak. Jakarta (ID): Penebar Swadaya.
Pareek CS, Czarnik U, Pierzchala M, Zwierzchowski L. 2008. An association
between the C>T single nucleotide polymorphism within intron IV of
osteopontin encoding gene (SPP1) and body weight of growing Polish
Holstein-Friesian cattle. J Anim Sci. 26(4): 251-257.
Pelt-Verkuil, van E, Belkum van A, Hays JP. 2008. Principles and Technical
Aspects of PCR Amplification. Netherlands (NL): Springer.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. USA (US): CSH Laboratory Pr.
Soehadji. 1990. Kebijaksanaan pemuliaan ternak (breeding policy) khususnya
sapi bali, dalam pembangunan peternakan. Seminar Nasional Sapi Bali; 1990
Sep 20-22; Denpasar, Indonesia. hlm A1-A9.
Talib C. 2002. Sapi bali di daerah sumber bibit dan peluang pengembangannya.
Wartazoa 12(3): 100-107.
Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. 2011. MEGA5:
Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood,
Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular
Biology and Evolution.
Viljoen GJ, Nel LH, Crowther JR. 2005. Molecular Diagnosis PCR Handbook.
Netherlands (NL): Springer.
White SN, Casas E, Allan MF, Keele JW, Snelling WM, Wheeler TL,Shackelford
SD, Koohmaraie M, Smith TPL. 2007. Evaluation in beef cattle of six
deoxyribonucleic acid markers developed for dairy traits reveals an osteopontin
polymorphism associated with postweaning growth. J Anim Sci. 85: 1-10.
Williams CL, Lester TD, Rowe MP, Rorie RW. 2011. Effects of osteopontin
single nucleotide polymorphisms on bull semen quality. Ark Anim Sci. 17-21.
Zulkharnaim, Jakaria, Noor RR. 2010. Identifikasi keragaman genetik gen
reseptor hormon pertumbuhan (GHR|Alu I) pada sapi bali. Media Petern.
33(2): 81-87.
11
LAMPIRAN
Lampiran 1 Sekuens gen osteopontin (OPN) yang diakses di GenBank kode akses
GU143824
GenBank:
LOCUS
DEFINITION
ACCESSION
VERSION
KEYWORDS .
SOURCE
ORGANISM
GU143824.1
GU143824 291 bp DNA linear MAM 08-NOV-2010
Bos taurus osteopontin gene, intron 4.
GU143824
GU143824.1 GI:310947851
Bos taurus (cattle)
Bos taurus
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata;
Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Laurasiatheria;
Cetartiodactyla; Ruminantia; Pecora; Bovidae; Bovinae;
Bos.
REFERENCE
1 (bases 1 to 291)
AUTHORS
Wang,J. and Lai,S.
TITLE
Single nucleotide polymorphisms of osteopontin gene in
Chinese cattle (Bos taurus), buffalo (Bubalus bubalis) and
yak (Bos grunniens) breeds
JOURNAL
Unpublished
REFERENCE 2
(bases 1 to 291)
AUTHORS
Lai,S.
TITLE
Direct Submission
JOURNAL
Submitted (26-OCT-2009) College of Animal Science and
Technology, Sichuan Agricultural University, Road
XinKang 46#, Ya'an, Sichuan 625014, China
FEATURES
Location/Qualifiers
source
1..291
/organism="Bos taurus"
/mol_type="genomic DNA"
/db_xref="taxon:9913
"
/chromosome="6"
/PCR_primers="fwd_seq: gcaaatcagaagtgtgatagac, rev_seq:
ccaagccaaacgtatgagtt"
/note="breed: Chinese Holstein"
gene
291
/gene="osteopontin"
intron
291
/gene="osteopontin"
/number=4
variation
198
/gene="osteopontin"
/replace="c"
12
ORIGIN
1 gcaaatcaga agtgtgatag acattaactg agctatagtt tctacacatg gataagagag
61 tcaccttttg attatccagg ctaataggga ggtgatttta gttttggggg tgtgcattaa
121 tacatggatt ctctgatccc ctgagaattt tcatttcaaa tagaaaaggt agtctcacaa
181 ttatgtatct gtatttattg gatcattgaa atttggtaaa ttagtgttta ttatgaacaa
241 ggaaaaacag tgtcattgat acaaatatta taactcatac gtttggcttg g
//
Lampiran 2 Hasil BLAST nukleotida sekuens gen OPN sapi bali dengan sekuens
GenBank kode akses GU143824
Lampiran 3 Hasil analisis sekuens fragmen gen OPN pada sapi bali
13
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor, 25 Februari 1991. Penulis adalah anak ketiga
dari pasangan I Nyoman Arnaya dan Putu Agustini Eliyati. Penulis menamatkan
pendidikan di SMA Negeri 1 Bogor pada tahun 2009 dan pada tahun yang sama
penulis diterima menjadi mahasiswa Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi
Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor melalui jalur UTMI.
Semasa kuliah, penulis aktif sebagai pengurus HIMAPROTER periode
2010-2012 dan KMHD periode 2009-2010. Penulis juga berperan sebagai asisten
praktikum mata kuliah Biologi Dasar pada tahun 2012. Selain itu penulis diberi
kepercayaan sebagai ketua Program Kreatifitas Mahasiswa bidang gagasan tertulis
pada tahun 2012.
