Studi molekuler dan uji ketahanan padi transgenik terhadap Rhizoc tonia solani khun dan pyricularia oryzae cav
STUD1 MOLEKULAR DAN UJI KETAHANAN
PAD1 TRANSGENIK TEREL4DAP
Rhizodonia solani KUHNDAN Pyricularia oryzae CAV
DJEMLU FILEMON PARERA
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Studi Molekular dan Uji
Ketahanan Padi Transgenik terhadap Wtizoctoniu solani Khun dan Pyriculuria
o p a e Cav, adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apapun
kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi atau yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain,
telah disebutkan dalain teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka acuan di
bagian akhir tesis ini.
Bogor, Maret 2006
Djemly F. Parera
NRP. P2S500001
ABSTRAK
DJEhlLY FILEMON PARERA. Studi Molekular dan Uji Ketahanan Padi
Transgenik Terhadap Rhizoctonia soluni K W dan Pyricularia oryzue CAV.
Di bimbing oleh Agus Purwito dan Inez Hortense Slamet-Loedin.
Padi transgenik yang diuji di sini adalah tanaman padi yang mengalami
peningkatan akumulasi asam salisilat (AS). AS menyebabkan terekspresi gen-gen
ketahanan tanaman, dan ketahanan yang diperoleh secara systemic (Systemic
Acquire Resistance, SAR). AS di dalam tanaman berperan dalam pusat
pertahanan melawan serangan patogen. Gen-gen yang bertanggungawab dalam
biosintesis AS melalui dua tahapan proses yaitu entC yang diisolasi dari
Escherichia coli menyandikan isokorimat synthase (ICS) menghasilkan
isokorismat dan pnzsB yang diisolasi dari Pseudomonus,jluerescensmenyandikan
isochorismat pyruvat lyase (IPL) menghasilkan AS.
Hasil uji hipromisin menunjukkan bahwa galur E-10-1 dan B-11-1
cenderung mengikuti pola segregasi Mendel 3 :1.
Uji ketahanan padi transgenik terhadap cendawan Rhizoctonia solani
(Ag-I) didapat 2 galur transgenik asal kultivar rojolele yang memiliki ketahanan
terhadap serangan cendawan Rlzizoctonia solani (Ag-I) yaitu galur E-10-1 dau
B-1 1-1. Sedangkan untuk Galurtransgenik asal IRATl12 adalah G6.
Uji ketahanan padi transgenik terhadap cendawan Pyricularia oryzae (ras
173) di dapat 6 galur yang memiliki persentase intensitas penyerangan cendawan
Pyriculuria oryzae (ras 173) dibawah 50 persen yaitu GI, G3, G5, G6, E-10-1
danB-11-1.
Amplifikasi Gen entC dan pmsB terdeteksi, terwaris pada individu galur
E-10-1 dan B-1 1-1 turunan kedua (TI).
STUDS MQLEKULAR DAN UJI KETAHANAN
PADS TRANSCENSK TERHADAP
Rhizoctonia solani Kuknv DAN Pyricularia oryzae CAV
DJEMLY FILEMON PARERA
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk ineinperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Biotelcnologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
Judul Tesis
:
Nama
: Djemly Filemon Parera
NRP
: P28500001
Studi Molekular clan Uji Ketahanan Padi Transgenik Terhadap
Rhizoctonia solani Kuhn dm Pyricularia olyzae Cav.
Program Studi : Bioteknologi
Disetujui,
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. ~ s h ' ~ u r v v i t MSG.
o.
Ketua
Diketahui,
Ketua Program Studi Bioteknologi
da Manuwoto, MSc
Tangggal Ujian : 2 7 JAN 2006
Tanggal Lulus : 2 9 MAR
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Tuhan Jesus Kristus atas
segala limpahan kasih dan karuniaNya sehingga tesis ini bisa berhasil
diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan
Maret 2004 ialah Ekspresi gen ketahanan terhadap Rhizoctoniu soluni Kuhn dan
Pyriculuriu orytrre Cav, dengan judul STUDIMOLEKULAR
DANUJI KETAHANAN
PADI TRANSGENM
TERHADAPR h k ~ o n i u s o Z c m i Kdan
~ J3riculariu o y z e CAV.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr 11. Agus Purwito, MSc
dan Ibu Dr. Ir. Inez Hortense Slamet-Loedin, MSc selaku pembimbing serta
Prof Dr. Ir. G.A. Wattimena, MSc yang telah banyak memberikan saran,
disamping itu penghargaan penulis sampaikan kepada Ibu Ir. Enung
Mulyaningsih, MSi, Sri, Angki, Dwi, Carla, Juli, Avi, Taufik, Budi beserta
seluruh Staf kelompok Padi Pusat Penelitian Biotek LIP1 Cibinong yang telah
membantu penulis dalam pengambilan data bioassay dirumah kaca dan di
laboratorium. Tak lupa juga penulis ucapkan terima kasih kepada Ibu Ir. Anggi
Nasution, Pak Ade Ahmad beserta Staf Rumah Kaca Kelti Rekayasa Protein clan
Imunologi, Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetika Bogor yang
telah membantu menyuplai isolat cendawan dan pengambilan data. Ucapan terima
kasih yang tulus penulis sampaikan kepada keluarga besar 24B, Bu Jerry, Usi
Nona, Piet, Anne, Bu Ampi, Usi Meity, Usi Vivi, Bung Gys, Om Oloph, tante
Daar, Edwin, Lady, dan Bu Febby untuk semangat dan dukungan doa. Ungkapan
terima kasih yang tak terhingga disampaikan kepada Anthony Alexander Parera
dan Henderina Christina Locopessy selaku Ayah dan Bunda serta kedelapan
saudara kandungku yang selalu memberikan doa dan dana serta semangat.
Ucapan terima kasih yang sangat dalam kepada istriku Foni, dan kedua anak
tercinta Allda dan Daniel yang selalu memberikan dorongan, doa, semangat dan
kasih sayangnya.
Semoga tesis ini bermanfaat.
Bogor Maret 2006
Djemly Filemon Parera
Penulis dilahirkan di Arnbon pada tanggal 26 Juni 1967 anak ke-enam dari
pasangan Anthony Alexander Parera dan Henderina Christina Lokopessy.
Pendidikan Sarjana ditempuh pada Program Studi Agronomi Jurusan Budidaya
Pertanian, Fakultas Pertanian Universitas Pattimura Arnbon pada tahun 1993.
Masuk pendidikan pascasarjana pada tahun 2000 pada Program Studi
Bioteknologi, Program Pascasajana IPB Bogor.
Tahun 1995
-
1996 penulis bekerja sebagai Sarjana Penggerak
Pembangunan Pedesaan di Desa Wainibe, Kecamatan Buru Utara Timur,
Kabupaten Maluku Tengah, Propinsi Maluku. Tahun 1997 sampai saat ini penulis
bekerja sebagai Dosen Tetap pada Fakultas Pertanian Universitas Pattimura,
Ambon.
Pada tahun 1999, penulis menikah dengan Foniike Samad, SP dan telah
dikaruniai 2 orang an& : Allda Adriana Martha Parera (6 tahun) clan Daniel
Parera (4 tahun).
DAFTAR IS1
Halaman
DAF~AR
TABEL ..................................................................
DAF~AR
GAMBAR ...............................................................
DAFTARLAMPIRAN
...............................................................
Latar belakang .................................................................
Hipotesis .......................................................................
..
Tujuan Penellban .............................................................
Manfaat Hasil Penelitian .....................................................
Tanarnan Transgenik .........................................................
..
Asa~nSallsllat ................................................................
Penyakit Hawar Pelepah Daun ................................................
Penyakit Blas ..................................................................
Uji Ketahanan ....................................................................................
..
Anahsls Molekuler ............................................................
Polymerase Chain Reaction (PCR) ............................................
Elektroforesis Gel Agarose sebagai Analisis Fragmen .............
xi
xii
...
XII~
1
3
4
4
5
7
8
9
9
10
10
11
Tempat dan Waktu Penelitian ...........................................................
..
Bahan Penellt~an..................................................................................
Metode Keja .......................................................................................
...
..
UJI Hlgromls~sn...............................................................................
Uji Ketahanan Padi Transgenik Terhadap Rhizoctonia solani .......
Uji Ketahanan Padi Transgenik Terhadap Pyricularia or),I-ae .......
..
Analls~sMolekular ..........................................................................
Isolasi DNA .........................................................................
PCR (PolymeraseClzainReactions) .......................................
Elekb-oforesis ........................................................................
..
UJI Pewarisan Mendel .......................................................................
20
Uji Ketahanan Padi Transgenik Terhadap R/zizoctonia solani ............
Tingkat Kerclsakan Tanaman ..................................................
Jumlah Anakkan Baru ............................................................
Jumlah Malai Produktif ........................................................
Persentase Tanaman Suwive ...................
.. ......................
Uji Ketahanan Padi Transgenik Terhadap Pyricularia oryzae ............
Intensitas Penyerangan ...........................................................
Analisis Molekular ............................................................................
Kesimpulan .........................................................................................
Saran ...................................................................................................
34
34
Lampiraa ...........................................................................
39
DAFTAR TABEL
Halaman
1.
Proyeksi Produksi dan Ketersediaan Beras untuk Konsumsi,
2001 - 2004 ............................................................................
1
Kisaran ukuran fragmen DNA dengan berbagai konsentrasi
gel agasose ..............................................................................
11
3.
Hasil uji hgromisin dan analisis khi-kuadrat ..........................
20
4.
Analisis Sidik Ragam uji ketahanan padi trransgenik terhadap
R solani untuk keseluruhan parameter yang diukur ...............
22
2.
DAFTAR LAMPIRAN
Hataman
Konstruksi Vektor ................................................................
ANOVA uji ketahanan padi galur transgenik kultivar rojolele
untuk parameter malai produktif, jumlah anakan baru, tingkat
kerusakan tanaman dan persentase tanaman survive setelah
diinokulasi dengan Rhizoctonia solani ...........................
ANOVA uji ketahanan padi galur transgenik kultivar
IRATI12 untuk parameter malai produktif, persentase
timaman survive, jumlah anakan baru, tingkat kerusakan
tanaman setelah diinokulasi dengan Rlzizoctonia solani ........
ANOVA persentase intensitas penyerangan 3 hsi, 6 hsi, dan
9 hsi Pyriculuria oryzae untuk semua galur yang dicobakan
...................................................................................................
Uji beda Duncan parameter malai produktif galur transgenik
C-27-1, B-2-1, B-10-1, D-2-2, F-1-1, B-8-1, B-27-1, B-11-1,
E-24-1, E-10-1 dan rojolele nontransgenik setelah diinokulasi
dengan Rhizoctonia solani AG-I ..................................
Uji beda Duncan parameter tingkat kerusakan tanaman galur
transgenik C-27-1, B-2-1, B-10-1, D-2-2,
F-1-1, B-8-1,
B-27-1, B-1 1-1, E-24-1, E-10-1 dan rojolele nontransgenik
setelah diinokulasi dengan Rhizoctonia solani AG- 1 ...........
Uji beda Duncan parameter jumlah anakan baru, galur
transgenik C-27-1, B-2-1, B-10-1, D-2-2, F-1-1, B-8-1, B-27-1,
B-11-1, E-24-1, E-10-1 dan rojolele nontransgenik setelah
diinokulasi dengan Rlzizoctonia solani AG-1 ...................
Uji beda Dullcan parameter persentase tananlan survive,
galur transgenik C-27-1, B-2-1, B-10-1, D-2-2, F-1-1, B-8-1,
B-27-1, B-11-1, E-241, E-10-1 dan Rojolele nontransgenik
setelah diinokulasi dengan Rhizoctonia solani AG-1 ...........
Uji beda Duncan parameter jumlah malai produktif, galur
transgenik G1, G3, G5, G6 dan IRAT112 nontransgenik
setelah diinokulasi dengan Rhizoctonia solani AG-1 ...........
Uji beda Duncan parameter persentase tanaman survive,
galur transgenik GI, G3, G5, G6 dan IRATI 12 nontransgenik
setelah diinokulasi dengan Rhizoctonia solani AG-I .............
Halaman
11.
12.
13.
14.
15.
Uji beda Duncan parameter jurnlah anakan baru, galur
transgenik G1, G3, G5, G6 dan IRAT112 nontransgenik
setelah diinokulasi dengan Nzisoctonia solani AG- 1 ..............
45
Uji beda Duncan parameter tingkat kerusakan, galur
transgenik GI, G3, G5, G6 dan IRAT112 nontransgenik
setelah diinokulasi dengan Rhizoctonia solani AG-I ..............
45
Uji beda Duncan parameter intensitas penyerangan
pyriadaria oryi-ae terhadap galur padi transgenik dan
nontransgenik, 3 hsi (hari setelah inokulasi) ...........................
46
Uji beda Duncan parameter intensitas penyerangan
pyriczrlaria oryzae terhadap galur padi transgenik clan
nontransgenik, 6 hsi (hari setelah inokulasi) ..........................
47
Uji beda Duncan parameter intensitas penyerangan
pyricularia orpae terhadap galur padi transgenik antifungal
dan nontransgenik, 9 hsi (hari setelah inokulasi) ..................
48
Latar Belakang
Padi adalah tanaman pangan utama di Indonesia disamping jagung, sagu
dan urnbi-umbian. Ketersediaan beras untuk di konsumsi diperkirakan hanya
meningkat sekitar 1 persen per 4 tahun dari 30,3 juta ton tahun 2001, menjadi 31,2
juta ton tahun 2004 (Tabel 1). Sementara tidak sebanding dengan jumlah
pertambahan penduduk Indonesia per tahun yang meningkat rata-rata 2.61 persen
per tahun (PPKP 2004).
Tabel 1. Proyeksi produksi dan ketersediaan beras untuk konsumsi, 2001 - 2004
Tahun
Produksi
(Ton)
K$zzan
Kehilangan
(Ton)
2004
51.614.460 1.290.361
Sumber : PPKP (2004)
(Ton)
2.322.651
Ketersediaan untuk
konsumsi
Setara Beras
Padi (Ton)
(Ton)
48.001.448
31.200.941
Ketersediaan akan lahan yang produktif untuk pertanian setiap tahun
menurun. Pemanfaatan lahan marginal m e ~ p a k a nalternatif untuk meningkatkan
produksi padi di masa mendatang. Di Indonesia tersedia 60 persen lahan pertanian
merupakan lahan kering. Kendala utama pada pertanian lahan kering selain
cekaman kekeringan adalah penyakit bias (Pyricukuria oryzae)
Selain cekaman abiotik seperti kekeringan, banjir dan bencana dam,
cekaman biotik seperti hama dan penyakit tanaman masih merupakan ancaman
utama bagi petani (Baharsjah et a1 1998). Upaya untuk memacu peningkatan
produktivitas usaha pangan mencakup : (i) penciptaan varietas unggul bary dan
teknologi berproduksi yang lebih efisien; (ii) teknologi pasca panen untuk
menekan kehilangan hasil; dan (iii) teknologi yang menunjang peningkatan
intensitas tanam PPKP (2004).
