Identifikasi Keragaman Gen UTMP Exon 4 Pada Sapi Bali
IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN UTMP EXON 4 PADA SAPI
BALI
NENIK TRI WAHYUNI
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN
FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Identifikasi
Keragaman Gen UTMP Exon 4 pada Sapi Bali adalah benar karya saya dengan
arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada
Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Mei 2014
Nenik Tri Wahyuni
NIM D14100116
ABSTRAK
NENIK TRI WAHYUNI. Identifikasi Keragaman Gen UTMP Exon 4 pada Sapi
Bali. Dibimbing oleh JAKARIA dan ASEP GUNAWAN.
Sapi bali sebagai sumber daya genetik ternak asli Indonesia yang memiliki
beberapa keunggulan, salah satunya memiliki kemampuan reproduksi yang tinggi.
Gen Uterine Milk Protein (UTMP) adalah gen yang diduga kuat berpengaruh
terhadap masa hidup produktif yang berkaitan dengan sifat reproduksi yang
berperan penting dalam mendukung konsepsi selama kebuntingan. Tujuan
penelitian ini adalah mengidentifikasi ada tidaknya polimorfisme gen UTMP
sebagai pengontrol sifat reproduksi pada sapi bali dengan metode Polymerase
Chain Reaction-Restriksi Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP).
Sebanyak 123 sampel darah yang berasal dari BPTU sapi bali dan BIBD
dideteksi keragaman gen UTMP menggunakan enzim restriksi BsrI yang
memotong sekuens basa C|CAGT. Amplifikasi gen UTMP menghasilkan fragmen
dengan panjang 406 bp pada posisi di exon 4 dengan suhu annealing 60 ⁰C.
Hasil analisis PCR-RFLP menunjukkan bahwa sapi bali yang dianalisis memiliki
alel monomorfik AA sampel BBTU dan BIBD sebesar 100%. Hasil sekuen
fragmen gen UTMP exon 4 menunjukkan tidak ditemukan mutasi pada gen
tersebut pada sapi Bali tetapi ditemukan insersi motif DNA minisatelit sepanjang
77 basa.
Kata kunci : gen Uterine Milk Protein (UTMP), PCR-RFLP, sapi bali
ABSTRACT
NENIK TRI WAHYUNI. Identification of UTMP Gene Polymorphisms Exon 4
In Bali Cattle . Supervised by JAKARIA and ASEP GUNAWAN.
The bali cattle, one of Indonesian specific animal genetic resource, has
many advantage, one of that advantage is high in reproductivity. Uterine Milk
Protein (UTMP) gene is expected having an effect on lifes’ productivity related
to the characteristic of reproduction and has main function in supporting
conception during pregnancy. The aim of this research was to identify the
existence of UTMP polymorphisms gene as controller of reproductions
characteristic in Bali cattle using the PCR-RFLP (Polymerase Chain ReactionRestriction Fragment Length Polymorphism). One hundred twenty three blood
samples of bali cattle derived from BPTU and BIBD was detected its presence of
genetic diversity at UTMP gene using BsrI which restric C|CAGT basic
sequences. UTMP gene amplification was performed with temperature of
annealing 60 ⁰C. The results of PCR-RFLP analysis indicated that bali cattle have
been analysed monomorphic A allele at BPTU and BIBD was 100%. Result of
sequence fragment UTMP gene exon 4 was indicate insersi mutation 77 basic
until long change sequence it bands 406 base pair.
Key words : bali cattle, uterine milk protein (UTMP), PCR-RFLP
IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN UTMP EXON 4 PADA SAPI
BALI
NENIK TRI WAHYUNI
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Peternakan
pada
Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN
FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi : Identifikasi Keragaman Gen UTMP Exon 4 Pada Sapi Bali
Nama
: Nenik Tri Wahyuni
NIM
: D14100116
Disetujui oleh
Dr Jakaria, SPt MSi
Pembimbing I
Dr agr Asep Gunawan, SPt MSc
Pembimbing II
Diketahui oleh
Prof Dr Ir Muladno, MSA
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan November 2013 hingga
Januari 2014 ini ialah gen reproduksi pada sapi Bali, dengan judul Identifikasi
Keragaman Gen UTMP Exon 4 pada Sapi Bali.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr Jakaria, SPt MSi selaku
pembimbing akademik dan pembimbing skripsi, Bapak Dr agr Asep Gunawan,
SPt MSc selaku dosen pembimbing skripsi atas waktu, tenaga, saran, dan
kesabaran yang telah diberikan. Terimakasih juga penulis ucapkan kepada Bapak
Edit Lesa Aditya SPt MSc selaku dosen penguji sidang yang telah memberikan
masukan dan saran dalam penulisan skripsi ini. Ungkapan terima kasih juga
disampaikan kepada ayah, ibu, serta seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih
sayangnya. Tak lupa penulis sampaikan terimakasih kepada Ricky SF, Devi S,
Luthfia I, Sherly J, Irine FZ, Kiky U, Dhini, Kak Alit, Kak Ferdi, Kak Erik, Kak
Irine, Kak Furqon, Ishfi dan Ria PR. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Mei 2014
Nenik Tri Wahyuni
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
METODE
Lokasi dan Waktu penelitian
Bahan
Alat
Prosedur
Ekstraksi DNA
Amplifikasi DNA
Genotyping Gen UTMP
Sekuens Fragmen Gen UTMP Exon 4
Analisis Data
HASIL DAN PEMBAHASAN
Amplifikasi Gen UTMP
Penentuan Genotipe Gen UTMP
Frekuensi Alel Gen UTMP
Analisis sekuens gen UTMP
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP
vi
vi
1
1
2
2
2
2
2
3
3
3
3
4
5
5
5
5
6
7
8
10
10
10
11
13
15
DAFTAR GAMBAR
1 Posisi Penempelan primer pada fragmen gen UTMP dan situs pemotongan
enzim BsrI
2 Hasil amplifikasi gen UTMP pada gel agarose 1.5%
3 Penentuan genotip gen UTMP|BsrI
4 Pola Insersi pada gen UTMP sepanjang 77 basa
5 Rekonstruksi gambar gen UTMP
4
6
7
8
9
DAFTAR LAMPIRAN
1 Sekuens gen uterine milk protein (UTMP) yang diakses di GanBank
dengan kode akses L22095
2 Hasil BLAST nukleotida sekuens gen UTMP sapi Bali
3 Hasil analisis sekuens fragmen gen UTMP pada sapi bali
13
14
14
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Sapi bali merupakan sapi hasil dari domestikasi banteng (Bos javanicus)
(Nijman et al. 2003) dan merupakan salah satu sumberdaya genetik ternak asli
Indonesia yang perlu dipertahankan dan dilestarikan keberadaannnya. Populasi
sapi bali tahun 2013 diperkirakan sekitar 4.483.890 (Ditjennak 2013) dan
berkontribusi sekitar 27% terhadap total sapi Indonesia. Daerah sumber bibit sapi
bali yang difokuskan dalam penelitian ini adalah BPTU dan BIBD sapi bali di
pulau Bali. Di BPTU sapi bali , berbagai teknik dan kiprah serta pengembangan
plasma nutfah kebanggaan Indonesia terus berjalan hingga saat ini. BPTU dan
BIBD merupakan daerah penghasil bibit-bibit unggul dari sapi bali yang
dianggap mempunyai keunggulan sebagai penghasil bibit. Pada sapi Bali telah
dilakukan program nasional pemurnian dan peningkatan mutu genetik ternak
sejak tahun 1976 di pulau Bali sesuai dengan Surat Keputusan (SK) Menteri
Pertanian nomor 776/Kpts/Um/12/1976.
Sapi bali mempunyai keunggulan yang tidak dimiliki sapi bangsa lain
diantaranya memiliki kemampuan beradaptasi dengan lingkungan marginal
seperti kualitas pakan yang rendah, iklim tropis, ketersediaan air yang kurang,
manajemen yang kurang baik dan ketahanan terhadap parasit (Zulkharniem et al.
2010). Selain itu sapi bali mempunyai kemampuan fertilitas berkisar antara 83%86 % (Siswanto et al. 2013) dan persentase karkas yang tinggi serta kadar lemak
yang rendah (Bugiwati 2007). Siswanto et al. (2013) melaporkan bahwa
penampilan reproduksi sapi bali yang dipelihara secara intensif adalah umur sapi
bali mengalami birahi pertama 718.57± 12.65 hari, umur pertama melahirkan
1104.51± 23.82 dan calving interval 350.46±27.98 hari. Namun disamping
kelebihannya tersebut, terdapat beberapa kelemahan pada sapi Bali diantaranya
memiliki produksi susu yang relatif rendah dan tingkat kematian anak yang cukup
tinggi mencapai 30% (Tolihere 2002). Seleksi sapi bali dengan kemampuan
hidup yang tinggi untuk kelangsungan hidup anak sangat penting untuk dilakukan
melalui seleksi yang akurat.
Aplikasi penanda molekuler memungkinkan untuk digunakan sebagai alat
seleksi yang akurat melalui pendekatan kandidat gen karena dimungkinkan dapat
diprediksi sejak awal dan diturunkan dari generasi ke generasi. Salah satu gen
yang diduga kuat berpengaruh terhadap masa hidup produktif dan produksi susu
yaitu gen Uterine Milk Protein (UTMP). UTMP atau lebih dikenal dengan
protein susu rahim adalah protein utama yang disekresikan oleh endometrium
dibawah kontrol dari progestron dan ekspresinya dominan ditemukan pada
endometrium yang mengindikasikan berperan penting dalam
mendukung
konsepsi selama masa kebuntingan (Ing et al. 1989).
Pada ternak lain seperti domba dan babi, UTMP dikenal juga sebagai serin
proteinase inhibitor (Tekin et al. 2005). Fungsi khusus UTMP masih belum
banyak diketahui akan tetapi kemungkinan berperan dalam mengontrol konsepsi,
pertumbuhan, dan sistem kekebalan tubuh pada induk. Ekspresi gen UTMP
ditemukan dominan pada jaringan reproduksi yang konsisten dengan peran
pentingnya dalam keberhasilan reproduksi (Khatib et al. 2007) yang terletak pada
2
kromosom 21 dalam wilayah genomic 321.6 kb yang terdiri dari 5 exon (Ulbrich
et al. 2009). Lebih lanjut dilaporkan identifikasi keragaman gen UTMP
ditemukan berhubungan nyata terhadap masa hidup produktif pada sapi holstein
(Khatib et al. 2007). Berdasarkan informasi tersebut, gen UTMP di yakini sebagai
salah satu kandidat gen yang dapat digunakan untuk memperbaiki masa hidup
produktif dan produksi susu pada sapi bali.
Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah mengidentifikasi keragaman gen UTMP
pada posisi exon 4 sapi bali di Balai Pembibitan Ternak Unggul dan Balai
Inseminasi Buatan Daerah pulau Bali.
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini meliputi analisis pada 100 ekor sapi bali yang terdapat di
Balai pembibitan Ternak Unggul (BPTU) dan 23 ekor sapi Balai Inseminasi
Buatan Daerah sapi bali, pulau Bali. Keragaman gen UTMP dianalisis
menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length
Polymorphism (PCR-RFLP). Ada tidaknya mutasi di fragmen gen UTMP exon 4
dianalisis melalui teknik sequencer. Analisis data dilakukan melalui pendekatan
frekuensi alel dan analisis sekuens menggunakan Basic Local Alignment Search
Tools (BLAST) nukleotida ( Altchul et al. 1997).
