Isolasi Dan Karakterisasi Bakteri Endofit Pada Tanaman Acacia Decurrens (J C Wendl ) Willd

ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ENDOFIT PADA
TANAMAN Acacia decurrens (J.C.Wendl.) Willd.

LUKMAN AMIR

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA 
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Isolasi dan Karakterisasi
Bakteri Endofit pada Tanaman Acacia decurrens (J.C.Wendl.) Willd. adalah benar
karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal
atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain
telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian
akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada
Institut Pertanian Bogor.

Bogor, Desember 2015

Lukman Amir
NIM A154130061



Pelimpahan hak cipta atas karya tulis dari penelitian kerja sama dengan pihak
luar IPB harus didasarkan pada perjanjian kerja sama yang terkait.

RINGKASAN

LUKMAN AMIR. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Endofit pada Tanaman
Acacia decurrens (J.C.Wendl.) Willd. Dibimbimg oleh DWI ANDREAS
SANTOSA dan GIYANTO.
Acacia decurrens merupakan tanaman dengan kemampuan tumbuh cepat
dan termasuk kedalam famili Leguminosae. Jenis tanaman ini dapat dijumpai di
kawasan taman nasional gunung Merapi (Selo dan Cangkringan) dan kawasan
taman nasional gunung Merbabu, Indonesia. Tanaman ini terkenal di Indonesia

selain karena kemampuan tumbuh cepatnya, juga karena kemampuan daya
adaptasi tinggi yang terkadang mampu menginvasi suatu kawasan. Kemampuan
tersebut diduga dipengaruhi kuat oleh keberadaan mikroorganisme khusunya
bakteri endofit pada jaringan tanaman tersebut. Tujuan dari penelitian ini yaitu:
(1) untuk mendapatkan bakteri endofit dengan cara mengisolasi,
mengkarakterisasi, menyeleksi dan mengidentifikasi bakteri endofit dari tanaman
A. decurrens, (2) mempelajari peran bakteri endofit dalam meningkatkan
pertumbuhan tanaman padi.
Lokasi pengambilan sampel terletak pada kawasan taman nasional gunung
Merapi dan Merbabu. Proses isolasi, seleksi, karakterisasi dan identifikasi bakteri
endofit dari sampel yang berupa bagian akar, batang dan daun tanaman A.
decurrens dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Lingkungan Indonesian
Center for Biodiversity and Biotechnology (ICBB) Bogor.
Sebanyak 48 isolat bakteri endofit telah diisolasi dari jaringan pada akar,
batang dan daun A. decurrens. Keseluruhan isolat kemudian diseleksi melalui uji
patogenitas (reaksi hemolisis pada media agar darah dan hypersensitif respon
menggunakan tanaman tembakau) dan dalam meningkatkan daya kecambah dan
daya tumbuh benih padi. Berdasarkan hasil seleksi, diperoleh sepuluh isolat yang
akan diuji lebih lanjut. Selanjutnya, kesepuluh isolat terpilih diuji dalam
menambat N2, memproduksi IAA, melarutkan fosfat, melarutkan kalium,

menghambat pertumbuhan bakteri (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) dan
cendawan (Rhizoctonia solani) penyebab penyakit pada tanaman. Dari hasil uji
lanjut yang telah dilakukan, keseluruhan isolat terbukti mampu menambat N2 dan
memproduksi IAA, enam diataranya sebagai pelarut fosfat, satu isolat dengan
kemamampuan menghambat pertumbuhan X. oryzae dan satu isolat terhadap R.
solani.
Isolat-isolat tersebut kemudian diuji dalam meningkatkan pertumbuhan
vegetatif tanaman padi. Percobaan ini menggunakan rancangan acak lengkap yang
terdiri dari 12 perlakuan dan 5 ulangan. Perlakuan tersebut yaitu (perlakuan 1-10)
bakteri endofit ditambah ½ dosis rekomendasi N, P, K dan (perlakuan 11 dan 12)
sebagai kontrol yaitu ½ dan 1 dosis rekomendasi pupuk N, P dan K. Diantara 10
isolat yang diujikan, isolat Bb4, Ca9 dan Bd3 merupkan isolat-isolat dengan hasil
terbaik yang mampu menutupi separuh dari penggunaan pupuk N, P dan K
dengan dosis rekomendasi. Ketiga isolat tersebut dilanjutkan pada tahap
identifikasi. Berdasarkan gene 16S rRNA, isolat Bb4 memiliki kemiripan 96.4%
dengan spesies padanan Enterobacter sp., Ca9 memeliki kemiripan 96.2% dengan

Pseudomonas sp. dan Bd3 memiliki kemiripan 96.1% dengan Enterobacter
cloacae. Keseluruh isolat tersebut telah terdaftar dan memiliki nomor aksesi dari
European Molecular Biology Laboratory (EMBL) Nucleotide Sequence

Database. Berdasarkan pada hasil sequensing gene 16S rRNA dan karakter
morfologi dan biokimia, ketiga isolat tersebut kemungkinan besar merupakan
genus baru dari kelas -proteobacteria.
Kata kunci: Acacia decurrens, Merapi, Merbabu, bakteri endofit, bakteri pemacu
pertumbuhan tanaman, gen 16S rRNA.

SUMMARY

LUKMAN AMIR. Isolation and Characterization of Endophytic Bacteria from
Acacia decurrens (J.C.Wendl.) Willd. Dibimbimg oleh DWI ANDREAS
SANTOSA dan GIYANTO.
Acacia decurrens is a fast growing tree from acacia species and belonging to
the family Leguminosae. A. decurrens can be found in Merapi (Selo and
Cangkringan) and Merbabu mountain national park, Indonesia. This plant is
famous in Indonesia because of its ability to grow rapidly, adapt and even invade
a territory. Microorganisms thought to play an important role in the growth of this
plant, especially endophytic bacteria. The aims of this study are: (1) To obtain the
endophytic bacteria by isolating, selecting, characterizing, and identifying
endophytic bacteria from A. decurrens, (2) Investigated the role of endophytic
bacteria in promoting the growth of the rice plant.

Sampling sites located in the national park area of Merapi and Merbabu
mountain. The process of isolation, selection, characterization and identification
of endophytic bacteria form roots, stems and leaves of A. decurrens conducted at
the Laboratory of Environmental Biotechnology Indonesian Center for
Biodiversity and Biotechnology (ICBB) Bogor.
A total of 48 endophytic bacteria isolated from roots, stems and leaves of A.
decurrens that grow in the national park of Merapi and Merbabu mountain. These
isolates were selected by the pathogenicity test (hemolytic reaction on blood agar
media and hypersensitive response of tobacco plants) and the ability to promote
the germination and growth of rice seed. Following the selection test, 10
endophytic bacteria were selected for further investigation. Further, experiments
were performed with 10 isolates to determine their N2 fixation, auxin producing
activities, phosphate and potassium solubilizing, antagonistic activities against
plant phytopathogenic bacteria (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) and fungi
(Rhizoctonia solani), and plant growth promotion in rice. Our result revealed that
ten bacterial isolates belonging to diazotrophic bacteria and producing IAA, while
six as phosphate solubilizing, one isolate showed antagonistic activities against X.
oryzae and one against R. solani.
These isolates were tested in promoting vegetative growth of rice plant. The
experiment was a completely randomized design consisted of 12 treatments, with

5 replications. The treatments were: (treatment 1-10) endophytic bacteria with half
recommended dose of N, P, K inorganic fertilizers and (treatment 11 and 12) as a
control half and full recommended dose of N, P, K fertilizers. Among 10 isolates
tested, the Bb4, Ca9 and Bd3 were superior isolate, which were capable to replace
half recommended dose of chemical fertilizer for the vegetative growth of rice.
These isolates were chosen for futher identification. Based on the 16S rRNA
sequences, the isolate of Bb4 (LN907847), Ca9 (LN907849) and Bd3
(LN907848) has 96.4%, 96.2% and 96.1% similarity to Enterobacter sp.,
Pseudomonas sp. and Enterobacter cloacae respectively. These isolates have
registered and have accession numbers from the European Molecular Biology
Laboratory (EMBL) Nucleotide Sequence Database. Sequencing results of the

16S rRNA gene and further morphology and biochemical tests showed that those
isolates were most probably a new genus of the γ-class of Proteobacteria.
Keywords: Mt. Merapi, Mt. Merbabu, endophytic bacteria, Acacia decurrens,
plant growth-promoting bacteria (PGPB), 16S rRNA gene.

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan

atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ENDOFIT PADA
TANAMAN AKASIA (Acacia decurrens (J.C.Wendl.) Willd.)

LUKMAN AMIR

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Bioteknologi Tanah dan Lingkungan

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR
2015

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Dra Rahayu Widyastuti, MScAgr

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT karena atas
segala rahmat dan karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil
diselesaikan. Penelitian ini dilaksanakan sejak Agustus 2014 sampai
Oktober 2015 dengan judul Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Endofit pada
Tanaman Acacia decurrens (J.C.Wendl.) Willd.
Penulis menyampaikan penghargaan dan terima kasih kepada Prof. Dr. Ir.
Dwi Andreas Santosa MS dan Dr. Ir Giyanto M.Si selaku komisi pembimbing
atas segala bimbingan, kritik, saran dan motivasi yang telah diberikan dengan
tulus dan penuh kesabaran untuk penulis selama penelitian hingga penyelesaian
tesis ini. Ungkapan terima kasih penulis sampaikan kepada Direktorat Jenderal
Pendidikan Tinggi untuk pemberian beasiswa sehingga penulis dapat menempu
pendidikan di Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Terima kasih juga
penulis sampaikan kepada bapak, ibu dan rekan-rekan di Laboratorium

Bioteknologi Lingkungan Indonesian Center for Biodiversity and Biotechnology
(ICBB) atas fasilitas serta bantuannya selama masa penelitian dan penulisan tesis
ini. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada Anggreny Pramitha
Wulandari dan rekan-rekan yang telah membantu, memberi dorongan dan
motivasi selama masa studi di IPB. Terima kasih tak terhingga penulis sampaikan
kepada ayahanda, ibunda, kakak, adik dan beserta keluarga besar yang telah
memberikan limpahan kasih sayang, doa dan dukungannya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Desember 2015
Lukman Amir

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
PENDAHULUAN

Halaman

xi
xi
xii
1

Latar Belakang
Peruumusan Masalah

1
2

Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian

2
2

METODOLOGI PENELITIAN

3

Tempat dan waktu penelitian

3

Bahan dan Alat
Isolasi Bakteri Endofit dari Tanaman Acacia decurrens

3
3

Seleksi Bakteri Endofit
Karakterisasi Bakteri Endofit

4
5

Uji Efektifitas 10 Isolat Bakteri Endofit dalam Memacu
Pertumbuhan Vegetatif Tanaman Padi

6

Identifikasi Bakteri Endofit

7

HASIL DAN PEMBAHASAN
Lokasi Pengambilan sampel

9
9

Hasil Isolasi Bakteri Endofit dari Tanaman Acacia decurrens
Seleksi Bakteri Endofit
Karakterisasi Bakteri Endofit

10
11
15

Pengaruh Bakteri Endofit terhadap Pertumbuhan
Vegetatif Tanaman Padi

18

Identifikasi Bakteri Endofit
PEMBAHASAN UMUM
SIMPULAN DAN SARAN
DAFTAR PUSTAKA

20
25
27
28

LAMPIRAN

33

RIWAYAT HIDUP

38

DAFTAR TABEL

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Halaman
Jumlah dan keragaman bakteri endofit yang diisolasi dari tanaman
10
Acacia decurrens
Uji hemolisis dan hipersensitif isolat bakteri endofit
11
Rata-rata panjang akar, panjang pucuk, bobot basah, bobot kering
14
pertumbuhan padi stelah 7 hari masa inkubasi
Kemampuan menambat N2, melarutkan fosfat, kalium dan
15
menghambat pertumbuhan mikrob pathogen
Tinggi tanaman, jumlah daun dan jumlah anakan setelah 4MST (37
19
hari)
Bobot segar dan kering akar, daun dan batang
20
Penelusuran sekuen 16S rRNA tiga isolat bakteri endofit dengan
21
spesies padanan
Karakter morfologi dan biokimia 3 bakteri endofit dengan bakteri
23
pembanding

DAFTAR GAMBAR

1. Lokasi pengambilan sampel
2. Lokasi pengambilan sampel di 3 lokasi, (a) kawasan TNG Merapi
daerah Selo, (b) kawasan TNG Merbabu, (c) kawasan TNG Merapi
daerah cangkringan
3. Hasil uji hemolisis dengan media agar darah setelah 17 jam masa
inkubasi, a) reaksi positif ditandai dengan adanya zona bening
disekitar koloni, b) reaksi negatif
4. Hasil uji respon hipersensitif terhadap isolat bakteri endofit pada
daun tembakau. Contoh reaksi positif yang ditunjukkan oleh isolat
Aa8 setelah masa inkubasi 48 jam
5. Kemampuan bakteri endofit dalam menambat N2 secara kualitatif
terlihat dengan terbentuknya pelikel putih di bawah permukaan
media NFB pada 10 isolat uji
6. Uji bakteri endofit dalam melarutkan fosfat setelah 4 hari masa
inkubasi, a) reaksi positif terlihat dari zona bening disekitar koloni,
b) reaksi negatif