Penciptaan varietas unggul baru pada point satu merupakan upaya yang
dibutuhkan dalam mempertahankan stabilitas ketahanan pangan. Salah satunya
yaitu merakit tanaman yang tahan terhadap serangan penyakit dengan memiliki
stabilitas produksi yang optimal.
Ada beberapa penyakit utama pada tanaman padi diantaranya, penyakit
hawar pelepah daun yang disebabkan oleh cendawan Rhizoctonia solani Kuhn dan
blas yang disebabkan oleh cendawan Pyricularia olyzae Cav. Kedua penyakit ini
telah lama dilaporkan sebagai penyakit penting baik pada padi gogo maupun padi
sawah diseluruh dunia. Berdasarkan data Biro Pusat Statistik (1997), intensitas
kerusakan tertinggi akibat blas di pulau jawa dan luar jawa adalah 12,60 persen
(Jawa Barat) dan 34,7 persen (Riau). Sedangkan untuk penyakit hawar pelepah
daun masing-masing 15,77 persen (Jawa Barat) dan 50 persen (Sulawesi Utara).
Kerugian akibat penyakit blas cukup besar dibandingkan dengan penyakit lainnya
(Ou 1972). Sedangkan akibat penyakit hawar pelepah daun produksi padi dapat
menurun hingga 20 persen bila penyakit berkembang sampai ke dam bendera
(Ou 1985) dan 1-35 persen (Kardin et a1 1997). Jika intensitas kedua penyakit ini
meningkat, stabilitas produksi yang tinggi akan terancam, dan dapat mengganggu
ketahanan pangan.
Selama ini pengendalian terhadap R solani dan P. o w e dilakukan
dengan fungisida. Cara ini kurang efektif jika strain suatu patogen cukup banyak,
seperti pada penyakit blas. Selain itu penggunaan fungisida secara terns-menerus
dapat menyebabkan cendawan patogen menjadi kebal sehingga perlu dilakukan
cara lain untuk pengendalian. Salah satu cara tersebut ialah dengan meralut
tanaman agar memiliki ketahanan terhadap cendawan.
Persilangan tanaman secara konvensional untuk mendapatkan tanaman
tahan terhadap cendawan sulit dilakukan karena membutuhkan waktu yang cukup
lama dan perubahan suatu ras patogen terlalu cepat dalam waktu singkat seperti
blas (P. o r p e ) . Prioritas utama dalam pengendaliannya adalah menggunakan
varietas tahan. Perakitan varietas tahan penyakit menjadi bagian dari upaya
pengendalian penyakit tertentu yang menjadi latar belakang heiptakannya padi
transgenik yang tahan terhadap R solani dan P. oryzae.
Berbagai metode telah dikembangkan dan digunakan untuk menghasilkan
tanaman transgenik, salah satunya adalah transfonnasi gen melalui Agrobacteriurn
tumeficiew: Ada beberapa gen yang dilaporkan bertanggung jawab terhadap
serangan patogen cendawan diantamnya adalah gen-gen yang bertanggung jawab
dalam menghasilkan asam salisilat (AS). Adanya respons yang hipersensitif
setelah tanaman diserang patogen-patogen, tanaman menunjukkan peningkatan
akumulasi AS, menyebabkan terekspresi gen-gen ketahanan tanaman, dan
ketahanan yang diperoleh secara systemik (Systemic Acquired Resistance, SAR).
AS di dalam tanaman berperan dalam pusat pertahanan melawan serangan
patogen (Verberne et al 2000).
Biosintesis AS pada bakteri melalui dua tahapan proses yaitu gen entC
yang diisolasi dari Eschersiclzia coli, menyandikan isochorismate synthase
(ICS) lnenghasilkan isochorismate dan gen pmsB yang diisolasi dari
P.seudomona.s flu~re~scens,
menyandikan isochorismat pyruvat lyase (IPL) yang
bertanggunjawab menghasilkan AS. Sebelum ditransformasikan ke dalam genom
A. tumefaciens, kedua gen tersebut terlebih dahulu disisipkan ke dalam suatu
vektor/plasmid rekombinan (Lampiran I.), kemudian di kokultivasi ke dalam
jaringan tanaman pa&. Teknik transformasi ini telah berhasil dikembangkan pada
tanaman padi oleh Slamet-Loedin (1996).
Penelitian ini akan diuji ketahanan padi transgenik terhadap cendawan
P. oryzae dan R. Solani dan analisis molekuler terhadap turunan 16 galur padi
generasi kedua (TI). Analisis molekuler yang digunakan adalah Polymerase Chain
Reaction (PCR).
Hipotesis
1. Transgen merupakan gen dominan yang terinteyasi pada satu lokus
2. Ekspresi gen entC da~zprnsB &lam menghasilkan asam salisilat berpengaruh
dalam mekanisme ketahanan terhadap cendawan R. solani dan P. oryzae
dibandingkan tanaman kontrol.
3.
Integrasi gen entC dan pmsB yang telah diintroduksi pada tanaman padl
tenvaris pada generasi kedua (TI).
Tujuan Penelitian
1.
Menguji ketahanan tanaman transgenik yang mengandung gen entC dan
prnsB terhadap penyakit hawar pelepah (R. solani) dan blas (P. oryzae).
2.
Menguji stabilitas dan pewarisan gen entC dan pmsB pada turunan
kedua (TI)
Manfaat Hasil Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai
efekivitas ekspresi gen enrC danpmsB yang telah diintroduksi pada tanaman padi
cv. Rojolele dan cv IRATI 12 untuk ketahanan terhadap R. solani dan P. oryzae.
TINJAUAN PUSTAKA
Tanaman Transgenik
Istilah tanaman transgenik dalam pengertian luas dipakai untuk tanaman
yang memiliki gen asing yang terintegrasi ke dalam genom tanaman dan gen
tersebut berfungsi (Uchimiya et a1 1989). Berbagai metode saat ini telah
dikembangkan dan digunakan untuk menghasilkan tanaman transgenik baik
melalui transformasi langsung maupun tidak langsung (Herman 1996).
Transformasi secara langsung antara lain dengan elektroporasi, fusi dengan PEG
('liethylene glycol), mikro injeksi dan penembakan DNA. Transformasi gen
secan tidak langsung ialah melalui vektor Agrobacterium tumefaciens.
Transfonnasi
melalui
A.
turrzefacier~s paling
sering
digurlakan
dibandingkan teknik transformasi gel1 yang dikembangkan saat ini. Mulanya
transformasi ini dilakukan pada tanaman dikotil melalui eksplan yang berupa
potongan daun atau bagian lain dari jaringan tanaman yang mempunyai potensi
beregenerasi tinggi (Hinchee et a1 1988; Mullins et a l 1990). Perkembangannya
kemudian teknik ini digunakan pula untuk tanainan monokotil dengan
menggunakan modifikasi berupa penambahan senyawa asetosiringone pada media
kokultivasi. Keberhasilan yang pernah dilakukan dengan teknik ini antara lain
pada tanaman padi dan jagung (Herman 1996; Nasir 2002).