PADA SAPI BALI DENGAN METODE PCR-RFLP
KOMANG ALIT PARAMITASARI
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN
FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Alel Monomorfik Gen
Osteopontin (OPN|BsrI) pada Sapi Bali dengan Metode PCR-RFLP adalah benar
karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Mei 2013
Komang Alit Paramitasari
NIM D14090089
ABSTRAK
KOMANG ALIT PARAMITASARI. Alel Monomorfik Gen Osteopontin
(OPN|BsrI) pada Sapi Bali dengan Metode PCR-RFLP. Dibimbing oleh
JAKARIA dan CECE SUMANTRI.
Bangsa sapi bali sebagai sumberdaya genetik ternak asli Indonesia
memiliki keunggulan, salah satunya adalah daya reproduksi yang tinggi. Gen
osteopontin (OPN) merupakan anggota dari alur POU class 1 homeobox 1
(POU1F1) yang berkaitan dengan sifat reproduksi. Penelitian ini bertujuan untuk
mengidentifikasi ada tidaknya polimorfisme gen osteopontin (OPN) sebagai
pengontrol sifat reproduksi pada sapi bali di Pulau Bali dengan menggunakan
metode PCR-RFLP. Sampel sapi bali sebanyak 100 sampel yang berasal dari
BPTU sapi bali dideteksi keberadaan keragaman genetiknya pada gen OPN
menggunakan enzim restriksi BsrI yang memotong sekuens basa ACTGG|N.
Amplifikasi gen OPN menghasilkan fragmen dengan panjang 290 bp yang
terletak pada intron 4 dengan suhu annealing 60 oC selama 20 detik. Hasil
analisis PCR-RFLP menunjukkan sapi bali yang dianalisis memiliki alel
monomorfik T adalah 100%. Hasil sekuens fragmen gen OPN intron 4
menunjukkan terdapat mutasi antara basa sitosin (C) dengan timin (T).
Kata kunci: gen osteopontin (OPN), PCR-RFLP, sapi bali
ABSTRACT
KOMANG ALIT PARAMITASARI. Monomorphic Allele Osteopontin Gene
(OPN|BsrI) in Bali Cattle Using PCR-RFLP Method. Supervised by JAKARIA
and CECE SUMANTRI.
Bali cattle as one of Indonesian animal genetic resources has advantages,
one of which is its high reproductive ability. Osteopontin gene (OPN) is a
member of POU class 1 homeobox 1 (POU1F1) related to reproductive traits.
The aim of this research was to identify the existence of OPN gene
polymorphisms in bali cattle at Bali Island using the PCR-RFLP method. A total
of 100 bali cattle from BPTU bali cattle were identified using BsrI restriction
enzyme that cuts the sequence of ACTGG|N bases. OPN gene amplification was
performed with annealing temperature of 60 oC for 20 seconds resulting in a
fragment with the length of 290 bp which is located at intron 4. The results of
PCR-RFLP analysis indicated that the analyzed bali cattles which have
monomorphic T allele was 100%. OPN gene fragment intron 4 sequences showed
that there was a mutation between cytosine (C) base with thymine (T).
Keywords: bali cattle, osteopontin gene (OPN), PCR-RFLP
ALEL MONOMORFIK GEN OSTEOPONTIN (OPN|BsrI)
PADA SAPI BALI DENGAN METODE PCR-RFLP
KOMANG ALIT PARAMITASARI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Peternakan
pada
Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN
FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi : Alel Monomorfik Gen Osteopontin (OPN|BsrI) pada Sapi Bali
dengan Metode PCR-RFLP
Nama
: Komang Alit Paramitasari
NIM
: D14090089
Disetujui oleh
Dr Jakaria, SPt MSi
Pembimbing I
Prof Dr Ir Cece Sumantri, MAgr Sc
Pembimbing II
Diketahui oleh
Prof Dr Ir Cece Sumantri, MAgr Sc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan atas segala karunia-Nya
sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam
penelitian yang dilaksanakan pada bulan Desember 2012 sampai Maret 2013 ini
adalah gen reproduksi pada sapi bali, dengan judul Alel Monomorfik Gen
Osteopontin (OPN|BsrI) pada Sapi Bali dengan Metode PCR-RFLP.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr Jakaria, SPt MSi selaku
pembimbing akademik dan pembimbing skripsi, Prof Dr Ir Cece Sumantri,
MAgrSc selaku pembimbing skripsi, Ir Rini H. Mulyono, MSi dan Dr Iwan
Prihantoro, SPt MSi selaku penguji ujian akhir, dan Dr Ir Sri Darwati, MSi selaku
perwakilan departemen dalam ujian akhir sarjana penulis. Ungkapan terima kasih
juga disampaikan kepada kedua orang tua, I Nyoman Arnaya dan Putu Agustini
Eliyati, kedua kakak, Putu Indira Pradnyawati dan Kadek Noni Lokasari, serta
seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya. Di samping itu, penulis
sampaikan terima kasih kepada I Putu Arimbawa Pande, Kak Eryk, Kak Ferdy,
Kak Irine, Kak Isyana, Rany Pratiwi, Roaslein Putri, Opak, Adit, Eja, Lusiana,
Tasya, dan teman-teman laboratorium genetika molekuler ternak, serta keluarga
besar Golden Ranch IPTP 46 atas segala dukungannya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Mei 2013
Komang Alit Paramitasari