Halaman
9
9

11

13

16

17

7. Kemampuan 10 isolat bakteri endofit dalam menghasilkan hormon
IAA
8. Koloni bakteri endofit a (Bb4), b (Ca9) dan c (Bd3)
9. Hasil elektroforesis amplifikasi gen 16S rRNA isolat Bd3, Bb4,Ca9
dengan penanda 1kb
10. Hasil analisis filogeni 3 isolat bakteri endofit

18
20
21
22

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman
1. Kurva standar dan pertumbuhan 10 isolat bakteri endofit

30

2. Karakteristik morfologi koloni 48 bakteri endofit

32

1

PENDAHULUAN

Latar Belakang
Akasia (Acacia spp.) merupakan jenis tanaman yang termasuk kedalam
famili Leguminosae (Glushenkova 2012). Genus akasia merupakan tanaman
tropis-subtropis yang tersebar luas dari Amerika tengah melintasi Afrika hingga
pada Asia tenggara dan Australia (Burley et al. 2004). Jenis tanaman ini banyak
dibudidayakan di Indonesia sebagai tanaman kehutanan atau sebagai tanaman
reklamasi. Salah satu jenis akasia yang ada di Indonesia yaitu Acacia decurrens
(J.C.Wendl.) Willd. Akasia jenis ini dapat dijumpai di kawasan Taman Nasional
Gunung Merapi dan kawasan Taman Nasional Gunung Merbabu. Tanaman ini
memiliki kemampuan tumbuh yang cepat dan daya adaptasi tinggi sehingga kerap
mendominasi dalam suatu kawasan. Genus Acacia spp. termasuk kedalam famili
Leguminosae dengan salah satu ciri yaitu bintil akar yang terbentuk dari hasil
simbiosis antara bakteri dan akar tanaman tersebut. Berdasarkan beberapa hasil
penelitian ditemukan beberapa jenis bakteri yang diisolasi dari bintil akar Acacia
spp. diantaranya, yaitu Bradyrhizobium (Nuswantara et al. 1997), Rhizobium dan
Sinorhizobium (Toledo et al. 2003). Namun demikian, keberadaan bakteri endofit
pada jaringan tanaman akasia khususnya Acacia decurrens belum pernah
dilaporkan dan diduga banyak memberikan pengaruh terhadap pertumbuhan
tanaman tersebut.
Bakteri endofit merupakan bakteri yang hidup di dalam jaringan tanaman
yang bersifat netral atau bermanfaat bagi tanaman inangnya. Peran bakteri endofit
dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman diduga didukung oleh kemampuan
bakteri tersebut dalam menghasilkan hormon tumbuh seperti indole-3- acetic acid
(IAA), abscisic acid (ABA), gibberallic acid (GA) dan cytokinin (CTK) (Feng et
al. 2006). Selain itu, bakteri endofit juga dilaporkan dapat meningkatkan
pertumbuhan tanaman melalui penambatan N2 (diazotrophic bacteria) (Doty
2011), memobilisasi fosfat (Gusmaini 2014), juga karena kemampuannya dalam
meningkatkan ketahananan tanaman terhadap hama dan penyakit (Brooks et al.
1994; Duan et al. 2013).
Eksplorasi bakteri endofit dari berbagai jenis tanaman dengan berbagai
kepentingan telah banyak dilakukan. Hal tersebut demi memperoleh bakteri
endofit yang unggul, khususnya di bidang pertanian. Bakteri dengan kemampuan
meningkatkan pertumbuhan tanaman dapat dikembangkan menjadi agen pupuk
hayati yang bermutu yang dapat meningkatkan hasil produksi tanaman pangan
misalnya padi (Oryza sativa). Sebagai contoh, Hidayati (2014) melaporkan bahwa
aplikasi pemberian inokulum bakteri endofit yang diisolasi dari tanaman karet
berpotensi sebagai bakteri pemacu pertumbuhan karena terbukti mampu
meningkatkan pertumbuhan batang bawah Hevea brasiliensis.
Padi dengan pertumbuhan yang cepat dengan hasil panen tinggi sangat
dibutuhkan. Berbagai upaya telah dilakuakan salah satunya dengan pemupukan.
Pertanian Indonesia sampai saat ini masih tergantung pada supalai pupuk sintetik
demi memperoleh hasil panen yang lebih banyak. Akan tetapi, penggunaan pupuk
sintetik secara terus menerus akan berdampak negatif bagi lingkungan dan tidak
dapat menunjang sistem pertanian berkelanjutan. Oleh karena itu, upaya

2

pengurangan penggunaan pupuk sintetik terus dilakukan salah satunya melalui
pendekatan biologis, dengan memanfaatkan bakteri endofit yang memiliki
kemampuan memacu pertumbuhan tanaman.
Minimnya informasi mengenai keberadaan bakteri endofit pada tanaman A.
decurrens dan juga potensi yang dimilikinya baik untuk tanaman akasia itu sendiri
maupun tanaman pangan (padi), mendorong upaya untuk mengeksplorasi bakteri
endofit pada tanaman tersebut.

Perumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang diatas, dirumuskan masalah penelitian sebagai
berikut:
1. laporan mengenai informasi keberadaan bakteri endofit pada tanaman A.
decurrens masih belum ada, khususnya di Indonesia.
2. belum terdapat informasi terkait dengan potensi bakteri endofit pada
tanaman A. decurrens khususnya dalam memacu pertumbuhan tanaman
padi.

Tujuan Penelitian
Penelitian ini dilakukan dengan tujuan sebagai berikut:
1. memperoleh bakteri endofit dari tanaman A. decurrens dengan cara
mengisolasi, mengkarakterisasi, menyeleksi dan mengidentifikasi bakteri
tersebut.
2. mempelajari peran bakteri endofit dari tanaman A. decurrens dalam hal
memacu pertumbuhan tanaman padi.

Manfaat Penelitian
Dari penelitian ini diharapkan diperoleh informasi mengenai keberadaan
bakteri endofit pada jaringan tanaman A. decurrens serta peranan dan manfaatnya,
khususnya dalam hal pemacu pertumbuhan tanaman padi melalui proses isolasi,
seleksi, karakterisasi dan identifikasi.

3

METODE PENELITIAN

Tempat dan Waktu Penelitian
Lokasi pengambilan sampel jaringan tanaman A. decurrens yaitu di
kawasan Taman Nasional Gunung Merapi (Kabupaten Boyolali, Provinsi Jawa
Tengah dan Kabupaten Sleman Daerah Istimewa Yogyakarta) dan di kawasan
Taman Nasional Gunung Merbabu (Kabupaten Boyolali, Provinsi Jawa Tengah).
Proses isolasi, seleksi, karakterisasi dan identifikasi molekuler bakteri endofit
dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Lingkungan Indonesian Center for
Biodiversity and Biotechnology (ICBB) Bogor. Penelitian ini dilaksanakan dari
Agustus 2014 - Oktober 2015.

Bahan dan Alat
Obyek penelitian berupa bagian akar, batang dan daun A. decurrens . Bahan
yang digunakan untuk isolasi, seleksi, karakterisasi dan identifikasi molekuler
adalah Nutrient agar (NA), Nutrient broth (NB), alkohol 70%, NaOCl, larutan
fisiologis (NaCl 0,85%), aquadest, media Blood agar (yang mengandung 5%
darah domba (Zimbro et al. 2009), tembakau (Nicotiana tabacum), media
Pikovskaya, media Alexandrov, media NFB (nitrogen free broth) dan benih padi.
Alat yang digunakan pada umumnya untuk isolasi, seleksi, karakterisasi dan
identifikasi molekuler yaitu, mortar, tabung ulir, cawan petri, erlenmeyer, tabung
reaksi, vortex, shaker, pipet mikro, magnetic stirrer, mikroskop, laminar air flow
(LAF), autoclaf, inkubator, Gas Chromatography (GC), High Performance Liquid
Chromatography (HPLC), sentrifus, elektroforesis, mesin Polymerase Chain
Reaction (PCR).

Isolasi Bakteri Endofit dari Tanaman Acacia decurrens
Pengambilan Sampel
Sumber bakteri endofit diisolasi dari jaringan pada akar, batang dan daun
tanaman A. decurrens. Sampel jaringan tanaman yang telah diperoleh dimasukkan
ke dalam plastik sampel kemudian disimpan dengan suhu sekitar 4 0C hingga
tahapan isolasi dilakukan (Strobel dan Daisy 2003).
Isolasi dan Purifikasi Bakteri Endofit
Isolasi bakteri endofit dari jaringan tanaman diawali dengan proses
sterilisasi permukaan. Metode sterilisasi permukaan mengikuti sebagaimana yang
dikemukakan Hallmann et al. (2006) yang telah dimodifikasi.
Sampel jaringan tanaman A. decurrens pertama-tama dicuci dengan air
mengalir sampai bersih, kemudian dikering anginkan dan ditimbang sebanyak 1
gram. Contoh kemudian disterilisasi dengan cara dibilas dengan air steril
sebanyak 2 kali. Selanjutnya sampel direndam selama 6 menit dalam alkohol 70%
dan dilanjutkan dengan perendaman kedalam natrium hipoklorit (NaOCl) 3%