Bakteri A. tzmzefaciem merupakan patogen tanaman. Secara alami
mekanisrne yang kompleks dari Agrobacteriurn marnpu memindalkan suatu
sekuen gen ke dalam genom bnaman melalui suatu vektor plasmid yaitu Ti
(turnor inducing). Saat ini plasmid Ti yang digunakan merupakan hasil modifikasi
dengan sifat virulensi yang telah dilucuti. Pada plasmid Ti terdapat bagian-bagian
penting yang terkait dalam mekanisme transformasi gen. Bagian-bagian tersebut
adalah daerah T-DNA dan daerah virulence (vir) pada T-DNA. Gen target yang
akan ditransformasi disisipkan pada bagian T-DNA untuk selanjutnya
dipindahkan ke dalam genom tanaman. Gen vir berperan penting dalam
mekanisme pemindahan daerah T-DNA ke dalam genom tanaman. Selain plasmid
Ti, ada pula gen lain yang berperan dalam transformasi yaitu gen chromosomal
virulence (chv). Gen-gen ini berperan dalam pelekatan bakteri ke dalam sel
tanaman (Sheng and Citovsky 199G).
Asam Salisilat
Selama berabad-abad diketahui bahwa mengunyah kulit kayu dari pohon
willow (salix) dapat menyembuhkan sakit kepala dan demam, dan di abad 19
Asam Salisilat (AS) sudah teridentifikasi komponen aktif dari ekstrak kulit kayu
pohon willow. AS di dalam tanaman terlibat dalam berbagai proses fisiologis
seperti penutupan stomata, induksi pembungaan, heat produksi, dan berperan
dalam pusat pertahanan melawan serangan patogen.
Tanaman yang mengalami luka nekrotik, dengan penyebab serangan
patogen, akan mengaktiikan suatu jalur yang mendorong ke arah ketahanan yang
diperoleh secara systemic (Systemic Aqczrire Resistance, SAR). Karakteristik SAR
adalah memperpanjang ketahanan jaringan tanaman yang jauh dari lokasi awal
infeksi, keberadaannya bertahan berminggu-minggu sampai berbulan-bulan, dan
~nemproteksitanaman melawan infeksi sekunder yang disebabkan oleh patogenpatogen yang memiliki spektrum yang luas. AS eksogenous dapat menginduksi
SAR.
AS tampaknya menjadi signal endogen yang memicu adanya SAR
(Verbene et ul2000).
Mekanisme pertahanan tanaman terhadap serangan patogen ditunjukkan
oleh adanya perubahan sifat fisik dan biokimia tanaman. Perubahan secara fisik
antara lain dinding sel tanaman menjadi lebih kuat oleh akumulasi hidrosiprolin,
glikoprotein, lignin, kalosa dan fenol. Secara biokimia ditandai oleh akumulasi
fitoaleksin dan inhibitor protease (Broglie et a1 1993) dan produksi protein
spesifik yang berhubungan dengan jenis patogen yang menginfeksi. Protein
spesifik tersebut antara lain pathogerresis related protein (PR-Protein) yang
berfungsi untuk menghambat proses infeksi patogen (Van Loon 1985).
Ditambahkan pula bahwa AS berperan di dalam pertahanan tanaman pada
tanaman tembakau yang ditransformasi dengan gen nahG dari Psettdornonus
putida.
Produk gen nahG penyandi salicylate hydroxylase menyebabkan AS
dikonversi secara biologi menjadi catechol non-aktif. Sehingga AS tidak bisa lagi
terakumulasi di dalam tanaman dan menghasilkan ketidakmampuan untuk
menginduksi SAR. Secara genetis dan data biokimia yang diperoleh, bahwa
kolnponen yang berada pada jalur signal AS bekerja secara upstream atau
downstream.
Biosintesis AS dalam tanaman adalah lewat jalur phenylpropanoid.
Setelah Biosintesis, sebagian besar AS terkonyugasi sebagai AS 2-6-f3-Dglucosida (ASG). Ditambahkan pula bahwa ASG berperan dalam mengaktifkan
SAR yang mungkin bertindak sebagai penyimpan non-aktif yang secara cepat
membelah untuk melepaskan AS aktif di lokasi infeksi (Verbeme et a1 2000).
Mikroorganisme, diantaranya Pseudomonas jluorescens dan Escherichia
coli, yang memproduksi AS dan senyawa-senyawa terkait bekeja membangun
blok untuk iron-chelating siderophores. Sebagai contoh, Pseudomonasfluorescens
tertentu menghasilkan AS atas pertolongan dari jalur biosintesis yang singkat dari
chorismat, yang didahului oleh precursor dari senyawa aromatik. Substrat ini
dikonversi oleh isochorismat synthase (ICS), menjadi isochorismat kemudian
dibelah oleh isochorismat pyruvat lyase (IPL) untuk menghasilkan AS (Verbeme
et a1 2000). Biosintesis AS pada bakteri ditunjukkan pada Gambar 1.
Shiliimic acid pahiway
Arognnic a a d
o-Gwmaric acid
Flawnnicls
OH
pCouinaric acid
Surnber :M b u x (2002).
Gambar 1. Jalur Biosintesis asam salisilat pada bakteri.
Penyakit Hawar Pelepah Daun
Penyakit hawar pelepah daun yang disebabkan oleh R solani mempakan
salah satu penyakit utama padi. Cendawan ini biasanya menyerang pada saat padi
memasuki fase akan bunting brimordia). Sehingga menghambat proses
pembentukan bulir padi.
Cendawan ini menyerang dan membentuk bercak pada pelepah daun dan
batang. Bercak berukuran besar, bertepi tidak teratur, berbentuk jorong dengan
tepi coklat kemerahan, sedangkan pusatnya benvama seperti jerami (kuning
kehijauan). Bercak ini seringkali terdapat dekat dengan lidah daun. Ukuran bercak
pada batang lebih kecil dibandingkan pada pelepah daun. Jika lingkungan lembab
pada bercak akan tumbuh benang-benang miselium cendawan putih atau coklat
muda (Semangun 1990).
Benang-benang miselium cendawan Rhizoctonia mempunyai lebar
berkisar 6-10pm, dengan percabangan membentuk sudut mncing. Pada titik
percabangan terdapat lekukan dan didekatnya terdapat sekat. Jamur kemudian
membentuk hifa bersel pendek-pendek, mempunyai banyak percabangan yang
lnembentuk sudut siku. Sebagian dari benang-benang ini membentuk benang yang
tebal dan pendek. Badan jamur membentuk sklerotium dengan bentuk tidak
teratur, benvama coklat atau coklat kehitaman.
Beberapa falctor yang berpengaruh terhadap perkembangan penyakit ini
ialah jar& tanam yang rapat, penggunaan varietas (galur) unggul yang pendek dan
mempunyai anakan banyak (:Amir dan Kardin 1991).