METODE
Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Ternak
Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan Institut Pertanian Bogor.
Penelitian dilakukan pada bulan November 2013-Januari 2014.
Bahan
Sampel DNA yang dianalisis berasal dari sampel darah 100 ekor sapi bali
di BPTU dan sampel semen 23 ekor sapi bali di BIBD pulau Bali yang merupakan
koleksi Laboratorium Genetika Molekuler Ternak. Bahan yang digunakan untuk
ekstraksi DNA adalah adalah DW (Destilation water), NaCl , 1x STE, ProteinaseK, SDS 10% (Sodium Dodesil Sulfat) , larutan fenol, CIAA (Kloroform Iso Amil
Alkohol), etanol absolut, dan bufer TE 80% (tris EDTA). Bahan yang digunakan
untuk amplifikasi, elektroforesis dan analisis RFLP adalah sampel DNA hasil
ekstraksi, destilation water (DW), 10 x buffer, MgCl2, pasangan primer forward
dan reverse fragmen gen UTMP, enzim Taq polymerase (Fermentas), deoxy
3
Nucleotide Triphospat (dNTPs), produk PCR, agarose, 0.5 x Tris-Borat EDTA
(TBE), Ethidium Bromide (EtBr), loading dye (0.01% Xylene Cyanol, 0.01%
Bromthymol blue dan 50% gliserol), marker 100 bp, enzim restriksi BsrI, dan
bufer B.
Bahan yang digunakan untuk analisis sekuensing adalah produk PCR dan
primer forward fragmen gen UTMP. Primer yang digunakan untuk
mengamplifikasi gen Uterine Milk protein (UTMP|BsrI) berdasarkan Khatib et al.
(2007) adalah forward: 5´- GGCCCTACATCAAGCTGAGA -3´ dan reverse: 5´
-CTACTCAACTTGGGGGTTGA -3´ dengan panjang produk 327 bp.
Alat
Alat yang digunakan antara lain 1 set pipet mikro dan tipnya, tabung
eppendorf, vortexmixer, refrigerator, alat sentrifugasi, freezer, mesin PCR, 1 set
alat pencetak gel, power supply 100 volt, microwave, stearer, gelas ukur, dan
tabug erlenmeyer.
Prosedur
Ekstraksi DNA
Eksktraksi DNA dilakukan berdasarkan metode Sambrook et al. (1989).
Ekstraksi dilakukan pada 2 jenis sampel berbeda yaitu sampel darah dan sampel
semen. Yang membedakan dari kedua sampel tersebut dalam ekstraksi DNA yaitu
volume awal yang digunakan. Sampel darah segar yang digunakan dalam
ekstraksi sebanyak 200 μL sedangkan untuk sampel semen yang digunakan
sebanyak 400 μL. Sampel dimasukkan dalam tabung 1.5 mL, selanjutnya
ditambahkan 1 000 μL larutan NaCl 0.2%. Sampel di sentrifugasi pada kecepatan
8 000 rpm selama 5 menit, lalu bagian supernatannya dibuang. Kemudian
ditambahkan 350 μL larutan 1xSTE (Sodium tris EDTA), 40 μL SDS 10%
(sodium dodesil sulfat), dan 20 μL proteinase K. Sampel dikocok pelan dalam
inkubator pada suhu 55 oC selama 2 jam. Molekul DNA selanjutnya dimurnikan
dengan metode fenol-chloroform yaitu dengan ditambahkan 400 μL larutan fenol,
400 μL chloroform iso amil alcohol (CIAA), dan 40 μL 5M NaCl, lalu dikocok
pelan pada suhu ruang selama 1 jam. Kemudian disentrifugasi selama 5 menit
dengan kecepatan 12 000 rpm.
Bagian DNA yang bening dipindahkan pipet ke tabung 1.5 mL yang baru.
Selanjutnya ditambahkan 800 μL EtOH absolut dan 40 μL 5M NaCl. Molekul
DNA kemudian disimpan selama semalam (over night) pada suhu -20 oC.
Molekul DNA kemudian dipisahkan dari etanol absolut dengan cara disentrifugasi
selama 5 menit dengan kecepatan 12 000 rpm. Bagian supernatan dibuang dan
didiamkan dalam keadaan terbuka hingga alkohol tersebut kering. Kemudian
endapan yang diperoleh disuspensikan dalam 100 μL TE (tris EDTA).
Amplifikasi DNA
Amplifikasi gen UTMP yang terletak diexon 4 menghasilkan produk PCR
sepanjang 327 bp dilakukan dengan menggunakan campuran yang terdiri dari 1
4
μL sampel DNA yang sudah di ekstraksi, dan master mix yang terdiri dari 10.75
μL DW, 1.5 μL buffer, 1 μL MgCl, 0.3 μL dNTPs , 0.2 μL primer forward dan 0.2
μL primer reverse, dan 0.05 taq polymerase.
Campuran tersebut kemudian dimasukkan ke dalam mesin PCR dengan
kondisi suhu predenaturasi 95 oC selama 5 menit, 35 siklus (denaturasi 95 oC
selama 10 detik, annealing 60 ⁰C selama 20 detik, dan ekstensi 72 oC selama 30
detik) dan post ekstensi 72 oC selama 5 menit, elongasi akhir pada suhu 72 ⁰C
selama 5 menit dalam 1 siklus. Produk PCR dielektroforesis menggunakan
agarose 1.5%. Posisi penempelan primer dan situs pemotong enzim BsrI pada
sekuens gen UTMP exon 4 dapat dilihat pada Gambar1.
Gambar 1 Posisi penempelan primer pada sekuen Gen UTMP menggunakan
enzim BsrI (GenBank Nomor Akses L22095). (basa c|cagt : situs
pemotongan enzim BsrI)
Genotyping Gen UTMP
Genotyping dengan metode Restriction Fragment Length Polymorphism
(RFLP) dilakukan dengan menggunakan produk PCR sebanyak 5μL yang
dipindahkan ke dalam tabung 0.5 mL dan ditambahkan 1 μL DW, 0.3 μL enzim
restriksi BsrI dan 0.7 bufer BsrI. Kemudian campuran tersebut diinkubasi pada
suhu 65 ⁰C selama 16 jam. Sampel DNA yang telah dipotong dengan enzim
restriksi kemudian dielektroforesis pada gel agarose 2% dengan tegangan 100
volt selama 30 menit.
Elektroforesis produk PCR-RFLP diawali dengan membuat gel agarose
2% yang dibuat dengan cara melarutkan 0.6 g agarose dalam larutan 0.5 x TBE
sebanyak 30 mL kemudian dipanaskan dalam microwave selama 5 menit, dikocok
menggunakan magnetic stirrer dan ditambahkan 2.5 μL EtBr. Agarose yang
sudah dipanaskan dituang dalam pencetak gel , sisir ditempatkan pada tepian gel
hingga mengeras. Setelah gel mengeras kemudian sisir dicabut hingga terbentuk
sumur-sumur gel. Selanjutnya gel ditempatkan dalam gel tray elektroforesis yang
berisi larutan buffer.
Produk PCR-RFLP sebanyak 5 μL dicampur dengan 1 μL loading dye
kemudian dimasukkan dalam sumur-sumur gel. Sumur bagian sebelah kiri
digunakan untuk menempatkan marker DNA 100 bp sebanyak 2 μL. Gel
kemudian dialiri listrik 100 volt selama 30-45 menit. Molekul DNA yang
bermuatan negatif pada pH netral akan bergerak ke arah positif (anode). Setelah
di elektroforesis gel agarose dilihat panjang pita DNAnya dengan menggunakan
5
sinar ultraviolet dengan mesin UV Transiluminator dan dibandingkan dengan
marker untuk mengetahui panjang fragmennya.
Sekuens Fragmen GenUTMP Exon 4
Sekuens fragmen gen UTMP exon 4 dilakukan pada individu sapi bali
bergenotipe AA dengan jumlah 1 sampel. Primer yang digunakan untuk sekuens
fragmen gen UTMP hanya primer forward. Sekuensing gen UTMP dilakukan
dengan menggunakan mesin sekuenser (ABI Prims 3100-Avant Genetic
Analyzer) di perusahaan sekuensing 1st Base, Selangor, Malaysia.
Analisis Data
Frekuensi Alel Gen UTMP
Keragaman alel yang terdapat pada sapi bali di BPTU dan BIBD yang
telah dianalisis kemudian dihitung dengan pendekatan frekuensi alel. Nilai
Frekuensi alel dan genotip (Xi) UTMP diperoleh menggunakan rumus sebagai
berikut (Nei dan Kumar 2000):
Xi =
2nii + ∑ nij
2N
Keterangan :
Xi = frekuensi alel ke-i
nii = jumlah individu bergenotipe ii
nij = jumlah individu bergenotipe ij
N = jumlah individu sampel
Homologi Gen UTMP Exon 4
Hasil sekuens dianalisis dengan program BioEdit (Hall 1999). Selanjutnya
untuk mengetahui kesamaan dengan gen UTMP yang terdapat di GenBank
dianalisis menggunakan metode BLAST (www.ncbi.nhl.nih.gov./BLAST).
Untuk merekonstruksi atau melihat ada tidaknya mutasi pada sekuens fragmen
gen UTMP pada exon 4 dilakukan analisis menggunakan program Molecular
Evolutionary Genetic Analysis (MEGA5) dengan metode ClustalW (Tamura et al.
2011).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Amplifikasi Gen UTMP
Amplifikasi fragmen gen UTMP pada sapi bali dengan menggunakan
metode Polymerase Chain Reaction (PCR) pada mesin thermocycler dengan suhu
annealing 60 ⁰C selama 20 detik menghasilkan panjang produk PCR 406 pasang
basa (bp) di exon 4 (Gambar 2). Sebanyak 123 sampel sapi bali yang berasal dari
6
BPTU dan BIBD pulau Bali berhasil diamplifikasi dengan tingkat keberhasilan
100 %. Berikut hasil amplifikasi gen UTMP.
Keterangan: M = marker DNA 100 bp. Sampel 1-6 = produk amplifikasi gen UTMP
Gambar 2 Hasil amplifikasi gen UTMP pada gel agarose 1.5%.
Suhu annealing merupakan suhu yang memungkinkan terjadinya
penempelan primer pada DNA target. Suhu annealing sangat penting dalam
proses amplifikasi karena proses pemanjangan DNA baru dapat dimulai dari
primer. Suhu annealing yang digunakan dalam penelitian ini adalah 60 ⁰C, suhu
annealing tersebut sedikit berbeda dengan suhu yang digunakan oleh Khatib et al.