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
METODE
Lokasi dan Waktu Penelitian
Bahan
Alat
Prosedur
Ekstraksi DNA
Amplifikasi DNA
Genotyping Gen OPN
Sekuens Fragmen Gen OPN Intron 4
Analisis Data
Frekuensi Alel Gen OPN
Sekuens Fragmen Gen OPN Intron 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Amplifikasi Gen Osteopontin (OPN)
Identifikasi Genotipe Gen Osteopontin (OPN)
Frekuensi Alel Gen Osteopontin (OPN)
Homologi dan Deteksi Mutasi Gen Osteopontin (OPN)
SIMPULAN DAN SARAN
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
viii
viii
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
4
4
4
4
5
5
5
6
6
7
9
9
11
DAFTAR GAMBAR
1 Posisi penempelan primer pada fragmen gen OPN dan situs
pemotongan enzim BsrI
2 Hasil amplifikasi gen osteopontin pada gel agarose 1.5%
3 Hasil PCR-RFLP fragmen gen osteopontin (OPN|BsrI) pada gel
agarose 2%
4 Hasil alignment nukleotida sekuens gen OPN|BsrI intron 4 sapi bali
dengan GenBank Bos taurus (kode akses GU143824)
5 Rekonstruksi struktur gen OPN pada sapi dengan SNP (single nuclotide
polymorphism) pada intron 4
3
5
6
8
8
DAFTAR LAMPIRAN
1 Sekuens gen osteopontin (OPN) yang diakses di GenBank kode akses
GU143824
2 Hasil BLAST nukleotida sekuens gen OPN sapi bali dengan sekuens
GenBank kode akses GU143824
3 Hasil analisis sekuens fragmen gen OPN pada sapi bali
11
12
12
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Sapi bali (Bos javanicus) merupakan salah satu ternak asli Indonesia hasil
domestikasi banteng (Bibos banteng) (Talib 2002) yang merupakan sumberdaya
genetik ternak yang tidak ternilai harganya dan telah diakui oleh FAO sebagai
salah satu bangsa ternak di dunia (DGLS 2003). Sapi bali memiliki beberapa
keunggulan yaitu mampu beradaptasi terhadap lingkungan marginal, selain itu
memiliki persentase karkas tinggi (56%-57%) serta angka kelahiran tinggi
(69%-83%) (Talib 2002). Sapi bali memiliki daya reproduksi yang tinggi
dibandingkan dengan bangsa-bangsa sapi lain yang dikembangkan di Indonesia.
Oleh karena itu, sapi bali merupakan bangsa sapi yang potensial untuk
dikembangkan dan dimanfaatkan untuk memenuhi kebutuhan daging secara
nasional.
Upaya peningkatan mutu genetik ternak sapi bali dapat dilakukan melalui
seleksi yaitu mempertahankan sifat-sifat unggul yang terdapat pada sapi bali
seperti kemampuan sifat reproduksi tinggi. Seleksi sifat reproduksi sapi bali pada
tingkat molekuler DNA dapat dilakukan dengan cara menganalisis gen-gen utama
pengontrol sifat reproduksi.
Khatib et al. (2009) menyatakan bahwa sifat reproduksi dikontrol oleh
beberapa gen, salah satunya adalah gen osteopontin (OPN). Gen osteopontin
(OPN) atau sering disebut sebagai secreted phospoprotein 1 (SPP1) pada sapi
terletak pada kromosom 6 (Leonard et al. 2005) yang terdiri atas tujuh exon dan
enam intron dengan ukuran sekitar 7 000 basa dari total genom (Pareek et al.
2008). Keragaman gen OPN di intron 4 telah ditemukan oleh beberapa hasil
penelitian seperti sifat produksi susu pada sapi FH (Leonard et al. 2005), sifat
pertumbuhan pasca sapih pada sapi pedaging (White et al. 2007), sifat fertilitas
pada embrio sapi (Khatib et al. 2009), dan sifat kembar pada sapi FH (Anggraeni
et al. 2012). Keragaman atau polimorfisme gen OPN pada sapi bali dapat
diketahui dengan menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction-Restriction
Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP).
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi ada tidaknya polimorfisme
gen osteopontin (OPN) pada sapi bali di Pulau Bali dengan menggunakan metode
PCR-RFLP. Selain itu, tujuan penelitian ini adalah untuk mendeteksi ada
tidaknya mutasi pada situs enzim pemotong BsrI gen OPN intron 4.
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini meliputi analisis pada 100 ekor sapi bali yang terdapat di
Balai Pembibitan Ternak Unggul (BPTU) sapi bali, Pulau Bali. Keragaman gen
OPN dianalisis menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction-Restriction
Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP). Ada tidaknya mutasi di fragmen
2
gen OPN intron 4 dianalisis melalui teknik sequencer. Analisis data dilakukan
melalui pendekatan frekuensi alel dan analisis Basic Local Alignment Search
Tools (BLAST) nukleotida.
METODE
Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak,
Bagian Pemuliaan dan Genetika, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor.
Penelitian ini berlangsung dari bulan Desember 2012 sampai dengan Maret 2013.
Bahan
Sampel DNA yang dianalisis berasal dari sampel darah 100 ekor sapi bali
di BPTU Bali yang merupakan koleksi Laboratorium Genetika Molekuler Ternak.
