Analisis Keragaman Pati pada Tanaman Sagu (Metroxylon sagu) dengan Teknik RAPD
ANALISIS KERAGAMAN PATI PADA TANAMAN SAGU
(Metroxylon sagu) DENGAN TEKNIK RAPD
IFROH JATIDIRI MEDIA
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Analisis Keragaman
Pati pada Tanaman Sagu (Metroxylon sagu) dengan Teknik RAPD adalah benar
karya saya dengan arahan dari pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa
pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada
Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Januari 2015
Ifroh Jatidiri Media
G84100077
ABSTRAK
IFROH JATIDIRI MEDIA. Analisis Keragaman Pati pada Tanaman Sagu
(Metroxylon sagu) dengan Teknik RAPD. Dibimbing oleh MEGA SAFITHRI dan
ASMINI BUDIANI.
Riset terkait pengembangan sagu secara molekuler masih tertinggal
padahal Indonesia memiliki sumber genetik sagu yang beragam. Sumber genetik
tersebut merupakan aset bagi pemuliaan tanaman yang menghasilkan karakter
tanaman yang unggul. Tujuan dari penelitian ini adalah menganalisis pola RAPD
pada tanaman sagu yang memiliki kadar pati tinggi dan kadar pati rendah.
Tahapan penelitian terdiri atas ekstraksi pati empulur sagu, isolasi DNA daun
sagu dan amplifikasi DNA daun sagu secara RAPD. Sebanyak 45 primer
digunakan untuk melihat pola RAPD sagu berkadar pati tinggi dan rendah.
Primer yang mampu membedakan pola RAPD sagu berkadar pati tinggi dan
rendah antara lain primer OPA1, OPA 17, OPA18, OPA19, OPA20, OPB2, OPB4,
OPB10, OPJ1, OPJ 5, dan OPJ8.
Kata kunci: Sagu, pati, RAPD, primer
ABSTRACT
IFROH JATIDIRI MEDIA. Analysis Starch Diversity in Sago Plant (Metroxylon
sagu) by RAPD Technique. Supervised by MEGA SAFITHRI and ASMINI
BUDIANI.
Reseach about sago’s development in molecular still left behind whereas
Indonesia has genetic diversity source of Sago. Source genetik is an aset for plant
glorification that can produce good character. The objective of this reseach is to
analysis RAPD Pattern in sago that has high starch content and low starch content.
There were some treatments in this research, they were extraction sago stach
from pith, isolation DNA of leaf sago DNA and amplification leaf sago DNA by
RAPD. It’s about 45 primers used for looking differences RAPD Pattern of high
starch and low starch sago. Primers that can different RAPD Pattern of high starch
and low starch sago are primer OPA1, OPA 17, OPA18, OPA19, OPA20, OPB2,
OPB4, OPB10, OPJ1, OPJ 5, and OPJ8.
Keywords: Sago, starch, RAPD, primer
ANALISIS KERAGAMAN PATI PADA TANAMAN SAGU
(Metroxylon sagu) DENGAN TEKNIK RAPD
IFROH JATIDIRI MEDIA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Judul Skripsi : Analisis Keragaman Pati pada Tanaman Sagu (Metroxylon sagu)
dengan Teknik RAPD
Nama
: Ifroh Jatidiri Media
NIM
: G84100077
Disetujui oleh
Dr Mega Safithri, SSi MSi
Pembimbing I
Dr Asmini Budiani, MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr I Made Artika, MAppSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT yang telah
melimpahkan karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan degan
baik. Karya ilmiah diberi judul “Analisis Keragaman Pati pada Tanaman Sagu
(Metroxylon sagu) dengan Teknik RAPD”.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada semua pihak yang telah
membantu penulis selama pelaksanaan penelitian maupun penulisan karya ilmiah,
antara lain: Dr. Mega Safithri, SSi MSi selaku pembimbing I yang selalu memberi
bimbingan dan dukungan agar penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah tepat
waktu, Dr. Asmini Budiani, MSi selaku pembimbing II yang memberi bimbingan
dan kesempatan penulis untuk melakukan penelitian di Balai Penelitian dan
Bioteknologi Perkebunan Indonesia. Ungkapan terima kasih juga penulis ucapkan
kepada orang tua penulis yaitu Bapak M Buang Jamil dan Ibu Mutayanah serta
Teh Umi, Ka Fauji dan Taruna yang selalu mendoakan dan memberi motivasi
agar penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah dengan baik. Yayasan beasiswa
Karya Salemba Empat yang telah membantu penulis dalam hal finansial selama
kuliah di IPB. Teh Rini, Teh Niyyah, Mba Emi dan Ica yang mengajari penulis
selama di Laboratorium Biomolekuler. Layyinah, Irna, Regina, Resti dan Dimas
yang membuat lab semakin ramai sehingga penulis merasa nyaman selama
penelitian. Tidak lupa untuk teman-teman satu angkatan biokimia 47 selaku
teman seperjuangan yang selalu mendukung satu sama lain.
Penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun atas karya ilmiah
ini sehingga dapat berguna bagi penulis sendiri khususnya maupun pembaca
umumnya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat demi kemajuan ilmu pengetahuan.
Bogor, Januari 2015
Ifroh Jatidiri Media
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
PENDAHULUAN
METODE
Alat
Bahan
Metode
HASIL
Kadar air empulur sagu
Kadar pati empulur sagu
Kuantitas dan kualitas DNA daun sagu
Elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu
PEMBAHASAN
Kadar air empulur sagu
Kadar pati empulur sagu
Kuantitas dan kualitas DNA daun sagu
Elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP
iv
iv
iv
1
2
2
2
2
5
5
6
6
7
9
9
10
11
11
12
12
13
12
15
23
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
Kadar air empulur sagu bulan Maret 2014 dan Juli 2014
Kadar pati empulur sagu bulan Maret 2014 dan Juli 2014
Kualitas DNA daun sagu bulan Maret 2014 dan Juli 2014
Profil elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu dengan
primer OPA1, 3, 6, 7, 8, dan 10
Profil elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu dengan primer
OPA11, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19 dan 20
Profil elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu dengan primer
OPB 1 ,2 ,3 ,4 ,7 , 8 , 10,11, 12, dan 20
Profil elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu dengan primer
OPJ 1,3-6, 7,810
Profil elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu dengan primer
OPD 4, 5, 7, 8, OPN 6- 9
5
6
7
8
8
8
9
9
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Alur penelitian
Kadar air empulur sagu bulan Maret 2014
Kadar air empulur sagu bulan Juli 2014
Contoh perhitungan kadar air
Kurva standar D-glukosa bulan Maret 2014
Kurva standar D-glukosa bulan Juli 2014
Absorbansi empulur sagu bulan Maret 2014
Absorbansi empulur sagu bulan Juli 2014
Kadar pati empulur sagu bulan Maret 2014
Kadar pati empulur sagu bulan Juli 2014
Contoh Perhitungan kadar pati
Primer-primer yang digunakan dan jumlah pita yang dihasilkan
15
16
17
18
18
19
19
20
20
21
21
22
20
PENDAHULUAN
Sagu (Metroxylon sp) adalah tumbuhan suku palma yang batangnya dapat
menghasilkan pati. Produktivitas pati sagu lebih tinggi dibandingkan tanaman
penghasil karbohidrat lain. Sagu mampu menghasilkan pati kering 10-25
ton/ha/tahun sedangkan pati kering jagung hanya 5,5 ton/ha/tahun, produktivitas
pati kering padi 6 ton/ha/tahun, dan produktivitas pati kering ubi kayu dan
kentang adalah 10-15 ton/ha/tahun (Sumaryono 2007). Sagu mampu memberikan
pati yang lebih murah karena daya hasil yang lebih tinggi dibanding tanaman lain
sehingga harganya amat bersaing (Bujang dan Adeni 2000).
Kebutuhan pati bagi industri dunia saat ini sekitar 50 juta ton per tahun
dengan laju pertumbuhan 7,7% per tahun (Jong et al. 2007). Pati digunakan
sebagai bahan dasar berbagai macam industri diantaranya sebagai bahan untuk
pembuatan roti, biskuit, mi, sohun, kerupuk dan lain sebagainya (Polnaya 2006)
sehingga produksinya di dunia terus meningkat dalam beberapa dasawarsa
terakhir. Sekitar 50% tanaman sagu dunia atau 1.128 juta ha sagu tumbuh di
Indonesia dan 90% dari 1.128 juta ha atau 1.015 juta ha berkembang di Provinsi
Papua dan Maluku (Lakuy dan Limbongan 2003).
Penelitian tentang pemuliaan tanaman sagu belum banyak dilakukan
padahal Indonesia memiliki sumber genetik sagu yang beragam,yang merupakan
aset penting bagi pemuliaan tanaman. Pemuliaan tanaman mampu menghasilkan
karakter yang unggul pada sagu seperti mampu memproduksi pati tinggi, tidak
berduri, dan memiliki rasa yang enak namun proses pemuliaan tanaman
membutuhkan waktu yang lama, oleh karena itu dibutuhkan teknologi yang
mampu mengatasi masalah tersebut. Berkembangnya teknologi marka molekuler
menjadikan proses karakterisasi keanekaragaman genetik tanaman dapat
dilakukan dengan mudah dan lebih cepat (Pandin 2009). Menurut Setyowati
(2013), perbedaan karakter seperti beda kadar pati merupakan indikasi adanya
keragaman genetik yang sangat bermanfaat untuk pemuliaan tanaman.
Beberapa teknik telah dikembangkan teknik yang dapat membantu para
pemulia untuk mempercepat proses seleksi. Salah satu teknik penanda molekuler
yang telah digunakan untuk melihat pola keragaman sebagai upaya untuk
mempermudah proses pemuliaan tanaman adalah Random Amplified Polymorphic
DNA (RAPD). RAPD digunakan untuk mengidentifikasi genotipe tanaman
karena memiliki beberapa kelebihan dalam pelaksanaan dan analisisnya (Suryanto
2003). Kelebihan RAPD adalah prosedurnya lebih mudah, murah, cepat, sampel
DNA yang diperlukan sedikit (0.5-50 ng) dan tidak memerlukan radioisotop
(Sharma et al. 2008).
Tujuan dari penelitian ini adalah menganalisis pola RAPD pada tanaman
sagu yang memiliki kadar pati tinggi dan kadar pati rendah. Hasil penelitian ini
diharapkan dapat memberikan informasi pola DNA sagu berkadar pati tinggi dan
rendah serta membantu mempercepat pemuliaan tanaman sagu dengan kadar pati
yang tinggi. Hipotesis penelitian ini adalah tanaman sagu dengan kadar pati tinggi
memiliki pola RAPD yang spesifik dan dapat dibedakan dengan pola RAPD
tanaman sagu berkadar pati rendah. RAPD dilakukan dengan mengamplifikasi
sampel dengan 45 primer.
2
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan dari bulan Maret sampai September 2014.
Pelaksanaan penelitian bertempat di Laboratorium Biomolekuler Balai Penelitian
dan Bioteknologi Perkebunan Indonesia Bogor.
Alat
Alat yang digunakan adalah oven, desikator, sentrifus Eppendorf 5804 R,
blender, vorteks, spektrofotometer NanoDrop, spektrofotometer Multiscan Go,
mesin PCR Esco APB10, Geldoc Alphamager Mini, elektroforesis set, timbangan,
dan peralatan pendukung lainnya.
Bahan
Bahan yang digunakan adalah empulur sagu, daun sagu, polivinil pirolidon
(PVP),
nitrogen
cair,
buffer
ekstraksi,
β-merkaptoetanol,
kloroform:isoamilalkohol, TE, isopropanol, natrium asetat, etanol absolut, etanol
70%, nuclease free water, RNAse, loading dye, gel red, agarose, marker lambda
DNA, marker 1 kb plus DNA Ladder, Tris borat EDTA (TBE), buffer MgCl2,
dNTP, primer, Taq DNA polimerase, akuades, asam perklorat, asam sulfat,
kertas saring, anthrone, es, dan standar D-glukosa.
Metode Penelitian
Preparasi Sampel Daun Sagu
Sampel sagu yang digunakan dalam penelitian berasal dari Parung. Sampel
diambil pada bulan Maret 2014 dan Juli 2014. Sampel daun sagu diberi kode
sampel 1, 2 ,3 dan 4. Pemberian kode bertujuan untuk memudahkan analisis saat
diberi perlakuan.
Daun tanaman sagu yang diprediksi memiliki kadar pati berbeda dipotongpotong lalu digerus dalam mortar dengan ditambahkan nitrogen cair dan ± 0,1
gram PVP. Daun yang telah menjadi serbuk disimpan dalam freezer untuk
digunakan dalam isolasi DNA.
Preparasi Sampel Empulur Sagu
Empulur sagu dipotong-potong lalu diblender hingga halus. Sampel batang
sagu yang halus lainnya diambil 3 x 2 gram untuk uji kadar air dan sisanya
dikeringkan dalam oven pada suhu 65 °C selama semalam. Sampel yang
dikeringkan disimpan dalam plastik pada suhu ruang untuk digunakan saat uji
kadar pati.
3
Penetapan Kadar Air (AOAC 2000)
Pengukuran kadar air empulur sagu dilakukan pada bulan Maret 2014 dan
Juli 2014 sebagai bulan (waktu) pengambilan sampel. Cawan dimasukan ke dalam
oven pada suhu 105 oC selama 3 jam. Cawan didinginkan dalam desikator selama
30 menit lalu bobotnya ditimbang. Sebanyak 2 gram empulur yang telah
dihaluskan dimasukkan ke dalam cawan Petri yang telah diketahui bobotnya,
kemudian dikeringkan dalam oven bersuhu 105 °C sampai bobotnya konstan.
Setelah itu dibiarkan dalam desikator dan ditimbang.
Pembuatan Kurva Standar (SNI 1998)
D-glukosa 1000 ppm disiapkan kemudian dibuat variasi konsentrasi dari
stok D-glukosa 1000 ppm. Variasi konsentrasi D-glukosa yang digunakan adalah
50, 100, 150, 200, 250, dan 300 ppm. Variasi konsentrasi dibuat dengan cara
mengambil larutan D-glukosa 1000 ppm dengan volume 50, 100, 150, 200, 250,
dan 300 µl kemudian ditambah akuades hingga totalnya 1000 µl atau 1 mL.