(2007) yang menggunakan suhu annealing 58 ⁰C. Menurut Muladno (2002), suhu
penempelan primer (annealing) berkisar antara 36 -72 ⁰C, namun suhu yang biasa
digunakan adalah 50 - 60 ⁰C. Keberhasilan dalam mengamplifikasi DNA
ditentukan oleh kondisi penempelan primer pada DNA target, selain itu faktorfaktor lain seperti komponen PCR dalam konsentrasi yang tepat dan kondisi
mesin PCR (Palumbi 1986). Beberapa hal yang dilakukan untuk optimasi PCR
antara lain suhu penempelan primer, konsentrasi primer, konsentrasi DNA target,
dan konsentrasi Mg2+. Fragmen gen UTMP|BsrI exon 4 sepanjang 406 bp dapat
diketahui dengan mencocokkan pasangan primer pada sekuens gen UTMP pada
GenBank (nomor akses L22095 ), hasil amplifikasi pada gel agarose
menunjukkan gen UTMP mempunyai panjang 406 bp. Panjang fragmen ini tidak
sama dengan hasil yang didapatkan oleh Khatib et al. (2007) yaitu 327 bp.
Penentuan Genotipe Gen UTMP
Penentuan genotip dari gen UTMP pada sapi bali dilakukan dengan
menggunakan metode PCR-RFLP menggunakan enzim restriksi BsrI yang akan
mengenali situs pemotongan C|CAGT yang terletak di daerah exon 4. Hasil
produk PCR fragmen gen UTMP|BsrI (406 bp) yang dipotong dengan enzim BsrI
menghasilkan 2 macam fragmen yaitu pada 302 bp dan 104 bp dan diperoleh 1
macam genotip yaitu AA (Gambar 3A) fenomena ini berbeda dengan hasil yang
diperoleh Khatib et al. (2007) (Gambar 3B). Pada lokus UTMP|BsrI, ternak sapi
dikatakan memiliki genotipe AA jika terdapat 2 fragmen DNA yaitu 302 bp dan
7
104 bp. Genotipe AG ditunjukkan dengan 3 fragmen yaitu 406 bp, 302 bp, dan
104 bp. Genotip GG ditunjukkan dengan 1 fragmen yaitu 406 bp.
Keterangan:
M = marker DNA 100 bp,1-6 = sampel sapi bali
(A) Hasil PCR-RFLP gen UTMP|BsrI
(B) Penentuan pita gen UTMP
Gambar 3 Penentuan genotip: (A) Hasil PCR-RFLP gen UTMP|BsrI, (B)
Penentuan pita gen UTMP
Individu-individu sapi bali yang dianalisis apabila dapat dipotong fragmen
gen UTMPnya berarti memiliki situs pemotong enzim BsrI. Individu yang tidak
dapat dipotong fragmen gen UTMPnya berarti mengalami perubahan (mutasi)
pada situs pemotong enzim BsrI. Individu yang memiliki fragmen gabungan
berarti individu tersebut memilki situs pemotong enzim BsrI dan situs pemotong
enzim BsrI yang tidak dikenal (mutasi) atau individu yang heterozigot. Analisis
RFLP mendeteksi keragaman dengan melihat perbedaan panjang fragmen DNA
yang di potong menggunakan enzim restriksi BsrI. Analisis PCR-RFLP
digunakan untuk mendeteksi adanya keragaman genetik pada gen yang
berhubungan dengan sifat ekonomis (Orita et al. 1989; Sumantri et al. 2007).
Identifikasi gen UTMP pada sapi bangsa lain yaitu holstein dilaporkan
oleh Khatib et al. (2007) bahwa terdapat keragaman gen UTMP pada posisi exon
4 posisi 1 779 (A/G) dan 1 296 (A/G). Hasil penelitian menunjukkan adanya
keragaman pada posisi 1 296 yang berhubungan erat dengan kenaikan masa
hidup produktif pada sapi holstein. Lebih lanjut dikemukakan genotipe GG dari
gen UTMP mempunyai daya tahan hidup embrio yang secara signifikan lebih
rendah bila dibandingkan genotipe lainnya. Ing et al. (1989) menjelaskan bahwa
sintesis UTMP berada di bawah kendali progesteron dan ekspresinya dominan
ditemukan pada endometrium yang mengindikasikan berperan penting dalam
mendukung konsepsi selama masa kebuntingan. Ekspresi dominan gen UTMP
dalam jaringan reproduksi konsisten dengan peran penting dari gen ini dalam
keberhasilan reproduksi dan terbukti berpengaruh nyata dengan usia hidup
produktif pada sapi perah (Khatib et al. 2009).
Frekuensi Alel Gen UTMP
Hasil analisis frekuensi alel gen UTMP pada sapi bali baik di BPTU
maupun BIBD menunjukkan bahwa ditemukan 1 macam genotipe AA dan alel A
8
(1.00) dan tidak ditemukan alel G(0.00). Hasil penelitian menunjukkan bahwa gen
UTMP|BsrI pada sapi bali bersifat monomorfik. Berikut tabel perhitungan
frekuensi alel sapi bali di BPTU dan BIBD.
Tabel 1 Frekuensi alel gen UTMP pada sapi Bali
Bangsa
Jumlah sampel
Frekuensi Alel
A
G
1.00
0.00
Sumber
Sapi Bali (BPTU)
100
Sapi bali (BIBD)
23
1.00
0.00
Hasil penelitian
1363
0.28
0.72
Khatib et al. 2007
913
0.36
0.64
Khatib et al. 2007
Sapi Holstein (CDDR)
Sapi Holstein (UW)
Hasil penelitian
Nei (1987) menyatakan bahwa suatu alel dikatakan polimorfik jika
memiliki frekuensi alel sama dengan atau kurang dari 0.99 (99%). Frekuesi alel
merupakan frekuensi relatif dari suatu alel dalam populasi (Nei dan Kumar 2000).
Selain frekuensi alel, keragaman genetik juga digunakan untuk melihat nilai
heterozigositas.
Pendugaan nilai heterozigositas penting diketahui untuk
mendapatkan informasi mengenai tingkat polimorfisme suatu alel (Falconer dan
Macay 1996). Heterozigositas digunakan dalam mengukur keragaman pada suatu
populasi. Allendorf dan Luikart (2006) menjelaskan bahwa nilai heteozigositas
dipengaruhi oleh frekuensi alel dan jumlah alel serta jumlah sampel yang
digunakan.
Analisis sekuens gen UTMP
Hasil dari analisis sekuens gen UTMP yang dipotong menggunakan enzim
BsrI terhadap sekuens gen UTMP atau SERPINA14 Bos Taurus memiliki
kesamaan pada GenBank (kode akses GenBank L22095) dengan tingkat
kesamaan 98%.
Gen UTMP yang diamati terdapat fragmen lain yang
menyebabkan insersi nukleotida pola minisatelit dengan motif 38 ulangan pada
sekuens gen UTMP pada exon 4 sapi bali di BPTU dan BIBD pulau Bali. Berikut
sekuen gen UTMP yang mengalami insersi pola minisatelit yang dijelaskan pada
gambar 4.
Gambar 4 Pola Insersi pada gen UTMP sepanjang 77 basa
9
Insersi menyebabkan perubahan panjang sekuens gen UTMP
menghasilkan pita yang panjangnya 406 bp. Insersi ini disebabkan karena adanya
penambahan basa yang berulang-ulang pada sekuen DNA gen UTMP yang
diteliti. Pada gen UTMP yang diteliti sapi bali BPTU dan BIBD tidak ditemukan
adanya mutasi melainkan terdapat insersi basa nitrogen. Insersi yang terjadi pada
gen UTMP lokasi exon 4 ini akan berpengaruh terhadap ekspresi dan fungsi gen
untuk itu perlu dilakukannya identifikasi fenotipik terkait insersi ini terhadap sapi
bali. Khatib et al. (2007) melaporkan bahwa single nukleotida polimorfisme
(SNP) gen UTMP A>G yang terdapat pada posisi 1 296 menunjukkan hubungan
yang signifikan dengan masa usia produktif (productive life). SNP ini bisa
dimanfaatkan untuk seleksi dengan bantuan penanda genetik untuk peningkatan
PL (usia hidup produktif) dalam inti pemuliaan. Berikut rekonstruksi gen UTMP
yang dijelaskan pada gambar 5.
Gambar 5 Rekonstruksi gambar gen UTMP (Ulbrich et al. 2009)
Berdasarkan hasil sekuensing panjang fragmen gen UTMP yaitu 406 bp.
Hal ini karena populasi sapi Bali yang diamati mengalami insersi sepanjang 77
basa pola minisatelit dengan motif pengulangan 38 basa yaitu 5’CCCAATGAAGGCAAAGGAGGTCCCGGCGGTCGTGAAAGT-3’ sebanyak 4
kali ulangan yang tidak sempurna. Pengertian lokus minisatelit atau Variable
Number Tandem Repeat (VNTR) adalah untaian DNA yang berisi sekuens
berulang yang panjangnya sekitar 20 hingga 100 pasang basa. Penyebab dari
variasi ini adalah unit pengulangan yang berbeda pada alel suatu individu.
Sekuens yang menyerupai satellite ini terdiri dari pasangan yang berulang dari
unit yang pendek yaitu 5-50 ulangan. Fenomena ini ditemukan secara kebetulan
sebagai fragmen yang ukurannya sangat bervariasi. Polimorfik VNTR banyak
digunakan sebagai penanda genetik dalam genetika populasi, pemetaan gen, dan
kedokteran forensik (Jeffreys et al. 1985). Posisi penempelan primer dan insersi
pola minisatelit pada exon 4 pada sekuen gen UTMP disajikan pada Gambar 4.
10
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Gen UTMP|BsrI exon 4 pada sapi bali di BPTU dan BIBD diperoleh 1
genotipe AA dan alel A. Sapi bali yang terdapat di BPTU dan BIBD pada gen
UTMP bersifat monomorfik. Sekuens gen UTMP sapi bali yang diamati tidak
ditemukan adanya mutasi tetapi ditemukan adanya insersi dengan pola minisatelit.
Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut pada sampel sapi bali yang terdapat
di daerah-daerah pengembangan sapi bali lain yang ada di Indonesia dan
pengujian fenotipik terkait insersi yang terjadi pada sampel sapi bali yang diamati.
Selain itu perlu lebih banyak lagi analisis mengenai gen-gen lain yang terkait
dengan sifat reproduksi pada sapi bali.
11
DAFTAR PUSTAKA
Altschul SF, Gish W, Miller W, Mayers EW, Lipman DJ. 1990. Basic local
alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410.
Allendorf FW, Luikart G. 2007. Conservation and the Genetics of Populations.
USA (US): Blackwell Publishing.
Bugiwati SRA. 2007. Pertumbuhan dimensi tubuh pedet jantan sapi bali di
Kabupaten Bone dan Barru Sulawesi Selatan. J. Sains dan Tekno. 7:103–
108.
[Ditjennak] Direktorat Jenderal Peteurnakan. 2013. Statistik Peternakan 2013.
[terhubung berkala]. http://ditjennak.deptan.go.id. [28 oktober 2013].
Direktorat Bina Pembibitan. 2000. Kebijakan Pembibitan dalam Swasembada
Daging 2005. Panduan Seminar Nasional. Departemen Pertanian,
Direktorat Jendral Peternakan.
Falconer DS, Mackay TFC. 1996. Introduction to Quantitative Genetics. Ed ke-4.
Longman(UK): Essex.
Ing NH, Francis H, Donnels J, Amann J, Roberts M. 1989. Progesteronen
induction of the uterine milk protein : Major secretory proteins of Sheep
Endometrium. Biology of Reproduction. 41, 643-654.
