3
METODE PENELITIAN A.
Bahan dan Alat
Bahan yang di gunakan dalam penelitian ini meliputi ekstrak etanol daun murbei Morus alba L., hewan uji yang digunakan tikus putih galur Wistar
umur 2-3 bulan, dengan berat 150-250 gram, reagen untuk mengukur kadar kolesterol yaitu Reagen Kit Kolesterol Cholesterol FS dari DiaSys dengan
metode CHOD-PAP enzymatic photometric test, penyari yang digunakan adalah etanol 90, PTU dan pakan tinggi lemak lemak kambing, mentega,
minyak jelantah, kuning telur bebek, telur burung puyuh, dan pakan standar untuk menginduksi hiperkolesterol, dan pakan standar serta minuman hewan uji.
Alat yang di gunakan dalam penelitian ini meliputispektrofotometer UVVis StarDust, kuvet, kandang tikus, tempat makan dan minum tikus,
timbangan hewan, sentrifugator, tabung sentrifuge, holder tikus, neraca elektrik,
mikropipet, propipet, ependorf, vortex, spuit injeksi, dan alat gelas. B.
Jalannya Penelitian 1.
Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Murbei Morus alba L.Mohammadi
Naik, 2008. Daun murbei dicuci hingga bersih menggunakan air. Daun murbei
dijemur sampai kering, 1 kg daun murbei kering kemudian diremas menjadi serbuk halus. Serbuk halus daun murbei yang didapatkan kemudian diekstraksi
dengan cara maserasi selama 5 hari dengan etanol 90 sebanyak 7 litersampai terendam sempurna pada suhu kamar.Selanjutnya disaring, filtrat yang
didapatkan kemudian diuapkan sampai kering menggunakan evaporator.
2. Pembuatan Hiperkolesterol pada Tikus
Kadar kolesterol tikus ditingkatkan dengan pemberian PTU dan pakan tinggi lemak. PTU 100 mg dilarutkan dalam 8 mL aquades, sehingga 1 mL
mengandung 12,5 mg PTU. Dosis PTU yang diberikan adalah 12,5 mghari dibagi dalam 2 kali pemberian Allo et al., 2013.
Tabel 1. Komposisi pakan tinggi lemak.
Bahan Jumlah lemak kambing
1 kg Mentega 250
gram minyak jelantah
100 mL kuning telur bebek
2 butir telur burung puyuh
20 butir pakan standar
5 kg
4 Pakan tinggi lemak dibuat dengan memanaskan lemak kambing,
mentega, dan minyak jelantah, setelah meleleh kunning telur bebek dan telur burung puyuh dimasukkan sedikit demi sedikit. Pakan standar dimasukkan
terakhir dan diaduk hingga rata. Pakan tinggi lemak dan PTU diberikan setiap hari. Kadar normal kolesterol pada tikus yaitu 10-50 mgdL Mitruka
Rawnsley, 1981.
3. Perlakuan pada Hewan Uji
a. Tikus putih jantan galur Wistar yang dibagi 6 kelompok secara acak.
Kelompok I sebagai kontrol normal, kelompok II sebagai kontrol negatif diberi PTU dan pakan tinggi lemak, kelompok III sebagai kontrol positif
diberi PTU, pakan tinggi lemak, dan simvastatin dengan dosis 0,72 mghari200 gBB tikus, kelompok IV, V, dan VI diberi PTU, pakan tinggi
lemak, dan ekstrak etanol daun murbei secara per oral dengan dosis masing-masing 400mgkgBB, 600mgkgBB, dan 800mgkgBB. Dosis
tesebut berdasarkan percobaan dari Mohammadi Naik 2008. b.
Pemberian perlakuan selama 2 minggu dilakukan setelah kadar kolesterol tikus meningkat secara signifikan dengan tetap diberi diet tinggi kolesterol,
kemudian diobservasi dengan mengukur kadar kolesterol total. c.
Hasil yang diperoleh kemudian dianalisis.
4. Penetapan Kadar Kolesterol Total
Pengukuran kadar kolesterol total dilakukan dalam tiga periode, hari ke-0, hari ke 14, dan hari ke-28. Kadar kolesterol baseline didapatkan sebelum
hewan uji diberi perlakuan yaitu hari ke-0, setelah pemberian PTU dan pakan tinggi lemak yaitu hari ke-14, dan hari ke-28 yaitu setelah perlakuan dengan
ekstrak daun murbei. Penetapan kadar kolesterol total menggunakan Reagen Kit Cholesterol FS dari Diasys dengan metode CHOD-PAP enzymatic
photometric test . Reagen Kit Cholesterol FS dari DiaSys mengandung
beberapa komponen. Tabel 2. Komposisi reagen Kit
DiaSys, 2014
Bahan Jumlah Good’s buffer pH 6,7
50 mmolL Phenol
5 mmolL 4-Aminoantipyrine 0,3
mmolL Cholesterol esterase CHE
≥ 200 UL Cholesterol oxydase CHO
≥ 50 UL Peroxidase POD
≥ 3 UL Standard : 200 mgdL 5,2 mmolL
5 Mekanisme reaksi dari metode CHOD-PAP adalah pemeriksaan
kolesterol setelah hidrolisis enzimatik dan oksidasi. Kolesterol ester yang dihidrolisis menjadi kolesterol bebas dengan kolesterol esterase. Kolesterol
bebas yang dihasilkan kemudian dioksidasi oleh kolesterol oksidase membentuk cholesterol-3-one dan H
2
O
2.
Indikator kolorimetri adalah quinonimin yang memiliki serapan maksimum pada500nm terbentuk dari 4-aminoantipirin dan
fenol oleh adanya reaksi katalitik dari peroksidase DiaSys, 2014; Allain et al., 1974.
Reaksi:
a Cholesterol ester + H
2 CHE
Cholesterol + Fatty acid
b Cholesterol
+ O
2 CHO
Cholesterol-3-one + H
2
O
2
c 2 H
2
O
2
+ 4-Aminoantypyrine + Phenol
POD
Quinoneimine + 4 H
2
O
Gambar 1. Reaksi Metode CHOD-PAP
DiaSys, 2014; Allain et al., 1974 Prosedur pengukuran kadar kolesterol total dilakuan dengan
pengambilan sampel darah tikus sebanyak 1 mL dari vena ekor, kemudian
6 disentrifuge 20 menit dengan 12.000 rpm untuk diambil serumnya. Sebelum
pembacaan data kolesterol total, dipersiapkan dahulu blangko, standar, dan sampel serum.
Tabel 3. Komposisi blangko, sampel, dan standar
Blangko Sampel
serumstandar Sampel standar
- 10 µL
Aquadest 10 µL -
Reagen 1000 µL
1000 µL
Kemudian campuran dicampur dan diinkubasi selama selama 10 menit pada 37
C, dibaca absorbansinya pada λ 500 nm terhadap blangko reagen
tidak lebih dari 60 menit.
5. Analisis Data