Larutan glukosa standar ditambah 10 mL pereaksi anthrone 0.1% (dilakukan
dalam wadah berisi es) lalu dikocok hingga homogen. Campuran divortex lalu
dipanaskan dalam penangas air pada suhu 100 ºC selama 7.5 menit kemudian
dibiarkan pada suhu ruang. Larutan diukur pada panjang gelombang 630 nm
dengan spektrofotometer UV-visible.
Kadar Pati (Tjasadihardja 1987)
Sebanyak 100 mg empulur yang sudah dikeringkan ditimbang kemudian
ditambah 2 mL akuades. Campuran divortex kemudian diinkubasi pada suhu 100
°C selama 15 menit (sesekali dikocok) kemudian campuran dibiarkan pada suhu
ruang. Campuran ditambah asam perklorat 9.2 N sebanyak 2 mL kemudian
didiamkan selama 15 menit (sesekali dikocok). Campuran ditambah akuades
hingga menjadi 10 mL. Campuran disentrifus pada kecepatan 15.000 rpm selama
15 menit. Pelet dipisahkan dengan supernatannya. Pelet ditambah asam perklorat
4.6 N sebanyak 2 mL kemudian didiamkan selama 15 menit (sesekali dikocok).
Campuran ditambah akuades hingga menjadi 10 mL. Campuran disentrifus pada
kecepatan 15.000 rpm selama 15 menit. Supernatan pada sentrifus kedua diambil
lalu digabung dengan supernatan pada sentrifus pertama. Campuran supernatan
ditera 50 mL kemudian disaring. Sebanyak 0.2 mL sampel diambil dan ditambah
0.8 mL akuades kemudian ditambahkan 10 mL pereaksi anthrone 0.1% (dilakukan
dalam wadah berisi es). Campuran ini dikocok lalu dipanaskan dalam penangas
air pada suhu 100 ºC selama 7.5 menit kemudian dibiarkan pada suhu ruang.
Larutan diukur pada panjang gelombang 630 nm dengan spektrofotometer
Multiscan Go.
Isolasi DNA (Orozco-Castillo 1994)
Serbuk daun yang telah dibuat sebelumnya dimasukan ke dalam tabung
sentrifus kemudian ditambahkan campuran 5 mL buffer ekstraksi dan 50 µL β-
4
merkaptoetanol yang telah dipanaskan 65 ºC. Larutan divortex kemudian
dipanaskan 65 °C selama 30 menit (dikocok setiap 10 menit sekali). Sampel
kemudian dibiarkan pada suhu ruang. Sampel ditambah 5 mL
kloroform:isoamilalkohol 24:1 lalu divortex hingga homogen. Larutan disentrifus
dengan kecepatan 11.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam
tabung sentrifus yang baru. Supernatan ditambahkan kloroform:isoamilalkohol
24:1 sebanyak satu volume, kemudian campuran disentrifus dengan kecepatan
11.000 rpm selama 10 menit. Supernatan diambil dan ditambah isopropanol
dingin sebanyak satu volume kemudian campuran disentrifus dengan kecepatan
11.000 rpm selama 10 menit. Pelet diambil lalu dikeringkan. Pelet ditambah 1 mL
senyawa Tris-EDTA kemudian ditambah CH3COONa 3 M 1/10 V dan etanol
absolut 2.5 mL. Campuran dikocok dan disimpan pada suhu -20 °C selama 30
menit atau semalam. Sampel kemudian disentrifus dengan kecepatan 11.000 rpm
selama 15 menit pada suhu 4 °C. Pelet diambil lalu ditambahkan etanol 70%.
Pelet didinginkan dengan speed vacum DNA. Pelet ditambahkan 100 µl nuclease
free water kemudian ditambahkan RNAse 25 µg/ mL. DNA diuji kuantitas
dengan spektrofotometer NanoDrop dan diuji kualitasnya dengan elektroforesis.
Uji Kuantitas dan Kualitas DNA
Kuantitas DNA daun sagu dilakukan dengan mengukur konsentrasi sampel
dengan spektrofotometer NanoDrop pada panjang gelombang 260 nm, 280 nm
dan 230 nm dengan batas kemurnian yang biasa dipakai dalam analisis molekuler
pada rasio A260/A280 dan A260/A230.
Kualitas DNA daun sagu divisualisasikan melalui elektroforesis gel
agarosa. Sebanyak 0.24 gram agarose ditimbang lalu dilarutkan dengan buffer
TBE 0.5x sebanyak 30 mL. Campuran ini kemudian dipanaskan di dalam
microwave pada suhu 70 °C selama 1.5 menit. Selanjutnya, ditambahkan gel red
1.5 µl ke dalam campuran lalu digoyang-goyang hingga campuran homogen.
Campuran ini kemudian dituang ke dalam cetakan gel elektroforesis. Campuran
dibiarkan hingga mengeras (30 menit). Setelah gel mengeras, gigi-gigi pencetak
sumur diangkat pelan-pelan lalu gel dimasukkan ke dalam bak elektroforesis
berisi buffer TBE 0.5 x 300 mL. Gel dimasukan dalam bak yang berisi buffer.
Sampel yang dicampur loading dye dimasukan ke dalam sumur. Elektroforesis
dijalankan dengan menggunakan tegangan sebesar 75 volt. Hasil elektroforesis
diamati dengan Geldoc Alphamager Mini.
Amplifikasi DNA Daun Sagu dengan Primer Acak (RAPD)
Amplifikasi DNA dilakukan dengan menggunakan mesin PCR Esco
APB10 dengan volume reaksi PCR sebanyak 12.5 μl. DNA diamplifikasi
sebanyak 44 siklus. Kondisi amplifikasi PCR yang digunakan adalah Pra PCR 92
˚C selama 2 menit, denaturasi 92 ˚C selama 3 menit 30 detik, pelekatan primer 35
˚C per 1 menit, pemanjangan DNA 72˚C per 2 menit, kemudian diatur suhu 92
˚C selama 1 menit untuk proses denaturasi, pelekatan primer 35 ˚C per 1 menit,
pemanjangan DNA 72 ˚C per 2 menit, pemanjangan DNA 72 ˚C selama 7 menit
pada siklus terakhir, dan suhu 10 ˚C untuk proses cooling. Primer yang digunakan
5
untuk mengamplifikasi DNA total tanaman sagu sebanyak 45 primer (Lampiran
12).
Elektroforesis Hasil RAPD
Sebanyak 0.45 gram agarose ditimbang lalu dilarutkan dengan larutan
buffer TBE 0.5x sebanyak 30 mL. Campuran ini kemudian dipanaskan di dalam
mikrowave pada suhu 70 °C selama 1.5 menit. Selanjutnya, ditambahkan gel red
ke dalam campuran lalu digoyang-goyang hingga campuran homogen. Campuran
ini kemudian dituang ke dalam cetakan gel elektroforesis. Campuran dibiarkan
hingga mengeras (kurang lebih 30 menit). Setelah gel mengeras, gigi-gigi
pencetak sumur diangkat pelan-pelan lalu gel dimasukkan ke dalam bak
elektroforesis. Bak diisi dengan buffer TBE 0.5 x 300 mL. Gel dimasukan dalam
bak yang berisi buffer TBE. Sebanyak 5 µl sampel hasil RAPD dipipet lalu
dicampur dengan loading dye. Sampel yang dicampur loading dye dimasukan ke
dalam sumur. Elektroforesis dijalankan dengan menggunakan tegangan sebesar 60
volt. Hasil elektroforesis diamati dengan Geldoc Alphamager Mini. Konsentrasi
DNA ditetapkan berdasarkan perbandingan DNA dengan pita DNA yang sudah
diketahui konsentrasinya (marker).
HASIL
Kadar Air Empulur Sagu
% Kadar air
Sampel empulur sagu bulan Maret 2014 dan Juli 2014 diukur kadar airnya
dengan tiga kali ulangan (triplo). Pengukuran kadar air sampel bulan Maret 2014
dan Juli 2014 didasarkan pada waktu pengambilan sampel. Kadar air empulur
sagu bulan Maret 2014 memiliki rata-rata antara 86.43%-90.36% sedangkan kadar
air empulur sagu bulan Juli 2014 memiliki rata- rata antara 85.98% - 88.61%.
91
90
89
88
87
86
85
84
83
90.36±0.39
88.96±0.41
88.61±0.07 88.89±0.05
87.9±0.18
87.18±0.21
86.43±0.24
85.98±0.63
1
2
3
4
Sampel
Gambar 1 Kadar air empulur sagu
bulan Maret 2014 dan
bulan Juli 2014
6
Kadar Pati Empulur Sagu
% Kadar pati
Sampel 2 bulan Maret 2014 memiliki kadar pati tertinggi yaitu sebesar
37.9%, sampel 4 memiliki kadar pati kedua tertinggi yaitu sebesar 36.82% dan
sampel 3 memiliki kadar pati terendah yaitu sebesar 24.46%. Sampel 4 bulan Juli
2014 memiliki kadar pati tertinggi yaitu sebesar 41.36% dan sampel 3 tetap
memiliki kadar pati terendah yaitu sebesar 25.02%.
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
35.58±0.36
41.36 ±4.32
36.82±0.64
37.9±2.99
31.54±1.98
25.73±0.61
1
25.02±0.10
24.46±0.49
2
3
4
Sampel
Gambar 2 Kadar pati empulur sagu
bulan Maret 2014 dan
bulan Juli 2014
Kuantitas dan Kualitas DNA Daun Sagu
Kuantitas DNA dilihat berdasarkan rasio A260/A280 dan rasio
A260/A230. Rasio A260/A280 menunjukkan kemurnian DNA terhadap
kontaminasi protein sedangkan rasio A260/A230 menunjukkan kemurnian DNA
terhadap kontaminasi polisakarida. Batas kemurnian DNA terhadap kontaminasi
polisakarida yaitu 2.00-2.2. Kuantitas DNA disajikan pada Tabel 1. Kemurnian
DNA daun sagu terhadap kontaminasi protein bulan Maret 2014 berada pada
rentang 1.90-1.97 sedangkan pada bulan Juli 2014 berada pada rentang 1.93-1.99.
Kemurnian DNA daun sagu terhadap kontaminasi polisakarida bulan Maret 2014
berada pada rentang 2.04-2.28 sedangkan pada bulan Juli 2014 berada pada
rentang 2.13-2.41.
7
Tabel 1 Kuantitas DNA daun sagu
Sampel
1
2
3
4
1
2
3
4
Konsentrasi
A260/A280
A260/A230
(ng/µL)
Kuantitas DNA daun sagu bulan Maret 2014
801.9
1.97
2.11
413.6
1.90
2.04
1090.7
1.92
2.17
1632.7
1.91
2.28
Kuantitas DNA daun sagu bulan Juli 2014
403.3
1.96
2.13
261.0
1.95
2.41
345.7
1.99
2.37
339.8
1.93
2.17
Uji kualitas DNA diperoleh melalui elektroforesis. Sampel dielektroforesis
pada gel agarosa konsentrasi 0.8%. Berdasarkan Gambar 4, profil elektrogram
DNA daun sagu memiliki kualitas yang baik karena DNA hasil elektroforesis
tidak terdegradasi.
48.502 bp
M
1
2
3
4
5
6
7
8
Gambar 3 Profil elektroforegram DNA daun sagu. M=marker lambda DNA ,lajur
1, 2, 3, 4 adalah isolasi DNA bulan Maret, lajur 5, 6, 7, 8 adalah
isolasi DNA bulan Juli.
Elektroforegram Hasil RAPD DNA Daun Sagu
Sampel 3 dan 4 dielektroforesis secara berpasangan dengan primer yang
sama dengan kode r untuk sampel 3 yang memiliki kadar pati rendah dan kode t
untuk sampel 4 yang memiliki kadar pati tinggi. Hal itu bertujuan untuk
mempermudah melihat pola RAPD yang dihasilkan. Sampel 3 dan 4 hasil RAPD
dielektroforesis pada gel agarose 1.4%. Berdasarkan Gambar 4-8, dapat diketahui
kemampuan setiap primer dalam mengampifikasi sampel. Beberapa sampel yang
tidak menghasilkan pita pada sampel 3 dan 4 seperti primer OPA9, OPA16, OPB9,
dan OPJ 2, terdapat pula primer yang hanya mampu mengamplifikasi sampel 3
saja seperti primer OPA17, OPA18, OPB2, OPJ5.