Jeffreys, AJ, Wilson E, Thein SL. 1985. ‘Hypervariable minisatellite’ regions in
human DNA. Nature. Vol 314: 67-73.
Khatib H, Schutzkuz V, Chang YM, Rosa GJM. 2007. Pattern of expression of
uterine milk protein gene and its association with productive life in dairy
cattle. J. Dairy Sci.90: 2427-2433. doi:10.3168/jds.2006-722
Khatib H, Huang W, Wang X, Train AH, Bindrim AB, Schutzkus V, Monson RL.
2009. Single gene and gene interaction effects on fertilization and
embryonic survival rates in cattle. J. Dairy Sci. 92: 2238-2247.
doi:10.3168/jds.2008-1767.
Moioli B, Napolitano F, Catillo G. 2004. Genetic diversity between Piedmontese,
Maremmana and Podolica Cattle Breeds. Journal of Heredity. Vol. 95, no.
3, p. 250-256
Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor (ID): Pustaka
Wirausaha Muda dan USESE Foundation.
Nei M. 1987. Molecular Evolutionery Genetics. New York (US) : Columbia
University Pr.
Nei M, Kumar S. 2000. Molecular Evolution and Phylogenetics. New York (US):
Oxford University Pr.
Nijman IJ, Otsen M, Verkaar ELC, Ruijter C, Hanekamp E, Ochieng JW,
Shamshad S, RegeJEO, Hanotte O, Barwegen MW et al. 2003.
Hybridization of banteng (Bos javanicus) and zebu (Bos indicus) revealed
by mitochondrial DNA, satellite DNA, AFLP and microsatellites. Nature.
90 : 10-16.
Orita M, Iwahana H, Kanazawa H, Hayashi K, Sekiya T. 1989. Detection of
polymorphism of human DNA by gel electrophoresis as single-strand
conformation polymorphism. Proc Natl Acad Sci. 86:2766-2770.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. USA(US): CSH Laboratory Pr.
12
Siswanto M, Patmawati NW, Trinayani NN, Wandia IN, Puja IK. 2013.
Penampilan reproduksi sapi bali pada peternakan intensif di Instalasi
pembibitan Pulukan. Jurnal Ilmu dan Kesehatan Hewan 1(1): 11-15.
Sumantri C, Anggraeni A, Farajallah A, Perwitasari D. 2007. Keragaman
mikrosatelit DNA sapi perah FH di balai pembibitan ternak unggul
Baturraden. Jurnal Ilmu Ternak dan Veteriner. 12 (2): 124-133.
Talib C. 2002. Sapi bali di daerah sumber bibit dan peluang pengembangannya.
Wartazoa 12(3): 100-107.
Tekin S, Padua MB, Newton GR, Hansen PJ. 2005. Identification and cloning of
Caprine Uterine Serpin. J Mol. Reprod. Dev. 70: 262–270. Wiley-Liss, Inc.
Tolihere MR. 2002. Increasing the success rate and adoption of artificial
insemination for genetic improvement of Bali cattle. Working Papers: Bali
Cattle Workshop. Bali, 4-7 February 2002.
Ulbrich SE, Thomas F, Katy S, Eva E, Nadine W, George JA, Horst R, Myriam R,
Eckhard W, Heinrich M et al. 2009. Evidence for estrus-dependent uterine
serpine (SERPINA 14) expression during estrus in the bovine endometrial
glandular epithelium and lumen. J Biology of Reproduction. 81:795-805.
Weir BS. 1996. Genetic Data Analysis : Method for Discrete Population Genetic
Data. Ed ke-2. Sunderland, MA (US): Sinauer Associates Inc.
Williamson G, Payne WJA, 1993. Pengantar Peternakan di Daerah
Tropis.Yogyakarta (ID): Universitas Gajah Mada Pr.
Winter WH. 2003. Cattle production in eastern Indonesia. A Summary of
collaborative research. Bogor (ID): Prosiding Seminar Nasional Teknologi
Peternakan dan Veteriner. Bogor: 28-29 September 2003.
Zulkharniem, Jakaria, Noor RR. 2010. Identifikasi keragaman genetik gen reseptor
hormone pertumbuhan (GHR|AluI) pada sapi bali. Media Peternakan.
33(2):81-87.
13
LAMPIRAN
Lampiran 1 Sekuens gen uterine milk protein yang diakses di GenBank dengan
kode akses L22095.1
LOCUS
DEFINITION
ACCESSION
VERSION
KEYWORDS
SOURCE
ORGANISM
BOVSPIS
1463 bp
mRNA
linear
MAM 26-JUN-1997
Bos taurus uterine milk protein precursor, mRNA, complete cds.
L22095
L22095.1 GI:438480
serine proteinase inhibitor; serpin; uterine milk protein.
Bos taurus (cattle)
Bos taurus
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
Mammalia; Eutheria; Laurasiatheria; Cetartiodactyla; Ruminantia;
Pecora; Bovidae; Bovinae; Bos.
REFERENCE
1 (bases 1 to 1463)
AUTHORS
Mathialagan,N. and Hansen,T.R.
TITLE
Pepsin-inhibitory activity of the uterine serpins
JOURNAL
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (24), 13653-13658 (1996)
8942989
PUBMED
REFERENCE
2 (bases 1 to 1463)
AUTHORS
Mathialagan,N., Hansen,T. and Roberts,M.R.
TITLE
Direct Submission
JOURNAL
Submitted (03-JAN-1994) Animal Sciences, University of Missouri,
158 ASRC, East Campus Drive, Columbia, MO 65211, USA
FEATURES
Location/Qualifiers
source
1..1463
/organism="Bos taurus"
/mol_type="mRNA"
/db_xref="taxon:9913"
/sex="female"
/cell_type="epithelial cell"
/tissue_type="endometrium"
/dev_stage="adult"
CDS
19..1398
/experiment="experimental evidence, no additional details
recorded"
/note="uterine milk protein; label: serpin"
/codon_start=1
/product="serine proteinase inhibitor precursor"
/protein_id="AAB61677.1"
/db_xref="GI:438481"
/translation="MSHGRMNLALSLVFILCGLFNSIFCEKQQHSQKHMNLVLLKKIS
ALSQKMEAHPKDFAQELFKALIIEDPRKNIIFSPMAMTTTLATLSLGIKSTMRTHHPE
DLKLEPKLLDVHKYLQPLVHVGRELVKQKVLKHQHILFINRKMMVNQMLLQQISKLQG
MDIQMIDFTDIEKAKKTISHHVAEKTHTKITNLITDLNPETILCLVNHIFFKGILKRA
FQPKLTQKEVFFVNDQTKVQVDMMRKTERMLYSRSEELHATMVKMPCKGNVSLTLMLP
DAGQFDTDLKKMTAKRAKLQKISDFRLVRLILPKLKISFKINFKHLLPKIDPKHILTA
TAISQAITSKAPLPNLEALHQAEIELSEHALTVDTAIHTDNLLKVPVKAKEVPAVVKV
PMKAKEVPAVVKVPMNTKEVPVVVKVPMNTKEVPVVVKVNRPFLLFVEDEKTQRDLFV
GKVLNPQVE"
sig_peptide
19..93
mat_peptide
94..1395
/product="serine proteinase inhibitor"
/experiment="experimental evidence, no additional details
recorded"
/note="uterine milk protein"
3'UTR
1396..1463
polyA_signal
1442..1447
polyA_site
1463
ORIGIN
1 ggctggattg ccgcagaaat gtcccacggg agaatgaatc tggccctgtc tctggtcttc
61 atcctctgtg gcctgtttaa tagcatcttc tgtgaaaagc aacaacactc tcaaaagcac
121 atgaacctag tcttattaaa gaaaatttca gctctctccc agaagatgga agctcaccct
181 aaggattttg cccaagaatt gttcaaggct ttgataattg aggatcccag aaagaatatc
241 atcttctccc ccatggccat gaccaccacc ctggccaccc tctccctggg gatcaagtct
301 acaatgagaa cccaccaccc tgaggacctg aaacttgagc ccaaactgtt ggatgtgcac
361 aagtacttac agcctctggt ccacgtgggg cgtgagctag tgaagcagaa ggtactgaag
421 caccagcaca ttctctttat caacagaaaa atgatggtca accagatgct tctacagcag
481 ataagcaagc tgcagggaat ggacatccag atgattgact ttacagatat agaaaaagcc
14
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
1381
1441
aagaagacca
accgacctga
ttgaaaagag
accaaagtgc
gagctacatg
cttccagatg
cttcagaaaa
ttcaagataa
acagcaatct
caagctgaga
aatctgttga
aaggcaaagg
gtcgtgaaag
ttcttgctgt
aacccccaag
gaataaaaag
tcagccacca
accctgagac
cttttcagcc
aggtggacat
ctacgatggt
ccggacaatt
tcagtgactt
actttaagca
cacaggccat
tagagctgag
aagtcccagt
aggtcccggc
tcccaatgaa
ttgtggagga
ttgagtagag
agtacaattc
tgtggctgaa
catcctgtgt
caaactcacc
gatgagaaag
taagatgcct
tgacactgat
cagactggtg
tctgcttccc
cacatcgaag
cgagcacgcc
gaaggcaaag
ggtcgtgaaa
cacaaaggag
tgagaagact
ccagggccac
acc
aaaacacata
cttgttaacc
cagaaggagg
acagaacgga
tgcaaaggaa
cttaaaaaga
cgcttaattt
aagattgacc
gctcccctgc
ttaaccgtgg
gaggtcccgg
gtcccaatga
gtcccagtgg
caaagagacc
actgtgcagc
cgaaaatcac
acattttctt
tcttctttgt
tgctttacag
atgtgtccct
tgactgctaa
tgcccaagtt
ccaaacatat
ctaatttgga
acacagccat
cggtcgtgaa
acacaaagga
tcgtgaaggt
tctttgtggg
acaggaactt
aaacttaatc
caaaggcatc
gaatgaccaa
ccggtcagag
aactctcatg
gcgagctaaa
gaagatctcc
actgactgcc
ggccctacat
tcacacagat
agtcccaatg
ggtcccagtg
caacagaccc
caaagtcctc
agcaggccat
//
Lampiran 2 Hasil BLAST nukleotida sekuens gen UTMP sapi bali dengan
sekuens GenBank kode akses L22095.1
Lampiran 3 Hasil analisis sekuens fragmen gen UTMP pada sapi bali
15
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di daerah Jombang pada tanggal 11 Desember 1990.
Penulis merupakan anak ketiga dari 5 bersaudara, dari pasangan Bapak Agus
Sucipto dan Ibu Sri Endang Susiani.
Tahun 1997 memulai pendidikan pertamanya di Sekolah Dasar Negeri
(SDN) Inpres SP V Khemon Jaya dan lulus tahun 2003. Tahun yang sama penulis
melanjutkan pendidikan Sekolah Menengah Pertama Negeri Urei Faisei dan lulus
tahun 2006. Selanjutnya pada tahun yang sama penulis melanjutkan pendidikan ke
Sekolah Menengah Atas Negeri 1 Waren, Waropen dan lulus pada tahun 2009.
Pada tahun 2010 penulis di terima di Institut Pertanian Bogor pada mayor
Teknologi Produksi Ternak. Penulis pernah melaksanakan magang kerja di Balai
Embrio Ternak Cipelang-Bogor .
