METODOLOGI PENELITIAN Analisis Profil Protein dan Asam Amino Sarang Walet Putih (Collocalia fuciphago) dengan Menggunakan SDS-PAGE dan KCKT
21
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
digunakan sebesar 12. Gel poliakrilamid yang telah dibuat dengan komposisi tertentu dapat dilihat pada lampiran 3, dicetak diantara dua
buah lempeng kaca. Larutan separating gel yang telah dibuat, dimasukkan ke dalam cetakan gel dengan menggunakan mikropipet sampai batas
tertentu, kemudian ditambahkan dengan aquades sampai penuh agar permukaan gel rata. Setelah gel mengering, aquades dibuang dan sisa air
pada cetakan gel diserap dengan kertas saring. Larutan stacking gel yang telah dibuat, dimasukkan ke dalam cetakan. Permukaan gel dipasang sisir,
lalu didiamkan sampai gel mengeras. Setelah gel keras, sisir dilepaskan dan cetakan gel dipindahkan ke perangkat elektroforesis kemudian running
buffer dimasukkan ke dalam alat elektroforesis hingga gel terendam. Ekstrak protein sarang burung walet putih yang telah disiapkan,
dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf dan ditambahkan dengan sample buffer dengan perbandingan 1:1, 1:2, dan 2:1. Ketiga tabung dipanaskan
pada suhu 100 ⁰C selama 5 menit. Elektroforesis dilakukan dengan cara 5
µ l marker protein dimasukkan ke sumur pertama dan 10 µ L campuran ekstrak protein sarang walet dan sample buffer dengan perbandingan yang
telah ditentukan, dimasukkan ke dalam sumur berikutnya yang telah dicetak pada gel poliakrilamid, kemudian alat elektroforesis dihubungkan
ke power supply dengan tegangan 175 V hingga sampel mencapai bagian dasar gel.
Setelah elektroforesis selesai, gel dikeluarkan dari cetakan dan divisualisasi menggunakan larutan pewarnastaining yaitu comassie
brilliant blue selama satu jam dan digoyangkan dengan shaker. Gel lalu dicuci dengan larutan destaining tiga kali masing-masing selama satu jam.
Identifikasi dan
analisis SDS-PAGE
dilakukan dengan
cara membandingkan pita protein yang tampak setelah proses pemisahan
dengan protein standar. Bobot molekul masing-masing protein ditentukan dengan cara menghitung nilai Rf dari masing-masing pita protein yang
tampak, lalu dibuat kurva standar hubungan antara log BM dengan Rf dari protein standar sehingga nilai BM protein sampel dapat dihitung.
22
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.5 Pengukuran Kadar Protein dengan Metode Semi-mikro Kjeldahl SNI 01- 2782-1998
Sebelum sampel dianalisis, terlebih dahulu dilakukan standarisasi HCl. Standarisasi dilakukan dengan mentitrasi HCl dengan 10 mL natrium
tetraborat 0,05 N. Pengukuran kadar protein dimulai dengan tahap destruksi. Sebanyak 0,5 gram sarang burung walet putih yang telah
dibersihkan dan dihaluskan, dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl, lalu ditambahkan 2 gram katalisator campuran dari 0,8 gram CuSO
4
, 0,1 gram SeO
2
, dan 4 gram K
2
SO
4
dan 25 mL H
2
SO
4
pekat. Labu Kjeldahl tersebut kemudian dididihkan di atas pemanas listrik selama 1,5 jam sampai cairan
menjadi jernih kehijauan, kemudian didinginkan. Setelah larutan hasil destruksi dalam labu Kjeldahl dingin, larutan
ditambah aquabides hingga volume mencapai 100 mL. Sebanyak 12,5 mL larutan dipipet lalu dimasukkan ke dalam labu destilasi kemudian
ditambah dengan 12,5 mL NaOH 30 dan tiga tetes indikator Bromcresol Green + Methyl Red BCG+MR. Destilat ditampung dalam erlenmeyer
yang berisi 12,5 mL larutan asam borat 2 dan tiga tetes indikator PP. Destilat yang tertampung di dalam erlenmeyer kemudian dititrasi dengan
menggunakan larutan HCl 0,05 N sampai terjadi perubahan warna dari biru menjadi merah muda. Penetapan kadar protein dilakukan secara triplo.
Kadar protein dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
Kadar Pr otein = x 100 x F
Keterangan: N = Normalitas HCl
F = faktor konversi Sudarmadji, 1989
3.3.6 Analisis Asam Amino dengan Menggunakan KCKT Ismail et al., 2013 Sebelum sampel dianalisis, terlebih dahulu dilakukan penyuntikan
larutan standar asam amino untuk mengetahui waktu retensi setiap kromatogram yang muncul. Standar asam amino dipipet sebanyak 40 µ L
lalu ditambahkan 40 µL internal standar AABA dan 920 µL aquabides. Larutan tersebut dihomogenkan. Setelah homogen, larutan dipipet
23
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
sebanyak 10 µL kemudian ditambah dengan 7 µL AccQ-Fluor Borate, dihomogenkan dengan menggunakan vortex, lalu ditambah dengan 20 µL
reagent Fluor A dan dihomogenkan lagi. Setelah homogen, larutan didiamkan selama satu menit dan diinkubasi pada suhu 55
⁰C selama sepuluh menit. Setelah inkubasi selesai, larutan standar disuntikkan ke
KCKT dengan menggunakan kolom C18, temperatur 37 ⁰C, fase gerak
asetonitril 60 dan AccqTag Eluent A dengan sistem gradien komposisi, detektor fluorescence, laju alir 1 mLmenit dan volume penyuntikan 5µL.
Setelah diperoleh kromatogram larutan standar asam amino, sebanyak 0,5 g sarang burung walet putih yang telah dibersihkan dan
dihaluskan, ditambahkan dengan 5 mL HCl 6N. Campuran divortex, lalu dialiri dengan gas nitrogen dan dihidrolisis pada suhu 110
⁰C selama 22 jam. Hidrolisat yang diperoleh didinginkan pada suhu kamar, lalu
dipindahkan ke labu ukur 100 mL, dan ditambahkan aquabides sampai tanda batas. Sampel disaring dengan
filter 0,45μm. Filtrat dipipet sebanyak 500 μL lalu ditambah dengan 40 μL AABA ± 460 μL aquabides. Larutan
dipipet sebanyak 10 μL, lalu ditambah dengan 70 μL AccQ-Fluor Borate,
vortex. Setelah divortex, larutan ditambah dengan 20 μL reagen fluor A,
lalu divortex lagi dan didiamkan selama 1 menit. Larutan sampel diinkubasi selama 10 menit pada suhu 55
⁰C, lalu disuntikkan pada KCKT dengan kondisi kromatografi yang sama seperti saat penyuntikan larutan
standar asam amino. Kadar asam amino dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
Asam amino =
ar ea sampel ar ea AABA sampel
x Cstd mol
µ
L x BM
gr mol
x FP
µ
L ar ea standar
ar ea AABA standar x bobot sampel gr am
x 100
Keterangan: Cstd
= Konsentrasi standar
µ
BM = Berat molekul
FP = Faktor pengenceran sampel µL
24
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta