Hasil dan Pembahasan

BAB IV Hasil dan Pembahasan

IV.1. Hasil Penelitian

Hasil pengecatan preparat ginjal dengan Sirius Red pada ketiga kelompok perlakuan menunjukkan adanya perbedaan. Pada kelompok SO, tidak didapatkan adanya fibrosis yang ditandai dengan munculnya tampakan area merah yang intens seperti yang tampak pada kelompok U7 dan U14. Struktur parenkim pada kelompok SO terlihat sesuai dengan struktur fisiologisnya, sedangkan pada kelompok U7 dan U14 terjadi perubahan pada struktur tubulus, di mana lumen tubulus mengalami dilatasi disertai dengan pemipihan dari sel pelapisnya. Terdapat massa eosinofilik didalam beberapa lumen tubulus pada kelompok U7 dan U14 yang disebut sebagai cast, suatu tanda adanya gangguan pada struktur parenkim ginjal.

42

C Gambar 4.1 Hasil Pengecatan Sirius Red pada Jaringan

Ginjal dari Ketiga Kelompok Perlakuan (A = SO; B = U7;

C = U14). Perhatikan area di lingkaran biru, terjadi

proses kemerahan pada parenkim yang menandakan fibrosis. Pada kelompok Sham tidak terjadi proses fibrosis dan arsitektur histologis jaringan masih

normal.

IV.1.1. Pengukuran Fraksi/Rasio Area Fibrosis

Interstisial dan Perivaskuler

Pengukuran fraksi area fibrosis interstisial masing-masing grup perlakuan dilakukan dengan bantuan peranti lunak ImageJ, begitu pula dalam perhitungan fibrosis perivaskuler.

Gambar 4.2 Proses Pengolahan Gambar pada Pengukuran Fraksi Area Fibrosis Interstisial (A = preparat U14;

B = gambar pada program pengolah ImageJ). Area dalam lingkaran biru dibandingkan dengan seluruh area

lapang pandang untuk memperoleh fraksi area fibrosis interstisial.

Pada pengukuran fibrosis interstisial, dilakukan pengukuran fraksi area berwarna hitam dengan warna putih yang menandakan fraksi antara area fibrosis dengan seluruh lapang pandang. Parameter hitung yang digunakan adalah fraksi area.

Pada pengukuran fibrosis perivaskuler, luas area fibrosis di area sekitar vasa dibandingkan dengan luas lumen vasa Pemilihan area fibrosis menggunakan metode semi-otomatis, sedangkan pemilihan luas lumen vasa menggunakan free hand selection. Parameter hitung yang digunakan adalah area.

Gambar 4.3 Proses Pengolahan Gambar pada Pengukuran Rasio Fibrosis Perivaskuler (A = gambar preparat; B =

gambar pada program pengolah ImageJ). Luas area lingkaran biru (luas lumen vasa) dibandingkan dengan luas area berwarna hitam pada gambar kanan untuk memperoleh rasio fibrosis perivaskular.

IV.1.2. Pengukuran Ekspresi eNOS

Analisis ekspresi eNOS menggunakan metode RT PCR. Setelah itu dilakukan perbandingan intensitas ekspresi eNOS dengan ekspresi GAPDH sebagai kontrol positif. Analisis perbedaan intensitas warna dibantu menggunakan peranti lunak ImageJ.

eNOS

GAPDH SO D14 UUO

Gambar 4.4 Ekspresi eNOS dan GAPDH pada Kelompok UUO 14

Kelompok Perlakuan

Gambar 4.5 Grafik Perbandingan Ekspresi eNOS/GAPDH antara Kelompok SO dengan UUO 14 Hari

IV.2. Analisis Statistik

Terdapat perbedaan persentase fraksi area fibrosis interstisial, rasio fibrosis perivaskular dan ekspresi eNOS/GAPDH pada ketiga kelompok perlakuan. Proses fibrosis, fibrosis interstisial maupun perivaskular terjadi paling dominan di kelompok U14 (memiliki nilai rata-rata tertinggi). Terjadi penurunan ekspresi eNOS pada kelompok U14 (0.36) jika dibandingkan dengan kelompok SO (0.84), seperti yang dapat dilihat pada tabel dan grafik di bawah.