Bahan-bahan yang digunakan untuk ekstraksi DNA adalah NaCl 0.2%, Sodium
Dodecyl Sulfat (SDS) 10%, enzim Proteinase-K (5 mg/ml), 1 x STE (NaCl 5 M,
tris HCl 2 M, EDTA 0.2 M), chlorofom isoamil alkohol (CIAA), phenol, EtOH
96%, EtOH 70%, dan buffer Tris EDTA (TE) 80%. Bahan yang digunakan untuk
amplifikasi, elektroforesis dan analisis RFLP adalah sampel DNA hasil ekstraksi,
destilation water (DW), 10 x buffer, MgCl2, pasangan primer forward dan reverse
fragmen gen OPN, enzim Taq polymerase (Fermentas), deoxy Nucleotide
Triphospat (dNTPs), produk PCR, serbuk agarose, 0.5 x Tris-Borat EDTA (TBE),
Ethidium Bromide (EtBr), loading dye (0.01% Xylene Cyanol, 0.01% Bromthymol
blue dan 50% gliserol), marker 100 bp, enzim restriksi BsrI, dan buffer B.
Bahan yang digunakan untuk analisis sekuensing adalah produk PCR dan
primer forward fragmen gen OPN.
Primer yang digunakan untuk
mengamplifikasi gen osteopontin (OPN|BsrI) berdasarkan Leonard et al. (2005)
adalah forward: 5´-GCAAAT-CAGAAGTGTGATAGAC-3´ dan reverse: 5´
CCAAGCCAAACGTATGAGTT-3´.
Alat
Alat-alat yang digunakan untuk ekstraksi DNA, amplifikasi dan analisis
penciri RFLP adalah tabung eppendorf 1.5 ml, satu set mikro pipet, tip pipet,
vortex, inkubator, rotary mixer, microsentrifuge, refrigerator, freezer, mesin PCR
Applied Biosystems, tabung PCR, dan tabung RFLP. Alat yang digunakan dalam
prosedur elektroforesis adalah satu set gel tray, magnetic stirrer, microwave,
power supply electrophoresis 100 volt, dan UV Transiluminator.
3
Prosedur
Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA dilakukan berdasarkan metode Sambrook et al. (1989)
yang dimodifikasi. Sampel darah diambil sebanyak 200 µl dan ditambahkan
dengan 1 000 µl NaCl 0.2%, kemudian dihomogenkan menggunakan vortex dan
didiamkan selama lima menit. Sampel disentrifugasi pada kecepatan 8 000 rpm
selama lima menit dan bagian supernatan dibuang. Endapan sampel ditambahkan
dengan 10 µl Proteinase-K (5mg/ml), 350 µl 1 x STE dan 40 µl SDS 10%,
kemudian diinkubasi pada suhu 55 oC selama dua jam. Larutan yang telah
diinkubasi ditambahkan 40 µl NaCl 5 M, 400 µl phenol dan 400 µl CIAA
kemudian dikocok perlahan pada suhu ruang selama satu jam. Tahap selanjutnya
adalah larutan disentrifugasi dengan kecepatan 12 000 rpm selama lima menit
sehingga terbentuk fase DNA. Fase DNA yang terbentuk diambil sebanyak 40 µl
dan dipindahkan ke tabung 1.5 ml baru, ditambahkan dengan 40 µl NaCl 5 M dan
800 µl EtOH 96%, dihomogenkan, kemudian diistirahatkan overnight pada suhu
-20 oC. Sampel DNA disentrifugasi pada kecepatan 12 000 rpm selama lima
menit dan supernatan yang terbentuk dibuang, kemudian endapan ditiriskan
sampai kering dan dilarutkan dalam 100 µl buffer TE 80%.
Amplifikasi DNA
Sampel DNA hasil ekstraksi sebanyak 1 µl dan pereaksi amplifikasi DNA
yang terdiri dari 10.95 µl DW, 0.2 µl primer, 0.05 µl Taq polymerase, 1.5 µl
buffer, 0.3 µl dNTPs dan 1 µl MgCl2 dimasukkan ke dalam tabung PCR kemudian
dihomogenkan. Amplifikasi DNA berlangsung di dalam mesin PCR Applied
Biosystems dengan kondisi suhu predenaturasi 95 oC selama lima menit, 35 siklus
untuk tahapan denaturasi 95 oC selama 10 detik, annealing pada suhu 60 oC
selama 20 detik, dan elongasi pada suhu 72 oC selama 30 detik dan elongasi akhir
pada suhu 72 oC selama lima menit dalam satu siklus.
Produk PCR
dielektroforesis menggunakan agarose 1.5%. Posisi penempelan primer pada
amplifikasi DNA dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1
Posisi penempelan primer pada fragmen gen OPN dan situs
pemotongan enzim BsrI
4
Genotyping Gen OPN
Produk PCR sebanyak 5 μl ditambahkan dengan 1 μl DW, 0.3 μl enzim
restriksi BsrI, dan 0.7 μl buffer B, kemudian diinkubasi di dalam inkubator pada
suhu 65 °C selama 16 jam (overnight). Elektroforesis produk PCR-RFLP diawali
dengan membuat gel agarose 2% yang dibuat dengan cara melarutkan 0.6 g
agarose dalam larutan 0.5 x TBE sebanyak 30 ml kemudian dipanaskan dalam
microwave selama lima menit, dikocok menggunakan magnetic stirrer dan
ditambahkan 2.5 μl EtBr. Larutan dalam bentuk cair dituangkan ke dalam
pencetak gel, sisir ditempatkan di dekat tepian gel dan dibiarkan hingga mengeras.
Sisir dicabut setelah gel mengeras sehingga terbentuk sumur-sumur. Tahap
selanjutnya gel ditempatkan ke dalam gel tray elektroforesis yang sudah berisi
larutan buffer. Produk PCR-RFLP sebanyak 5 μl dicampur dengan 1 μl loading
dye kemudian dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel. Marker DNA 100 bp
sebanyak 2 μl ditaruh ke dalam sumur paling kiri sebagai penanda. Gel dialiri
listrik 100 volt selama 30-45 menit. Molekul DNA yang bermuatan negatif pada
pH netral akan bergerak ke arah positif (anode). Setelah elektroforesis selesai, gel
agarose diambil untuk dilihat panjang pita DNA dengan menggunakan sinar
ultraviolet dalam mesin UV Transiluminator.
Pita-pita DNA yang muncul dibandingkan dengan marker untuk diketahui
panjang fragmennya dan jumlah pita DNA dari setiap sampel dibandingkan untuk
menentukan genotipe pita DNA. Alel T tidak memiliki titik potong dan hanya
menunjukkan satu fragmen yang panjangnya sama dengan produk PCR yaitu 290
bp. Alel C memiliki titik potong enzim BsrI (ACTGG|N) dan menunjukkan
adanya dua fragmen yang masing-masing memiliki panjang 200 bp dan 90 bp.
Sekuens Fragmen Gen OPN Intron 4
Sekuens fragmen gen OPN intron 4 dilakukan pada individu sapi bali
yang bergenotipe TT dengan jumlah dua sampel. Primer yang digunakan untuk
sekuens fragmen gen OPN hanya primer forward. Sekuensing gen OPN
dilakukan dengan menggunakan mesin sekuenser (ABI Prims 3100-Avant Genetic
Analyzer) di perusahaan sekuensing 1st Base, Selangor, Malaysia.
Analisis Data
Frekuensi Alel Gen OPN
Keragaman alel yang terdapat pada populasi sapi bali di BPTU sapi bali,
Pulau Bali dianalisis dengan pendekatan frekuensi alel. Frekuensi alel adalah
rasio suatu alel terhadap keseluruhan alel pada suatu lokus dalam populasi.
Frekuensi alel (
gen OPN yang dihitung berdasarkan rumus sebagai berikut
(Nei dan Kumar 2000):
2nii nij
2
Keterangan :
= frekuensi alel ke-i
nii
= jumlah individu bergenotipe ii
nij
= jumlah individu bergenotipe ij
N
= jumlah individu sampel
5
Sekuens Fragmen Gen OPN Intron 4
Hasil sekuens dianalisis dengan program BioEdit (Hall 1999). Selanjutnya
untuk mengetahui kesamaan dengan gen OPN yang terdapat di GenBank
dianalisis menggunakan metode BLAST (www.ncbi.nhl.nih.gov./BLAST). Ada
tidaknya mutasi pada sekuens fragmen gen OPN intron 4 dilakukan analisis
dengan menggunakan program Molecular Evolutionary Genetic Analysis
(MEGA5) dengan metode ClustalW (Tamura et al. 2011).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Amplifikasi Gen Osteopontin (OPN)
Amplifikasi fragmen gen OPN pada sapi bali dengan menggunakan mesin
thermocycler pada suhu annealing 60 oC selama 20 detik menghasilkan panjang
produk PCR 290 base pair (bp) (Gambar 2). Sebanyak 100 sampel sapi bali
berhasil diamplifikasi dengan tingkat keberhasilan 100%.
Gambar 2
Hasil amplifikasi gen osteopontin pada gel
agarose 1.5%. Keterangan: M = marker DNA
100 bp. Sampel 1-16 = produk amplifikasi
gen OPN.
Berdasarkan hasil amplifikasi yang dilakukan oleh Leonard et al. (2005)
bahwa kondisi annealing fragmen gen OPN|BsrI berlangsung pada suhu
touchdown 63 oC ke 50 oC selama 45 detik. Suhu annealing adalah suhu
optimum untuk berlangsungnya penempelan primer sesuai dengan sekuens DNA
komplementer yang akan diperbanyak selama proses amplifikasi DNA
berlangsung. Penelitian ini menggunakan suhu penempelan pasangan primer
yang berbeda dengan suhu yang disarankan oleh Leonard et al. (2005). Hal
tersebut disebabkan oleh perbedaan kondisi mesin PCR dan campuran komponen
pereaksi PCR. Viljoen et al. (2005) menyatakan bahwa suhu annealing berkisar
antara 55-72 oC, selain itu suhu optimal annealing salah satunya bergantung pada
konsentrasi MgCl2. Pelt-Verkuil et al. (2008) menyatakan bahwa waktu
annealing yang dibutuhkan supaya primer dapat berkomplemen dan menempel
dengan targetnya bergantung pada kapasitas pemanasan mesin thermocycler yang
digunakan, volume campuran PCR serta konsentrasi primer dan gen target.
6
Identifikasi Genotipe Gen Osteopontin (OPN)
Hasil pemotongan dengan enzim BsrI terhadap fragmen gen OPN sapi bali
diperoleh hanya satu macam genotipe yaitu genotipe TT (satu pita) dengan
panjang 290 bp (Gambar 3). Individu-individu sapi bali yang tidak dapat
dipotong fragmen gen OPN-nya berarti mengalami mutasi pada situs pemotong
sekuens enzim BsrI.
