18
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Gambar 2.9 Skema alat KCKT
Sumber: NMSU Board of Regents, 2006.
Pelarut yang biasanya digunakan pada KCKT adalah air, metanol, asetonitril, kloroform, dan pelarut lainnya yang berada dalam keadaan
murni HPLC grade. Pelarut-pelarut tersebut sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu dengan kertas saring milipore 0,45 mm dan
harus dihilangkan gasnya degassing. Komponen utama alat yang dipakai dalam KCKT antara lain 1 reservoir zat pelarut untuk fase gerak; 2
pompa; 3 injektor; 4 kolom; 5 detektor, dan 6 rekorder Adnan, 1997. Jantung dari peralatan KCKT adalah kolom dimana terdapat fase
diam dan terjadi pemisahan komponen antara fase diam dan fase bergerak yang dialirkan dengan bantuan pompa Salamah, 1997.
19
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Pangan Pusat Laboratorium Terpadu PLT UIN Syarif Hidayatullah Jakarta, Laboratorium PT.
Saraswanti Indo Genetech Bogor, Laboratorium Penelitian II, dan Laboratorium Kesehatan Lingkungan FKIK UIN Syarif Hidayatullah
Jakarta yang berlangsung sejak bulan Maret hingga Juni 2014.
3.2 Alat dan Bahan Penelitian
3.2.1 Alat Penelitian Satu set alat elektroforesis Bio-Rad, satu set perangkat KCKT Waters
tipe Breeze, alat destilasi lengkap dengan erlenmeyer berpenampung berukuran 250 mL, buret 50 mL, pemanas Kjeldahl lengkap yang
dihubungkan dengan pengisap uap melalui aspirator, labu Kjeldahl berukuran 50 mL, freeze dry, mikropipet beserta tip, erlenmeyer, labu
ukur, sentrifuge Eppendorf 5417R beserta tabungnya, waterbath ultrasonic Branson, peralatan gelas, pinset, spatula, syringe, batang pengaduk, vial,
timbangan analitik Wiggen Hauser, pipet volumetrik, pipet tetes.
3.2.2 Bahan Penelitian Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sarang burung
walet diperoleh dari Kediri, Jawa Timur, standar berat molekul protein Bio-Rad Prestained SDS-PAGE Standars Broad Range, commasie
brilliant blue, larutan 30 akrilamid, larutan 0,8 bisakrilamid, buffer Tris-HCL 1,5 M pH 8,8, buffer Tris-HCL 0,5 M pH 6,8, larutan 10
ammonium persulfat APS, larutan 10 wv sodium dodesil sulfat SDS, tetramethylethylenediamine TEMED, sample buffer, dapar
elektroforesis, katalisator campuran dari 0,8 gram CuSO
4
, 0,1 gram SeO
2
, dan 4 gram K
2
SO
4
, larutan H
2
SO
4
pekat, larutan NaOH 30, larutan asam borat 2, larutan HCl 0,05 N, indikator Bromcresol Green + Methyl
20
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Red BCG+MR, indikator fenolftalein PP, metanol teknis, larutan HCl 6N, internal standar AABA alpha amino butyric acid, AccQ•Tag Reagen
Kit dari Waters, reagen kit terdiri dari Waters AccQ-Tag. Fluor Borate Buffer, Waters AccQ•Tag Fluor Reagen serbuk 6-aminoquinolil-
Nhidroksi-suksinimidil karbamat–AQC, Waters AccQ•Tag Fluor Reagen Diluen, dan Hidrolisat Asam Amino Standar dari Waters, asetonitril grade
HPLC, aquabides. 3.3
Prosedur Penelitian 3.3.1 Perolehan Sampel
Bahan yang digunakan adalah sarang burung walet putih yang diperoleh dari daerah Kediri, Jawa Timur.
3.3.2 Determinasi Sampel Sampel sarang walet putih yang diperoleh dari Kediri, Jawa Timur,
dideterminasi di Herbarium Bogoriense, Puslit Biologi Bidang Zoologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI Cibinong, Bogor, Jawa
Barat.
3.3.3 Ekstraksi Protein pada Sampel Liu et al., 2012 Sampel yang telah dideterminasi, dibersihkan dari bulu burung
walet yang menempel pada sampel dengan menggunakan pinset. Setelah sampel bersih, sampel dihaluskan dengan menggunakan lumpang dan alu.
Sebanyak 1 gram sampel dilarutkan dengan 50 mL aquabides lalu disonikasi selama 30 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 10000
rpm selama 30 menit. Supernatan yang diperoleh dikeringkan dengan metode pengeringan freeze dry dan disimpan pada suhu -20
⁰C Liu et al, 2012.
3.3.4 Analisis Profil Protein dengan Menggunakan SDS-PAGE Profil protein dianalisis menggunakan SDS-PAGE berdasarkan
metode Laemmli dalam Coligan et al. 1995 dengan sistem buffer Laemmli dan konsentrasi gel poliakrilamid separating gel yang
21
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
digunakan sebesar 12. Gel poliakrilamid yang telah dibuat dengan komposisi tertentu dapat dilihat pada lampiran 3, dicetak diantara dua
buah lempeng kaca. Larutan separating gel yang telah dibuat, dimasukkan ke dalam cetakan gel dengan menggunakan mikropipet sampai batas
tertentu, kemudian ditambahkan dengan aquades sampai penuh agar permukaan gel rata. Setelah gel mengering, aquades dibuang dan sisa air
pada cetakan gel diserap dengan kertas saring. Larutan stacking gel yang telah dibuat, dimasukkan ke dalam cetakan. Permukaan gel dipasang sisir,
lalu didiamkan sampai gel mengeras. Setelah gel keras, sisir dilepaskan dan cetakan gel dipindahkan ke perangkat elektroforesis kemudian running
buffer dimasukkan ke dalam alat elektroforesis hingga gel terendam. Ekstrak protein sarang burung walet putih yang telah disiapkan,
dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf dan ditambahkan dengan sample buffer dengan perbandingan 1:1, 1:2, dan 2:1. Ketiga tabung dipanaskan
pada suhu 100 ⁰C selama 5 menit. Elektroforesis dilakukan dengan cara 5
µ l marker protein dimasukkan ke sumur pertama dan 10 µ L campuran ekstrak protein sarang walet dan sample buffer dengan perbandingan yang
telah ditentukan, dimasukkan ke dalam sumur berikutnya yang telah dicetak pada gel poliakrilamid, kemudian alat elektroforesis dihubungkan
ke power supply dengan tegangan 175 V hingga sampel mencapai bagian dasar gel.
Setelah elektroforesis selesai, gel dikeluarkan dari cetakan dan divisualisasi menggunakan larutan pewarnastaining yaitu comassie
brilliant blue selama satu jam dan digoyangkan dengan shaker. Gel lalu dicuci dengan larutan destaining tiga kali masing-masing selama satu jam.
Identifikasi dan
analisis SDS-PAGE
dilakukan dengan
cara membandingkan pita protein yang tampak setelah proses pemisahan
dengan protein standar. Bobot molekul masing-masing protein ditentukan dengan cara menghitung nilai Rf dari masing-masing pita protein yang
tampak, lalu dibuat kurva standar hubungan antara log BM dengan Rf dari protein standar sehingga nilai BM protein sampel dapat dihitung.