8
M r
t
r t
r t
M
r
t
r
t
r
t
M
4 kb
2 kb
1.5 kb
2 kb
1.5 kb
1 kb
0.5 kb
0.7 kb
0.5 kb
0.4 kb
M
OPA1
OPA3
OPA6
M OPA7
OPA8
OPA10 M
Gambar 4 Profil elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu dengan primer
OPA1, OPA3, OPA6, OPA7, OPA8, dan OPA10
M
r
t
r
t
r
t
r
t
r t
r
t
r
t
r
t
r
t
r
t
M
3 kb
2 kb
1.5 kb
1 kb
1.5 kb
1 kb
0.7kb
0.5 kb
0.5 kb
0.4 kb
0.3kb
M
OPA11OPA12 OPA13 OPA14 OPA15 OPA17 OPA18
OPA19 OPA20
M
Gambar 5 Profil elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu dengan primer
OPA11 OPA12 , OPA13, OPA 14, OPA15, OPA17, OPA18, OPA19, dan
OPA20
M
r t r t
r
t
M
OPB1 OPB2
OPB4
r
t
r
t
r
t
M r t
r t
M
r
t
5 kb
3 kb
2 kb
1 kb
0.7 kb
0.5 kb
0.4 kb
0.2 kb
OPB7 OPB8
OPB10 M OPB11 OPB12 M OPB20
Gambar 6 Profil elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu dengan primer
OPB1, OPB2, OPB3, OPB4, OPB7, OPB8, OPB10, OPB11, OPB12,
OPB20
Keterangan :
M=1 kb plus DNA Ladder
r= sampel 3 (sagu berkadar pati rendah)
t= sampel 4 (sagu berkadar pati tinggi)
9
M
r
t
r
t r t r t
r t r t
r t r t
3 kb
2 kb
1.5 kb
1 kb
0.7 kb
0.5 kb
M
OPJ1
OPJ3 OPJ4 OPJ5 OPJ6 OPJ7 OPJ8
OPJ10
Gambar 7 Profil elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu dengan primer
OPJ1, OPJ3, OPJ4, OPJ5, OPJ6, OPJ7, OPJ8, dan OPJ10
M
r t
r t
r t
r t
r t
r t
M
r
t r
t
2 kb
1.5 kb
1 kb
0.7 kb
0.5 kb
0.2 kb
M OPD4 OPD 5OPD7 OPD8 OPN6 OPN7
M OPN8
OPN9
Gambar 8 Profil elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu dengan primer
OPD4, OPD5, OPD7, OPD8, OPN6, OPN7, OPN8, dan OPN9
Keterangan :
M=1 kb plus DNA Ladder
r= sampel 3 (sagu berkadar pati rendah)
t= sampel 4 (sagu berkadar pati tinggi)
PEMBAHASAN
Kadar Air Empulur Sagu
Pengeringan merupakan proses pengurangan kadar air bahan hingga
mencapai kadar air tertentu sehingga menghambat laju kerusakan bahan akibat
aktifitas biologis dan kimia (Brooker et al. 2004). Variasi jumlah kadar air sering
dijumpai pada bahan. Variasi kadar air ini akan mempengaruhi lamanya proses
pengeringan sehingga perlu diketahui berapa persen kadar air pada bahan saat
basah dan pada saat kering (Brooker et al. 2004).
Uji kadar air merupakan uji yang penting karena kadar air dalam empulur
mempengaruhi lamanya masa penyimpanan dan mempengaruhi banyaknya
kandungan pati dalam empulur. Hasil pengukuran kadar air disajikan pada
Gambar 1. Berdasarkan Gambar 1, rata-rata kadar air empulur sagu bulan Maret
2014 berkisar antara 86.43% sampai 90.36% sedangkan rata-rata kadar air
empulur sagu bulan Juli 2014 berkisar antara 85.98% sampai 88.61%. Nilai
10
tersebut lebih besar jika dibandingkan dengan penelitian Haryanto (1987) yaitu
sebear 64.80%. Menurut Jong (1995), kadar air tinggi dan konstan selama batang
nya masih muda sagu yang telah dewasa mengalami penurunan terutama pada
batangnya. Penurunan kadar air empulur sagu mungkin saja disebabkan oleh usia
tanaman yang bertambah tua.
Kadar Pati Empulur Sagu
Pengukuran kadar pati bertujuan untuk menentukan sampel yang
digunakan saat RAPD. Kadar pati diukur pada bulan Maret 2014 dan Juli 2014.
Kadar pati empulur sagu disajikan pada Gambar 2. Sampel 2 bulan Maret 2014
memiliki kadar pati tertinggi, sampel 4 memiliki kadar pati kedua tertinggi dan
sampel 3 memiliki kadar pati terendah. Sampel 4 bulan Juli memiliki kadar pati
tertinggi sedangkan sampel 3 tetap memiliki kadar pati terendah. Berdasarkan
Gambar 2 dan 3, sampel 4 konsisten memiliki kadar pati tinggi dan sampel 3
konsisten memiliki kadar pati rendah. Menurut Yamamoto (2004), kandungan pati
tertinggi di dalam empulur berada saat tahap berbunga setelah itu kandungannya
berkurang karena translokasi menjadi bunga dan buah.
Sampel bulan Maret 2014 dan Juli 2014 memiliki kadar pati yang berbeda
meskipun sampel tersebut berasal dari satu tanaman yang sama. Sampel 1, 3 dan 4
mengalami peningkatan kadar pati. Hal tersebut mungkin saja terjadi jika tanaman
tersebut semakin bertambah tua saat bulan Juli 2014. Menurut Haryanto et al.
(1992) semakin tua umur tanaman sagu, maka kandungan pati dalam empulur
sagu akan semakin banyak. Sampel 2 mengalami penurunan kadar pati hal
tersebut juga mungkin saja terjadi jika tanaman sagu berada tahap berbunga
(Yamamoto 2004) dan proses produksi pati sedikit.
Li et al. (2002) dan Smidansky et al (2002) melaporkan bahwa produksi
pati diregulasi oleh enzim ADP-glukose phosporilase (AGPase). AGPase telah
diidentifikasi sebagai enzim inti untuk biosintesis pati dan polimerasi karbohidrat.
Biosintesis pati dalam umbi diidentifikasi tergantung pada enzim AGPase yang
distimulasi saat sintesis pati (Tiessen et al. 2002). Enzim α-glucan water kinase
merupakan enzim inti untuk regulasi posporilasi pati sehingga pati yang dibentuk
oleh tumbuhan dapat dimobilisasi dan ditransportasikan (Blennow et al. 2002).
Kuantitas dan Kualitas DNA Daun Sagu
Isolasi DNA daun sagu dilakukan pada sampel 1, 2, 3, dan 4 pada bulan
Maret 2014 dan Juli 2014. Hasil isolasi diuji kuantitas dan kualitasnya agar
diperoleh DNA yang memadai untuk amplifikasi DNA secara RAPD. Kuantitas
DNA daun sagu diukur dengan spektrofotometer NanoDrop.
Asam nukleat dan protein mempunyai absorbansi maksimum pada A 260
nm dan A 280 nm. Rasio absorbansi pada panjang gelombang tersebut digunakan
untuk mengukur kemurnian ekstraksi asam nukleat dan protein. Kemurnian DNA
ditunjukkan oleh Tabel 1 dan 2. Menurut Das et al. (2009) DNA memiliki kualitas
yang baik jika nilai A260/280 antara 1.6-1.7 namun menurut William et al. (1997)
A260/A280 berada pada rentang 1.8-2.00. Merujuk pada penelitian William et al.
(1997), hasil isolasi DNA daun sagu bulan Maret 2014 dan Juli 2014
menunjukkan bahwa sampel 1, 2, 3 dan 4 bebas dari kontaminasi protein.
11
Rasio A260/A230 menunjukkan kemurnian DNA terhadap polisakarida.
Hasil isolasi DNA daun sagu bulan Maret 2014 dan Juli 2014 menunjukkan
bahwa sampel 1, 2, 3 dan 4 bebas dari kontaminasi polisakarida karena
A260/A230 lebih dari 1.8. Menurut Cruz et al. (1997), proses isolasi DNA
tanaman umumnya sulit dilakukan karena tanaman mengandung senyawa
polisakarida yang cukup besar. Polisakarida dapat dihilangkan dengan
penambahan pengendap yang selektif untuk asam nukleat seperti CTAB (Das et al.
2009).
Uji kualitas DNA dilakukan dengan elektroforesis gel agarose 0.8%. Gel
agarose 0.8% memiliki pori-pori yang cukup besar sehingga memudahkan DNA
melewati pori gel tersebut. Sampel DNA dan marker dielektroforesis secara
bersamaan. Marker yang digunakan adalah marker DNA lambda yang
menghasilkan pita tunggal dan cocok digunakan dalam agarose. Ukuran marker
lambda adalah 48.502 bp. Konsentrasi DNA daun sagu bulan Maret memiliki
konsentrasi antara 413.6-1632.7 (ng/µg) sedangkan konsentrasi DNA daun sagu
bulan Juli yang didapat berada pada rentang 261-403.3(ng/µg) (Tabel 1).
Berdasarkan Gambar 4, hasil isolasi DNA memiliki kualitas yang cukup baik
karena DNA hasil elektroforesis tidak terdegradasi.
Elektroforegram hasil RAPD DNA Daun Sagu
Kemampuan suatu primer untuk mengamplifikasi DNA dari suatu genom
tanaman selain ditentukan oleh jumlah dan kualitas DNA juga ditentukan oleh
adanya situs (sekuen) pada DNA cetakan yang homolog dengan urutan basa-basa
dari primer yang digunakan. Jika di dalam DNA cetakan yang digunakan tidak
mempunyai situs homolog, maka DNA cetakan tidak akan diamplifikasi. Hal itu
ditandai dengan tidak adanya pita DNA di dalam gel agarose hasil elektroforesis.
Oleh karena itu langkah awal yang perlu dilakukan adalah seleksi primer yang
dapat mengamplifikasi DNA genom tanaman sagu yang dihasilkan dalam bentuk
pita-pita DNA (Manoj et al. 2005). Seleksi primer yang dilakukan pada
penelitian adalah melihat kemampuan primer dalam membedakan pola RAPD
sampel 3 dan 4 yang memiliki kadar pati berbeda berdasarkan polimorfis yang
dihasilkan saat elektroforesis.
Pita RAPD terbentuk dari pemanjangan primer yang menempel pada DNA
cetakan yang terjadi secara berulang. Setiap primer dapat menempel secara
bersamaan pada beberapa situs homolog yang tersebar di dalam DNA cetakan dan
hasil pemanjangan primer tersebut memiliki ukuran yang sangat bervariasi. Oleh
karena itu di dalam hasil elektroforesis menggunakan gel agarose terlihat
beberapa pita dengan ukuran berbeda (Upadhyay et al. 2004).
Sampel dan marker dielektroforesis secara berdampingan. Marker yang
digunakan adalah 1 kb+ DNA Ladder yang memiliki ukuran antara 0.075 kb-20
kb. Berdasarkan hasil elektroforesis, primer OPA9 (Gambar 4), OPA16 (Gambar
5), OPB3 (Gambar 6), OPB9 (Gambar 6), OPJ2 (Gambar 7) tidak dapat
mengamplifikasi sampel karena tidak terdapatnya pita DNA yang dihasilkan
(data tidak ditampilkan dalam elektroforegram). Hal itu menunjukkan bahwa
primer tidak menemukan sekuen yang sesuai. Kemungkinan lainnya adalah
primer tersebut menempel pada dua situs pada DNA cetakan yang memiliki jarak
12
yang cukup jauh sehingga tidak mampu diamplifikasi oleh enzim DNA Taq
polimerase (Pandin 2010).
Primer yang menghasilkan pita paling sedikit adalah OPA15 (Gambar 5),
OPB2 (Gambar 6), OPB8 (Gambar 6), OPD4 (Gambar 8). Primer tersebut hanya
menghasilkan satu pita pada sampel 3 dan 4. Primer yang menghasilkan pita DNA
paling banyak antara 6-8 pita adalah OPA3 (Gambar 4), OPA8 (Gambar 4), dan
OPA10 (Gambar 4). Upadhyay et al. (2004) melaporkan bahwa jumlah pita DNA
yang terdeteksi dalam setiap primer bergantung pada urutan basa dari primer dan
ada atau tidaknya variasi dalam genotipe tertentu.
Primer OPA1(Gambar 4), OPA17 (Gambar 5), OPA18 (Gambar 5),
OPA19 (Gambar 5), OPA20 (Gambar 5), OPB2 (Gambar 6), OPB4 (Gambar 6),
OPB10 (Gambar 6), OPJ1 (Gambar 7), OPJ 5 (Gambar 7), OPJ8 (Gambar 7)
mampu membedakan sagu berkadar pati tinggi dan rendah. OPA 1 hanya mampu
mengamplifikasi sampel 4, OPA17, OPA18 dan OPJ5 hanya mampu
mengamplifikasi sampel 3. OPA19 dan OPA20 mampu membedakan sampel
dengan menghasilkan satu polimorfis namun pita yang dihasilkan sangat tipis
sehingga sulit untuk dilihat ukuran DNA nya. OPB2 dan OPB 8 (Gambar 6 )
sama-sama menghasilkan satu pita dengan ukuran yang sama namun intensitas
pita DNA sampel 4 lebih tipis dibandingkan sampel 3. OPB4 menghasilkan satu
polimorfis pada sampel 4 berukuran 4 kb. OPB10 menghasilkan satu polimorfis
pada sampel 4 berukuran 2 kb. OPJ1 menghasilkan polimorfis pada sampel 4
berukuran 2 kb. OPJ8 membedakan sampel dengan menghasilkan satu polimorfis
pada sampel 3 berukuran 0.4 kb.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Sampel yang memiliki kadar pati terendah adalah sampel 3 yaitu sebesar
24.46 % pada bulan Maret 2014 dan 25.02% pada bulan Juli 2014 sedangkan
sampel yang memiliki kadar pati tertinggi adalah sampel 4 yaitu sebesar 36.82 %
pada bulan Maret 2014 dan 41.36% pada bulan Juli 2014. Primer yang mampu
membedakan pola RAPD sampel sagu berkadar pati tinggi dan rendah adalah
primer OPA1, OPA 17, OPA18, OPA19, OPA20, OPB2, OPB4, OPB10, OPJ1,
OPJ 5, dan OPJ8.
Saran
Primer yang mampu membedakan sagu berkadar pati tinggi dan rendah
perlu diuji stabilitasnya dengan menggunakan sampel sagu dengan asal yang
berbeda.
DAFTAR PUSTAKA
[AOAC] Association of Official Analytical Chemist. The Association of Official
Analytical Chemist. 2000. Official Method of Analysis of The Associattion
of Official Analytical of Chemist Arlington: Inc.
13
Blennow A, Nielsen TH, Baunsgaard L, Mikkelsen R, Engelsen SB. 2002. Starch
phosphorylation: a new front line in starch research. Trends Plant Sci
7(10):445-450.
Das BK, Jena RC, Samal KC. 2009. Optimization of DNA isolation and PCR
protocol for RAPD analysis of banana/plantain (Musa spp). In ternational J
Agri Sci1(2):21-25.
Brooker. 2004. Mengukur faktor kekeringan dalam proses pengeringan. Teknologi
2(1):70-79.
Bujang KB, Adeni DSA. 2000. Effects of dilution rate and pH control in ethanol
fermentation of hydrolyzed sago starch. In: H.M.H. Bintoro et al. (eds.).
SAGO 2000. Proc. Int. Sago Seminar, Bogor. March 22-23, 2000. p.117-23.
Cruz M, Ramirez F, Hernandez H. 1997. DNA isolation and amplification from
cacti. Plant Molecular Biology Report (15): 319-325.
Haryanto, Bambang, P Pangloli.
Sagu.Yogyakarta :Kanisius.
1992.
Potensi
dan
Pemanfaatan
Jong FS. 1995. Reseach for development of sago palm (Metroxylon sagu Rottb.)
cultivation
in
Sarawak,
Malaysia.
[thesis].
Wageningen(ID):
Lanbouwuniversiteit.
Jong FS, Adi W. 2007. Sagu potensi besar pertanian Indonesia. Iptek Tanaman
Pangan 1(2):54-6.
Lakuy H dan J Limbongan. 2003. Beberapa hasil kajian dan teknologi yang
diperlukan untuk pengembangan sagu di Provinsi Papua. Prosiding Seminar
Nasional Sagu; 2003 Oktober 6; Manado. Indonesia: Balai Penelitian
Tanaman Kelapa dan Palma Lain.
Li X, Xing J, Gianfagna TJ, Janes HW. 2002. Sucrose regulation of ADP-glucose
pyrophosphorylase subunit genes transcript levels in leaves and fruits. Plant
Sci 162(2):239-244.
Manoj T, NK Singh, M Rathore, And N Kumar. 2005. RAPD markers in the
analysis of genetic diversity among common bean germplasm from Central
Himalaya. Genetic Res Crop Evol 52(3):315- 324.
Orozco-Castillo, KJ Chalmera, R Waugh and W Powell. 1994. Detection of
genetic diversity and selective gene introgression in coffee using RAPD
marker. Theor Appl Genet 87: 934-938.
Pandin DS. 2009. Keragaman genetik kultivar kelapa dalam mapanget (dmt) dan
dalam tenga (dta) berdasarkan penanda random amplified polymorphic
DNA (RAPD). Buletin Palma 36: 17-27.
Pandin DS. 2010. Keragaman genetik kelapa dalam Bali (dbi) dan dalam sawarna
(dsa) berdasarkan penanda random amplified polymorphic DNA (RAPD).
Littri 16(2):83-89.
Polnaya. 2006. Kegunaan pati sagu alami dan termodifikasi serta karakteristiknya.
Agroforestri 1(3):50-56.
14
Sharma A, AG Namdeo, KR Mahadik. 2008. Molecular markers: new prospects
in plant genome analysis. Pharmacognosy Reviews 2(3): 23- 31.
Setyowati N. 2013. Optimasi isolasi DNA dan PCR-RAPD pada tanaman Garut
(Maranta arundinacea L) lokal DIY [skripsi]. Yogyakarta (ID): Universitas
Islam Negeri Sunan Kalijaga.
Smidansky ED, Clancy M, Meyer FD, Lanning SP, Blake NK, Talbert LE, Giroux
MJ. 2002. Enhanced ADP-glucose pyrophosphorylase activity in wheat
endosperm increases seed yield. Proc Nat Acad Sci 99(3):1724-1729.
Sumaryono. 2007. Tanaman sagu sebagai sumber energi alternatif. Warta
Penelitian dan Pengembangan Pertanian 29(4):3-4.
Suryanto D. 2003. Melihat keanekaragaman organisme melalui beberapa teknik
genetika molekuler. USU digital library; [2014 April 2]: Sumatra Utara.
Tiessen A, Hendriks JH, Stitt M, Branscheid A, Gibon Y, Farre EM,
Geigenberger P. 2002. Starch synthesis in potato tubers is regulated by posttranslational redox modification of ADP-glucose pyrophosphorylase: a
novel regulatory mechanism linking starch synthesis to the sucrose supply.
Plant Cell 14(9):2191-2213.
Tjasadihardja A. 1987. Hubungan antara pertambahan pucuk, perkembangan buah
serta tingkat kandungan asam indol asetat di dalam biji dan layu pentil
kakao [disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Upadhyay A, Jayadev K, Manimekalai R, Parthasarathy V. 2004. Genetic
relationship and diversity in Indian coconut accession based on RAPD
markers. Scientia Horticulturae 99:353-362.
William W, Wilfinger, Karol Mackey, and Piotr Chomczynski. 1997. Effect of pH
and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid
purity. Biotechniques 22:474-481.
Yamamoto Y. 2004. Starch accumulation proses and varietal and/ or regional
differences in starch productivity in sago palm (Metroxylon sagu ).
Prosiding. Seminar Nasional Sagu dan Palma penghasil Karbohidrat. Hal 23. Bogor.
15
Lampiran 1 Bagan alir penelitian
Preparasi sampel
Empulur sagu
Daun sagu
Penetapan kadar air
Isolasi DNA
Penetapan kadar pati
Uji kuantitas
kualitas DNA
Amplifikasi DNA
daun sagu dengan
primer acak (RAPD)
dan
20
16
Lampiran 2 Kadar air empulur sagu bulan Maret 2014
Sampel
1
1
1
Rata- rata
2
2
2
Rata- rata
3
3
3
Rata- rata
4
4
4
Rata- rata
1
2
3
27.65
28.60
27.28
Bobot
sampel
(gram )
2.00
2.00
2.00
1
2
3
2.00
2.00
2.00
29.24
30.36
29.75
27.45
28.57
27.97
27.23
28.35
27.75
1
2
3
28.06
28.44
28.25
2.00
2.00
2.01
30.06
30.45
30.26
28.26
28.64
28.44
1
2
3
28.75
29.44
28.66
2.01
2.03
2.00
30.76
31.48
30.66
28.97
29.67
28.88
Ulangan
Bobot cawan
kosong (gram)
Cawan kosong+
sampel sebelum
dikeringkan
29.66
30.60
29.29
Cawan kosong+
sampel setelah
dikeringkan
27.93
28.85
27.56
%Kadar air
86.05
87.16
86.08
86.43 0.24
89.20
88.87
88.80
88.96 0.41
90.33
90.31
90.45
90.36 0.39
88.71
88.88
89.07
88.89 0.05
17
17
Lampiran 3 Kadar air empulur sagu bulan Juli 2014
Bobot cawan
kosong
Bobot
Sampel
Ulangan
(gram)
sampel
(gram )
1
1
27.77
1.00
1
2
27.75
1.00
1
3
28.50
1.00
Rata- rata
2
1
27.67
1.00
2
2
28.49
1.00
2
3
27.65
1.00
Rata- rata
3
1
28.18
1.00
3
2
30.64
1.00
3
3
28.34
1.00
Rata- rata
4
1
28.22
1.00
4
2
27.96
1.00
4
3
27.03
1.00
Rata- rata
Cawan kosong+ Cawan kosong+
sampel sebelum sampel setelah
dikeringkan
dikeringkan
(gram )
(gram)
28.77
27.90
28.76
27.89
29.51
28.64
28.67
29.50
28.65
27.79
28.62
27.78
29.18
31.65
29.34
28.29
30.75
28.45
29.22
28.96
28.04
28.34
28.08
27.15
%Kadar air
86.26
85.82
85.87
85.98 0.63
87.65
86.85
87.04
87.18 0.21
88.25
89.03
88.57
88.62 0.07
87.91
87.84
87.95
87.90 0.18
20
18
19
Lampiran 4 Contoh perhitungan kadar air
Sampel 4R ulangan 1
Rumus untuk menghitung kadar air adalah sebagai berikut:
Kadar air (%)=
Keterangan : w1= bobot cawan dan sampel sebelum dikeringkan
w2= bobot cawan dan sampel sebelum dikeringkan
w3= bobot sampel
=
=87.9147%
Lampiran 5 Kurva standar D- Glukosa bulan Maret 2014
Konsentrasi (ppm)
Absorbansi
0
0
50
0.2699
100
0.5027
150
0.6997
200
0.981
250
1.1596
300
1.3685
1,6
Absorbansi
18
1,4
1,2
1
0,8
0,6
y = 0,0045x + 0,0299
R² = 0,9973
0,4
0,2
0
0
100
200
300
Konsentrasi (ppm)
400
19
20
19
Lampiran 6 Kurva standar D- Glukosa bulan Juli 2014
Konsentrasi (ppm)
0
50
100
150
200
Absorbansi
0
0.2147
0.5206
0.701
0.8303
1
absorbansi
0,8
0,6
y = 0,0043x + 0,0239
R² = 0,9798
0,4
0,2
0
0
50
100
150
Konsentrasi (ppm)
Lampiran 7 Absorbansi empulur sagu bulan Maret 2014
Sampel
1
2
3
4
Ulangan
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
Absorbansi
empulur
0.5077
0.4863
0.5008
0.7722
0.7368
0.6670
0.4849
0.4679
0.4763
0.7072
0.7029
0.6839
Konsentrasi
empulur
(ppm)
106.17
101.45
104.64
164.95
157.08
141.57
101.11
97.33
99.20
150.51
149.55
145.33
200
250
20
20
20
Lampiran 8 Absorbansi empulur sagu bulan Juli 2014
Sampel
Ulangan
1
Absorbansi
empulur
0.6483
0.6406
0.5945
0.549
0.4582
0.4603
0.7085
0.7658
1
2
1
2
1
2
1
2
2
3
4
Konsentrasi
empulur (ppm)
145.21
143.42
132.70
122.12
101.00
101.49
159.21
172.53
Keterangan : konsentrasi empulur sebanding dengan konsentrasi D-glukosa
Lampiran 9 Kadar pati empulur sagu bulan Maret 2014
Sampel
1
Rata-rata
2
Rata-rata
3
Rata-rata
4
Rata-rata
Ulangan
Rata-rata
%kadar air
empulur
1
2
3
86.43
86.43
86.43
Bobot
kering
empulur
(mg)
100.80
101.00
101.50
1
2
3
88.96
88.96
88.96
102.90
100.30
102.60
1
2
3
90,36
90,36
90,36
101,00
100,80
102,40
1
2
3
88.89
88.89
88.89
101.30
100.40
100.70
% Kadar
pati
26.33
25.10
25.77
25.73 0.61
40.07
39.15
34.50
37.90 2.99
25.03
24.14
24.22
24.46 0.49
37.14
37.24
36.08
36.82 0.64
21
21
21
Lampiran 10 Kadar pati empulur sagu bulan Juli 2014
Sampel
1
Rata-rata
2
Rata-rata
3
Rata-rata
4
Ulangan
Rata-rata
%kadar air
empulur
1
2
85.99
85.99
Bobot
kering
empulur
(mg)
101.3
101.5
1
2
87.18
87.18
100.7
101.3
1
2
88.62
88.62
100.9
100.8
1
2
87.90
87.90
100.0
100.5
Rata-rata
% Kadar pati
35.83
35.32
35.58 0.36
32.94
30.13
31.54 1.98
25.02
25.17
25.02 0.10
39.80
45.91
41.36 4.32
Lampiran 11 Contoh perhitungan kadar pati
Rumus untuk menghitng kadar pati adalah sebagai berikut :
y=ax+b
x dicari untuk mendapat konsentrasi sampel empulur
% kadar pati = Konsentrasi yang didapat x pengenceran x 0.05 Lx100%
Bobot sampel kering
Sampel 1 ulangan 1
y = 0.0043x + 0.0239
0.6483= 0.0043x + 0.0239
0.6483-0.0239== 0.0043x
X= 145.21
% kadar pati = 145.2093 mg/mLx 5 x 0.05 L x100%
101.3 mg
= 35.83%
Keterangan : 0.05 L = 50 ml (pengenceran saat di labu ukur)
22
20 22
Lampiran 12 Primer yang digunakan dan pita yang dihasilkan
No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
Primer
OPA 1
OPA 3
OPA 6
OPA 7
OPA 8
OPA 9
OPA 10
OPA 11
OPA 12
OPA 13
OPA 14
OPA 15
OPA 16
OPA 17
OPA 18
OPA 19
OPA 20
OPB 1
OPB 2
OPB 3
OPB 4
OPB 7
OPB8
Total
4
8
6
4
7
0
6
3
2
6
3
1
0
1
3
4
5
6
1
0
7
2
1
Jumlah pita DNA
Polimorfik Monomorfik
1
3
0
8
1
5
0
4
0
7
0
0
0
6
0
3
0
2
0
6
0
3
0
1
0
0
1
0
3
0
1
3
1
4
0
6
0
1
0
0
1
6
0
2
0
1
No
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
Primer
OPB 9
OPB 10
OPB 11
OPB 12
OPB 20
OPJ 1
OPJ 2
OPJ 3
OPJ 4
OPJ 5
OPJ 6
OPJ 7
OPJ 8
OPJ 10
OPD 4
OPD 5
OPD 7
OPD 8
OPN 6
OPN 7
OPN 8
OPN 9
Total
0
2
1
4
3
3
0
1
3
4
4
1
2
5
1
2
2
5
5
2
5
3
Jumlah pita DNA
Polimorfik Monomorfik
0
0
1
1
0
1
0
4
0
3
2
1
0
0
0
1
0
3
4
0
0
4
0
1
1
1
0
5
0
1
1
1
0
2
0
5
0
5
0
2
0
5
0
3
20
23
23
RIWAYAT HIDUP
Penulis bernama Ifroh Jatidiri Media. Penulis adalah anak ke-empat dari
lima bersaudara. Penulis berasal dari Cilegon-Banten. Jenjang pendidikan yang
dilalui penulis sampai saat ini adalah SMA Negeri Cahaya Madani Banten
(Boarding School) tahun 2007-2010 dan kuliah di Institut Pertanian Bogor tahun
2010-2014. Organisasi yang diikuti penulis selama masa pendidikan antara lain:
staff kajian strategi Badan Eksekutif Mahasiswa Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor tahun 2011, staff Human Research
Development Paguyuban Karya Salemba Empat Institut Pertanian Bogor tahun
2011, ketua divisi Master Program Paguyuban Karya Salemba Empat Institut
Pertanian Bogor tahun 2012, dan ketua divisi Edukasi Paguyuban Karya Salemba
Empat Institut Pertanian Bogor tahun 2013. Penulis pernah melaksanakan
praktik lapang di Laboratorium Mikrobiologi, PT Jawa Manis
CiwandanCilegon dengan judul Analisis Total Plate Count, Yeat Mold, dan Patogen
Salmonella pada Gula Rafinasi.
(Metroxylon sagu) DENGAN TEKNIK RAPD
IFROH JATIDIRI MEDIA
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Analisis Keragaman
Pati pada Tanaman Sagu (Metroxylon sagu) dengan Teknik RAPD adalah benar
karya saya dengan arahan dari pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa
pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada
Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Januari 2015
Ifroh Jatidiri Media
G84100077
ABSTRAK
IFROH JATIDIRI MEDIA. Analisis Keragaman Pati pada Tanaman Sagu
(Metroxylon sagu) dengan Teknik RAPD. Dibimbing oleh MEGA SAFITHRI dan
ASMINI BUDIANI.
Riset terkait pengembangan sagu secara molekuler masih tertinggal
padahal Indonesia memiliki sumber genetik sagu yang beragam. Sumber genetik
tersebut merupakan aset bagi pemuliaan tanaman yang menghasilkan karakter
tanaman yang unggul. Tujuan dari penelitian ini adalah menganalisis pola RAPD
pada tanaman sagu yang memiliki kadar pati tinggi dan kadar pati rendah.
Tahapan penelitian terdiri atas ekstraksi pati empulur sagu, isolasi DNA daun
sagu dan amplifikasi DNA daun sagu secara RAPD. Sebanyak 45 primer
digunakan untuk melihat pola RAPD sagu berkadar pati tinggi dan rendah.
Primer yang mampu membedakan pola RAPD sagu berkadar pati tinggi dan
rendah antara lain primer OPA1, OPA 17, OPA18, OPA19, OPA20, OPB2, OPB4,
OPB10, OPJ1, OPJ 5, dan OPJ8.
Kata kunci: Sagu, pati, RAPD, primer
ABSTRACT
IFROH JATIDIRI MEDIA. Analysis Starch Diversity in Sago Plant (Metroxylon
sagu) by RAPD Technique. Supervised by MEGA SAFITHRI and ASMINI
BUDIANI.
Reseach about sago’s development in molecular still left behind whereas
Indonesia has genetic diversity source of Sago. Source genetik is an aset for plant
glorification that can produce good character. The objective of this reseach is to
analysis RAPD Pattern in sago that has high starch content and low starch content.
There were some treatments in this research, they were extraction sago stach
from pith, isolation DNA of leaf sago DNA and amplification leaf sago DNA by
RAPD. It’s about 45 primers used for looking differences RAPD Pattern of high
starch and low starch sago. Primers that can different RAPD Pattern of high starch
and low starch sago are primer OPA1, OPA 17, OPA18, OPA19, OPA20, OPB2,
OPB4, OPB10, OPJ1, OPJ 5, and OPJ8.
Keywords: Sago, starch, RAPD, primer
ANALISIS KERAGAMAN PATI PADA TANAMAN SAGU
(Metroxylon sagu) DENGAN TEKNIK RAPD
IFROH JATIDIRI MEDIA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Judul Skripsi : Analisis Keragaman Pati pada Tanaman Sagu (Metroxylon sagu)
dengan Teknik RAPD
Nama
: Ifroh Jatidiri Media
NIM
: G84100077
Disetujui oleh
Dr Mega Safithri, SSi MSi
Pembimbing I
Dr Asmini Budiani, MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr I Made Artika, MAppSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT yang telah
melimpahkan karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan degan
baik. Karya ilmiah diberi judul “Analisis Keragaman Pati pada Tanaman Sagu
(Metroxylon sagu) dengan Teknik RAPD”.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada semua pihak yang telah
membantu penulis selama pelaksanaan penelitian maupun penulisan karya ilmiah,
antara lain: Dr. Mega Safithri, SSi MSi selaku pembimbing I yang selalu memberi
bimbingan dan dukungan agar penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah tepat
waktu, Dr. Asmini Budiani, MSi selaku pembimbing II yang memberi bimbingan
dan kesempatan penulis untuk melakukan penelitian di Balai Penelitian dan
Bioteknologi Perkebunan Indonesia. Ungkapan terima kasih juga penulis ucapkan
kepada orang tua penulis yaitu Bapak M Buang Jamil dan Ibu Mutayanah serta
Teh Umi, Ka Fauji dan Taruna yang selalu mendoakan dan memberi motivasi
agar penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah dengan baik. Yayasan beasiswa
Karya Salemba Empat yang telah membantu penulis dalam hal finansial selama
kuliah di IPB. Teh Rini, Teh Niyyah, Mba Emi dan Ica yang mengajari penulis
selama di Laboratorium Biomolekuler. Layyinah, Irna, Regina, Resti dan Dimas
yang membuat lab semakin ramai sehingga penulis merasa nyaman selama
penelitian. Tidak lupa untuk teman-teman satu angkatan biokimia 47 selaku
teman seperjuangan yang selalu mendukung satu sama lain.
Penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun atas karya ilmiah
ini sehingga dapat berguna bagi penulis sendiri khususnya maupun pembaca
umumnya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat demi kemajuan ilmu pengetahuan.
Bogor, Januari 2015
Ifroh Jatidiri Media
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
PENDAHULUAN
METODE
Alat
Bahan
Metode
HASIL
Kadar air empulur sagu
Kadar pati empulur sagu
Kuantitas dan kualitas DNA daun sagu
Elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu
PEMBAHASAN
Kadar air empulur sagu
Kadar pati empulur sagu
Kuantitas dan kualitas DNA daun sagu
Elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP
iv
iv
iv
1
2
2
2
2
5
5
6
6
7
9
9
10
11
11
12
12
13
12
15
23
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
Kadar air empulur sagu bulan Maret 2014 dan Juli 2014
Kadar pati empulur sagu bulan Maret 2014 dan Juli 2014
Kualitas DNA daun sagu bulan Maret 2014 dan Juli 2014
Profil elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu dengan
primer OPA1, 3, 6, 7, 8, dan 10
Profil elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu dengan primer
OPA11, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19 dan 20
Profil elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu dengan primer
OPB 1 ,2 ,3 ,4 ,7 , 8 , 10,11, 12, dan 20
Profil elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu dengan primer
OPJ 1,3-6, 7,810
Profil elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu dengan primer
OPD 4, 5, 7, 8, OPN 6- 9
5
6
7
8
8
8
9
9
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Alur penelitian
Kadar air empulur sagu bulan Maret 2014
Kadar air empulur sagu bulan Juli 2014
Contoh perhitungan kadar air
Kurva standar D-glukosa bulan Maret 2014
Kurva standar D-glukosa bulan Juli 2014
Absorbansi empulur sagu bulan Maret 2014
Absorbansi empulur sagu bulan Juli 2014
Kadar pati empulur sagu bulan Maret 2014
Kadar pati empulur sagu bulan Juli 2014
Contoh Perhitungan kadar pati
Primer-primer yang digunakan dan jumlah pita yang dihasilkan
15
16
17
18
18
19
19
20
20
21
21
22
20
PENDAHULUAN
Sagu (Metroxylon sp) adalah tumbuhan suku palma yang batangnya dapat
menghasilkan pati. Produktivitas pati sagu lebih tinggi dibandingkan tanaman
penghasil karbohidrat lain. Sagu mampu menghasilkan pati kering 10-25
ton/ha/tahun sedangkan pati kering jagung hanya 5,5 ton/ha/tahun, produktivitas
pati kering padi 6 ton/ha/tahun, dan produktivitas pati kering ubi kayu dan
kentang adalah 10-15 ton/ha/tahun (Sumaryono 2007). Sagu mampu memberikan
pati yang lebih murah karena daya hasil yang lebih tinggi dibanding tanaman lain
sehingga harganya amat bersaing (Bujang dan Adeni 2000).
Kebutuhan pati bagi industri dunia saat ini sekitar 50 juta ton per tahun
dengan laju pertumbuhan 7,7% per tahun (Jong et al. 2007). Pati digunakan
sebagai bahan dasar berbagai macam industri diantaranya sebagai bahan untuk
pembuatan roti, biskuit, mi, sohun, kerupuk dan lain sebagainya (Polnaya 2006)
sehingga produksinya di dunia terus meningkat dalam beberapa dasawarsa
terakhir. Sekitar 50% tanaman sagu dunia atau 1.128 juta ha sagu tumbuh di
Indonesia dan 90% dari 1.128 juta ha atau 1.015 juta ha berkembang di Provinsi
Papua dan Maluku (Lakuy dan Limbongan 2003).
Penelitian tentang pemuliaan tanaman sagu belum banyak dilakukan
padahal Indonesia memiliki sumber genetik sagu yang beragam,yang merupakan
aset penting bagi pemuliaan tanaman. Pemuliaan tanaman mampu menghasilkan
karakter yang unggul pada sagu seperti mampu memproduksi pati tinggi, tidak
berduri, dan memiliki rasa yang enak namun proses pemuliaan tanaman
membutuhkan waktu yang lama, oleh karena itu dibutuhkan teknologi yang
mampu mengatasi masalah tersebut. Berkembangnya teknologi marka molekuler
menjadikan proses karakterisasi keanekaragaman genetik tanaman dapat
dilakukan dengan mudah dan lebih cepat (Pandin 2009). Menurut Setyowati
(2013), perbedaan karakter seperti beda kadar pati merupakan indikasi adanya
keragaman genetik yang sangat bermanfaat untuk pemuliaan tanaman.
Beberapa teknik telah dikembangkan teknik yang dapat membantu para
pemulia untuk mempercepat proses seleksi. Salah satu teknik penanda molekuler
yang telah digunakan untuk melihat pola keragaman sebagai upaya untuk
mempermudah proses pemuliaan tanaman adalah Random Amplified Polymorphic
DNA (RAPD). RAPD digunakan untuk mengidentifikasi genotipe tanaman
karena memiliki beberapa kelebihan dalam pelaksanaan dan analisisnya (Suryanto
2003). Kelebihan RAPD adalah prosedurnya lebih mudah, murah, cepat, sampel
DNA yang diperlukan sedikit (0.5-50 ng) dan tidak memerlukan radioisotop
(Sharma et al. 2008).
Tujuan dari penelitian ini adalah menganalisis pola RAPD pada tanaman
sagu yang memiliki kadar pati tinggi dan kadar pati rendah. Hasil penelitian ini
diharapkan dapat memberikan informasi pola DNA sagu berkadar pati tinggi dan
rendah serta membantu mempercepat pemuliaan tanaman sagu dengan kadar pati
yang tinggi. Hipotesis penelitian ini adalah tanaman sagu dengan kadar pati tinggi
memiliki pola RAPD yang spesifik dan dapat dibedakan dengan pola RAPD
tanaman sagu berkadar pati rendah. RAPD dilakukan dengan mengamplifikasi
sampel dengan 45 primer.
2
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan dari bulan Maret sampai September 2014.
Pelaksanaan penelitian bertempat di Laboratorium Biomolekuler Balai Penelitian
dan Bioteknologi Perkebunan Indonesia Bogor.
Alat
Alat yang digunakan adalah oven, desikator, sentrifus Eppendorf 5804 R,
blender, vorteks, spektrofotometer NanoDrop, spektrofotometer Multiscan Go,
mesin PCR Esco APB10, Geldoc Alphamager Mini, elektroforesis set, timbangan,
dan peralatan pendukung lainnya.
Bahan
Bahan yang digunakan adalah empulur sagu, daun sagu, polivinil pirolidon
(PVP),
nitrogen
cair,
buffer
ekstraksi,
β-merkaptoetanol,
kloroform:isoamilalkohol, TE, isopropanol, natrium asetat, etanol absolut, etanol
70%, nuclease free water, RNAse, loading dye, gel red, agarose, marker lambda
DNA, marker 1 kb plus DNA Ladder, Tris borat EDTA (TBE), buffer MgCl2,
dNTP, primer, Taq DNA polimerase, akuades, asam perklorat, asam sulfat,
kertas saring, anthrone, es, dan standar D-glukosa.
Metode Penelitian
Preparasi Sampel Daun Sagu
Sampel sagu yang digunakan dalam penelitian berasal dari Parung. Sampel
diambil pada bulan Maret 2014 dan Juli 2014. Sampel daun sagu diberi kode
sampel 1, 2 ,3 dan 4. Pemberian kode bertujuan untuk memudahkan analisis saat
diberi perlakuan.
Daun tanaman sagu yang diprediksi memiliki kadar pati berbeda dipotongpotong lalu digerus dalam mortar dengan ditambahkan nitrogen cair dan ± 0,1
gram PVP. Daun yang telah menjadi serbuk disimpan dalam freezer untuk
digunakan dalam isolasi DNA.
Preparasi Sampel Empulur Sagu
Empulur sagu dipotong-potong lalu diblender hingga halus. Sampel batang
sagu yang halus lainnya diambil 3 x 2 gram untuk uji kadar air dan sisanya
dikeringkan dalam oven pada suhu 65 °C selama semalam. Sampel yang
dikeringkan disimpan dalam plastik pada suhu ruang untuk digunakan saat uji
kadar pati.
3
Penetapan Kadar Air (AOAC 2000)
Pengukuran kadar air empulur sagu dilakukan pada bulan Maret 2014 dan
Juli 2014 sebagai bulan (waktu) pengambilan sampel. Cawan dimasukan ke dalam
oven pada suhu 105 oC selama 3 jam. Cawan didinginkan dalam desikator selama
30 menit lalu bobotnya ditimbang. Sebanyak 2 gram empulur yang telah
dihaluskan dimasukkan ke dalam cawan Petri yang telah diketahui bobotnya,
kemudian dikeringkan dalam oven bersuhu 105 °C sampai bobotnya konstan.
Setelah itu dibiarkan dalam desikator dan ditimbang.
Pembuatan Kurva Standar (SNI 1998)
D-glukosa 1000 ppm disiapkan kemudian dibuat variasi konsentrasi dari
stok D-glukosa 1000 ppm. Variasi konsentrasi D-glukosa yang digunakan adalah
50, 100, 150, 200, 250, dan 300 ppm. Variasi konsentrasi dibuat dengan cara
mengambil larutan D-glukosa 1000 ppm dengan volume 50, 100, 150, 200, 250,
dan 300 µl kemudian ditambah akuades hingga totalnya 1000 µl atau 1 mL.