Berdasarkan hasil penelitian gen OPN dengan situs polimorfik intron 4 pada
sapi FH oleh Leonard et al. (2005) diperoleh tiga macam genotipe yaitu genotipe
TT, genotipe CC (dua pita), dan genotipe CT (tiga pita). Ketiga genotipe tersebut
juga diperoleh dari hasil penelitian Boleckova et al. (2012) pada bangsa sapi
Czech Fleckvieh dengan proporsi genotipe CC, CT, dan TT masing-masing
sebesar 0.04, 0.28, dan 0.68. Khatib et al. (2009) menyatakan bahwa genotipe TT
memiliki angka fertilitas yang lebih tinggi (70%) dibandingkan dengan genotipe
CC (62%) pada embrio in vitro fertilization (IVF) sapi.
Gambar 3 Hasil PCR-RFLP fragmen gen osteopontin
(OPN|BsrI) pada gel agarose 2%. Keterangan:
M = marker DNA 100 bp, 1-16 = sampel sapi
bali.
Frekuensi Alel Gen Osteopontin (OPN)
Hasil analisis frekuensi alel gen OPN pada sapi bali menunjukkan bahwa
hanya ditemukan satu macam alel yaitu alel T (100%) dan tidak ditemukan alel C.
Gen OPN pada sapi bali bersifat seragam atau monomorfik. Nei (1987)
menyatakan bahwa suatu alel tergolong polimorfik jika memiliki frekuensi alel
sama dengan atau kurang dari 0.99. Frekuensi alel sapi bali dan beberapa bangsa
sapi lainnya disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1 Frekuensi alel gen OPN pada sapi bali dan beberapa bangsa sapi
Bangsa
Jumlah sampel
Sapi bali
100
FH
214
27
Czech Fleckvieh
505
Frekuensi Alel
C
T
0.00
1.00
0.49
0.51
0.57
0.18
0.43
0.82
Sumber
Hasil penelitian
Leonard et al. (2005)
Anggraeni et al. (2012)
Boleckova et al. (2012)
7
Keragaman genetik atau polimorfisme genetik adalah terdapatnya lebih dari
satu bentuk atau macam genotipe di dalam populasi. Sumber keragaman genetik
disebabkan oleh adanya pengulangan urutan sekuen, insersi, delesi dan
rekombinasi di dalam runutan DNA antar individu, kelompok atau suatu populasi
(Nei dan Kumar 2000). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa gen OPN|BsrI
pada sapi bali bersifat monomorfik karena hanya ditemukan satu tipe alel yaitu
alel T.
Fenomena monomorfisme pada sapi bali juga ditemukan pada beberapa
hasil penelitian yaitu gen GHR|AluI (Zulkharnaim et al. 2010) dan gen GH MspI
dan AluI (Jakaria et al. 2009; Jakaria dan Noor 2011). Program nasional
pemurnian dan peningkatan mutu genetik ternak telah dilakukan pada sapi bali
sejak tahun 1976 di Pulau Bali berdasarkan Surat Keputusan (SK) Menteri
Pertanian nomor 776/Kpts/Um/12/1976. Kegiatan yang dilakukan oleh Proyek
Pengembangan dan Pembibitan sapi bali (P3Bali) adalah pemuliaan sapi bali
dengan melakukan seleksi dalam bangsa sehingga diperoleh bibit sapi bali yang
bermutu baik (Soehadji 1990). Pemusatan dan pemurnian genetik sapi bali di
daerah tertentu dalam jangka waktu yang cukup panjang menyebabkan terjadinya
silang dalam. Noor (2008) menyatakan bahwa silang dalam adalah salah satu
bentuk isolasi secara genetik karena pada suatu populasi yang terisolasi akan
menyebabkan keterbatasan pilihan dalam proses perkawinan. Konservasi di
BPTU sapi bali berkaitan dengan pewarisan sifat dari tetua yang menyumbangkan
alel homozigot kepada keturunannya sehingga keragaman genotipe pada populasi
bersifat monomorfik.
Homologi dan Deteksi Mutasi Gen Osteopontin (OPN)
Hasil analisis sekuens fragmen gen OPN|BsrI menunjukkan bahwa sapi bali
memiliki kesamaan yang tinggi terhadap sekuens gen OPN Bos taurus yang
terdapat di GenBank (kode akses GU143284) dengan tingkat kesamaan
(homologi) yang tinggi yaitu sebesar 100%. Selain itu, ditemukan bahwa terjadi
mutasi antara basa C dan T pada sekuens gen OPN intron 4 (Gambar 4, Lampiran
2).
Mutasi transisi basa sitosin (C) menjadi timin (T) menyebabkan perubahan
sekuens situs pemotong enzim BsrI ACTGG|N menjadi ATTGG|N sehingga
enzim BsrI tidak dapat mengenali situs pemotongnya dan menghasilkan satu pita
pada 290 bp. Mutasi transisi adalah mutasi titik yang disebabkan oleh perubahan
basa purin menjadi purin (AG, GA) dan basa pirimidin menjadi basa
pirimidin (CT, TC) (Brown 2002). Mutasi antara basa pirimidin sitosin
dengan timin pada sekuens gen OPN intron 4 Bos taurus berdasarkan GenBank
(kode akses GU143824) sesuai dengan mutasi yang terjadi pada seluruh sapi bali
di penelitian ini.