Tabel 4.1 Mean dan SE dari Fraksi Area Fibrosis Interstisial, Rasio Fibrosis Perivaskuler dan Rasio Ekspresi eNOS/GAPDH dari Kelompok SO, UUO 7 Hari, dan UUO 14 Hari

Kelompok

Mean dan SE

Fraksi Area

Rasio Fibrosis

Rasio

Ekspresi Interstisial Perivaskuler

Fibrosis

eNOS/GAPDH

SO

0.031992 (SE 2.308201 (SE 0.835668 (SE = 0.021)

= 0.08397) 95%CI (-0.275 95%CI (1.091 95%CI (0.474 – 0.915)

1.077762 (SE 2.160659 (SE NO DATA = 0.619)

95%CI (0.47 – 95%CI (0.441 1.685)

U14

1.460654 (SE 3.722898 (SE 0.3596343 (SE = 0.527)

= 0.047) 95%CI (-0.002 95%CI (1.806 95%CI (0228 – – 2.924)

Kelompok Perlakuan

Gambar 4.6 Grafik Perbandingan Mean Skor Fibrosis Perivaskuler pada Kelompok SO, U7, dan U14. Data dalam

bentuk rasio. ** = p>0.05

n 1,5 esre P

Kelompok Perlakuan

Gambar 4.7 Grafik Perbandingan Fraksi Area Fibrosis Interstisial pada Kelompok SO, U7, dan U14. Data dalam

bentuk persentase * = p<0.05

Kelompok Perlakuan

Gambar 4.8 Grafik Perbandingan Ekspresi eNOS/GAPDH pada

Kelompok SO dan U14. * = p<0.05

IV.2.1. Uji Persebaran Data

IV.2.1.1. Uji Persebaran Data pada Kelompok Fibrosis Perivaskuler

Tabel 4.2 Hasil Tes Statistik Saphiro-Wilk untuk Uji Persebaran Data Kelompok Fibrosis Perivaskuler

Shapiro-Wilk W test for normal data Variable Obs W V z Prob>z

Rasio_FP 15 0.93655 1.230 0.410 0.34101

Nilai p untuk data-data pada fibrosis perivaskuler berada di angka 0.34101, nilai p >0.05 menandakan bahwa hipotesis null bahwa data berada di distribusi normal tidak tertolak, sehingga data berada pada distribusi normal.

IV.2.1.2. Uji Persebaran Data pada Kelompok Fibrosis Interstisial

Tabel 4.3 Hasil Tes Statistik Saphiro-Wilk untuk Uji Persebaran Data Kelompok Fibrosis Interstisial

Shapiro-Wilk W test for normal data Variable Obs W V z Prob>z

FA_FI 15 0.85703 2.772 2.016 0.02188

Nilai p untuk data-data pada fibrosis perivaskuler berada di angkat 0.02188, nilai p<0.05 menandakan bahwa hipotesis null bahwa data berada di distribusi normal tertolak, sehingga data berada pada distribusi tidak normal.

IV.2.1.3. Uji Persebaran Data pada Kelompok Ekspresi eNOS/GAPDH

Tabel 4.4 Hasil Tes Statistik Saphiro-Wilk untuk Uji Persebaran Data Ekspresi eNOS/GAPDH

Shapiro-Wilk W test for normal data Variable Obs W V z Prob>z

eNOS_GAPDH 8 0.92807 1.002 0.003 0.49863

Dapat disimpulkan bahwa data ekspresi eNOS/GAPDH berada pada distribusi normal melihat nilai p dari uji Saphiro-Wilk untuk data ini >0.05.

IV.2.2. Uji Komparasi Nilai Rerata antar Kelompok Perlakuan (SO, U7 dan U14)

IV.2.2.1 Uji Komparasi Rasio Fibrosis Perivaskuler di kelompok SO, U7 dan U14

Studi ini menggunakan analisis one-way ANOVA untuk menguji perbedaan nilai rata-rata rasio fibrosis perivaskuler yang terdapat pada kelompok SO, U7, dan U14. Perbedaan ini secara statistik tidak signifikan, melihat nilai p = 0.1737, dikonfirmasi dengan uji post hoc (metode Scheffe) dengan hasil yang juga tidak signifikan (nilai p >0.05 pada ketiga kelompok).

Area Fibrosis Interstisial di Kelompok SO, U7 dan U14

IV.2.2.2. Uji

Komparasi Fraksi

Studi ini menggunakan uji Kruskal-Wallis untuk melakukan pengujian statistik terhadap perbedaan rata- rata luas fraksi area fibrosis interstisial di kelompok SO, U7, dan U14. Perbedaan nilai pada ketiga kelompok ini secara statistik signifikan dengan nilai p = 0.0087.