Larutan glukosa standar ditambah 10 mL pereaksi anthrone 0.1% (dilakukan
dalam wadah berisi es) lalu dikocok hingga homogen. Campuran divortex lalu
dipanaskan dalam penangas air pada suhu 100 ºC selama 7.5 menit kemudian
dibiarkan pada suhu ruang. Larutan diukur pada panjang gelombang 630 nm
dengan spektrofotometer UV-visible.
Kadar Pati (Tjasadihardja 1987)
Sebanyak 100 mg empulur yang sudah dikeringkan ditimbang kemudian
ditambah 2 mL akuades. Campuran divortex kemudian diinkubasi pada suhu 100
°C selama 15 menit (sesekali dikocok) kemudian campuran dibiarkan pada suhu
ruang. Campuran ditambah asam perklorat 9.2 N sebanyak 2 mL kemudian
didiamkan selama 15 menit (sesekali dikocok). Campuran ditambah akuades
hingga menjadi 10 mL. Campuran disentrifus pada kecepatan 15.000 rpm selama
15 menit. Pelet dipisahkan dengan supernatannya. Pelet ditambah asam perklorat
4.6 N sebanyak 2 mL kemudian didiamkan selama 15 menit (sesekali dikocok).
Campuran ditambah akuades hingga menjadi 10 mL. Campuran disentrifus pada
kecepatan 15.000 rpm selama 15 menit. Supernatan pada sentrifus kedua diambil
lalu digabung dengan supernatan pada sentrifus pertama. Campuran supernatan
ditera 50 mL kemudian disaring. Sebanyak 0.2 mL sampel diambil dan ditambah
0.8 mL akuades kemudian ditambahkan 10 mL pereaksi anthrone 0.1% (dilakukan
dalam wadah berisi es). Campuran ini dikocok lalu dipanaskan dalam penangas
air pada suhu 100 ºC selama 7.5 menit kemudian dibiarkan pada suhu ruang.
Larutan diukur pada panjang gelombang 630 nm dengan spektrofotometer
Multiscan Go.
Isolasi DNA (Orozco-Castillo 1994)
Serbuk daun yang telah dibuat sebelumnya dimasukan ke dalam tabung
sentrifus kemudian ditambahkan campuran 5 mL buffer ekstraksi dan 50 µL β-
4
merkaptoetanol yang telah dipanaskan 65 ºC. Larutan divortex kemudian
dipanaskan 65 °C selama 30 menit (dikocok setiap 10 menit sekali). Sampel
kemudian dibiarkan pada suhu ruang. Sampel ditambah 5 mL
kloroform:isoamilalkohol 24:1 lalu divortex hingga homogen. Larutan disentrifus
dengan kecepatan 11.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam
tabung sentrifus yang baru. Supernatan ditambahkan kloroform:isoamilalkohol
24:1 sebanyak satu volume, kemudian campuran disentrifus dengan kecepatan
11.000 rpm selama 10 menit. Supernatan diambil dan ditambah isopropanol
dingin sebanyak satu volume kemudian campuran disentrifus dengan kecepatan
11.000 rpm selama 10 menit. Pelet diambil lalu dikeringkan. Pelet ditambah 1 mL
senyawa Tris-EDTA kemudian ditambah CH3COONa 3 M 1/10 V dan etanol
absolut 2.5 mL. Campuran dikocok dan disimpan pada suhu -20 °C selama 30
menit atau semalam. Sampel kemudian disentrifus dengan kecepatan 11.000 rpm
selama 15 menit pada suhu 4 °C. Pelet diambil lalu ditambahkan etanol 70%.
Pelet didinginkan dengan speed vacum DNA. Pelet ditambahkan 100 µl nuclease
free water kemudian ditambahkan RNAse 25 µg/ mL. DNA diuji kuantitas
dengan spektrofotometer NanoDrop dan diuji kualitasnya dengan elektroforesis.
Uji Kuantitas dan Kualitas DNA
Kuantitas DNA daun sagu dilakukan dengan mengukur konsentrasi sampel
dengan spektrofotometer NanoDrop pada panjang gelombang 260 nm, 280 nm
dan 230 nm dengan batas kemurnian yang biasa dipakai dalam analisis molekuler
pada rasio A260/A280 dan A260/A230.
Kualitas DNA daun sagu divisualisasikan melalui elektroforesis gel
agarosa. Sebanyak 0.24 gram agarose ditimbang lalu dilarutkan dengan buffer
TBE 0.5x sebanyak 30 mL. Campuran ini kemudian dipanaskan di dalam
microwave pada suhu 70 °C selama 1.5 menit. Selanjutnya, ditambahkan gel red
1.5 µl ke dalam campuran lalu digoyang-goyang hingga campuran homogen.
Campuran ini kemudian dituang ke dalam cetakan gel elektroforesis. Campuran
dibiarkan hingga mengeras (30 menit). Setelah gel mengeras, gigi-gigi pencetak
sumur diangkat pelan-pelan lalu gel dimasukkan ke dalam bak elektroforesis
berisi buffer TBE 0.5 x 300 mL. Gel dimasukan dalam bak yang berisi buffer.
Sampel yang dicampur loading dye dimasukan ke dalam sumur. Elektroforesis
dijalankan dengan menggunakan tegangan sebesar 75 volt. Hasil elektroforesis
diamati dengan Geldoc Alphamager Mini.
Amplifikasi DNA Daun Sagu dengan Primer Acak (RAPD)
Amplifikasi DNA dilakukan dengan menggunakan mesin PCR Esco
APB10 dengan volume reaksi PCR sebanyak 12.5 μl. DNA diamplifikasi
sebanyak 44 siklus. Kondisi amplifikasi PCR yang digunakan adalah Pra PCR 92
˚C selama 2 menit, denaturasi 92 ˚C selama 3 menit 30 detik, pelekatan primer 35
˚C per 1 menit, pemanjangan DNA 72˚C per 2 menit, kemudian diatur suhu 92
˚C selama 1 menit untuk proses denaturasi, pelekatan primer 35 ˚C per 1 menit,
pemanjangan DNA 72 ˚C per 2 menit, pemanjangan DNA 72 ˚C selama 7 menit
pada siklus terakhir, dan suhu 10 ˚C untuk proses cooling. Primer yang digunakan
5
untuk mengamplifikasi DNA total tanaman sagu sebanyak 45 primer (Lampiran
12).
Elektroforesis Hasil RAPD
Sebanyak 0.45 gram agarose ditimbang lalu dilarutkan dengan larutan
buffer TBE 0.5x sebanyak 30 mL. Campuran ini kemudian dipanaskan di dalam
mikrowave pada suhu 70 °C selama 1.5 menit. Selanjutnya, ditambahkan gel red
ke dalam campuran lalu digoyang-goyang hingga campuran homogen. Campuran
ini kemudian dituang ke dalam cetakan gel elektroforesis. Campuran dibiarkan
hingga mengeras (kurang lebih 30 menit). Setelah gel mengeras, gigi-gigi
pencetak sumur diangkat pelan-pelan lalu gel dimasukkan ke dalam bak
elektroforesis. Bak diisi dengan buffer TBE 0.5 x 300 mL. Gel dimasukan dalam
bak yang berisi buffer TBE. Sebanyak 5 µl sampel hasil RAPD dipipet lalu
dicampur dengan loading dye. Sampel yang dicampur loading dye dimasukan ke
dalam sumur. Elektroforesis dijalankan dengan menggunakan tegangan sebesar 60
volt. Hasil elektroforesis diamati dengan Geldoc Alphamager Mini. Konsentrasi
DNA ditetapkan berdasarkan perbandingan DNA dengan pita DNA yang sudah
diketahui konsentrasinya (marker).
HASIL
Kadar Air Empulur Sagu
% Kadar air
Sampel empulur sagu bulan Maret 2014 dan Juli 2014 diukur kadar airnya
dengan tiga kali ulangan (triplo). Pengukuran kadar air sampel bulan Maret 2014
dan Juli 2014 didasarkan pada waktu pengambilan sampel. Kadar air empulur
sagu bulan Maret 2014 memiliki rata-rata antara 86.43%-90.36% sedangkan kadar
air empulur sagu bulan Juli 2014 memiliki rata- rata antara 85.98% - 88.61%.
91
90
89
88
87
86
85
84
83
90.36±0.39
88.96±0.41
88.61±0.07 88.89±0.05
87.9±0.18
87.18±0.21
86.43±0.24
85.98±0.63
1
2
3
4
Sampel
Gambar 1 Kadar air empulur sagu
bulan Maret 2014 dan
bulan Juli 2014
6
Kadar Pati Empulur Sagu
% Kadar pati
Sampel 2 bulan Maret 2014 memiliki kadar pati tertinggi yaitu sebesar
37.9%, sampel 4 memiliki kadar pati kedua tertinggi yaitu sebesar 36.82% dan
sampel 3 memiliki kadar pati terendah yaitu sebesar 24.46%. Sampel 4 bulan Juli
2014 memiliki kadar pati tertinggi yaitu sebesar 41.36% dan sampel 3 tetap
memiliki kadar pati terendah yaitu sebesar 25.02%.
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
35.58±0.36
41.36 ±4.32
36.82±0.64
37.9±2.99
31.54±1.98
25.73±0.61
1
25.02±0.10
24.46±0.49
2
3
4
Sampel
Gambar 2 Kadar pati empulur sagu
bulan Maret 2014 dan
bulan Juli 2014
Kuantitas dan Kualitas DNA Daun Sagu
Kuantitas DNA dilihat berdasarkan rasio A260/A280 dan rasio
A260/A230. Rasio A260/A280 menunjukkan kemurnian DNA terhadap
kontaminasi protein sedangkan rasio A260/A230 menunjukkan kemurnian DNA
terhadap kontaminasi polisakarida. Batas kemurnian DNA terhadap kontaminasi
polisakarida yaitu 2.00-2.2. Kuantitas DNA disajikan pada Tabel 1. Kemurnian
DNA daun sagu terhadap kontaminasi protein bulan Maret 2014 berada pada
rentang 1.90-1.97 sedangkan pada bulan Juli 2014 berada pada rentang 1.93-1.99.
Kemurnian DNA daun sagu terhadap kontaminasi polisakarida bulan Maret 2014
berada pada rentang 2.04-2.28 sedangkan pada bulan Juli 2014 berada pada
rentang 2.13-2.41.
7
Tabel 1 Kuantitas DNA daun sagu
Sampel
1
2
3
4
1
2
3
4
Konsentrasi
A260/A280
A260/A230
(ng/µL)
Kuantitas DNA daun sagu bulan Maret 2014
801.9
1.97
2.11
413.6
1.90
2.04
1090.7
1.92
2.17
1632.7
1.91
2.28
Kuantitas DNA daun sagu bulan Juli 2014
403.3
1.96
2.13
261.0
1.95
2.41
345.7
1.99
2.37
339.8
1.93
2.17
Uji kualitas DNA diperoleh melalui elektroforesis. Sampel dielektroforesis
pada gel agarosa konsentrasi 0.8%. Berdasarkan Gambar 4, profil elektrogram
DNA daun sagu memiliki kualitas yang baik karena DNA hasil elektroforesis
tidak terdegradasi.
48.502 bp
M
1
2
3
4
5
6
7
8
Gambar 3 Profil elektroforegram DNA daun sagu. M=marker lambda DNA ,lajur
1, 2, 3, 4 adalah isolasi DNA bulan Maret, lajur 5, 6, 7, 8 adalah
isolasi DNA bulan Juli.
Elektroforegram Hasil RAPD DNA Daun Sagu
Sampel 3 dan 4 dielektroforesis secara berpasangan dengan primer yang
sama dengan kode r untuk sampel 3 yang memiliki kadar pati rendah dan kode t
untuk sampel 4 yang memiliki kadar pati tinggi. Hal itu bertujuan untuk
mempermudah melihat pola RAPD yang dihasilkan. Sampel 3 dan 4 hasil RAPD
dielektroforesis pada gel agarose 1.4%. Berdasarkan Gambar 4-8, dapat diketahui
kemampuan setiap primer dalam mengampifikasi sampel. Beberapa sampel yang
tidak menghasilkan pita pada sampel 3 dan 4 seperti primer OPA9, OPA16, OPB9,
dan OPJ 2, terdapat pula primer yang hanya mampu mengamplifikasi sampel 3
saja seperti primer OPA17, OPA18, OPB2, OPJ5.
8
M r
t
r t
r t
M
r
t
r
t
r
t
M
4 kb
2 kb
1.5 kb
2 kb
1.5 kb
1 kb
0.5 kb
0.7 kb
0.5 kb
0.4 kb
M
OPA1
OPA3
OPA6
M OPA7
OPA8
OPA10 M
Gambar 4 Profil elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu dengan primer
OPA1, OPA3, OPA6, OPA7, OPA8, dan OPA10
M
r
t
r
t
r
t
r
t
r t
r
t
r
t
r
t
r
t
r
t
M
3 kb
2 kb
1.5 kb
1 kb
1.5 kb
1 kb
0.7kb
0.5 kb
0.5 kb
0.4 kb
0.3kb
M
OPA11OPA12 OPA13 OPA14 OPA15 OPA17 OPA18
OPA19 OPA20
M
Gambar 5 Profil elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu dengan primer
OPA11 OPA12 , OPA13, OPA 14, OPA15, OPA17, OPA18, OPA19, dan
OPA20
M
r t r t
r
t
M
OPB1 OPB2
OPB4
r
t
r
t
r
t
M r t
r t
M
r
t
5 kb
3 kb
2 kb
1 kb
0.7 kb
0.5 kb
0.4 kb
0.2 kb
OPB7 OPB8
OPB10 M OPB11 OPB12 M OPB20
Gambar 6 Profil elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu dengan primer
OPB1, OPB2, OPB3, OPB4, OPB7, OPB8, OPB10, OPB11, OPB12,
OPB20
Keterangan :
M=1 kb plus DNA Ladder
r= sampel 3 (sagu berkadar pati rendah)
t= sampel 4 (sagu berkadar pati tinggi)
9
M
r
t
r
t r t r t
r t r t
r t r t
3 kb
2 kb
1.5 kb
1 kb
0.7 kb
0.5 kb
M
OPJ1
OPJ3 OPJ4 OPJ5 OPJ6 OPJ7 OPJ8
OPJ10
Gambar 7 Profil elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu dengan primer
OPJ1, OPJ3, OPJ4, OPJ5, OPJ6, OPJ7, OPJ8, dan OPJ10
M
r t
r t
r t
r t
r t
r t
M
r
t r
t
2 kb
1.5 kb
1 kb
0.7 kb
0.5 kb
0.2 kb
M OPD4 OPD 5OPD7 OPD8 OPN6 OPN7
M OPN8
OPN9
Gambar 8 Profil elektroforegram hasil RAPD DNA daun sagu dengan primer
OPD4, OPD5, OPD7, OPD8, OPN6, OPN7, OPN8, dan OPN9
Keterangan :
M=1 kb plus DNA Ladder
r= sampel 3 (sagu berkadar pati rendah)
t= sampel 4 (sagu berkadar pati tinggi)
PEMBAHASAN
Kadar Air Empulur Sagu
Pengeringan merupakan proses pengurangan kadar air bahan hingga
mencapai kadar air tertentu sehingga menghambat laju kerusakan bahan akibat
aktifitas biologis dan kimia (Brooker et al. 2004). Variasi jumlah kadar air sering
dijumpai pada bahan. Variasi kadar air ini akan mempengaruhi lamanya proses
pengeringan sehingga perlu diketahui berapa persen kadar air pada bahan saat
basah dan pada saat kering (Brooker et al. 2004).