Cendawan R. .~olunimempunyai sebaran inang luas selain pada padi dapat
pula bertahan pada gulma, sehingga sulit dikendalikan (Overseas Technical
Cooperation Agency 1973; Atkins et aE 1974; Kardin et a1 1997). Sumber
inokulum patogen ini adalah miselia dan sklerotia yang dapat bertahan pada
jerami dan rumput-rumputan. Banyak gulma yang dapat menjadi tumbuhan inang
I
PAD1 TRANSGENIK TEREL4DAP
Rhizodonia solani KUHNDAN Pyricularia oryzae CAV
DJEMLU FILEMON PARERA
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Studi Molekular dan Uji
Ketahanan Padi Transgenik terhadap Wtizoctoniu solani Khun dan Pyriculuria
o p a e Cav, adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apapun
kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi atau yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain,
telah disebutkan dalain teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka acuan di
bagian akhir tesis ini.
Bogor, Maret 2006
Djemly F. Parera
NRP. P2S500001
ABSTRAK
DJEhlLY FILEMON PARERA. Studi Molekular dan Uji Ketahanan Padi
Transgenik Terhadap Rhizoctonia soluni K W dan Pyricularia oryzue CAV.
Di bimbing oleh Agus Purwito dan Inez Hortense Slamet-Loedin.
Padi transgenik yang diuji di sini adalah tanaman padi yang mengalami
peningkatan akumulasi asam salisilat (AS). AS menyebabkan terekspresi gen-gen
ketahanan tanaman, dan ketahanan yang diperoleh secara systemic (Systemic
Acquire Resistance, SAR). AS di dalam tanaman berperan dalam pusat
pertahanan melawan serangan patogen. Gen-gen yang bertanggungawab dalam
biosintesis AS melalui dua tahapan proses yaitu entC yang diisolasi dari
Escherichia coli menyandikan isokorimat synthase (ICS) menghasilkan
isokorismat dan pnzsB yang diisolasi dari Pseudomonus,jluerescensmenyandikan
isochorismat pyruvat lyase (IPL) menghasilkan AS.
Hasil uji hipromisin menunjukkan bahwa galur E-10-1 dan B-11-1
cenderung mengikuti pola segregasi Mendel 3 :1.
Uji ketahanan padi transgenik terhadap cendawan Rhizoctonia solani
(Ag-I) didapat 2 galur transgenik asal kultivar rojolele yang memiliki ketahanan
terhadap serangan cendawan Rlzizoctonia solani (Ag-I) yaitu galur E-10-1 dau
B-1 1-1. Sedangkan untuk Galurtransgenik asal IRATl12 adalah G6.
Uji ketahanan padi transgenik terhadap cendawan Pyricularia oryzae (ras
173) di dapat 6 galur yang memiliki persentase intensitas penyerangan cendawan
Pyriculuria oryzae (ras 173) dibawah 50 persen yaitu GI, G3, G5, G6, E-10-1
danB-11-1.
Amplifikasi Gen entC dan pmsB terdeteksi, terwaris pada individu galur
E-10-1 dan B-1 1-1 turunan kedua (TI).
STUDS MQLEKULAR DAN UJI KETAHANAN
PADS TRANSCENSK TERHADAP
Rhizoctonia solani Kuknv DAN Pyricularia oryzae CAV
DJEMLY FILEMON PARERA
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk ineinperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Biotelcnologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
Judul Tesis
:
Nama
: Djemly Filemon Parera
NRP
: P28500001
Studi Molekular clan Uji Ketahanan Padi Transgenik Terhadap
Rhizoctonia solani Kuhn dm Pyricularia olyzae Cav.
Program Studi : Bioteknologi
Disetujui,
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. ~ s h ' ~ u r v v i t MSG.
o.
Ketua
Diketahui,
Ketua Program Studi Bioteknologi
da Manuwoto, MSc
Tangggal Ujian : 2 7 JAN 2006
Tanggal Lulus : 2 9 MAR
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Tuhan Jesus Kristus atas
segala limpahan kasih dan karuniaNya sehingga tesis ini bisa berhasil
diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan
Maret 2004 ialah Ekspresi gen ketahanan terhadap Rhizoctoniu soluni Kuhn dan
Pyriculuriu orytrre Cav, dengan judul STUDIMOLEKULAR
DANUJI KETAHANAN
PADI TRANSGENM
TERHADAPR h k ~ o n i u s o Z c m i Kdan
~ J3riculariu o y z e CAV.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr 11. Agus Purwito, MSc
dan Ibu Dr. Ir. Inez Hortense Slamet-Loedin, MSc selaku pembimbing serta
Prof Dr. Ir. G.A. Wattimena, MSc yang telah banyak memberikan saran,
disamping itu penghargaan penulis sampaikan kepada Ibu Ir. Enung
Mulyaningsih, MSi, Sri, Angki, Dwi, Carla, Juli, Avi, Taufik, Budi beserta
seluruh Staf kelompok Padi Pusat Penelitian Biotek LIP1 Cibinong yang telah
membantu penulis dalam pengambilan data bioassay dirumah kaca dan di
laboratorium. Tak lupa juga penulis ucapkan terima kasih kepada Ibu Ir. Anggi
Nasution, Pak Ade Ahmad beserta Staf Rumah Kaca Kelti Rekayasa Protein clan
Imunologi, Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetika Bogor yang
telah membantu menyuplai isolat cendawan dan pengambilan data. Ucapan terima
kasih yang tulus penulis sampaikan kepada keluarga besar 24B, Bu Jerry, Usi
Nona, Piet, Anne, Bu Ampi, Usi Meity, Usi Vivi, Bung Gys, Om Oloph, tante
Daar, Edwin, Lady, dan Bu Febby untuk semangat dan dukungan doa. Ungkapan
terima kasih yang tak terhingga disampaikan kepada Anthony Alexander Parera
dan Henderina Christina Locopessy selaku Ayah dan Bunda serta kedelapan
saudara kandungku yang selalu memberikan doa dan dana serta semangat.
Ucapan terima kasih yang sangat dalam kepada istriku Foni, dan kedua anak
tercinta Allda dan Daniel yang selalu memberikan dorongan, doa, semangat dan
kasih sayangnya.
Semoga tesis ini bermanfaat.
Bogor Maret 2006
Djemly Filemon Parera
Penulis dilahirkan di Arnbon pada tanggal 26 Juni 1967 anak ke-enam dari
pasangan Anthony Alexander Parera dan Henderina Christina Lokopessy.
Pendidikan Sarjana ditempuh pada Program Studi Agronomi Jurusan Budidaya
Pertanian, Fakultas Pertanian Universitas Pattimura Arnbon pada tahun 1993.
Masuk pendidikan pascasarjana pada tahun 2000 pada Program Studi
Bioteknologi, Program Pascasajana IPB Bogor.
Tahun 1995
-
1996 penulis bekerja sebagai Sarjana Penggerak
Pembangunan Pedesaan di Desa Wainibe, Kecamatan Buru Utara Timur,
Kabupaten Maluku Tengah, Propinsi Maluku. Tahun 1997 sampai saat ini penulis
bekerja sebagai Dosen Tetap pada Fakultas Pertanian Universitas Pattimura,
Ambon.
Pada tahun 1999, penulis menikah dengan Foniike Samad, SP dan telah
dikaruniai 2 orang an& : Allda Adriana Martha Parera (6 tahun) clan Daniel
Parera (4 tahun).
DAFTAR IS1
Halaman
DAF~AR
TABEL ..................................................................
DAF~AR
GAMBAR ...............................................................
DAFTARLAMPIRAN
...............................................................
Latar belakang .................................................................
Hipotesis .......................................................................
..
Tujuan Penellban .............................................................