BALI
NENIK TRI WAHYUNI
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN
FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Identifikasi
Keragaman Gen UTMP Exon 4 pada Sapi Bali adalah benar karya saya dengan
arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada
Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Mei 2014
Nenik Tri Wahyuni
NIM D14100116
ABSTRAK
NENIK TRI WAHYUNI. Identifikasi Keragaman Gen UTMP Exon 4 pada Sapi
Bali. Dibimbing oleh JAKARIA dan ASEP GUNAWAN.
Sapi bali sebagai sumber daya genetik ternak asli Indonesia yang memiliki
beberapa keunggulan, salah satunya memiliki kemampuan reproduksi yang tinggi.
Gen Uterine Milk Protein (UTMP) adalah gen yang diduga kuat berpengaruh
terhadap masa hidup produktif yang berkaitan dengan sifat reproduksi yang
berperan penting dalam mendukung konsepsi selama kebuntingan. Tujuan
penelitian ini adalah mengidentifikasi ada tidaknya polimorfisme gen UTMP
sebagai pengontrol sifat reproduksi pada sapi bali dengan metode Polymerase
Chain Reaction-Restriksi Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP).
Sebanyak 123 sampel darah yang berasal dari BPTU sapi bali dan BIBD
dideteksi keragaman gen UTMP menggunakan enzim restriksi BsrI yang
memotong sekuens basa C|CAGT. Amplifikasi gen UTMP menghasilkan fragmen
dengan panjang 406 bp pada posisi di exon 4 dengan suhu annealing 60 ⁰C.
Hasil analisis PCR-RFLP menunjukkan bahwa sapi bali yang dianalisis memiliki
alel monomorfik AA sampel BBTU dan BIBD sebesar 100%. Hasil sekuen
fragmen gen UTMP exon 4 menunjukkan tidak ditemukan mutasi pada gen
tersebut pada sapi Bali tetapi ditemukan insersi motif DNA minisatelit sepanjang
77 basa.
Kata kunci : gen Uterine Milk Protein (UTMP), PCR-RFLP, sapi bali
ABSTRACT
NENIK TRI WAHYUNI. Identification of UTMP Gene Polymorphisms Exon 4
In Bali Cattle . Supervised by JAKARIA and ASEP GUNAWAN.
The bali cattle, one of Indonesian specific animal genetic resource, has
many advantage, one of that advantage is high in reproductivity. Uterine Milk
Protein (UTMP) gene is expected having an effect on lifes’ productivity related
to the characteristic of reproduction and has main function in supporting
conception during pregnancy. The aim of this research was to identify the
existence of UTMP polymorphisms gene as controller of reproductions
characteristic in Bali cattle using the PCR-RFLP (Polymerase Chain ReactionRestriction Fragment Length Polymorphism). One hundred twenty three blood
samples of bali cattle derived from BPTU and BIBD was detected its presence of
genetic diversity at UTMP gene using BsrI which restric C|CAGT basic
sequences. UTMP gene amplification was performed with temperature of
annealing 60 ⁰C. The results of PCR-RFLP analysis indicated that bali cattle have
been analysed monomorphic A allele at BPTU and BIBD was 100%. Result of
sequence fragment UTMP gene exon 4 was indicate insersi mutation 77 basic
until long change sequence it bands 406 base pair.
Key words : bali cattle, uterine milk protein (UTMP), PCR-RFLP
IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN UTMP EXON 4 PADA SAPI
BALI
NENIK TRI WAHYUNI
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Peternakan
pada
Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN
FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi : Identifikasi Keragaman Gen UTMP Exon 4 Pada Sapi Bali
Nama
: Nenik Tri Wahyuni
NIM
: D14100116
Disetujui oleh
Dr Jakaria, SPt MSi
Pembimbing I
Dr agr Asep Gunawan, SPt MSc
Pembimbing II
Diketahui oleh
Prof Dr Ir Muladno, MSA
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan November 2013 hingga
Januari 2014 ini ialah gen reproduksi pada sapi Bali, dengan judul Identifikasi
Keragaman Gen UTMP Exon 4 pada Sapi Bali.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr Jakaria, SPt MSi selaku
pembimbing akademik dan pembimbing skripsi, Bapak Dr agr Asep Gunawan,
SPt MSc selaku dosen pembimbing skripsi atas waktu, tenaga, saran, dan
kesabaran yang telah diberikan. Terimakasih juga penulis ucapkan kepada Bapak
Edit Lesa Aditya SPt MSc selaku dosen penguji sidang yang telah memberikan
masukan dan saran dalam penulisan skripsi ini. Ungkapan terima kasih juga
disampaikan kepada ayah, ibu, serta seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih
sayangnya. Tak lupa penulis sampaikan terimakasih kepada Ricky SF, Devi S,
Luthfia I, Sherly J, Irine FZ, Kiky U, Dhini, Kak Alit, Kak Ferdi, Kak Erik, Kak
Irine, Kak Furqon, Ishfi dan Ria PR. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Mei 2014
Nenik Tri Wahyuni
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
METODE
Lokasi dan Waktu penelitian
Bahan
Alat
Prosedur
Ekstraksi DNA
Amplifikasi DNA
Genotyping Gen UTMP
Sekuens Fragmen Gen UTMP Exon 4
Analisis Data
HASIL DAN PEMBAHASAN
Amplifikasi Gen UTMP
Penentuan Genotipe Gen UTMP
Frekuensi Alel Gen UTMP
Analisis sekuens gen UTMP
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP
vi
vi
1
1
2
2
2
2
2
3
3
3
3
4
5
5
5
5
6
7
8
10
10
10
11
13
15
DAFTAR GAMBAR
1 Posisi Penempelan primer pada fragmen gen UTMP dan situs pemotongan
enzim BsrI
2 Hasil amplifikasi gen UTMP pada gel agarose 1.5%
3 Penentuan genotip gen UTMP|BsrI
4 Pola Insersi pada gen UTMP sepanjang 77 basa
5 Rekonstruksi gambar gen UTMP
4
6
7
8
9
DAFTAR LAMPIRAN
1 Sekuens gen uterine milk protein (UTMP) yang diakses di GanBank
dengan kode akses L22095
2 Hasil BLAST nukleotida sekuens gen UTMP sapi Bali
3 Hasil analisis sekuens fragmen gen UTMP pada sapi bali
13
14
14
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Sapi bali merupakan sapi hasil dari domestikasi banteng (Bos javanicus)
(Nijman et al. 2003) dan merupakan salah satu sumberdaya genetik ternak asli
Indonesia yang perlu dipertahankan dan dilestarikan keberadaannnya. Populasi
sapi bali tahun 2013 diperkirakan sekitar 4.483.890 (Ditjennak 2013) dan
berkontribusi sekitar 27% terhadap total sapi Indonesia. Daerah sumber bibit sapi
bali yang difokuskan dalam penelitian ini adalah BPTU dan BIBD sapi bali di
pulau Bali. Di BPTU sapi bali , berbagai teknik dan kiprah serta pengembangan
plasma nutfah kebanggaan Indonesia terus berjalan hingga saat ini. BPTU dan
BIBD merupakan daerah penghasil bibit-bibit unggul dari sapi bali yang
dianggap mempunyai keunggulan sebagai penghasil bibit. Pada sapi Bali telah
dilakukan program nasional pemurnian dan peningkatan mutu genetik ternak
sejak tahun 1976 di pulau Bali sesuai dengan Surat Keputusan (SK) Menteri
Pertanian nomor 776/Kpts/Um/12/1976.
Sapi bali mempunyai keunggulan yang tidak dimiliki sapi bangsa lain
diantaranya memiliki kemampuan beradaptasi dengan lingkungan marginal
seperti kualitas pakan yang rendah, iklim tropis, ketersediaan air yang kurang,
manajemen yang kurang baik dan ketahanan terhadap parasit (Zulkharniem et al.
2010). Selain itu sapi bali mempunyai kemampuan fertilitas berkisar antara 83%86 % (Siswanto et al. 2013) dan persentase karkas yang tinggi serta kadar lemak
yang rendah (Bugiwati 2007). Siswanto et al. (2013) melaporkan bahwa
penampilan reproduksi sapi bali yang dipelihara secara intensif adalah umur sapi
bali mengalami birahi pertama 718.57± 12.65 hari, umur pertama melahirkan
1104.51± 23.82 dan calving interval 350.46±27.98 hari. Namun disamping
kelebihannya tersebut, terdapat beberapa kelemahan pada sapi Bali diantaranya
memiliki produksi susu yang relatif rendah dan tingkat kematian anak yang cukup
tinggi mencapai 30% (Tolihere 2002). Seleksi sapi bali dengan kemampuan
hidup yang tinggi untuk kelangsungan hidup anak sangat penting untuk dilakukan
melalui seleksi yang akurat.
Aplikasi penanda molekuler memungkinkan untuk digunakan sebagai alat
seleksi yang akurat melalui pendekatan kandidat gen karena dimungkinkan dapat
diprediksi sejak awal dan diturunkan dari generasi ke generasi. Salah satu gen
yang diduga kuat berpengaruh terhadap masa hidup produktif dan produksi susu
yaitu gen Uterine Milk Protein (UTMP). UTMP atau lebih dikenal dengan
protein susu rahim adalah protein utama yang disekresikan oleh endometrium
dibawah kontrol dari progestron dan ekspresinya dominan ditemukan pada
endometrium yang mengindikasikan berperan penting dalam
mendukung
konsepsi selama masa kebuntingan (Ing et al. 1989).
Pada ternak lain seperti domba dan babi, UTMP dikenal juga sebagai serin
proteinase inhibitor (Tekin et al. 2005). Fungsi khusus UTMP masih belum
banyak diketahui akan tetapi kemungkinan berperan dalam mengontrol konsepsi,
pertumbuhan, dan sistem kekebalan tubuh pada induk. Ekspresi gen UTMP
ditemukan dominan pada jaringan reproduksi yang konsisten dengan peran
pentingnya dalam keberhasilan reproduksi (Khatib et al. 2007) yang terletak pada
2
kromosom 21 dalam wilayah genomic 321.6 kb yang terdiri dari 5 exon (Ulbrich
et al. 2009). Lebih lanjut dilaporkan identifikasi keragaman gen UTMP
ditemukan berhubungan nyata terhadap masa hidup produktif pada sapi holstein
(Khatib et al. 2007). Berdasarkan informasi tersebut, gen UTMP di yakini sebagai
salah satu kandidat gen yang dapat digunakan untuk memperbaiki masa hidup
produktif dan produksi susu pada sapi bali.
Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah mengidentifikasi keragaman gen UTMP
pada posisi exon 4 sapi bali di Balai Pembibitan Ternak Unggul dan Balai
Inseminasi Buatan Daerah pulau Bali.
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini meliputi analisis pada 100 ekor sapi bali yang terdapat di
Balai pembibitan Ternak Unggul (BPTU) dan 23 ekor sapi Balai Inseminasi
Buatan Daerah sapi bali, pulau Bali. Keragaman gen UTMP dianalisis
menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length
Polymorphism (PCR-RFLP). Ada tidaknya mutasi di fragmen gen UTMP exon 4
dianalisis melalui teknik sequencer. Analisis data dilakukan melalui pendekatan
frekuensi alel dan analisis sekuens menggunakan Basic Local Alignment Search
Tools (BLAST) nukleotida ( Altchul et al. 1997).