IV.2.2.3. Uji Komparasi Ekspresi eNOS/GAPDH di kelompok SO dan U14 Studi ini menggunakan independent sample t-test untuk melakukan pengujian terhadap perbedaan nilai rata- IV.2.2.3. Uji Komparasi Ekspresi eNOS/GAPDH di kelompok SO dan U14 Studi ini menggunakan independent sample t-test untuk melakukan pengujian terhadap perbedaan nilai rata-

IV.2.3. Uji korelasi

IV.2.3.1 Uji Korelasi Fibrosis Perivaskuler terhadap Ekspresi eNOS/GAPDH

antara ekspresi eNOS/GAPDH terhadap rasio fibrosis perivaskuler, semakin tinggi ekspresi eNOS/GAPDH, maka rasio fibrosis perivaskuler akan semakin menurun (nilai r=-0.4816). Namun, secara statistik uji ini tidak signifikan karena nilai p = 0.2270, dilakukan konfirmasi dengan uji regresi liniar dan didapatkan hasil yang juga tidak signifikan (nilai p = 0.227).

IV.2.3.2. Uji Korelasi Fibrosis Interstisial terhadap Ekspresi eNOS/GAPDH

Studi ini menggunakan uji Spearman untuk menguji korelasi antara fraksi area fibrosis interstisial dari ketiga kelompok perlakuan (SO, U7 dan U14) dengan ekspresi eNOS/GAPDH. Didapatkan nilai rho = -0.7381 yang Studi ini menggunakan uji Spearman untuk menguji korelasi antara fraksi area fibrosis interstisial dari ketiga kelompok perlakuan (SO, U7 dan U14) dengan ekspresi eNOS/GAPDH. Didapatkan nilai rho = -0.7381 yang

IV.2.3.3. Uji Korelasi Fibrosis Interstisial terhadap Fibrosis Perivaskuler

Pada studi ini, korelasi antara fibrosis interstisial dan perivaskuler dari ketiga kelompok perlakuan dilakukan dengan dua cara, yaitu dengan penggabungan serta pemisahan (hanya kelompok U14) observasi korteks dan medulla renalis pada fibrosis interstisial. Uji Spearman dilakukan pada data gabungan (karena persebaran data tidak normal) dan uji Pearson dilakukan pada data yang terpisah (karena persebaran data yang normal).

Dari hasil pengujian data gabungan (korteks + medulla), korelasi antara fibrosis interstisial dengan fibrosis perivaskuler memiliki nilai rho = 0.345 yang menandakan suatu korelasi positif, namun secara statistik hubungan ini tidak signifikan (nilai p = 0.2143).

Dari hasil pengujian data terpisah (observasi medulla dan korteks dibedakan) korelasi antara fibrosis interstisial pada kelompok U14 di bagian medulla dan Dari hasil pengujian data terpisah (observasi medulla dan korteks dibedakan) korelasi antara fibrosis interstisial pada kelompok U14 di bagian medulla dan

IV.3. Diskusi

Dari beberapa studi yang ada, didapatkan fakta bahwa insidensi gagal ginjal meningkat seiring waktu. Menurut Indonesian Renal Registry, jumlah kasus gagal ginjal yang memerlukan terapi hemodialisis mencapai angka 15.353 kasus pada tahun 2011. Data menyebutkan bahwa tiga penyebab tersering dari gagal ginjal adalah hipertensi, diabetes mellitus, dan obstruksi saluran kemih (PERNEFRI, 2011).

Di situasi klinik, cidera ginjal akut, suatu istilah yang diperkenalkan untuk menggambarkan seluruh spektrum dari gagal ginjal akut masih ditegakkan dengan menggunakan kreatinin serum dan produksi urin. Diagnosis cidera ginjal akut ditegakkan apabila terjadi peningkatan >0,3 gr/dL dari kreatinin serum pasien atau peningkatan >50% dari data dasar disertai dengan oligouria (produksi urin <0,5 mL/kg/jam). Penanda ini merupakan suatu penanda yang tidak reliabel dan terlambat. Beberapa alasan yang mendasari pernyatan ini

adalah: kadar kreatinin serum bisa sangat bervariasi, tergantung dari umur, jenis kelamin, massa otot, metabolisme otot, medikasi dan status hidrasi; peningkatan kreatinin serum terjadi apabila sebagian besar parenkim ginjal sudah rusak; pada kondisi penurunan laju filtrasi glomerulus, akan terjadi peningkatan sekresi tubulus dari kreatinin sehingga berujung pada overestimation fungsi ginjal; pada kondisi perubaha laju filtrasi glomerulus yang akut, kadar kreatinin serum gagal untuk menggambarkan fungsi ginjal secara keseluruhan (Devarajan, Emerging urinary biomarkers in the diagnosis of acute kidney injury, 2008).