Manfaat Hasil Penelitian .....................................................
Tanarnan Transgenik .........................................................
..
Asa~nSallsllat ................................................................
Penyakit Hawar Pelepah Daun ................................................
Penyakit Blas ..................................................................
Uji Ketahanan ....................................................................................
..
Anahsls Molekuler ............................................................
Polymerase Chain Reaction (PCR) ............................................
Elektroforesis Gel Agarose sebagai Analisis Fragmen .............
xi
xii
...
XII~
1
3
4
4
5
7
8
9
9
10
10
11
Tempat dan Waktu Penelitian ...........................................................
..
Bahan Penellt~an..................................................................................
Metode Keja .......................................................................................
...
..
UJI Hlgromls~sn...............................................................................
Uji Ketahanan Padi Transgenik Terhadap Rhizoctonia solani .......
Uji Ketahanan Padi Transgenik Terhadap Pyricularia or),I-ae .......
..
Analls~sMolekular ..........................................................................
Isolasi DNA .........................................................................
PCR (PolymeraseClzainReactions) .......................................
Elekb-oforesis ........................................................................
..
UJI Pewarisan Mendel .......................................................................
20
Uji Ketahanan Padi Transgenik Terhadap R/zizoctonia solani ............
Tingkat Kerclsakan Tanaman ..................................................
Jumlah Anakkan Baru ............................................................
Jumlah Malai Produktif ........................................................
Persentase Tanaman Suwive ...................
.. ......................
Uji Ketahanan Padi Transgenik Terhadap Pyricularia oryzae ............
Intensitas Penyerangan ...........................................................
Analisis Molekular ............................................................................
Kesimpulan .........................................................................................
Saran ...................................................................................................
34
34
Lampiraa ...........................................................................
39
DAFTAR TABEL
Halaman
1.
Proyeksi Produksi dan Ketersediaan Beras untuk Konsumsi,
2001 - 2004 ............................................................................
1
Kisaran ukuran fragmen DNA dengan berbagai konsentrasi
gel agasose ..............................................................................
11
3.
Hasil uji hgromisin dan analisis khi-kuadrat ..........................
20
4.
Analisis Sidik Ragam uji ketahanan padi trransgenik terhadap
R solani untuk keseluruhan parameter yang diukur ...............
22
2.
DAFTAR LAMPIRAN
Hataman
Konstruksi Vektor ................................................................
ANOVA uji ketahanan padi galur transgenik kultivar rojolele
untuk parameter malai produktif, jumlah anakan baru, tingkat
kerusakan tanaman dan persentase tanaman survive setelah
diinokulasi dengan Rhizoctonia solani ...........................
ANOVA uji ketahanan padi galur transgenik kultivar
IRATI12 untuk parameter malai produktif, persentase
timaman survive, jumlah anakan baru, tingkat kerusakan
tanaman setelah diinokulasi dengan Rlzizoctonia solani ........
ANOVA persentase intensitas penyerangan 3 hsi, 6 hsi, dan
9 hsi Pyriculuria oryzae untuk semua galur yang dicobakan
...................................................................................................
Uji beda Duncan parameter malai produktif galur transgenik
C-27-1, B-2-1, B-10-1, D-2-2, F-1-1, B-8-1, B-27-1, B-11-1,
E-24-1, E-10-1 dan rojolele nontransgenik setelah diinokulasi
dengan Rhizoctonia solani AG-I ..................................
Uji beda Duncan parameter tingkat kerusakan tanaman galur
transgenik C-27-1, B-2-1, B-10-1, D-2-2,
F-1-1, B-8-1,
B-27-1, B-1 1-1, E-24-1, E-10-1 dan rojolele nontransgenik
setelah diinokulasi dengan Rhizoctonia solani AG- 1 ...........
Uji beda Duncan parameter jumlah anakan baru, galur
transgenik C-27-1, B-2-1, B-10-1, D-2-2, F-1-1, B-8-1, B-27-1,
B-11-1, E-24-1, E-10-1 dan rojolele nontransgenik setelah
diinokulasi dengan Rlzizoctonia solani AG-1 ...................
Uji beda Dullcan parameter persentase tananlan survive,
galur transgenik C-27-1, B-2-1, B-10-1, D-2-2, F-1-1, B-8-1,
B-27-1, B-11-1, E-241, E-10-1 dan Rojolele nontransgenik
setelah diinokulasi dengan Rhizoctonia solani AG-1 ...........
Uji beda Duncan parameter jumlah malai produktif, galur
transgenik G1, G3, G5, G6 dan IRAT112 nontransgenik
setelah diinokulasi dengan Rhizoctonia solani AG-1 ...........
Uji beda Duncan parameter persentase tanaman survive,
galur transgenik GI, G3, G5, G6 dan IRATI 12 nontransgenik
setelah diinokulasi dengan Rhizoctonia solani AG-I .............
Halaman
11.
12.
13.
14.
15.
Uji beda Duncan parameter jurnlah anakan baru, galur
transgenik G1, G3, G5, G6 dan IRAT112 nontransgenik
setelah diinokulasi dengan Nzisoctonia solani AG- 1 ..............
45
Uji beda Duncan parameter tingkat kerusakan, galur
transgenik GI, G3, G5, G6 dan IRAT112 nontransgenik
setelah diinokulasi dengan Rhizoctonia solani AG-I ..............
45
Uji beda Duncan parameter intensitas penyerangan
pyriadaria oryi-ae terhadap galur padi transgenik dan
nontransgenik, 3 hsi (hari setelah inokulasi) ...........................
46
Uji beda Duncan parameter intensitas penyerangan
pyriczrlaria oryzae terhadap galur padi transgenik clan
nontransgenik, 6 hsi (hari setelah inokulasi) ..........................
47
Uji beda Duncan parameter intensitas penyerangan
pyricularia orpae terhadap galur padi transgenik antifungal
dan nontransgenik, 9 hsi (hari setelah inokulasi) ..................
48
Latar Belakang
Padi adalah tanaman pangan utama di Indonesia disamping jagung, sagu
dan urnbi-umbian. Ketersediaan beras untuk di konsumsi diperkirakan hanya
meningkat sekitar 1 persen per 4 tahun dari 30,3 juta ton tahun 2001, menjadi 31,2
juta ton tahun 2004 (Tabel 1). Sementara tidak sebanding dengan jumlah
pertambahan penduduk Indonesia per tahun yang meningkat rata-rata 2.61 persen
per tahun (PPKP 2004).
Tabel 1. Proyeksi produksi dan ketersediaan beras untuk konsumsi, 2001 - 2004
Tahun
Produksi
(Ton)
K$zzan
Kehilangan
(Ton)
2004
51.614.460 1.290.361
Sumber : PPKP (2004)
(Ton)
2.322.651
Ketersediaan untuk
konsumsi
Setara Beras
Padi (Ton)
(Ton)
48.001.448
31.200.941
Ketersediaan akan lahan yang produktif untuk pertanian setiap tahun
menurun. Pemanfaatan lahan marginal m e ~ p a k a nalternatif untuk meningkatkan
produksi padi di masa mendatang. Di Indonesia tersedia 60 persen lahan pertanian
merupakan lahan kering. Kendala utama pada pertanian lahan kering selain
cekaman kekeringan adalah penyakit bias (Pyricukuria oryzae)
Selain cekaman abiotik seperti kekeringan, banjir dan bencana dam,
cekaman biotik seperti hama dan penyakit tanaman masih merupakan ancaman
utama bagi petani (Baharsjah et a1 1998). Upaya untuk memacu peningkatan
produktivitas usaha pangan mencakup : (i) penciptaan varietas unggul bary dan
teknologi berproduksi yang lebih efisien; (ii) teknologi pasca panen untuk
menekan kehilangan hasil; dan (iii) teknologi yang menunjang peningkatan
intensitas tanam PPKP (2004).