METODE
Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Ternak
Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan Institut Pertanian Bogor.
Penelitian dilakukan pada bulan November 2013-Januari 2014.
Bahan
Sampel DNA yang dianalisis berasal dari sampel darah 100 ekor sapi bali
di BPTU dan sampel semen 23 ekor sapi bali di BIBD pulau Bali yang merupakan
koleksi Laboratorium Genetika Molekuler Ternak. Bahan yang digunakan untuk
ekstraksi DNA adalah adalah DW (Destilation water), NaCl , 1x STE, ProteinaseK, SDS 10% (Sodium Dodesil Sulfat) , larutan fenol, CIAA (Kloroform Iso Amil
Alkohol), etanol absolut, dan bufer TE 80% (tris EDTA). Bahan yang digunakan
untuk amplifikasi, elektroforesis dan analisis RFLP adalah sampel DNA hasil
ekstraksi, destilation water (DW), 10 x buffer, MgCl2, pasangan primer forward
dan reverse fragmen gen UTMP, enzim Taq polymerase (Fermentas), deoxy
3
Nucleotide Triphospat (dNTPs), produk PCR, agarose, 0.5 x Tris-Borat EDTA
(TBE), Ethidium Bromide (EtBr), loading dye (0.01% Xylene Cyanol, 0.01%
Bromthymol blue dan 50% gliserol), marker 100 bp, enzim restriksi BsrI, dan
bufer B.
Bahan yang digunakan untuk analisis sekuensing adalah produk PCR dan
primer forward fragmen gen UTMP. Primer yang digunakan untuk
mengamplifikasi gen Uterine Milk protein (UTMP|BsrI) berdasarkan Khatib et al.
(2007) adalah forward: 5´- GGCCCTACATCAAGCTGAGA -3´ dan reverse: 5´
-CTACTCAACTTGGGGGTTGA -3´ dengan panjang produk 327 bp.
Alat
Alat yang digunakan antara lain 1 set pipet mikro dan tipnya, tabung
eppendorf, vortexmixer, refrigerator, alat sentrifugasi, freezer, mesin PCR, 1 set
alat pencetak gel, power supply 100 volt, microwave, stearer, gelas ukur, dan
tabug erlenmeyer.
Prosedur
Ekstraksi DNA
Eksktraksi DNA dilakukan berdasarkan metode Sambrook et al. (1989).
Ekstraksi dilakukan pada 2 jenis sampel berbeda yaitu sampel darah dan sampel
semen. Yang membedakan dari kedua sampel tersebut dalam ekstraksi DNA yaitu
volume awal yang digunakan. Sampel darah segar yang digunakan dalam
ekstraksi sebanyak 200 μL sedangkan untuk sampel semen yang digunakan
sebanyak 400 μL. Sampel dimasukkan dalam tabung 1.5 mL, selanjutnya
ditambahkan 1 000 μL larutan NaCl 0.2%. Sampel di sentrifugasi pada kecepatan
8 000 rpm selama 5 menit, lalu bagian supernatannya dibuang. Kemudian
ditambahkan 350 μL larutan 1xSTE (Sodium tris EDTA), 40 μL SDS 10%
(sodium dodesil sulfat), dan 20 μL proteinase K. Sampel dikocok pelan dalam
inkubator pada suhu 55 oC selama 2 jam. Molekul DNA selanjutnya dimurnikan
dengan metode fenol-chloroform yaitu dengan ditambahkan 400 μL larutan fenol,
400 μL chloroform iso amil alcohol (CIAA), dan 40 μL 5M NaCl, lalu dikocok
pelan pada suhu ruang selama 1 jam. Kemudian disentrifugasi selama 5 menit
dengan kecepatan 12 000 rpm.
Bagian DNA yang bening dipindahkan pipet ke tabung 1.5 mL yang baru.
Selanjutnya ditambahkan 800 μL EtOH absolut dan 40 μL 5M NaCl. Molekul
DNA kemudian disimpan selama semalam (over night) pada suhu -20 oC.
Molekul DNA kemudian dipisahkan dari etanol absolut dengan cara disentrifugasi
selama 5 menit dengan kecepatan 12 000 rpm. Bagian supernatan dibuang dan
didiamkan dalam keadaan terbuka hingga alkohol tersebut kering. Kemudian
endapan yang diperoleh disuspensikan dalam 100 μL TE (tris EDTA).
Amplifikasi DNA
Amplifikasi gen UTMP yang terletak diexon 4 menghasilkan produk PCR
sepanjang 327 bp dilakukan dengan menggunakan campuran yang terdiri dari 1
4
μL sampel DNA yang sudah di ekstraksi, dan master mix yang terdiri dari 10.75
μL DW, 1.5 μL buffer, 1 μL MgCl, 0.3 μL dNTPs , 0.2 μL primer forward dan 0.2
μL primer reverse, dan 0.05 taq polymerase.
Campuran tersebut kemudian dimasukkan ke dalam mesin PCR dengan
kondisi suhu predenaturasi 95 oC selama 5 menit, 35 siklus (denaturasi 95 oC
selama 10 detik, annealing 60 ⁰C selama 20 detik, dan ekstensi 72 oC selama 30
detik) dan post ekstensi 72 oC selama 5 menit, elongasi akhir pada suhu 72 ⁰C
selama 5 menit dalam 1 siklus. Produk PCR dielektroforesis menggunakan
agarose 1.5%. Posisi penempelan primer dan situs pemotong enzim BsrI pada
sekuens gen UTMP exon 4 dapat dilihat pada Gambar1.
Gambar 1 Posisi penempelan primer pada sekuen Gen UTMP menggunakan
enzim BsrI (GenBank Nomor Akses L22095). (basa c|cagt : situs
pemotongan enzim BsrI)
Genotyping Gen UTMP
Genotyping dengan metode Restriction Fragment Length Polymorphism
(RFLP) dilakukan dengan menggunakan produk PCR sebanyak 5μL yang
dipindahkan ke dalam tabung 0.5 mL dan ditambahkan 1 μL DW, 0.3 μL enzim
restriksi BsrI dan 0.7 bufer BsrI. Kemudian campuran tersebut diinkubasi pada
suhu 65 ⁰C selama 16 jam. Sampel DNA yang telah dipotong dengan enzim
restriksi kemudian dielektroforesis pada gel agarose 2% dengan tegangan 100
volt selama 30 menit.
Elektroforesis produk PCR-RFLP diawali dengan membuat gel agarose
2% yang dibuat dengan cara melarutkan 0.6 g agarose dalam larutan 0.5 x TBE
sebanyak 30 mL kemudian dipanaskan dalam microwave selama 5 menit, dikocok
menggunakan magnetic stirrer dan ditambahkan 2.5 μL EtBr. Agarose yang
sudah dipanaskan dituang dalam pencetak gel , sisir ditempatkan pada tepian gel
hingga mengeras. Setelah gel mengeras kemudian sisir dicabut hingga terbentuk
sumur-sumur gel. Selanjutnya gel ditempatkan dalam gel tray elektroforesis yang
berisi larutan buffer.
Produk PCR-RFLP sebanyak 5 μL dicampur dengan 1 μL loading dye
kemudian dimasukkan dalam sumur-sumur gel. Sumur bagian sebelah kiri
digunakan untuk menempatkan marker DNA 100 bp sebanyak 2 μL. Gel
kemudian dialiri listrik 100 volt selama 30-45 menit. Molekul DNA yang
bermuatan negatif pada pH netral akan bergerak ke arah positif (anode). Setelah
di elektroforesis gel agarose dilihat panjang pita DNAnya dengan menggunakan
5
sinar ultraviolet dengan mesin UV Transiluminator dan dibandingkan dengan
marker untuk mengetahui panjang fragmennya.
Sekuens Fragmen GenUTMP Exon 4
Sekuens fragmen gen UTMP exon 4 dilakukan pada individu sapi bali
bergenotipe AA dengan jumlah 1 sampel. Primer yang digunakan untuk sekuens
fragmen gen UTMP hanya primer forward. Sekuensing gen UTMP dilakukan
dengan menggunakan mesin sekuenser (ABI Prims 3100-Avant Genetic
Analyzer) di perusahaan sekuensing 1st Base, Selangor, Malaysia.
Analisis Data
Frekuensi Alel Gen UTMP
Keragaman alel yang terdapat pada sapi bali di BPTU dan BIBD yang
telah dianalisis kemudian dihitung dengan pendekatan frekuensi alel. Nilai
Frekuensi alel dan genotip (Xi) UTMP diperoleh menggunakan rumus sebagai
berikut (Nei dan Kumar 2000):
Xi =
2nii + ∑ nij
2N
Keterangan :
Xi = frekuensi alel ke-i
nii = jumlah individu bergenotipe ii
nij = jumlah individu bergenotipe ij
N = jumlah individu sampel
Homologi Gen UTMP Exon 4
Hasil sekuens dianalisis dengan program BioEdit (Hall 1999). Selanjutnya
untuk mengetahui kesamaan dengan gen UTMP yang terdapat di GenBank
dianalisis menggunakan metode BLAST (www.ncbi.nhl.nih.gov./BLAST).
Untuk merekonstruksi atau melihat ada tidaknya mutasi pada sekuens fragmen
gen UTMP pada exon 4 dilakukan analisis menggunakan program Molecular
Evolutionary Genetic Analysis (MEGA5) dengan metode ClustalW (Tamura et al.
2011).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Amplifikasi Gen UTMP
Amplifikasi fragmen gen UTMP pada sapi bali dengan menggunakan
metode Polymerase Chain Reaction (PCR) pada mesin thermocycler dengan suhu
annealing 60 ⁰C selama 20 detik menghasilkan panjang produk PCR 406 pasang
basa (bp) di exon 4 (Gambar 2). Sebanyak 123 sampel sapi bali yang berasal dari
6
BPTU dan BIBD pulau Bali berhasil diamplifikasi dengan tingkat keberhasilan
100 %. Berikut hasil amplifikasi gen UTMP.
Keterangan: M = marker DNA 100 bp. Sampel 1-6 = produk amplifikasi gen UTMP
Gambar 2 Hasil amplifikasi gen UTMP pada gel agarose 1.5%.
Suhu annealing merupakan suhu yang memungkinkan terjadinya
penempelan primer pada DNA target. Suhu annealing sangat penting dalam
proses amplifikasi karena proses pemanjangan DNA baru dapat dimulai dari
primer. Suhu annealing yang digunakan dalam penelitian ini adalah 60 ⁰C, suhu
annealing tersebut sedikit berbeda dengan suhu yang digunakan oleh Khatib et al.
