Dilakukan pengenceran kuning telur menggunakan PBS dengan perbandingan 1 bagian kuning telur dengan 2 bagian pengencer, selanjutnya kuning telur
yang telah diencerkan disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit, supernatan digunakan untuk menguji keberadaan antibodi spesifik
dengan metode AGPT dan HI Soejoedono et al. 2005.
5. Tahap Uji Keberadaan Antibodi Spesifik dengan AGPT dan Uji HI
5.1. Teknik Imunodifusi Agar Gel Precipitation Test AGPT
Agar gel dibuat dengan melarutkan 0,5 gram agarose dalam 25 ml miliQ dan 25 ml PBS pH 7,2. Ditambahkan Na Acid sebagai bahan anti jamur
sebanyak 0,001 gramml. Larutan ini dipanaskan dengan penangas air sampai larut dan warna larutan menjadi bening. Sebanyak 4 ml agar gel
tersebut dituangkan pada gelas objek menggunakan pipet dan ditunggu hingga mengeras. Setelah agar gel mengeras, dibuat sumur-sumur
dengan puncher. Sebanyak 25 µl antigen Escherichia coli atau Salmonella Enteritidis
dimasukkan ke dalam sumur tengah dan pada sumur sekelilingnya dimasukan 25 µl kuning telur yang telah diberi perlakuan pemanasan.
Gelas obyek diletakan di atas tisu basah agar terjaga kelembabannya, dan disimpan dalam wadah tertutup untuk mencegah terjadinya
kontaminasi. Reaksi dibaca setelah 18–48 jam dan reaksi positif ditunjukan dengan adanya garis presipitasi garis buram putih pada
daerah antara sumur antigen dengan sumur kuning telur segar. Ini menandakan bahwa antigen dan antibodi tersebut homolog. Uji AGPT
ini digunakan untuk mendeteksi antibodi terhadap antigen bakteri Escherichia coli
dan Salmonella Enteritidis. Antigen yang digunakan adalah isolat bakteri Escherichia coli dan
Salmonella Enteritidis yang ditumbuhkan dalam 50 ml media BHI
Broth yang diinkubasi pada suhu 37°C selama 18–24 jam. Kemudian masing-masing isolat disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama
15 menit. Supernatan dibuang dan pelet dicuci dengan 5 ml NaCl fisiologis, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama
15 menit. Pencucian dengan NaCl fisiologis dilakukan sebanyak 3 kali. Setelah proses pencucian selanjutnya pelet ditambah dengan 0,5 ml HCl
0,2 N dan satu tetes phenol red ditambahkan sebagai indikator kemudian ditangas pada suhu 52°C selama 2 jam. Selanjutnya ditambahkan NaOH
1N sampai warna berubah menjadi merah, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang dihasilkan
digunakan sebagai antigen terlarut dan disimpan pada suhu 4°C Pasaribu Wibawan 1993.
5.2. Pengujian terhadap antibodi H5N1
