METODOLOGI PENELITIAN Analisis Profil Protein dan Asam Amino Sarang Walet Putih (Collocalia fuciphago) dengan Menggunakan SDS-PAGE dan KCKT

21 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta digunakan sebesar 12. Gel poliakrilamid yang telah dibuat dengan komposisi tertentu dapat dilihat pada lampiran 3, dicetak diantara dua buah lempeng kaca. Larutan separating gel yang telah dibuat, dimasukkan ke dalam cetakan gel dengan menggunakan mikropipet sampai batas tertentu, kemudian ditambahkan dengan aquades sampai penuh agar permukaan gel rata. Setelah gel mengering, aquades dibuang dan sisa air pada cetakan gel diserap dengan kertas saring. Larutan stacking gel yang telah dibuat, dimasukkan ke dalam cetakan. Permukaan gel dipasang sisir, lalu didiamkan sampai gel mengeras. Setelah gel keras, sisir dilepaskan dan cetakan gel dipindahkan ke perangkat elektroforesis kemudian running buffer dimasukkan ke dalam alat elektroforesis hingga gel terendam. Ekstrak protein sarang burung walet putih yang telah disiapkan, dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf dan ditambahkan dengan sample buffer dengan perbandingan 1:1, 1:2, dan 2:1. Ketiga tabung dipanaskan pada suhu 100 ⁰C selama 5 menit. Elektroforesis dilakukan dengan cara 5 µ l marker protein dimasukkan ke sumur pertama dan 10 µ L campuran ekstrak protein sarang walet dan sample buffer dengan perbandingan yang telah ditentukan, dimasukkan ke dalam sumur berikutnya yang telah dicetak pada gel poliakrilamid, kemudian alat elektroforesis dihubungkan ke power supply dengan tegangan 175 V hingga sampel mencapai bagian dasar gel. Setelah elektroforesis selesai, gel dikeluarkan dari cetakan dan divisualisasi menggunakan larutan pewarnastaining yaitu comassie brilliant blue selama satu jam dan digoyangkan dengan shaker. Gel lalu dicuci dengan larutan destaining tiga kali masing-masing selama satu jam. Identifikasi dan analisis SDS-PAGE dilakukan dengan cara membandingkan pita protein yang tampak setelah proses pemisahan dengan protein standar. Bobot molekul masing-masing protein ditentukan dengan cara menghitung nilai Rf dari masing-masing pita protein yang tampak, lalu dibuat kurva standar hubungan antara log BM dengan Rf dari protein standar sehingga nilai BM protein sampel dapat dihitung. 22 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 3.3.5 Pengukuran Kadar Protein dengan Metode Semi-mikro Kjeldahl SNI 01- 2782-1998 Sebelum sampel dianalisis, terlebih dahulu dilakukan standarisasi HCl. Standarisasi dilakukan dengan mentitrasi HCl dengan 10 mL natrium tetraborat 0,05 N. Pengukuran kadar protein dimulai dengan tahap destruksi. Sebanyak 0,5 gram sarang burung walet putih yang telah dibersihkan dan dihaluskan, dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl, lalu ditambahkan 2 gram katalisator campuran dari 0,8 gram CuSO 4 , 0,1 gram SeO 2 , dan 4 gram K 2 SO 4 dan 25 mL H 2 SO 4 pekat. Labu Kjeldahl tersebut kemudian dididihkan di atas pemanas listrik selama 1,5 jam sampai cairan menjadi jernih kehijauan, kemudian didinginkan. Setelah larutan hasil destruksi dalam labu Kjeldahl dingin, larutan ditambah aquabides hingga volume mencapai 100 mL. Sebanyak 12,5 mL larutan dipipet lalu dimasukkan ke dalam labu destilasi kemudian ditambah dengan 12,5 mL NaOH 30 dan tiga tetes indikator Bromcresol Green + Methyl Red BCG+MR. Destilat ditampung dalam erlenmeyer yang berisi 12,5 mL larutan asam borat 2 dan tiga tetes indikator PP. Destilat yang tertampung di dalam erlenmeyer kemudian dititrasi dengan menggunakan larutan HCl 0,05 N sampai terjadi perubahan warna dari biru menjadi merah muda. Penetapan kadar protein dilakukan secara triplo. Kadar protein dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut: Kadar Pr otein = x 100 x F Keterangan: N = Normalitas HCl F = faktor konversi Sudarmadji, 