4

selama 3 menit untuk daun dan 4 menit untuk akar dan batang. Setelah itu sampel
dibilas kembali dengan air steril sebanyak 3 kali. Untuk mengetahui keberhasilan
dari proses sterilisasi permukaan, sampel disapukan ke permukaan media Nutrient
Agar (NA) 10%. Indikator keberhasilan yang diamati yaitu dengan tidak adanya
mikrob yang tumbuh pada media yang telah disapukan sampel tersebut.
Setelah proses sterilisasi permukaan, 1 gram sampel kemudian digerus
hingga halus dan dilarutkan kedalam 9 ml larutan NaCl fisiologis, kemudian
dilakukan seri pengenceran hingga 10 -4. Masing-masing dari seri pengenceran
ditumbuhkan pada media NA 10% kemudian isolat bakteri dimurnikan pada
media NA 100%.

Seleksi Isolat Bakteri Endofit
Uji Hemolisis
Pengujian ini bertujuan untuk membedakan bakteri endofit yang diisolasi
dari jaringan tanaman A. decurrens berdasarkan kemampuan melisiskan sel darah
merah. Isolat bakteri endofit ditumbuhkan pada media agar darah dan diinkubasi
pada suhu 35 ± 20C selama 18-24 jam. Adanya zona bening disekitar koloni
mengindikasikan bahwa isolat tersebut berpotensi patogen terhadap manusia dan
hewan (Zimbro et al. 2009).
Uji Respon Hipersensitif
Pengujian ini bertujuan untuk mengetahui sifat patogenitas isolat bakteri
endofit terhadap tanaman. Isolat bakteri endofit yang telah ditumbuhkan pada
media NB kemudian diinfiltrasikan pada sisi absial daun tanaman tembakau yang
berumur sekitar 2 bulan. Pengamatan yang dilakukan berupa respon dari daun
tembakau yang telah disuntikkan isolat bakteri endofit setelah 48 jam. Respon
yang diperlihatkan dari daun tembakau berupa reaksi nekrosis pada sekitar daun
yang berarti isolat tersebut berpotensi patogen terhadap tanaman (Schaad et al.
2001).
Uji Daya Kecambah dan Daya Tumbuh
Pengujian isolat bakteri endofit terhadap daya kecambah dan daya tumbuh
bertujuan untuk melihat pengaruh bakteri endofit dalam mendukung daya
kecambah dan daya tumbuh benih padi. Varietas benih padi yang digunakan yaitu
varietas Ciherang. Benih padi steril direndam selama kurang lebih 24 jam
kedalam suspensi isolat bakteri endofit yang telah ditumbuhkan pada media cair
selama 24 jam. Sebagai kontrol benih direndam dengan air steril tanpa inokulan.
Benih padi yang telah direndam kemudian diletakkan pada cawan petri yang telah
dilapisi dengan kertas saring, jumlah benih pada setiap cawan petri yaitu 20 dan
diulang sebanyak 3 kali. Pengamatan daya kecambah dilakukan pada hari ke 2 dan
pertumbuhan setelah 7 hari inkubasi. Parameter yang diamati yaitu panjang akar,
panjang pucuk, berat segar dan berat kering bibit padi.
Seleksi dilakukan dengan menggunakan metode skoring seperti yang telah
dilakukan Hidayati (2014). Skor diperoleh dari nilai parameter pengamatan yang
telah dibandingkan dengan kontrol dikali dengan persen bobot nilai tiap
parameter. Bobot nilai panjang akar dan panjang pucuk 15%, bobot nilai berat

5

segar 20% dan bobot kering 30%. Masing-masing nilai dari parameter dikalikan
dengan bobot masing-masing. Selanjutnya hasil perkalian dari 4 parameter
tersebut dijumlahkan. 10 isolat terbaik dipilih untuk diuji lebih lanjut.