(2007) yang menggunakan suhu annealing 58 ⁰C. Menurut Muladno (2002), suhu
penempelan primer (annealing) berkisar antara 36 -72 ⁰C, namun suhu yang biasa
digunakan adalah 50 - 60 ⁰C. Keberhasilan dalam mengamplifikasi DNA
ditentukan oleh kondisi penempelan primer pada DNA target, selain itu faktorfaktor lain seperti komponen PCR dalam konsentrasi yang tepat dan kondisi
mesin PCR (Palumbi 1986). Beberapa hal yang dilakukan untuk optimasi PCR
antara lain suhu penempelan primer, konsentrasi primer, konsentrasi DNA target,
dan konsentrasi Mg2+. Fragmen gen UTMP|BsrI exon 4 sepanjang 406 bp dapat
diketahui dengan mencocokkan pasangan primer pada sekuens gen UTMP pada
GenBank (nomor akses L22095 ), hasil amplifikasi pada gel agarose
menunjukkan gen UTMP mempunyai panjang 406 bp. Panjang fragmen ini tidak
sama dengan hasil yang didapatkan oleh Khatib et al. (2007) yaitu 327 bp.
Penentuan Genotipe Gen UTMP
Penentuan genotip dari gen UTMP pada sapi bali dilakukan dengan
menggunakan metode PCR-RFLP menggunakan enzim restriksi BsrI yang akan
mengenali situs pemotongan C|CAGT yang terletak di daerah exon 4. Hasil
produk PCR fragmen gen UTMP|BsrI (406 bp) yang dipotong dengan enzim BsrI
menghasilkan 2 macam fragmen yaitu pada 302 bp dan 104 bp dan diperoleh 1
macam genotip yaitu AA (Gambar 3A) fenomena ini berbeda dengan hasil yang
diperoleh Khatib et al. (2007) (Gambar 3B). Pada lokus UTMP|BsrI, ternak sapi
dikatakan memiliki genotipe AA jika terdapat 2 fragmen DNA yaitu 302 bp dan
7
104 bp. Genotipe AG ditunjukkan dengan 3 fragmen yaitu 406 bp, 302 bp, dan
104 bp. Genotip GG ditunjukkan dengan 1 fragmen yaitu 406 bp.
Keterangan:
M = marker DNA 100 bp,1-6 = sampel sapi bali
(A) Hasil PCR-RFLP gen UTMP|BsrI
(B) Penentuan pita gen UTMP
Gambar 3 Penentuan genotip: (A) Hasil PCR-RFLP gen UTMP|BsrI, (B)
Penentuan pita gen UTMP
Individu-individu sapi bali yang dianalisis apabila dapat dipotong fragmen
gen UTMPnya berarti memiliki situs pemotong enzim BsrI. Individu yang tidak
dapat dipotong fragmen gen UTMPnya berarti mengalami perubahan (mutasi)
pada situs pemotong enzim BsrI. Individu yang memiliki fragmen gabungan
berarti individu tersebut memilki situs pemotong enzim BsrI dan situs pemotong
enzim BsrI yang tidak dikenal (mutasi) atau individu yang heterozigot. Analisis
RFLP mendeteksi keragaman dengan melihat perbedaan panjang fragmen DNA
yang di potong menggunakan enzim restriksi BsrI. Analisis PCR-RFLP
digunakan untuk mendeteksi adanya keragaman genetik pada gen yang
berhubungan dengan sifat ekonomis (Orita et al. 1989; Sumantri et al. 2007).
Identifikasi gen UTMP pada sapi bangsa lain yaitu holstein dilaporkan
oleh Khatib et al. (2007) bahwa terdapat keragaman gen UTMP pada posisi exon
4 posisi 1 779 (A/G) dan 1 296 (A/G). Hasil penelitian menunjukkan adanya
keragaman pada posisi 1 296 yang berhubungan erat dengan kenaikan masa
hidup produktif pada sapi holstein. Lebih lanjut dikemukakan genotipe GG dari
gen UTMP mempunyai daya tahan hidup embrio yang secara signifikan lebih
rendah bila dibandingkan genotipe lainnya. Ing et al. (1989) menjelaskan bahwa
sintesis UTMP berada di bawah kendali progesteron dan ekspresinya dominan
ditemukan pada endometrium yang mengindikasikan berperan penting dalam
mendukung konsepsi selama masa kebuntingan. Ekspresi dominan gen UTMP
dalam jaringan reproduksi konsisten dengan peran penting dari gen ini dalam
keberhasilan reproduksi dan terbukti berpengaruh nyata dengan usia hidup
produktif pada sapi perah (Khatib et al. 2009).
Frekuensi Alel Gen UTMP
Hasil analisis frekuensi alel gen UTMP pada sapi bali baik di BPTU
maupun BIBD menunjukkan bahwa ditemukan 1 macam genotipe AA dan alel A
8
(1.00) dan tidak ditemukan alel G(0.00). Hasil penelitian menunjukkan bahwa gen
UTMP|BsrI pada sapi bali bersifat monomorfik. Berikut tabel perhitungan
frekuensi alel sapi bali di BPTU dan BIBD.
Tabel 1 Frekuensi alel gen UTMP pada sapi Bali
Bangsa
Jumlah sampel
Frekuensi Alel
A
G
1.00
0.00
Sumber
Sapi Bali (BPTU)
100
Sapi bali (BIBD)
23
1.00
0.00
Hasil penelitian
1363
0.28
0.72
Khatib et al. 2007
913
0.36
0.64
Khatib et al. 2007
Sapi Holstein (CDDR)
Sapi Holstein (UW)
Hasil penelitian
Nei (1987) menyatakan bahwa suatu alel dikatakan polimorfik jika
memiliki frekuensi alel sama dengan atau kurang dari 0.99 (99%). Frekuesi alel
merupakan frekuensi relatif dari suatu alel dalam populasi (Nei dan Kumar 2000).
Selain frekuensi alel, keragaman genetik juga digunakan untuk melihat nilai
heterozigositas.
Pendugaan nilai heterozigositas penting diketahui untuk
mendapatkan informasi mengenai tingkat polimorfisme suatu alel (Falconer dan
Macay 1996). Heterozigositas digunakan dalam mengukur keragaman pada suatu
populasi. Allendorf dan Luikart (2006) menjelaskan bahwa nilai heteozigositas
dipengaruhi oleh frekuensi alel dan jumlah alel serta jumlah sampel yang
digunakan.
Analisis sekuens gen UTMP
Hasil dari analisis sekuens gen UTMP yang dipotong menggunakan enzim
BsrI terhadap sekuens gen UTMP atau SERPINA14 Bos Taurus memiliki
kesamaan pada GenBank (kode akses GenBank L22095) dengan tingkat
kesamaan 98%.
Gen UTMP yang diamati terdapat fragmen lain yang
menyebabkan insersi nukleotida pola minisatelit dengan motif 38 ulangan pada
sekuens gen UTMP pada exon 4 sapi bali di BPTU dan BIBD pulau Bali. Berikut
sekuen gen UTMP yang mengalami insersi pola minisatelit yang dijelaskan pada
gambar 4.
Gambar 4 Pola Insersi pada gen UTMP sepanjang 77 basa
9
Insersi menyebabkan perubahan panjang sekuens gen UTMP
menghasilkan pita yang panjangnya 406 bp. Insersi ini disebabkan karena adanya
penambahan basa yang berulang-ulang pada sekuen DNA gen UTMP yang
diteliti. Pada gen UTMP yang diteliti sapi bali BPTU dan BIBD tidak ditemukan
adanya mutasi melainkan terdapat insersi basa nitrogen. Insersi yang terjadi pada
gen UTMP lokasi exon 4 ini akan berpengaruh terhadap ekspresi dan fungsi gen
untuk itu perlu dilakukannya identifikasi fenotipik terkait insersi ini terhadap sapi
bali. Khatib et al. (2007) melaporkan bahwa single nukleotida polimorfisme
(SNP) gen UTMP A>G yang terdapat pada posisi 1 296 menunjukkan hubungan
yang signifikan dengan masa usia produktif (productive life). SNP ini bisa
dimanfaatkan untuk seleksi dengan bantuan penanda genetik untuk peningkatan
PL (usia hidup produktif) dalam inti pemuliaan. Berikut rekonstruksi gen UTMP
yang dijelaskan pada gambar 5.
Gambar 5 Rekonstruksi gambar gen UTMP (Ulbrich et al. 2009)
Berdasarkan hasil sekuensing panjang fragmen gen UTMP yaitu 406 bp.
Hal ini karena populasi sapi Bali yang diamati mengalami insersi sepanjang 77
basa pola minisatelit dengan motif pengulangan 38 basa yaitu 5’CCCAATGAAGGCAAAGGAGGTCCCGGCGGTCGTGAAAGT-3’ sebanyak 4
kali ulangan yang tidak sempurna. Pengertian lokus minisatelit atau Variable
Number Tandem Repeat (VNTR) adalah untaian DNA yang berisi sekuens
berulang yang panjangnya sekitar 20 hingga 100 pasang basa. Penyebab dari
variasi ini adalah unit pengulangan yang berbeda pada alel suatu individu.
Sekuens yang menyerupai satellite ini terdiri dari pasangan yang berulang dari
unit yang pendek yaitu 5-50 ulangan. Fenomena ini ditemukan secara kebetulan
sebagai fragmen yang ukurannya sangat bervariasi. Polimorfik VNTR banyak
digunakan sebagai penanda genetik dalam genetika populasi, pemetaan gen, dan
kedokteran forensik (Jeffreys et al. 1985). Posisi penempelan primer dan insersi
pola minisatelit pada exon 4 pada sekuen gen UTMP disajikan pada Gambar 4.
10
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Gen UTMP|BsrI exon 4 pada sapi bali di BPTU dan BIBD diperoleh 1
genotipe AA dan alel A. Sapi bali yang terdapat di BPTU dan BIBD pada gen
UTMP bersifat monomorfik. Sekuens gen UTMP sapi bali yang diamati tidak
ditemukan adanya mutasi tetapi ditemukan adanya insersi dengan pola minisatelit.
Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut pada sampel sapi bali yang terdapat
di daerah-daerah pengembangan sapi bali lain yang ada di Indonesia dan
pengujian fenotipik terkait insersi yang terjadi pada sampel sapi bali yang diamati.
Selain itu perlu lebih banyak lagi analisis mengenai gen-gen lain yang terkait
dengan sifat reproduksi pada sapi bali.
11
DAFTAR PUSTAKA
Altschul SF, Gish W, Miller W, Mayers EW, Lipman DJ. 1990. Basic local
alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410.
Allendorf FW, Luikart G. 2007. Conservation and the Genetics of Populations.
USA (US): Blackwell Publishing.
Bugiwati SRA. 2007. Pertumbuhan dimensi tubuh pedet jantan sapi bali di
Kabupaten Bone dan Barru Sulawesi Selatan. J. Sains dan Tekno. 7:103–
108.
[Ditjennak] Direktorat Jenderal Peteurnakan. 2013. Statistik Peternakan 2013.
[terhubung berkala]. http://ditjennak.deptan.go.id. [28 oktober 2013].
Direktorat Bina Pembibitan. 2000. Kebijakan Pembibitan dalam Swasembada
Daging 2005. Panduan Seminar Nasional. Departemen Pertanian,
Direktorat Jendral Peternakan.
Falconer DS, Mackay TFC. 1996. Introduction to Quantitative Genetics. Ed ke-4.
Longman(UK): Essex.
Ing NH, Francis H, Donnels J, Amann J, Roberts M. 1989. Progesteronen
induction of the uterine milk protein : Major secretory proteins of Sheep
Endometrium. Biology of Reproduction. 41, 643-654.