Terapi yang ada pada saat ini masih belum efektif, dokter hanya dapat melakukan terapi suportif berupa hemodialisis jika pasien telah mengalami gagal ginjal, sehingga pasien dengan gagal ginjal memiliki tingkat morbiditas dan mortalitas yang tinggi, di mana hal ini dapat diramalkan dari seberapa besar peningkatan kreatinin serum dari pasien tersebut (Devarajan, Emerging urinary biomarkers in the diagnosis of acute kidney injury, 2008).

Keluaran terapi yang buruk ini diakibatkan karena intervensi yang dilakukan setelah terjadi kenaikan kreatinin serum. Terdapat lag antara serum kreatinin dan gagal ginjal, terutama pada kasus acute renal failure, dikarenakan kondisi pasien yang tidak stabil (Hewitt, Dear, & Star, 2004). Hal inilah yang mengakibatkan keluaran yang buruk dari terapi pasien dengan gagal ginjal dan juga peningkatan penggunaan fasilitas hemodialisis dari tahun ke tahun. Diperlukan adanya suatu penanda biologis baru yang lebih baik untuk membantu dokter dalam mendiagnosis gagal ginjal.

Dalam kondisi yang ideal, suatu penanda biologis yang baik adalah: tidak memerlukan prosedur yang invasif dalam pemakaiannya (dapat diperoleh lewat urin atau darah), dapat diukur dengan cepat, memiliki sensitivitas yang tinggi untuk deteksi awal, memiliki spesifisitas yang tinggi, dapat menjadi petunjuk untuk memulai terapi, memiliki nilai prognosis yang luas, dan mampu menjadi alat pemantau proses terapi (Devarajan, 2011).

Salah satu proses patologis yang dominan terjadi pada gagal ginjal adalah fibrosis interstisial. Pada beberapa penelitian yang telah dilakukan sebelumnya, terjadi fibrosis interstisial pada hari ke-16 pasca Salah satu proses patologis yang dominan terjadi pada gagal ginjal adalah fibrosis interstisial. Pada beberapa penelitian yang telah dilakukan sebelumnya, terjadi fibrosis interstisial pada hari ke-16 pasca

14 dan secara signifikan berbeda apabila dibandingkan dengan kelompok SO dan U7 (nilai p = 0.0087).

Didapatkan korelasi negatif yang tidak signifikan antara fibrosis perivaskular dengan ekspresi eNOS. Hal ini mungkin diakibatkan karena penurunan ekspresi eNOS diakibatkan oleh gangguan pada mikrovaskulatur. Seperti yang pernah diungkapkan pada penelitian sebelumnya, proses penurunan eNOS diakibatkan karena terjadinya peritubular capillary loss pada proses degeneratif ginjal (Thomas, et al., 1994). Proses yang dilihat pada penelitian ini adalah pada makrovaskulatur, sehingga terjadi hubungan yang tidak signifikan antara penurunan ekspresi eNOS dengan fibrosis perivaskular.

Ekspresi eNOS pada penelitian ini dikaitkan dengan disfungsi endothel yang menjadi faktor predisposisi dari penyakit gagal ginjal. Pada penelitian ini, didapatkan penurunan ekspresi eNOS/GAPDH yang menandakan penurunan kerja dari eNOS itu sendiri (nilai p = 0.0016). Hal serupa juga ditemukan pada beberapa penelitian lain di mana pada periode awal obstruksi (<24 jam) terjadi Ekspresi eNOS pada penelitian ini dikaitkan dengan disfungsi endothel yang menjadi faktor predisposisi dari penyakit gagal ginjal. Pada penelitian ini, didapatkan penurunan ekspresi eNOS/GAPDH yang menandakan penurunan kerja dari eNOS itu sendiri (nilai p = 0.0016). Hal serupa juga ditemukan pada beberapa penelitian lain di mana pada periode awal obstruksi (<24 jam) terjadi