Gen OPN berada pada daerah non-coding intron 4 yang akan hilang pada
saat transkripsi, dengan demikian mutasi yang terjadi pada bagian intron tidak
berpengaruh terhadap ekspresi dan fungsi gen yang disebut silent mutation
(Brown 2002). Deteksi single nucleotide polymorphism (SNP) gen OPN telah
dilaporkan pada beberapa penelitian seperti Pareek et al. (2008) yang menyatakan
bahwa OPN C>T SNP terdapat pada posisi basa ke-8514 gen OPN dan dapat
8
dijadikan penciri sifat bobot badan dan produksi susu pada sapi Polish HF dan
Polish Red, White et al. (2007) yang menyatakan bahwa terdapat alel fungsional
pada gen OPN yang mempengaruhi bobot sapih dan bobot lahir sapi, dan Leonard
et al. (2005) menyatakan bahwa alel C berhubungan dengan peningkatan
kandungan protein dan lemak dalam susu pada sapi FH.
Gambar 4 Hasil alignment nukleotida sekuens gen OPN|BsrI intron 4 sapi bali
dengan GenBank Bos taurus (kode akses GU143824)
Osteopontin pertama kali dilaporkan terdapat pada jaringan tulang
termineralisasi dan protein OPN yang disintesis oleh sel sertoli pada tubulus
seminiferus berpotensi terlibat pada adhesi dan migrasi sel (Moura 2005). Khatib
et al. (2009) menyatakan bahwa OPN berperan dalam proses binding antara
sperma dengan sel telur dan tahap awal perkembangan embrionik, selain itu OPN
berpengaruh terhadap kapasitasi sperma in vitro (Monaco et al. 2009). Williams
et al. (2011) menyatakan bahwa SNPs pada gen OPN berpotensi sebagai penciri
fertilitas sapi pejantan. Struktur gen OPN yang telah dimodifikasi berdasarkan
Pareek et al. (2008) dapat dilihat pada Gambar 5.
Gambar 5 Rekonstruksi struktur gen OPN pada sapi dengan SNP (single nuclotide
polymorphism) pada intron 4
9
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Gen osteopontin (OPN|BsrI) intron 4 pada sapi bali diperoleh hanya satu
macam genotipe dan alel yaitu genotipe TT dan alel T (100%). Mutasi yang
terjadi pada sapi bali adalah mutasi antara basa sitosin (C) dengan timin (T). Gen
OPN intron 4 pada sapi bali yang terdapat di BPTU sapi bali, Pulau Bali bersifat
monomorfik.
Saran
Perlu dilakukan penelitian pada sampel sapi bali yang terdapat di daerah
pengembangan sapi bali lainnya di Indonesia. Selain itu, diperlukan analisis gengen lain yang terkait dengan sifat reproduksi.
DAFTAR PUSTAKA
Anggraeni A, Hasinah H, Arta SA, Tiesnamurti B, Misrianti R, Andreas E. 2012.
Genetic variation of the IGF1 and OPN genes in Holstein-Friesian dairy cattle
of historical and non-historical twins. [Editor tidak diketahui]. 2nd
International Seminar on Animal Industry[Internet]; 2012 Jan 5-6; Jakarta,
Indonesia. Jakarta (ID): [penerbit tidak diketahui] hlm 91-96; [diunduh 2013
Apr 5]. Tersedia pada: http//www.repository.ipb.ac.id.
Boleckova J, Matejickova J, Stipkova M, Kyselova J, Barton L. 2012. The
association of five polymorphisms with milk production traits in Czech
Fleckvieh cattle. Czech J Anim Sci. 57(2): 45–53.
Brown TA. 2002. Genomes 3. 3rd ed. New York (US): Garland Sci.
[DGLS] Directorate Generale of Livestock Services. 2003. National Report on
Animal Genetic Resources in Indonesia. Directorate Generale of Livestock
Services, Directorate of Livestock Breeding (ID).
Hall, TA. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor
and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl Acids Symp. Ser. 41: 9598.
Jakaria, Noor RR, Martojo H, Duryadi D, Tappa B. 2009. Identification of
growth hormone (Gh) gene MspI and AluI loci polymorphism in beef cattles.
The 1st International Seminar on Animal Industry. Bogor, Indonesia.
Jakaria, Noor RR. 2011. Analysis on Alu-I growth hormone (GH Alu-I) gene in
bali cattle. J. Indones Trop Anim Agric. 1: 1-6.
Khatib H, Huang W, Wang X, Tran AH, Bindrim AB, Schutzkus V, Monson RL,
Yandell BS. 2009. Single gene and gene interaction effects on fertilization
and embryonic survival rates in cattle. J Dairy Sci. 92: 2238-22447.
doi:10.3168/jds.2008-1767.
10
Leonard S, Khatib H, Schutzkus V, Chang YM, Maltecca C. 2005. Effects of the
osteopontin gene variants on milk production traits in dairy cattle. J Dairy Sci.
88: 4083-4086.
Monaco E, Gasparrini B, Boccia L, De Rosa A, Attanasio L, Zicarelli L, Killian G.
2009. Effect of osteopontin (OPN) on in vitro embryo development in cattle. J
Theriogenology. 71: 450-457. doi:10.1016/j.theriogenology.2008.08.012.
Moura AA. 2005. Seminal plasma proteins and fertility indexes in the bull: the
case for osteopontin. Anim Reprod. 2(1): 3-10.
Nei M. 1987. Molecular Evolutionary Genetics. New York (US): Columbia
Univ Pr.