1989 3.3.6 Analisis Asam Amino dengan Menggunakan KCKT Ismail et al., 2013 Sebelum sampel dianalisis, terlebih dahulu dilakukan penyuntikan larutan standar asam amino untuk mengetahui waktu retensi setiap kromatogram yang muncul. Standar asam amino dipipet sebanyak 40 µ L lalu ditambahkan 40 µL internal standar AABA dan 920 µL aquabides. Larutan tersebut dihomogenkan. Setelah homogen, larutan dipipet 23 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta sebanyak 10 µL kemudian ditambah dengan 7 µL AccQ-Fluor Borate, dihomogenkan dengan menggunakan vortex, lalu ditambah dengan 20 µL reagent Fluor A dan dihomogenkan lagi. Setelah homogen, larutan didiamkan selama satu menit dan diinkubasi pada suhu 55 ⁰C selama sepuluh menit. Setelah inkubasi selesai, larutan standar disuntikkan ke KCKT dengan menggunakan kolom C18, temperatur 37 ⁰C, fase gerak asetonitril 60 dan AccqTag Eluent A dengan sistem gradien komposisi, detektor fluorescence, laju alir 1 mLmenit dan volume penyuntikan 5µL. Setelah diperoleh kromatogram larutan standar asam amino, sebanyak 0,5 g sarang burung walet putih yang telah dibersihkan dan dihaluskan, ditambahkan dengan 5 mL HCl 6N. Campuran divortex, lalu dialiri dengan gas nitrogen dan dihidrolisis pada suhu 110 ⁰C selama 22 jam. Hidrolisat yang diperoleh didinginkan pada suhu kamar, lalu dipindahkan ke labu ukur 100 mL, dan ditambahkan aquabides sampai tanda batas. Sampel disaring dengan filter 0,45μm. Filtrat dipipet sebanyak 500 μL lalu ditambah dengan 40 μL AABA ± 460 μL aquabides. Larutan dipipet sebanyak 10 μL, lalu ditambah dengan 70 μL AccQ-Fluor Borate, vortex. Setelah divortex, larutan ditambah dengan 20 μL reagen fluor A, lalu divortex lagi dan didiamkan selama 1 menit. Larutan sampel diinkubasi selama 10 menit pada suhu 55 ⁰C, lalu disuntikkan pada KCKT dengan kondisi kromatografi yang sama seperti saat penyuntikan larutan standar asam amino. Kadar asam amino dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut: Asam amino = ar ea sampel ar ea AABA sampel x Cstd mol µ L x BM gr mol x FP µ L ar ea standar ar ea AABA standar x bobot sampel gr am x 100 Keterangan:  Cstd = Konsentrasi standar µ  BM = Berat molekul  FP = Faktor pengenceran sampel µL 24 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Determinasi Sampel Sampel sarang burung walet putih yang diperoleh dari Kediri, Jawa Timur dideterminasi di Herbarium Bogoriense, Puslit Biologi Bidang Zoologi LIPI Cibinong, Bogor, Jawa Barat, dimana hasil menunjukkan bahwa sampel benar merupakan sarang burung walet putih dari burung walet putih Collocalia fuciphago. Determinasi dilakukan dengan tujuan untuk mengidentifikasi sampel. Hasil determinasi dapat dilihat pada lampiran 2. 4.2 Ekstraksi Protein pada Sampel Proses ekstraksi dilakukan setelah sampel dibersihkan dari bulu burung walet yang menempel kemudian dihaluskan. Sebanyak 1 gram sampel dilarutkan dalam 50 mL aquabidest, kemudian disonikasi selama 30 menit untuk memecah ikatan antar molekul dan merusak sel sehingga menyebabkan protein di dalam sel akan keluar Lacoma, 2009. Hasil sonikasi kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 30 menit untuk memisahkan substansi berdasarkan berat molekul sehingga larutan protein dapat dipisahkan dengan endapan Holme and Peck, 1993. Larutan protein yang diperoleh dipekatkan dengan cara pengeringan freeze dry selama 9 jam yang kemudian disimpan pada suhu -20 ⁰C. Dari hasil ekstraksi diperoleh sebanyak 32 mL larutan protein hasil sentrifugasi dan 0,4 mg ekstrak kering protein. 