28
III. METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan Januari - Mei 2016 di Laboratorium Biokimia Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas
Lampung.
B. Alat dan Bahan
Adapun alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain alat-alat gelas, kapas, kain kasa, karet gelang, alumunium foil, kertas, jarum ose, pembakar
spiritus, autoklaf model S-90N, laminar air flow CURMA model 9005-FL, neraca analitik, shaker incubator, magnetic stirrer, sentrifuga, lemari pendingin,
mikropipet Eppendroff, waterbath, termometer, spatula dan spektrofotometer UV- Vis Carry Win UV 32.
Sedangkan bahan-bahan yang digunakan adalah NA Nutrient Agar, pepton, MgSO
4
, KH
2
PO
4
, yeast extract, glukosa, NaCl, buffer posfat, kasein, TCA Tri Cloroacetic Acid, tirosin, NaOH, Na
2
CO
3
, CuSO
4
.5H
2
O 1, NaK tartarat 1, reagen follin-ciocalteau, pereaksi DNS dinitrosalisilic acid, Bovine Serum
Albumin BSA, akuades, alkohol, kantong selofan dan zeolit. Mikroorganisme
29
yang digunakan adalah bakteri Bacillus subtilis ITBCCB148 penghasil enzim protease yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi dan Teknologi Bioproses
Jurusan Teknik Kimia, Institut Teknologi Bandung.
C. Prosedur Penelitian
1. Pembuatan media inokulum dan fermentasi, inokulasi Bacillus subtilis
ITBCCB148 dan produksi enzim protease
a. Pembuatan media inokulum dan fermentasi
Media inokulum digunakan sebagai medium adaptasi awal pertumbuhan dan medium perkembangbiakan bakteri pada media cair tanpa terjadinya produksi
enzim protease. Sedangkan media fermentasi digunakan sebagai medium pertumbuhan dan perkembangbiakkan disertai produksi enzim protease. Media
inokulum yang digunakan terdiri dari KH
2
PO
4
0,1 gram, NaCl 0,25 gram, MgSO
4
0,005 gram, pepton 0,5 gram, yeast extract 0,5 gram, dan glukosa 0,25 gram. Kemudian semua bahan dilarutkan dalam akuades sebanyak 100 mL dalam labu
erlenmeyer dan disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121
o
C, tekanan 1 atm selama 15 menit. Sedangkan media fermentasi yang digunakan terdiri dari
KH
2
PO
4
1 gram, NaCl 2,5 gram, MgSO
4
0,05 gram, pepton 5 gram, dan yeast extract 5 gram, dan glukosa 2,5 gram yang dilarutkan dalam akuades sebanyak
1000 mL dan disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121
o
C tekanan 1 atm selama 15 menit.
30
b. Inokulasi Bacillus subtilis ITBCCB148
Sebanyak 3 ose Bacillus subtilis ITBCCB148 dari media agar miring dipindahkan ke dalam 100 mL media inokulum secara aseptik lalu dikocok dalam shaker
incubator dengan kecepatan 150 rpm selama 24 jam.
c. Produksi enzim protease
Produksi enzim protease dilakukan dengan memindahkan sebanyak 2 media inokulum dari jumlah media fermentasi ke dalam media fermentasi secara aseptik
lalu dikocok menggunakan shaker incubator dengan kecepatan 150 rpm selama 72 jam Nurhaeni, 2015.
2. Isolasi enzim protease
Isolasi enzim protease dilakukan menggunakan metode sentrifugasi. Prinsip sentrifugasi berdasarkan kecepatan sedimentasi dengan cara pemusingan.
Sentrifugasi digunakan untuk memisahkan enzim ekstraseluler dari sisa-sisa sel. Sentrifugasi dilakukan pada suhu rendah di bawah suhu kamar untuk menjaga
kehilangan aktivitas enzim Suhartono, 1989. Untuk memisahkan enzim dari komponen sel lainnya digunakan metode sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm
selama 20 menit. Filtrat yang diperoleh merupakan ekstrak kasar enzim yang selanjutnya diuji aktivitasnya dengan metode Kunitz dan diukur kadar proteinnya
dengan metode Lowry.
31
3. Uji aktivitas enzim protease metode Kunitz
a. Pembuatan pereaksi uji aktivitas enzim protease dengan metode Kunitz.
Uji aktivitas enzim protease dengan metode Kunitz diawali dengan pembuatan pereaksi.
1. Larutan Kasein : 1 gram kasein dilarutkan dalam 100 mL buffer
posfat pH 7 pada air mendidih. 2. Larutan TCA
: 5 gram TCA dilarutkan dalam 100 mL aquades. 3. Larutan standar
: larutan tirosin dengan kadar 100, 200, 400, 600, dan 800 ppm.
b. Uji aktivitas enzim protease metode Kunitz.
Dimasukkan 1 mL larutan kasein dan 1 mL larutan enzim ke dalam tabung reaksi. Diinkubasi pada suhu 60
o
C selama 30 menit, setelah itu diinkubasi dihentikan dengan penambahan 3 mL larutan TCA secara tepat, larutan
diaduk dengan baik dan didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar agar pengendapan berjalan sempurna. Endapan gumpalan protein yang terbentuk
dipisahkan dengan penyaringan atau sentrifugasi. Absorbansi filtrat diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 280 nm.
Kontrol dibuat dengan memasukkan 1 mL larutan enzim, 3 mL larutan TCA, kemudian diinkubasi dengan perlakuan yang sama pada sampel. Aktivitas
enzim dihitung berdasarkan jumlah asam amino peptida sederhana yang terbentuk dengan menggunakan kurva standar Tirosin dan perhitungan
metode Kunitz.
Kategori