Efek dari penurunan eNOS akan terjadi penurunan produksi NO, sehingga mengakibatkan penurunan respon vasodilatasi yang diinduksi oleh achetylcholine (Savard, et al ., 2012). Selain itu, penurunan kadar NO di ginjal diasosiasikan

patologis dari hemodinamika ginjal, peningkatan tekanan kapiler glomerulus, peningkatan sklerosis glomerulus, atrofi tubulus dan fibrosis interstisial (Katoh, Takahashi, & Klahr, 1994). Seyawa oposisi NO seperti angiotensin II, endothelin-1, dan katekolamin menjadi sangat dominan. Di sel otot polos tunica media vasa, senyawa-senyawa ini akan mengakibatkan suatu remodelling vasa sedangkan secara sistemik akan mengakibatkan suatu peningkatan tahanan perifer (Lerman, Sandok, & Hilderbrand, 1992)

dengan

perubahan

Penghantaran gen eNOS menggunakan adenovirus pada tikus yang telah diinduksi gagal ginjal mampu Penghantaran gen eNOS menggunakan adenovirus pada tikus yang telah diinduksi gagal ginjal mampu

Pada penelitian ini dilakukan pengukuran fibrosis perivaskuler untuk mengukur proses patologis ini dan membandingkan serta mengkorelasikannya dengan fibrosis interstisial sebagai salah satu proses utama pada gagal ginjal dan ekspresi eNOS. Komponen perivaskuler menjadi penting karena sel yang memiliki peran krusial dalam proses fibrosis interstisial, myofibroblast, suatu sel dengan elemen kontraktil yang secara aktif memproduksi matriks ekstraseluler berasal dari sel-sel di area perivaskuler

transisi. Komponen perivaskuler memiliki peran yang dominan dalam eksistensi myofibroblast ini (Humphreys, Targeting pericyte differentiation as a strategy to modulate kidney fibrosis in diabetic nephropathy, 2012).

yang

mengalami

Morfometri fibrosis perivaskuler jarang dilakukan sehingga sangat sulit untuk menemukan pembanding dari penelitian lain. Pada penelitian ini, didapatkan perbedaan fibrosis perivaskuler pada kelompok U14 jika dibandingkan dengan kelompok U7 dan SO, namun secara statistik tidak signifikan (nilai p = 0.1737). Dari hasil uji korelasi, didapatkan bahwa ekspresi eNOS tidak memiliki korelasi yang signifikan terhadap derajat fibrosis perivaskuler (nilai p = 0.227).

Namun, muncul suatu pola hubungan antara fibrosis perivaskuler dengan fibrosis interstisial. Dari hasil uji korelasi didapatkan bahwa fraksi area fibrosis interstisial di area medulla maupun korteks ginjal memiliki korelasi positif (nilai p <0.05), sehingga didapatkan suatu kesimpulan bahwa semakin besar derajat fibrosis

maka akan meningkatkan luas fraksi area fibrosis interstisial, atau dalam kata lain memperberat kondisi gagal ginjal.

perivaskuler yang

terjadi

Dari penelitian ini dapat ditarik kesimpulan bahwa terjadi fibrosis interstisial yang signifikan pada ginjal yang mengalami ligasi ureter unilateral selama 7 sampai 10 hari. Terjadi penurunan ekspresi eNOS di ginjal yang mengalami ligasi ureter unilateral dibandingkan Dari penelitian ini dapat ditarik kesimpulan bahwa terjadi fibrosis interstisial yang signifikan pada ginjal yang mengalami ligasi ureter unilateral selama 7 sampai 10 hari. Terjadi penurunan ekspresi eNOS di ginjal yang mengalami ligasi ureter unilateral dibandingkan

Fibrosis interstisial ini juga dipengaruhi oleh derajat fibrosis perivaskuler, di mana semakin tinggi derajat fibrosis perivaskuler yang terjadi, semakin luas pula fibrosis interstisial yang akan muncul. Hal ini berarti peningkatan derajat fibrosis perivaskuler menandakan kerusakan parenkim yang semakin ekstensif pada patogenesis gagal ginjal. Hal ini sejalan dengan teori yang ada bahwa myofibroblast yang memegang peranan krusial dalam fibrosis interstisial berasal dari sel-sel perivaskuler.