4.3 Analisis Profil Protein dengan Menggunakan SDS-PAGE Profil protein sarang burung walet putih dianalisis dengan teknik elektroforesis menggunakan gel poliakrilamid. Prinsip dari SDS-PAGE adalah dengan memanfaatkan perbedaan kemampuan migrasi masing- masing molekul protein. Kemampuan migrasi tiap molekul akan berbeda disebabkan perbedaan berat molekul protein. Pemisahan protein dengan 25 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta elektroforesis gel poliakrilamid dapat dilakukan dengan menambahkan detergen ionik dan menambahkan tahap denaturasi Kurniati dan Wanadi, 2001. Pada proses persiapan sampel, sampel ditambahkan dengan suatu detergen anionik, sodium dodesil sulfat SDS. Sebelum elektroforesis, sampel yang akan dipisahkan dilarutkan terlebih dahulu dalam suatu dapar yang mengandung Tris-HCl, SDS, gliserol, bromfenol biru, dan merkaptoetanol. Tujuan penggunaan SDS dan merkaptoetanol disertai dengan pemanasan akan memecah struktur tiga dimensi dari protein, terutama ikatan disulfida menjadi subunit-subunit polipeptida secara individual. SDS juga membungkus rantai protein yang terikat dengan muatan negatif yang sama membentuk kompleks SDS-protein. Kompleks SDS-protein memiliki densitas muatan yang identik dan bergerak pada gel hanya berdasarkan ukuran protein Wijaya dan Rohman 2005; Fatmawati et al., 2009. Oleh karena itu, kompleks SDS-protein yang lebih besar mempunyai mobilitas yang lebih rendah dibandingkan dengan kompleks SDS-protein yang lebih kecil Fatmawati et al., 2009. Adapun dalam penelitian, elektroforesis diatur dengan tegangan 175 V konstan dengan arus sebesar 400 mA. Pengaturan ini dapat dimodifikasi sesuai dengan keperluan percobaan. Pengaturan tersebut dipilih karena memberikan hasil yang paling baik berdasarkan percobaan- percobaan yang telah dilakukan. Elektroforesis dilakukan hingga sampel mencapai bagian dasar gel selama 50 menit. Elektroforesis dilakukan terhadap ekstrak protein sarang burung walet dan menggunakan standar berat molekul pembanding marker protein Prestained SDS-PAGE Standards Broad Range dari Bio-Rad. Hasil perhitungan berat molekul sesuai kurva standar protein dari elektroforesis Lampiran 4 menunjukkan terdapat beberapa pita protein yang tampak. Pita dari marker protein yang tampak adalah Myosin 198 kDa, BSA 57 kDa, soybean tripsin inhibitor 20 kDa, lysozime 15 kDa, dan aprotinin 6 kDa. Kurva standar yang dihasilkan dari marker protein tersebut memiliki persamaan linier Y = -1,743x + 5,390; r = 0,983. 26 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Diketahui bahwa Y adalah log bobot molekul protein dan x adalah Rf nisbah bagi antara migrasi pita protein sampel dengan migrasi pita protein marker. Berdasarkan hasil elektroforesis, ekstrak protein sarang burung walet putih menunjukkan pemisahan sebanyak enam pita protein. Pita-pita protein yang tampak memiliki berat molekul sebesar 96,6276 kDa, 67,0907 kDa, 48,5096 kDa, 10,8217 kDa, 9,5826 kDa, dan 7,5137 kDa. Pita protein muncul baik dari perbandingan 1:1, 1:2, dan 2:1. Tetapi dapat dilihat bahwa pita protein dari perbandingan 2:1 sedikit lebih jelas dibanding perbandingan 1:1 dan 1:2. Hal ini dipengaruhi oleh volume pemipetan sampel yang lebih banyak. Gambar 4.1 Hasil analisis SDS-PAGE ekstrak sarang burung walet putih Keterangan: 1 = marker protein Prestained SDS-PAGE standards Board Range dari Bio- Rad; 2 dan 3 = Ekstrak protein sarang burung walet putih dan sample buffer dengan perbandingan 1:1; 4 dan 5 = Ekstrak protein sarang burung walet putih dan sample buffer dengan perbandingan 1:2; 6 dan 7 = Ekstrak protein sarang burung walet putih dan sample buffer dengan perbandingan 2:1 Hasil analisis profil protein dengan menggunakan SDS-PAGE dari penelitian ini menunjukkan perbedaan berat molekul protein yang muncul dibandingkan dengan hasil penelitian Liu et al. pada tahun 2012 dan Elfita pada tahun 2013. Penelitian ini menunjukkan adanya enam pita protein yang muncul, yaitu 96,6276 kDa, 67,0907 kDa, 48,5096 kDa, 10,8217 1 2 3 4 5 6 7 198 kDa 15 kDa 20 kDa 57 kDa 6 kDa 96,6276 kDa 67,0907 kDa 48,5096 kDa 10,8217 kDa 9,5826 kDa 7,5137 kDa