Karakterisasi Bakteri Endofit
Uji Kemampuan Menambat N2
Uji kemampuan bakteri endofit dalam menambat N2 secara kualitatif
dilakukan dengan cara menumbuhkan isolat bakteri endofit pada media Nitrogen
Free Broth (NFB). Sebanyak 100 µl suspensi isolat dimasukkan kedalam tabung
reaksi yang berisi media NFB dan di inkubasi selama 5-7 hari. Indicator yang
diamati yaitu pelikel putih yang terbentuk dibawah permukaan media.
Uji kemampuan bakteri endofit dalam menambat N2 secara kulaitatif
diamati secara tidak langsung melalui reduksi astilen menjadi etilen menggunakan
Gas Chromatoghraphy (GC) (Gothwal et al. 2007). Isolat ditumbuhkan pada
media cair Nitrogen free broth dan diinkubasi pada mesin pengocok selama 24
jam dengan kecepatan rotasi 180 rpm pada suhu ruang. Kemudian 20 ml suspensi
isolat dimasukkan ke dalam tabung inkubasi berkapasitas 30 ml. sebanyak 10%
udara dari volume tabung inkubasi dikeluarkan menggunakan alat suntik steril
kemudian disubtitusi dengan gas asetilen sebanyak volume yang diambil dan
diinkubasi selama 2 jam. Jumlah dari gas etilen hasil reduksi dari asetilen oleh
bakteri digunakan untuk mengukur kemampuan bakteri endofit dalam menambat
N2.
Uji Kemampuan Melarutkan Fosfat
Isolat bakteri endofit yang berumur 24 jam diinokulasikan pada permukaan
media pikovskaya padat (Subba-Rao 1982) dan diinkubasi selama 3-6 hari pada
suhu 350C. Indikator yang diamati yaitu terbentuknya zona bening disekitar
koloni yang berarti isolat tersebut mampu melarutkan fosfat (Saraswati et al.
2007).
Uji Kemampuan Melarutkan Kalium
Isolat bakteri endofit yang berumur 24 jam diinokulasikan pada permukaan
media Alexandrof (Hu et al. 2006) padat dan diinkubasi selama 3-6 hari pada
suhu 350C. Indikator yang diamati yaitu terbentuknya zona bening disekitar
koloni yang berarti isolat tersebut mampu melarutkan kalium.
Uji Kemampuan Menghasilkan Hormon Tumbuh Indol-3-Acetat Acid (IAA)
Pengujian 10 isolat bakteri endofit dilakukan dengan menggunakan metode
high-performance liquid chromatography (HPLC; Frankenberger dan Poth 1987)
yang telah dimodifikasi. Sebanyak 20 ml kultur cair isolat bakteri endofit yang
berumur 24 jam pada media NB ditambahkan dengan methanol 20 ml dan
diinkubasi pada inkubator bergoyang selama 24 jam. Supernatant dievaporasi
pada suhu 350C. Ekstrak ditambah dengan HCL 2 M hingga pH 2,5 dan
diekstraksi sebanyak 3 kali dengan etil asetat pada volume yang sama. Ekstrak
kemudian disaring dan diinjek ke HPLC detector UV/Vis dengan panjang
gelombang 265 nm.

6

Uji Antagonis Bakteri Endofit terhadap Mikrob Pathogen Tanaman
Uji antagonis isolat bakteri endofit diuji pada mikrob patogen yaitu
Xantomonas oryzae pv. oryzae dan Rhizoctonia solani. X. oryzae merupakan
salah satu jenis bakteri Gram-negatif yang menyebabkan penyakit hawar daun
pada padi (Furutani 2009) dan Rhizoctonia solani merupakan cendawan penyebab
hawar pelepah pada padi (Neeraja et al. 2002).
Kultur cair X. oryzae disapukan secara merata kepermukaan media NA dan
diikuti dengan meletakkan kertas cakram yang telah dicelupkan kedalam kultur
cair bakteri endofit ke permukaan media yang telah disapukan X. oryzae
sebelumnya. Uji antagonisme bakteri endofit terhadap cendawan pathogen berupa
R. solani dilakukan pada media Potato Dextrose Agar (PDA). Isolat bakteri
endofit ditumbuhkan selama 48 jam lebih awal dari cendawan patogen. Pengujian
tersebut menggunakan metode dual culture seperti yang telah dilakukan
sebelumnya oleh Kim et al. (2008). Indikator bahwa bakteri endofit positif
menghambat pertumbuhan isolat patogen yaitu dengan terbentuknya zona bening
di sekitar koloni setelah masa inkubasi selama 24-48 jam untuk bakteri dan 120
jam untuk cendawan.