Penciptaan varietas unggul baru pada point satu merupakan upaya yang
dibutuhkan dalam mempertahankan stabilitas ketahanan pangan. Salah satunya
yaitu merakit tanaman yang tahan terhadap serangan penyakit dengan memiliki
stabilitas produksi yang optimal.
Ada beberapa penyakit utama pada tanaman padi diantaranya, penyakit
hawar pelepah daun yang disebabkan oleh cendawan Rhizoctonia solani Kuhn dan
blas yang disebabkan oleh cendawan Pyricularia olyzae Cav. Kedua penyakit ini
telah lama dilaporkan sebagai penyakit penting baik pada padi gogo maupun padi
sawah diseluruh dunia. Berdasarkan data Biro Pusat Statistik (1997), intensitas
kerusakan tertinggi akibat blas di pulau jawa dan luar jawa adalah 12,60 persen
(Jawa Barat) dan 34,7 persen (Riau). Sedangkan untuk penyakit hawar pelepah
daun masing-masing 15,77 persen (Jawa Barat) dan 50 persen (Sulawesi Utara).
Kerugian akibat penyakit blas cukup besar dibandingkan dengan penyakit lainnya
(Ou 1972). Sedangkan akibat penyakit hawar pelepah daun produksi padi dapat
menurun hingga 20 persen bila penyakit berkembang sampai ke dam bendera
(Ou 1985) dan 1-35 persen (Kardin et a1 1997). Jika intensitas kedua penyakit ini
meningkat, stabilitas produksi yang tinggi akan terancam, dan dapat mengganggu
ketahanan pangan.
Selama ini pengendalian terhadap R solani dan P. o w e dilakukan
dengan fungisida. Cara ini kurang efektif jika strain suatu patogen cukup banyak,
seperti pada penyakit blas. Selain itu penggunaan fungisida secara terns-menerus
dapat menyebabkan cendawan patogen menjadi kebal sehingga perlu dilakukan
cara lain untuk pengendalian. Salah satu cara tersebut ialah dengan meralut
tanaman agar memiliki ketahanan terhadap cendawan.
Persilangan tanaman secara konvensional untuk mendapatkan tanaman
tahan terhadap cendawan sulit dilakukan karena membutuhkan waktu yang cukup
lama dan perubahan suatu ras patogen terlalu cepat dalam waktu singkat seperti
blas (P. o r p e ) . Prioritas utama dalam pengendaliannya adalah menggunakan
varietas tahan. Perakitan varietas tahan penyakit menjadi bagian dari upaya
pengendalian penyakit tertentu yang menjadi latar belakang heiptakannya padi
transgenik yang tahan terhadap R solani dan P. oryzae.
Berbagai metode telah dikembangkan dan digunakan untuk menghasilkan
tanaman transgenik, salah satunya adalah transfonnasi gen melalui Agrobacteriurn
tumeficiew: Ada beberapa gen yang dilaporkan bertanggung jawab terhadap
serangan patogen cendawan diantamnya adalah gen-gen yang bertanggung jawab
dalam menghasilkan asam salisilat (AS). Adanya respons yang hipersensitif
setelah tanaman diserang patogen-patogen, tanaman menunjukkan peningkatan
akumulasi AS, menyebabkan terekspresi gen-gen ketahanan tanaman, dan
ketahanan yang diperoleh secara systemik (Systemic Acquired Resistance, SAR).
AS di dalam tanaman berperan dalam pusat pertahanan melawan serangan
patogen (Verberne et al 2000).
Biosintesis AS pada bakteri melalui dua tahapan proses yaitu gen entC
yang diisolasi dari Eschersiclzia coli, menyandikan isochorismate synthase
(ICS) lnenghasilkan isochorismate dan gen pmsB yang diisolasi dari
P.seudomona.s flu~re~scens,
menyandikan isochorismat pyruvat lyase (IPL) yang
bertanggunjawab menghasilkan AS. Sebelum ditransformasikan ke dalam genom
A. tumefaciens, kedua gen tersebut terlebih dahulu disisipkan ke dalam suatu
vektor/plasmid rekombinan (Lampiran I.), kemudian di kokultivasi ke dalam
jaringan tanaman pa&. Teknik transformasi ini telah berhasil dikembangkan pada
tanaman padi oleh Slamet-Loedin (1996).
Penelitian ini akan diuji ketahanan padi transgenik terhadap cendawan
P. oryzae dan R. Solani dan analisis molekuler terhadap turunan 16 galur padi
generasi kedua (TI). Analisis molekuler yang digunakan adalah Polymerase Chain
Reaction (PCR).
Hipotesis
1. Transgen merupakan gen dominan yang terinteyasi pada satu lokus
2. Ekspresi gen entC da~zprnsB &lam menghasilkan asam salisilat berpengaruh
dalam mekanisme ketahanan terhadap cendawan R. solani dan P. oryzae
dibandingkan tanaman kontrol.
3.
Integrasi gen entC dan pmsB yang telah diintroduksi pada tanaman padl
tenvaris pada generasi kedua (TI).
Tujuan Penelitian
1.
Menguji ketahanan tanaman transgenik yang mengandung gen entC dan
prnsB terhadap penyakit hawar pelepah (R. solani) dan blas (P. oryzae).
2.
Menguji stabilitas dan pewarisan gen entC dan pmsB pada turunan
kedua (TI)
Manfaat Hasil Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai
efekivitas ekspresi gen enrC danpmsB yang telah diintroduksi pada tanaman padi
cv. Rojolele dan cv IRATI 12 untuk ketahanan terhadap R. solani dan P. oryzae.
TINJAUAN PUSTAKA
Tanaman Transgenik
Istilah tanaman transgenik dalam pengertian luas dipakai untuk tanaman
yang memiliki gen asing yang terintegrasi ke dalam genom tanaman dan gen
tersebut berfungsi (Uchimiya et a1 1989). Berbagai metode saat ini telah
dikembangkan dan digunakan untuk menghasilkan tanaman transgenik baik
melalui transformasi langsung maupun tidak langsung (Herman 1996).
Transformasi secara langsung antara lain dengan elektroporasi, fusi dengan PEG
('liethylene glycol), mikro injeksi dan penembakan DNA. Transformasi gen
secan tidak langsung ialah melalui vektor Agrobacterium tumefaciens.
Transfonnasi
melalui
A.
turrzefacier~s paling
sering
digurlakan
dibandingkan teknik transformasi gel1 yang dikembangkan saat ini. Mulanya
transformasi ini dilakukan pada tanaman dikotil melalui eksplan yang berupa
potongan daun atau bagian lain dari jaringan tanaman yang mempunyai potensi
beregenerasi tinggi (Hinchee et a1 1988; Mullins et a l 1990). Perkembangannya
kemudian teknik ini digunakan pula untuk tanainan monokotil dengan
menggunakan modifikasi berupa penambahan senyawa asetosiringone pada media
kokultivasi. Keberhasilan yang pernah dilakukan dengan teknik ini antara lain
pada tanaman padi dan jagung (Herman 1996; Nasir 2002).