Nei M, Kumar S. 2000. Molecular Evolution and Phylogenetics. New York
(US): Oxford Univ Pr.
Noor RR. 2008. Genetika Ternak. Jakarta (ID): Penebar Swadaya.
Pareek CS, Czarnik U, Pierzchala M, Zwierzchowski L. 2008. An association
between the C>T single nucleotide polymorphism within intron IV of
osteopontin encoding gene (SPP1) and body weight of growing Polish
Holstein-Friesian cattle. J Anim Sci. 26(4): 251-257.
Pelt-Verkuil, van E, Belkum van A, Hays JP. 2008. Principles and Technical
Aspects of PCR Amplification. Netherlands (NL): Springer.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. USA (US): CSH Laboratory Pr.
Soehadji. 1990. Kebijaksanaan pemuliaan ternak (breeding policy) khususnya
sapi bali, dalam pembangunan peternakan. Seminar Nasional Sapi Bali; 1990
Sep 20-22; Denpasar, Indonesia. hlm A1-A9.
Talib C. 2002. Sapi bali di daerah sumber bibit dan peluang pengembangannya.
Wartazoa 12(3): 100-107.
Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. 2011. MEGA5:
Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood,
Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular
Biology and Evolution.
Viljoen GJ, Nel LH, Crowther JR. 2005. Molecular Diagnosis PCR Handbook.
Netherlands (NL): Springer.
White SN, Casas E, Allan MF, Keele JW, Snelling WM, Wheeler TL,Shackelford
SD, Koohmaraie M, Smith TPL. 2007. Evaluation in beef cattle of six
deoxyribonucleic acid markers developed for dairy traits reveals an osteopontin
polymorphism associated with postweaning growth. J Anim Sci. 85: 1-10.
Williams CL, Lester TD, Rowe MP, Rorie RW. 2011. Effects of osteopontin
single nucleotide polymorphisms on bull semen quality. Ark Anim Sci. 17-21.
Zulkharnaim, Jakaria, Noor RR. 2010. Identifikasi keragaman genetik gen
reseptor hormon pertumbuhan (GHR|Alu I) pada sapi bali. Media Petern.
33(2): 81-87.
11
LAMPIRAN
Lampiran 1 Sekuens gen osteopontin (OPN) yang diakses di GenBank kode akses
GU143824
GenBank:
LOCUS
DEFINITION
ACCESSION
VERSION
KEYWORDS .
SOURCE
ORGANISM
GU143824.1
GU143824 291 bp DNA linear MAM 08-NOV-2010
Bos taurus osteopontin gene, intron 4.
GU143824
GU143824.1 GI:310947851
Bos taurus (cattle)
Bos taurus
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata;
Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Laurasiatheria;
Cetartiodactyla; Ruminantia; Pecora; Bovidae; Bovinae;
Bos.
REFERENCE
1 (bases 1 to 291)
AUTHORS
Wang,J. and Lai,S.
TITLE
Single nucleotide polymorphisms of osteopontin gene in
Chinese cattle (Bos taurus), buffalo (Bubalus bubalis) and
yak (Bos grunniens) breeds
JOURNAL
Unpublished
REFERENCE 2
(bases 1 to 291)
AUTHORS
Lai,S.
TITLE
Direct Submission
JOURNAL
Submitted (26-OCT-2009) College of Animal Science and
Technology, Sichuan Agricultural University, Road
XinKang 46#, Ya'an, Sichuan 625014, China
FEATURES
Location/Qualifiers
source
1..291
/organism="Bos taurus"
/mol_type="genomic DNA"
/db_xref="taxon:9913
"
/chromosome="6"
/PCR_primers="fwd_seq: gcaaatcagaagtgtgatagac, rev_seq:
ccaagccaaacgtatgagtt"
/note="breed: Chinese Holstein"
gene
291
/gene="osteopontin"
intron
291
/gene="osteopontin"
/number=4
variation
198
/gene="osteopontin"
/replace="c"
12
ORIGIN
1 gcaaatcaga agtgtgatag acattaactg agctatagtt tctacacatg gataagagag
61 tcaccttttg attatccagg ctaataggga ggtgatttta gttttggggg tgtgcattaa
121 tacatggatt ctctgatccc ctgagaattt tcatttcaaa tagaaaaggt agtctcacaa
181 ttatgtatct gtatttattg gatcattgaa atttggtaaa ttagtgttta ttatgaacaa
241 ggaaaaacag tgtcattgat acaaatatta taactcatac gtttggcttg g
//
Lampiran 2 Hasil BLAST nukleotida sekuens gen OPN sapi bali dengan sekuens
GenBank kode akses GU143824
Lampiran 3 Hasil analisis sekuens fragmen gen OPN pada sapi bali
13
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor, 25 Februari 1991. Penulis adalah anak ketiga
dari pasangan I Nyoman Arnaya dan Putu Agustini Eliyati. Penulis menamatkan
pendidikan di SMA Negeri 1 Bogor pada tahun 2009 dan pada tahun yang sama
penulis diterima menjadi mahasiswa Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi
Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor melalui jalur UTMI.
Semasa kuliah, penulis aktif sebagai pengurus HIMAPROTER periode
2010-2012 dan KMHD periode 2009-2010. Penulis juga berperan sebagai asisten
praktikum mata kuliah Biologi Dasar pada tahun 2012. Selain itu penulis diberi
kepercayaan sebagai ketua Program Kreatifitas Mahasiswa bidang gagasan tertulis
pada tahun 2012.