Uji kadar air merupakan uji yang penting karena kadar air dalam empulur
mempengaruhi lamanya masa penyimpanan dan mempengaruhi banyaknya
kandungan pati dalam empulur. Hasil pengukuran kadar air disajikan pada
Gambar 1. Berdasarkan Gambar 1, rata-rata kadar air empulur sagu bulan Maret
2014 berkisar antara 86.43% sampai 90.36% sedangkan rata-rata kadar air
empulur sagu bulan Juli 2014 berkisar antara 85.98% sampai 88.61%. Nilai
10
tersebut lebih besar jika dibandingkan dengan penelitian Haryanto (1987) yaitu
sebear 64.80%. Menurut Jong (1995), kadar air tinggi dan konstan selama batang
nya masih muda sagu yang telah dewasa mengalami penurunan terutama pada
batangnya. Penurunan kadar air empulur sagu mungkin saja disebabkan oleh usia
tanaman yang bertambah tua.
Kadar Pati Empulur Sagu
Pengukuran kadar pati bertujuan untuk menentukan sampel yang
digunakan saat RAPD. Kadar pati diukur pada bulan Maret 2014 dan Juli 2014.
Kadar pati empulur sagu disajikan pada Gambar 2. Sampel 2 bulan Maret 2014
memiliki kadar pati tertinggi, sampel 4 memiliki kadar pati kedua tertinggi dan
sampel 3 memiliki kadar pati terendah. Sampel 4 bulan Juli memiliki kadar pati
tertinggi sedangkan sampel 3 tetap memiliki kadar pati terendah. Berdasarkan
Gambar 2 dan 3, sampel 4 konsisten memiliki kadar pati tinggi dan sampel 3
konsisten memiliki kadar pati rendah. Menurut Yamamoto (2004), kandungan pati
tertinggi di dalam empulur berada saat tahap berbunga setelah itu kandungannya
berkurang karena translokasi menjadi bunga dan buah.
Sampel bulan Maret 2014 dan Juli 2014 memiliki kadar pati yang berbeda
meskipun sampel tersebut berasal dari satu tanaman yang sama. Sampel 1, 3 dan 4
mengalami peningkatan kadar pati. Hal tersebut mungkin saja terjadi jika tanaman
tersebut semakin bertambah tua saat bulan Juli 2014. Menurut Haryanto et al.
(1992) semakin tua umur tanaman sagu, maka kandungan pati dalam empulur
sagu akan semakin banyak. Sampel 2 mengalami penurunan kadar pati hal
tersebut juga mungkin saja terjadi jika tanaman sagu berada tahap berbunga
(Yamamoto 2004) dan proses produksi pati sedikit.
Li et al. (2002) dan Smidansky et al (2002) melaporkan bahwa produksi
pati diregulasi oleh enzim ADP-glukose phosporilase (AGPase). AGPase telah
diidentifikasi sebagai enzim inti untuk biosintesis pati dan polimerasi karbohidrat.
Biosintesis pati dalam umbi diidentifikasi tergantung pada enzim AGPase yang
distimulasi saat sintesis pati (Tiessen et al. 2002). Enzim α-glucan water kinase
merupakan enzim inti untuk regulasi posporilasi pati sehingga pati yang dibentuk
oleh tumbuhan dapat dimobilisasi dan ditransportasikan (Blennow et al. 2002).
Kuantitas dan Kualitas DNA Daun Sagu
Isolasi DNA daun sagu dilakukan pada sampel 1, 2, 3, dan 4 pada bulan
Maret 2014 dan Juli 2014. Hasil isolasi diuji kuantitas dan kualitasnya agar
diperoleh DNA yang memadai untuk amplifikasi DNA secara RAPD. Kuantitas
DNA daun sagu diukur dengan spektrofotometer NanoDrop.
Asam nukleat dan protein mempunyai absorbansi maksimum pada A 260
nm dan A 280 nm. Rasio absorbansi pada panjang gelombang tersebut digunakan
untuk mengukur kemurnian ekstraksi asam nukleat dan protein. Kemurnian DNA
ditunjukkan oleh Tabel 1 dan 2. Menurut Das et al. (2009) DNA memiliki kualitas
yang baik jika nilai A260/280 antara 1.6-1.7 namun menurut William et al. (1997)
A260/A280 berada pada rentang 1.8-2.00. Merujuk pada penelitian William et al.
(1997), hasil isolasi DNA daun sagu bulan Maret 2014 dan Juli 2014
menunjukkan bahwa sampel 1, 2, 3 dan 4 bebas dari kontaminasi protein.
11
Rasio A260/A230 menunjukkan kemurnian DNA terhadap polisakarida.
Hasil isolasi DNA daun sagu bulan Maret 2014 dan Juli 2014 menunjukkan
bahwa sampel 1, 2, 3 dan 4 bebas dari kontaminasi polisakarida karena
A260/A230 lebih dari 1.8. Menurut Cruz et al. (1997), proses isolasi DNA
tanaman umumnya sulit dilakukan karena tanaman mengandung senyawa
polisakarida yang cukup besar. Polisakarida dapat dihilangkan dengan
penambahan pengendap yang selektif untuk asam nukleat seperti CTAB (Das et al.
2009).
Uji kualitas DNA dilakukan dengan elektroforesis gel agarose 0.8%. Gel
agarose 0.8% memiliki pori-pori yang cukup besar sehingga memudahkan DNA
melewati pori gel tersebut. Sampel DNA dan marker dielektroforesis secara
bersamaan. Marker yang digunakan adalah marker DNA lambda yang
menghasilkan pita tunggal dan cocok digunakan dalam agarose. Ukuran marker
lambda adalah 48.502 bp. Konsentrasi DNA daun sagu bulan Maret memiliki
konsentrasi antara 413.6-1632.7 (ng/µg) sedangkan konsentrasi DNA daun sagu
bulan Juli yang didapat berada pada rentang 261-403.3(ng/µg) (Tabel 1).
Berdasarkan Gambar 4, hasil isolasi DNA memiliki kualitas yang cukup baik
karena DNA hasil elektroforesis tidak terdegradasi.
Elektroforegram hasil RAPD DNA Daun Sagu
Kemampuan suatu primer untuk mengamplifikasi DNA dari suatu genom
tanaman selain ditentukan oleh jumlah dan kualitas DNA juga ditentukan oleh
adanya situs (sekuen) pada DNA cetakan yang homolog dengan urutan basa-basa
dari primer yang digunakan. Jika di dalam DNA cetakan yang digunakan tidak
mempunyai situs homolog, maka DNA cetakan tidak akan diamplifikasi. Hal itu
ditandai dengan tidak adanya pita DNA di dalam gel agarose hasil elektroforesis.
Oleh karena itu langkah awal yang perlu dilakukan adalah seleksi primer yang
dapat mengamplifikasi DNA genom tanaman sagu yang dihasilkan dalam bentuk
pita-pita DNA (Manoj et al. 2005). Seleksi primer yang dilakukan pada
penelitian adalah melihat kemampuan primer dalam membedakan pola RAPD
sampel 3 dan 4 yang memiliki kadar pati berbeda berdasarkan polimorfis yang
dihasilkan saat elektroforesis.
Pita RAPD terbentuk dari pemanjangan primer yang menempel pada DNA
cetakan yang terjadi secara berulang. Setiap primer dapat menempel secara
bersamaan pada beberapa situs homolog yang tersebar di dalam DNA cetakan dan
hasil pemanjangan primer tersebut memiliki ukuran yang sangat bervariasi. Oleh
karena itu di dalam hasil elektroforesis menggunakan gel agarose terlihat
beberapa pita dengan ukuran berbeda (Upadhyay et al. 2004).
Sampel dan marker dielektroforesis secara berdampingan. Marker yang
digunakan adalah 1 kb+ DNA Ladder yang memiliki ukuran antara 0.075 kb-20
kb. Berdasarkan hasil elektroforesis, primer OPA9 (Gambar 4), OPA16 (Gambar
5), OPB3 (Gambar 6), OPB9 (Gambar 6), OPJ2 (Gambar 7) tidak dapat
mengamplifikasi sampel karena tidak terdapatnya pita DNA yang dihasilkan
(data tidak ditampilkan dalam elektroforegram). Hal itu menunjukkan bahwa
primer tidak menemukan sekuen yang sesuai. Kemungkinan lainnya adalah
primer tersebut menempel pada dua situs pada DNA cetakan yang memiliki jarak
12
yang cukup jauh sehingga tidak mampu diamplifikasi oleh enzim DNA Taq
polimerase (Pandin 2010).
Primer yang menghasilkan pita paling sedikit adalah OPA15 (Gambar 5),
OPB2 (Gambar 6), OPB8 (Gambar 6), OPD4 (Gambar 8). Primer tersebut hanya
menghasilkan satu pita pada sampel 3 dan 4. Primer yang menghasilkan pita DNA
paling banyak antara 6-8 pita adalah OPA3 (Gambar 4), OPA8 (Gambar 4), dan
OPA10 (Gambar 4). Upadhyay et al. (2004) melaporkan bahwa jumlah pita DNA
yang terdeteksi dalam setiap primer bergantung pada urutan basa dari primer dan
ada atau tidaknya variasi dalam genotipe tertentu.
Primer OPA1(Gambar 4), OPA17 (Gambar 5), OPA18 (Gambar 5),
OPA19 (Gambar 5), OPA20 (Gambar 5), OPB2 (Gambar 6), OPB4 (Gambar 6),
OPB10 (Gambar 6), OPJ1 (Gambar 7), OPJ 5 (Gambar 7), OPJ8 (Gambar 7)
mampu membedakan sagu berkadar pati tinggi dan rendah. OPA 1 hanya mampu
mengamplifikasi sampel 4, OPA17, OPA18 dan OPJ5 hanya mampu
mengamplifikasi sampel 3. OPA19 dan OPA20 mampu membedakan sampel
dengan menghasilkan satu polimorfis namun pita yang dihasilkan sangat tipis
sehingga sulit untuk dilihat ukuran DNA nya. OPB2 dan OPB 8 (Gambar 6 )
sama-sama menghasilkan satu pita dengan ukuran yang sama namun intensitas
pita DNA sampel 4 lebih tipis dibandingkan sampel 3. OPB4 menghasilkan satu
polimorfis pada sampel 4 berukuran 4 kb. OPB10 menghasilkan satu polimorfis
pada sampel 4 berukuran 2 kb. OPJ1 menghasilkan polimorfis pada sampel 4
berukuran 2 kb. OPJ8 membedakan sampel dengan menghasilkan satu polimorfis
pada sampel 3 berukuran 0.4 kb.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Sampel yang memiliki kadar pati terendah adalah sampel 3 yaitu sebesar
24.46 % pada bulan Maret 2014 dan 25.02% pada bulan Juli 2014 sedangkan
sampel yang memiliki kadar pati tertinggi adalah sampel 4 yaitu sebesar 36.82 %
pada bulan Maret 2014 dan 41.36% pada bulan Juli 2014. Primer yang mampu
membedakan pola RAPD sampel sagu berkadar pati tinggi dan rendah adalah
primer OPA1, OPA 17, OPA18, OPA19, OPA20, OPB2, OPB4, OPB10, OPJ1,
OPJ 5, dan OPJ8.
Saran
Primer yang mampu membedakan sagu berkadar pati tinggi dan rendah
perlu diuji stabilitasnya dengan menggunakan sampel sagu dengan asal yang
berbeda.
DAFTAR PUSTAKA
[AOAC] Association of Official Analytical Chemist. The Association of Official
Analytical Chemist. 2000. Official Method of Analysis of The Associattion
of Official Analytical of Chemist Arlington: Inc.
13
Blennow A, Nielsen TH, Baunsgaard L, Mikkelsen R, Engelsen SB. 2002. Starch
phosphorylation: a new front line in starch research. Trends Plant Sci
7(10):445-450.
Das BK, Jena RC, Samal KC. 2009. Optimization of DNA isolation and PCR
protocol for RAPD analysis of banana/plantain (Musa spp). In ternational J
Agri Sci1(2):21-25.
Brooker. 2004. Mengukur faktor kekeringan dalam proses pengeringan. Teknologi
2(1):70-79.
Bujang KB, Adeni DSA. 2000. Effects of dilution rate and pH control in ethanol
fermentation of hydrolyzed sago starch. In: H.M.H. Bintoro et al. (eds.).
SAGO 2000. Proc. Int. Sago Seminar, Bogor. March 22-23, 2000. p.117-23.
Cruz M, Ramirez F, Hernandez H. 1997. DNA isolation and amplification from
cacti. Plant Molecular Biology Report (15): 319-325.