Jeffreys, AJ, Wilson E, Thein SL. 1985. ‘Hypervariable minisatellite’ regions in
human DNA. Nature. Vol 314: 67-73.
Khatib H, Schutzkuz V, Chang YM, Rosa GJM. 2007. Pattern of expression of
uterine milk protein gene and its association with productive life in dairy
cattle. J. Dairy Sci.90: 2427-2433. doi:10.3168/jds.2006-722
Khatib H, Huang W, Wang X, Train AH, Bindrim AB, Schutzkus V, Monson RL.
2009. Single gene and gene interaction effects on fertilization and
embryonic survival rates in cattle. J. Dairy Sci. 92: 2238-2247.
doi:10.3168/jds.2008-1767.
Moioli B, Napolitano F, Catillo G. 2004. Genetic diversity between Piedmontese,
Maremmana and Podolica Cattle Breeds. Journal of Heredity. Vol. 95, no.
3, p. 250-256
Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor (ID): Pustaka
Wirausaha Muda dan USESE Foundation.
Nei M. 1987. Molecular Evolutionery Genetics. New York (US) : Columbia
University Pr.
Nei M, Kumar S. 2000. Molecular Evolution and Phylogenetics. New York (US):
Oxford University Pr.
Nijman IJ, Otsen M, Verkaar ELC, Ruijter C, Hanekamp E, Ochieng JW,
Shamshad S, RegeJEO, Hanotte O, Barwegen MW et al. 2003.
Hybridization of banteng (Bos javanicus) and zebu (Bos indicus) revealed
by mitochondrial DNA, satellite DNA, AFLP and microsatellites. Nature.
90 : 10-16.
Orita M, Iwahana H, Kanazawa H, Hayashi K, Sekiya T. 1989. Detection of
polymorphism of human DNA by gel electrophoresis as single-strand
conformation polymorphism. Proc Natl Acad Sci. 86:2766-2770.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. USA(US): CSH Laboratory Pr.
12
Siswanto M, Patmawati NW, Trinayani NN, Wandia IN, Puja IK. 2013.
Penampilan reproduksi sapi bali pada peternakan intensif di Instalasi
pembibitan Pulukan. Jurnal Ilmu dan Kesehatan Hewan 1(1): 11-15.
Sumantri C, Anggraeni A, Farajallah A, Perwitasari D. 2007. Keragaman
mikrosatelit DNA sapi perah FH di balai pembibitan ternak unggul
Baturraden. Jurnal Ilmu Ternak dan Veteriner. 12 (2): 124-133.
Talib C. 2002. Sapi bali di daerah sumber bibit dan peluang pengembangannya.
Wartazoa 12(3): 100-107.
Tekin S, Padua MB, Newton GR, Hansen PJ. 2005. Identification and cloning of
Caprine Uterine Serpin. J Mol. Reprod. Dev. 70: 262–270. Wiley-Liss, Inc.
Tolihere MR. 2002. Increasing the success rate and adoption of artificial
insemination for genetic improvement of Bali cattle. Working Papers: Bali
Cattle Workshop. Bali, 4-7 February 2002.
Ulbrich SE, Thomas F, Katy S, Eva E, Nadine W, George JA, Horst R, Myriam R,
Eckhard W, Heinrich M et al. 2009. Evidence for estrus-dependent uterine
serpine (SERPINA 14) expression during estrus in the bovine endometrial
glandular epithelium and lumen. J Biology of Reproduction. 81:795-805.
Weir BS. 1996. Genetic Data Analysis : Method for Discrete Population Genetic
Data. Ed ke-2. Sunderland, MA (US): Sinauer Associates Inc.
Williamson G, Payne WJA, 1993. Pengantar Peternakan di Daerah
Tropis.Yogyakarta (ID): Universitas Gajah Mada Pr.
Winter WH. 2003. Cattle production in eastern Indonesia. A Summary of
collaborative research. Bogor (ID): Prosiding Seminar Nasional Teknologi
Peternakan dan Veteriner. Bogor: 28-29 September 2003.
Zulkharniem, Jakaria, Noor RR. 2010. Identifikasi keragaman genetik gen reseptor
hormone pertumbuhan (GHR|AluI) pada sapi bali. Media Peternakan.
33(2):81-87.
13
LAMPIRAN
Lampiran 1 Sekuens gen uterine milk protein yang diakses di GenBank dengan
kode akses L22095.1
LOCUS
DEFINITION
ACCESSION
VERSION
KEYWORDS
SOURCE
ORGANISM
BOVSPIS
1463 bp
mRNA
linear
MAM 26-JUN-1997
Bos taurus uterine milk protein precursor, mRNA, complete cds.
L22095
L22095.1 GI:438480
serine proteinase inhibitor; serpin; uterine milk protein.
Bos taurus (cattle)
Bos taurus
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
Mammalia; Eutheria; Laurasiatheria; Cetartiodactyla; Ruminantia;
Pecora; Bovidae; Bovinae; Bos.
REFERENCE
1 (bases 1 to 1463)
AUTHORS
Mathialagan,N. and Hansen,T.R.
TITLE
Pepsin-inhibitory activity of the uterine serpins
JOURNAL
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (24), 13653-13658 (1996)
8942989
PUBMED
REFERENCE
2 (bases 1 to 1463)
AUTHORS
Mathialagan,N., Hansen,T. and Roberts,M.R.
TITLE
Direct Submission
JOURNAL
Submitted (03-JAN-1994) Animal Sciences, University of Missouri,
158 ASRC, East Campus Drive, Columbia, MO 65211, USA
FEATURES
Location/Qualifiers
source
1..1463
/organism="Bos taurus"
/mol_type="mRNA"
/db_xref="taxon:9913"
/sex="female"
/cell_type="epithelial cell"
/tissue_type="endometrium"
/dev_stage="adult"
CDS
19..1398
/experiment="experimental evidence, no additional details
recorded"
/note="uterine milk protein; label: serpin"
/codon_start=1
/product="serine proteinase inhibitor precursor"
/protein_id="AAB61677.1"
/db_xref="GI:438481"
/translation="MSHGRMNLALSLVFILCGLFNSIFCEKQQHSQKHMNLVLLKKIS
ALSQKMEAHPKDFAQELFKALIIEDPRKNIIFSPMAMTTTLATLSLGIKSTMRTHHPE
DLKLEPKLLDVHKYLQPLVHVGRELVKQKVLKHQHILFINRKMMVNQMLLQQISKLQG
MDIQMIDFTDIEKAKKTISHHVAEKTHTKITNLITDLNPETILCLVNHIFFKGILKRA
FQPKLTQKEVFFVNDQTKVQVDMMRKTERMLYSRSEELHATMVKMPCKGNVSLTLMLP
DAGQFDTDLKKMTAKRAKLQKISDFRLVRLILPKLKISFKINFKHLLPKIDPKHILTA
TAISQAITSKAPLPNLEALHQAEIELSEHALTVDTAIHTDNLLKVPVKAKEVPAVVKV
PMKAKEVPAVVKVPMNTKEVPVVVKVPMNTKEVPVVVKVNRPFLLFVEDEKTQRDLFV
GKVLNPQVE"
sig_peptide
19..93
mat_peptide
94..1395
/product="serine proteinase inhibitor"
/experiment="experimental evidence, no additional details
recorded"
/note="uterine milk protein"
3'UTR
1396..1463
polyA_signal
1442..1447
polyA_site
1463
ORIGIN
1 ggctggattg ccgcagaaat gtcccacggg agaatgaatc tggccctgtc tctggtcttc
61 atcctctgtg gcctgtttaa tagcatcttc tgtgaaaagc aacaacactc tcaaaagcac
121 atgaacctag tcttattaaa gaaaatttca gctctctccc agaagatgga agctcaccct
181 aaggattttg cccaagaatt gttcaaggct ttgataattg aggatcccag aaagaatatc
241 atcttctccc ccatggccat gaccaccacc ctggccaccc tctccctggg gatcaagtct
301 acaatgagaa cccaccaccc tgaggacctg aaacttgagc ccaaactgtt ggatgtgcac
361 aagtacttac agcctctggt ccacgtgggg cgtgagctag tgaagcagaa ggtactgaag
421 caccagcaca ttctctttat caacagaaaa atgatggtca accagatgct tctacagcag
481 ataagcaagc tgcagggaat ggacatccag atgattgact ttacagatat agaaaaagcc
14
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
1381
1441
aagaagacca
accgacctga
ttgaaaagag
accaaagtgc
gagctacatg
cttccagatg
cttcagaaaa
ttcaagataa
acagcaatct
caagctgaga
aatctgttga
aaggcaaagg
gtcgtgaaag
ttcttgctgt
aacccccaag
gaataaaaag
tcagccacca
accctgagac
cttttcagcc
aggtggacat
ctacgatggt
ccggacaatt
tcagtgactt
actttaagca
cacaggccat
tagagctgag
aagtcccagt
aggtcccggc
tcccaatgaa
ttgtggagga
ttgagtagag
agtacaattc
tgtggctgaa
catcctgtgt
caaactcacc
gatgagaaag
taagatgcct
tgacactgat
cagactggtg
tctgcttccc
cacatcgaag
cgagcacgcc
gaaggcaaag
ggtcgtgaaa
cacaaaggag
tgagaagact
ccagggccac
acc
aaaacacata
cttgttaacc
cagaaggagg
acagaacgga
tgcaaaggaa
cttaaaaaga
cgcttaattt
aagattgacc
gctcccctgc
ttaaccgtgg
gaggtcccgg
gtcccaatga
gtcccagtgg
caaagagacc
actgtgcagc
cgaaaatcac
acattttctt
tcttctttgt
tgctttacag
atgtgtccct
tgactgctaa
tgcccaagtt
ccaaacatat
ctaatttgga
acacagccat
cggtcgtgaa
acacaaagga
tcgtgaaggt
tctttgtggg
acaggaactt
aaacttaatc
caaaggcatc
gaatgaccaa
ccggtcagag
aactctcatg
gcgagctaaa
gaagatctcc
actgactgcc
ggccctacat
tcacacagat
agtcccaatg
ggtcccagtg
caacagaccc
caaagtcctc
agcaggccat
//
Lampiran 2 Hasil BLAST nukleotida sekuens gen UTMP sapi bali dengan
sekuens GenBank kode akses L22095.1
Lampiran 3 Hasil analisis sekuens fragmen gen UTMP pada sapi bali
15
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di daerah Jombang pada tanggal 11 Desember 1990.
Penulis merupakan anak ketiga dari 5 bersaudara, dari pasangan Bapak Agus
Sucipto dan Ibu Sri Endang Susiani.
Tahun 1997 memulai pendidikan pertamanya di Sekolah Dasar Negeri
(SDN) Inpres SP V Khemon Jaya dan lulus tahun 2003. Tahun yang sama penulis
melanjutkan pendidikan Sekolah Menengah Pertama Negeri Urei Faisei dan lulus
tahun 2006. Selanjutnya pada tahun yang sama penulis melanjutkan pendidikan ke
Sekolah Menengah Atas Negeri 1 Waren, Waropen dan lulus pada tahun 2009.
Pada tahun 2010 penulis di terima di Institut Pertanian Bogor pada mayor
Teknologi Produksi Ternak. Penulis pernah melaksanakan magang kerja di Balai
Embrio Ternak Cipelang-Bogor .