Bakteri A. tzmzefaciem merupakan patogen tanaman. Secara alami
mekanisrne yang kompleks dari Agrobacteriurn marnpu memindalkan suatu
sekuen gen ke dalam genom bnaman melalui suatu vektor plasmid yaitu Ti
(turnor inducing). Saat ini plasmid Ti yang digunakan merupakan hasil modifikasi
dengan sifat virulensi yang telah dilucuti. Pada plasmid Ti terdapat bagian-bagian
penting yang terkait dalam mekanisme transformasi gen. Bagian-bagian tersebut
adalah daerah T-DNA dan daerah virulence (vir) pada T-DNA. Gen target yang
akan ditransformasi disisipkan pada bagian T-DNA untuk selanjutnya
dipindahkan ke dalam genom tanaman. Gen vir berperan penting dalam
mekanisme pemindahan daerah T-DNA ke dalam genom tanaman. Selain plasmid
Ti, ada pula gen lain yang berperan dalam transformasi yaitu gen chromosomal
virulence (chv). Gen-gen ini berperan dalam pelekatan bakteri ke dalam sel
tanaman (Sheng and Citovsky 199G).
Asam Salisilat
Selama berabad-abad diketahui bahwa mengunyah kulit kayu dari pohon
willow (salix) dapat menyembuhkan sakit kepala dan demam, dan di abad 19
Asam Salisilat (AS) sudah teridentifikasi komponen aktif dari ekstrak kulit kayu
pohon willow. AS di dalam tanaman terlibat dalam berbagai proses fisiologis
seperti penutupan stomata, induksi pembungaan, heat produksi, dan berperan
dalam pusat pertahanan melawan serangan patogen.
Tanaman yang mengalami luka nekrotik, dengan penyebab serangan
patogen, akan mengaktiikan suatu jalur yang mendorong ke arah ketahanan yang
diperoleh secara systemic (Systemic Aqczrire Resistance, SAR). Karakteristik SAR
adalah memperpanjang ketahanan jaringan tanaman yang jauh dari lokasi awal
infeksi, keberadaannya bertahan berminggu-minggu sampai berbulan-bulan, dan
~nemproteksitanaman melawan infeksi sekunder yang disebabkan oleh patogenpatogen yang memiliki spektrum yang luas. AS eksogenous dapat menginduksi
SAR.
AS tampaknya menjadi signal endogen yang memicu adanya SAR
(Verbene et ul2000).
Mekanisme pertahanan tanaman terhadap serangan patogen ditunjukkan
oleh adanya perubahan sifat fisik dan biokimia tanaman. Perubahan secara fisik
antara lain dinding sel tanaman menjadi lebih kuat oleh akumulasi hidrosiprolin,
glikoprotein, lignin, kalosa dan fenol. Secara biokimia ditandai oleh akumulasi
fitoaleksin dan inhibitor protease (Broglie et a1 1993) dan produksi protein
spesifik yang berhubungan dengan jenis patogen yang menginfeksi. Protein
spesifik tersebut antara lain pathogerresis related protein (PR-Protein) yang
berfungsi untuk menghambat proses infeksi patogen (Van Loon 1985).
Ditambahkan pula bahwa AS berperan di dalam pertahanan tanaman pada
tanaman tembakau yang ditransformasi dengan gen nahG dari Psettdornonus
putida.
Produk gen nahG penyandi salicylate hydroxylase menyebabkan AS
dikonversi secara biologi menjadi catechol non-aktif. Sehingga AS tidak bisa lagi
terakumulasi di dalam tanaman dan menghasilkan ketidakmampuan untuk
menginduksi SAR. Secara genetis dan data biokimia yang diperoleh, bahwa
kolnponen yang berada pada jalur signal AS bekerja secara upstream atau
downstream.
Biosintesis AS dalam tanaman adalah lewat jalur phenylpropanoid.
Setelah Biosintesis, sebagian besar AS terkonyugasi sebagai AS 2-6-f3-Dglucosida (ASG). Ditambahkan pula bahwa ASG berperan dalam mengaktifkan
SAR yang mungkin bertindak sebagai penyimpan non-aktif yang secara cepat
membelah untuk melepaskan AS aktif di lokasi infeksi (Verbeme et a1 2000).
Mikroorganisme, diantaranya Pseudomonas jluorescens dan Escherichia
coli, yang memproduksi AS dan senyawa-senyawa terkait bekeja membangun
blok untuk iron-chelating siderophores. Sebagai contoh, Pseudomonasfluorescens
tertentu menghasilkan AS atas pertolongan dari jalur biosintesis yang singkat dari
chorismat, yang didahului oleh precursor dari senyawa aromatik. Substrat ini
dikonversi oleh isochorismat synthase (ICS), menjadi isochorismat kemudian
dibelah oleh isochorismat pyruvat lyase (IPL) untuk menghasilkan AS (Verbeme
et a1 2000). Biosintesis AS pada bakteri ditunjukkan pada Gambar 1.
Shiliimic acid pahiway
Arognnic a a d
o-Gwmaric acid
Flawnnicls
OH
pCouinaric acid
Surnber :M b u x (2002).
Gambar 1. Jalur Biosintesis asam salisilat pada bakteri.
Penyakit Hawar Pelepah Daun
Penyakit hawar pelepah daun yang disebabkan oleh R solani mempakan
salah satu penyakit utama padi. Cendawan ini biasanya menyerang pada saat padi
memasuki fase akan bunting brimordia). Sehingga menghambat proses
pembentukan bulir padi.
Cendawan ini menyerang dan membentuk bercak pada pelepah daun dan
batang. Bercak berukuran besar, bertepi tidak teratur, berbentuk jorong dengan
tepi coklat kemerahan, sedangkan pusatnya benvama seperti jerami (kuning
kehijauan). Bercak ini seringkali terdapat dekat dengan lidah daun. Ukuran bercak
pada batang lebih kecil dibandingkan pada pelepah daun. Jika lingkungan lembab
pada bercak akan tumbuh benang-benang miselium cendawan putih atau coklat
muda (Semangun 1990).
Benang-benang miselium cendawan Rhizoctonia mempunyai lebar
berkisar 6-10pm, dengan percabangan membentuk sudut mncing. Pada titik
percabangan terdapat lekukan dan didekatnya terdapat sekat. Jamur kemudian
membentuk hifa bersel pendek-pendek, mempunyai banyak percabangan yang
lnembentuk sudut siku. Sebagian dari benang-benang ini membentuk benang yang
tebal dan pendek. Badan jamur membentuk sklerotium dengan bentuk tidak
teratur, benvama coklat atau coklat kehitaman.
Beberapa falctor yang berpengaruh terhadap perkembangan penyakit ini
ialah jar& tanam yang rapat, penggunaan varietas (galur) unggul yang pendek dan
mempunyai anakan banyak (:Amir dan Kardin 1991).
Cendawan R. .~olunimempunyai sebaran inang luas selain pada padi dapat
pula bertahan pada gulma, sehingga sulit dikendalikan (Overseas Technical
Cooperation Agency 1973; Atkins et aE 1974; Kardin et a1 1997). Sumber
inokulum patogen ini adalah miselia dan sklerotia yang dapat bertahan pada
jerami dan rumput-rumputan. Banyak gulma yang dapat menjadi tumbuhan inang
I