Haryanto, Bambang, P Pangloli.
Sagu.Yogyakarta :Kanisius.
1992.
Potensi
dan
Pemanfaatan
Jong FS. 1995. Reseach for development of sago palm (Metroxylon sagu Rottb.)
cultivation
in
Sarawak,
Malaysia.
[thesis].
Wageningen(ID):
Lanbouwuniversiteit.
Jong FS, Adi W. 2007. Sagu potensi besar pertanian Indonesia. Iptek Tanaman
Pangan 1(2):54-6.
Lakuy H dan J Limbongan. 2003. Beberapa hasil kajian dan teknologi yang
diperlukan untuk pengembangan sagu di Provinsi Papua. Prosiding Seminar
Nasional Sagu; 2003 Oktober 6; Manado. Indonesia: Balai Penelitian
Tanaman Kelapa dan Palma Lain.
Li X, Xing J, Gianfagna TJ, Janes HW. 2002. Sucrose regulation of ADP-glucose
pyrophosphorylase subunit genes transcript levels in leaves and fruits. Plant
Sci 162(2):239-244.
Manoj T, NK Singh, M Rathore, And N Kumar. 2005. RAPD markers in the
analysis of genetic diversity among common bean germplasm from Central
Himalaya. Genetic Res Crop Evol 52(3):315- 324.
Orozco-Castillo, KJ Chalmera, R Waugh and W Powell. 1994. Detection of
genetic diversity and selective gene introgression in coffee using RAPD
marker. Theor Appl Genet 87: 934-938.
Pandin DS. 2009. Keragaman genetik kultivar kelapa dalam mapanget (dmt) dan
dalam tenga (dta) berdasarkan penanda random amplified polymorphic
DNA (RAPD). Buletin Palma 36: 17-27.
Pandin DS. 2010. Keragaman genetik kelapa dalam Bali (dbi) dan dalam sawarna
(dsa) berdasarkan penanda random amplified polymorphic DNA (RAPD).
Littri 16(2):83-89.
Polnaya. 2006. Kegunaan pati sagu alami dan termodifikasi serta karakteristiknya.
Agroforestri 1(3):50-56.
14
Sharma A, AG Namdeo, KR Mahadik. 2008. Molecular markers: new prospects
in plant genome analysis. Pharmacognosy Reviews 2(3): 23- 31.
Setyowati N. 2013. Optimasi isolasi DNA dan PCR-RAPD pada tanaman Garut
(Maranta arundinacea L) lokal DIY [skripsi]. Yogyakarta (ID): Universitas
Islam Negeri Sunan Kalijaga.
Smidansky ED, Clancy M, Meyer FD, Lanning SP, Blake NK, Talbert LE, Giroux
MJ. 2002. Enhanced ADP-glucose pyrophosphorylase activity in wheat
endosperm increases seed yield. Proc Nat Acad Sci 99(3):1724-1729.
Sumaryono. 2007. Tanaman sagu sebagai sumber energi alternatif. Warta
Penelitian dan Pengembangan Pertanian 29(4):3-4.
Suryanto D. 2003. Melihat keanekaragaman organisme melalui beberapa teknik
genetika molekuler. USU digital library; [2014 April 2]: Sumatra Utara.
Tiessen A, Hendriks JH, Stitt M, Branscheid A, Gibon Y, Farre EM,
Geigenberger P. 2002. Starch synthesis in potato tubers is regulated by posttranslational redox modification of ADP-glucose pyrophosphorylase: a
novel regulatory mechanism linking starch synthesis to the sucrose supply.
Plant Cell 14(9):2191-2213.
Tjasadihardja A. 1987. Hubungan antara pertambahan pucuk, perkembangan buah
serta tingkat kandungan asam indol asetat di dalam biji dan layu pentil
kakao [disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Upadhyay A, Jayadev K, Manimekalai R, Parthasarathy V. 2004. Genetic
relationship and diversity in Indian coconut accession based on RAPD
markers. Scientia Horticulturae 99:353-362.
William W, Wilfinger, Karol Mackey, and Piotr Chomczynski. 1997. Effect of pH
and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid
purity. Biotechniques 22:474-481.
Yamamoto Y. 2004. Starch accumulation proses and varietal and/ or regional
differences in starch productivity in sago palm (Metroxylon sagu ).
Prosiding. Seminar Nasional Sagu dan Palma penghasil Karbohidrat. Hal 23. Bogor.
15
Lampiran 1 Bagan alir penelitian
Preparasi sampel
Empulur sagu
Daun sagu
Penetapan kadar air
Isolasi DNA
Penetapan kadar pati
Uji kuantitas
kualitas DNA
Amplifikasi DNA
daun sagu dengan
primer acak (RAPD)
dan
20
16
Lampiran 2 Kadar air empulur sagu bulan Maret 2014
Sampel
1
1
1
Rata- rata
2
2
2
Rata- rata
3
3
3
Rata- rata
4
4
4
Rata- rata
1
2
3
27.65
28.60
27.28
Bobot
sampel
(gram )
2.00
2.00
2.00
1
2
3
2.00
2.00
2.00
29.24
30.36
29.75
27.45
28.57
27.97
27.23
28.35
27.75
1
2
3
28.06
28.44
28.25
2.00
2.00
2.01
30.06
30.45
30.26
28.26
28.64
28.44
1
2
3
28.75
29.44
28.66
2.01
2.03
2.00
30.76
31.48
30.66
28.97
29.67
28.88
Ulangan
Bobot cawan
kosong (gram)
Cawan kosong+
sampel sebelum
dikeringkan
29.66
30.60
29.29
Cawan kosong+
sampel setelah
dikeringkan
27.93
28.85
27.56
%Kadar air
86.05
87.16
86.08
86.43 0.24
89.20
88.87
88.80
88.96 0.41
90.33
90.31
90.45
90.36 0.39
88.71
88.88
89.07
88.89 0.05
17
17
Lampiran 3 Kadar air empulur sagu bulan Juli 2014
Bobot cawan
kosong
Bobot
Sampel
Ulangan
(gram)
sampel
(gram )
1
1
27.77
1.00
1
2
27.75
1.00
1
3
28.50
1.00
Rata- rata
2
1
27.67
1.00
2
2
28.49
1.00
2
3
27.65
1.00
Rata- rata
3
1
28.18
1.00
3
2
30.64
1.00
3
3
28.34
1.00
Rata- rata
4
1
28.22
1.00
4
2
27.96
1.00
4
3
27.03
1.00
Rata- rata
Cawan kosong+ Cawan kosong+
sampel sebelum sampel setelah
dikeringkan
dikeringkan
(gram )
(gram)
28.77
27.90
28.76
27.89
29.51
28.64
28.67
29.50
28.65
27.79
28.62
27.78
29.18
31.65
29.34
28.29
30.75
28.45
29.22
28.96
28.04
28.34
28.08
27.15
%Kadar air
86.26
85.82
85.87
85.98 0.63
87.65
86.85
87.04
87.18 0.21
88.25
89.03
88.57
88.62 0.07
87.91
87.84
87.95
87.90 0.18
20
18
19
Lampiran 4 Contoh perhitungan kadar air
Sampel 4R ulangan 1
Rumus untuk menghitung kadar air adalah sebagai berikut:
Kadar air (%)=
Keterangan : w1= bobot cawan dan sampel sebelum dikeringkan
w2= bobot cawan dan sampel sebelum dikeringkan
w3= bobot sampel
=
=87.9147%
Lampiran 5 Kurva standar D- Glukosa bulan Maret 2014
Konsentrasi (ppm)
Absorbansi
0
0
50
0.2699
100
0.5027
150
0.6997
200
0.981
250
1.1596
300
1.3685
1,6
Absorbansi
18
1,4
1,2
1
0,8
0,6
y = 0,0045x + 0,0299
R² = 0,9973
0,4
0,2
0
0
100
200
300
Konsentrasi (ppm)
400
19
20
19
Lampiran 6 Kurva standar D- Glukosa bulan Juli 2014
Konsentrasi (ppm)
0
50
100
150
200
Absorbansi
0
0.2147
0.5206
0.701
0.8303
1
absorbansi
0,8
0,6
y = 0,0043x + 0,0239
R² = 0,9798
0,4
0,2
0
0
50
100
150
Konsentrasi (ppm)
Lampiran 7 Absorbansi empulur sagu bulan Maret 2014
Sampel
1
2
3
4
Ulangan
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
Absorbansi
empulur
0.5077
0.4863
0.5008
0.7722
0.7368
0.6670
0.4849
0.4679
0.4763
0.7072
0.7029
0.6839
Konsentrasi
empulur
(ppm)
106.17
101.45
104.64
164.95
157.08
141.57
101.11
97.33
99.20
150.51
149.55
145.33
200
250
20
20
20
Lampiran 8 Absorbansi empulur sagu bulan Juli 2014
Sampel
Ulangan
1
Absorbansi
empulur
0.6483
0.6406
0.5945
0.549
0.4582
0.4603
0.7085
0.7658
1
2
1
2
1
2
1
2
2
3
4
Konsentrasi
empulur (ppm)
145.21
143.42
132.70
122.12
101.00
101.49
159.21
172.53
Keterangan : konsentrasi empulur sebanding dengan konsentrasi D-glukosa
Lampiran 9 Kadar pati empulur sagu bulan Maret 2014
Sampel
1
Rata-rata
2
Rata-rata
3
Rata-rata
4
Rata-rata
Ulangan
Rata-rata
%kadar air
empulur
1
2
3
86.43
86.43
86.43
Bobot
kering
empulur
(mg)
100.80
101.00
101.50
1
2
3
88.96
88.96
88.96
102.90
100.30
102.60
1
2
3
90,36
90,36
90,36
101,00
100,80
102,40
1
2
3
88.89
88.89
88.89
101.30
100.40
100.70
% Kadar
pati
26.33
25.10
25.77
25.73 0.61
40.07
39.15
34.50
37.90 2.99
25.03
24.14
24.22
24.46 0.49
37.14
37.24
36.08
36.82 0.64
21
21
21
Lampiran 10 Kadar pati empulur sagu bulan Juli 2014
Sampel
1
Rata-rata
2
Rata-rata
3
Rata-rata
4
Ulangan
Rata-rata
%kadar air
empulur
1
2
85.99
85.99
Bobot
kering
empulur
(mg)
101.3
101.5
1
2
87.18
87.18
100.7
101.3
1
2
88.62
88.62
100.9
100.8
1
2
87.90
87.90
100.0
100.5
Rata-rata
% Kadar pati
35.83
35.32
35.58 0.36
32.94
30.13
31.54 1.98
25.02
25.17
25.02 0.10
39.80
45.91
41.36 4.32
Lampiran 11 Contoh perhitungan kadar pati
Rumus untuk menghitng kadar pati adalah sebagai berikut :
y=ax+b
x dicari untuk mendapat konsentrasi sampel empulur
% kadar pati = Konsentrasi yang didapat x pengenceran x 0.05 Lx100%
Bobot sampel kering
Sampel 1 ulangan 1
y = 0.0043x + 0.0239
0.6483= 0.0043x + 0.0239
0.6483-0.0239== 0.0043x
X= 145.21
% kadar pati = 145.2093 mg/mLx 5 x 0.05 L x100%
101.3 mg
= 35.83%
Keterangan : 0.05 L = 50 ml (pengenceran saat di labu ukur)
22
20 22
Lampiran 12 Primer yang digunakan dan pita yang dihasilkan
No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
Primer
OPA 1
OPA 3
OPA 6
OPA 7
OPA 8
OPA 9
OPA 10
OPA 11
OPA 12
OPA 13
OPA 14
OPA 15
OPA 16
OPA 17
OPA 18
OPA 19
OPA 20
OPB 1
OPB 2
OPB 3
OPB 4
OPB 7
OPB8
Total
4
8
6
4
7
0
6
3
2
6
3
1
0
1
3
4
5
6
1
0
7
2
1
Jumlah pita DNA
Polimorfik Monomorfik
1
3
0
8
1
5
0
4
0
7
0
0
0
6
0
3
0
2
0
6
0
3
0
1
0
0
1
0
3
0
1
3
1
4
0
6
0
1
0
0
1
6
0
2
0
1
No
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
Primer
OPB 9
OPB 10
OPB 11
OPB 12
OPB 20
OPJ 1
OPJ 2
OPJ 3
OPJ 4
OPJ 5
OPJ 6
OPJ 7
OPJ 8
OPJ 10
OPD 4
OPD 5
OPD 7
OPD 8
OPN 6
OPN 7
OPN 8
OPN 9
Total
0
2
1
4
3
3
0
1
3
4
4
1
2
5
1
2
2
5
5
2
5
3
Jumlah pita DNA
Polimorfik Monomorfik
0
0
1
1
0
1
0
4
0
3
2
1
0
0
0
1
0
3
4
0
0
4
0
1
1
1
0
5
0
1
1
1
0
2
0
5
0
5
0
2
0
5
0
3
20
23
23
RIWAYAT HIDUP
Penulis bernama Ifroh Jatidiri Media. Penulis adalah anak ke-empat dari
lima bersaudara. Penulis berasal dari Cilegon-Banten. Jenjang pendidikan yang
dilalui penulis sampai saat ini adalah SMA Negeri Cahaya Madani Banten
(Boarding School) tahun 2007-2010 dan kuliah di Institut Pertanian Bogor tahun
2010-2014. Organisasi yang diikuti penulis selama masa pendidikan antara lain:
staff kajian strategi Badan Eksekutif Mahasiswa Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor tahun 2011, staff Human Research
Development Paguyuban Karya Salemba Empat Institut Pertanian Bogor tahun
2011, ketua divisi Master Program Paguyuban Karya Salemba Empat Institut
Pertanian Bogor tahun 2012, dan ketua divisi Edukasi Paguyuban Karya Salemba
Empat Institut Pertanian Bogor tahun 2013. Penulis pernah melaksanakan
praktik lapang di Laboratorium Mikrobiologi, PT Jawa Manis
CiwandanCilegon dengan judul Analisis Total Plate Count, Yeat Mold, dan Patogen
Salmonella pada Gula Rafinasi.