Uji Efektifitas 10 Isolat Bakteri Endofit dalam Memacu Pertumbuhan
Vegetatif Tanaman Padi
Percobaan ini menggunakan 10 isolat bakteri endofit hasil seleksi dari uji
daya kecambah. Percobaan ini terdiri dari 12 perlakuan yang terdiri dari 10 isolat
bakteri endofit (ditambah 1/2 dosis anjuran pupuk NPK) dan 2 kontrol (1/2 dan 1
dosis anjuran pupuk NPK). Percobaan menggunakan rancangan acak lengkap.
Model linear yang digunakan adalah Y ij = μ + τi + εij. Yij Pengamatan pada
perlakuan ke-i dan ulangan ke-j, μ adalah rataan umum, τi adalah pengaruh
perlakuan ke-i dan εij adalah pengaruh acak pada perlakuan ke-i, ulangan ke-j.
percobaan ini dilakukan hingga tanaman berumur 37 hari (4 minggu setelah tanam
= MST). Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 5 kali sehingga diperoleh 60
satuan percobaan.
Parameter pertumbuhan yang diamati yaitu jumlah daun (seluruh daun yang
muncul dihitung), tinggi tanaman (diukur dari tanah hingga daun terpanjang),
jumlah anakan, bobot basah dan bobot kering tanaman. Pengaruh perlakuan
terhadap peubah-peubah yang diamati dilakukan dengan menggunakan analisis
sidik ragam, dan apabila ada beda nyata diuji lanjut dengan Duncan’s Multiple
Range Test (DMRT) pada taraf kepercayaan 5%.
Percobaan ini menggunakan benih padi varietas Ciherang, benih padi
direndam dengan menggunakan aquades selama 24 jam. Setelah perendaman,
benih kemudian disemai pada media pembibitan hingga berumur 10 hari dan bibit
siap tanam. Bibit padi ditanam pada 1 kg tanah di dalam pot plastik. Inokulasi 10
isolat bakteri endofit ketanaman padi dengan cara disemprotkan dengan
kepadatan populasi 108 spk ml-1 sebanyak 5 ml/tanaman dan diaplikasikan 1
minggu sekali hingga tanaman berumur 1 bulan. Penentuan jumlah populasi
berdasarkan kurva standard dan grafik pertumbuhan (Lampiran 1) masing-masing

7

isolat. Waktu aplikasi pemberian pupuk N, P dan K berdasarkan anjuran
pemupukan tanaman padi.
Identifikasi Bakteri Endofit
Identifikasi Molekuler
Identifikasi molekuler bakteri endofit dilakukan berdasarkan sekuen parsial
16S rRNA. Metode isolasi DNA mengacu pada publikasi Atashpaz et al. (2010)
yang telah dimodifikasi.
Kultur bakteri yang telah ditumbuhkan pada media cair selama 12 jam
dimasukkan sebanyak 1,5 ml kedalam mikro tube 3 ml kemudian disentrigusai
pada 5600 xg dengan suhu 40C selama 5 menit. Hasil berupa supernatant di buang
dan dimasukkan kembali sebanyak 1,5 ml kedalam tabung yang sama dan
disentrifugasi hingga terbentuk pelet seberat 50-100 mg. Pelet yang diperoleh
diresuspensi dengan larutan buffer lisis yang telah dihangatkan pada suhu 65 0C
sebanyak 800 µ l. Sampel kemudian di inkubasi pada suhu 650C selama 30 menit
(untuk Gram negatif) atau 2 jam (untuk Gram positif) dengan sambil dibolak-balik
setiap 10 menit. Setelah di inkubasi, sampel disentrifugasi pada suhu 4 0C selama 5
menit. Supernatant hasil sentrifugasi kemudian dipindahkan kedalam mikro tube
yang baru dan ditambahkan kloroform-isoamilalkohol (24:1 v/v) dengan volume
yang sama. Sampel kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 8064 xg pada suhu
40C selama 10 menit. Hasil sentrifugasi berupa 2 lapisan pada sampel dan lapisan
diatas dipindahkan ke tabung mikro dan ditambhkan isopropanol secara perlahan
demi mencegah terjadinya fragmentasi DNA. Sampel kemudian di inkubasi pada
suhu -200C selama 30 menit kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10976 xg
pada suhu 40C selama 10 menit. Supernatant hasil sentrifugasi dibuang dan pelet
ditambahkan etanol 96% kemudian disentrifugasi pada kecepatan 8064 xg selama
5 menit. Setelah 5 menit, supernatant dibuang dan ditambahkan etanol 70%
kedalam pelet dan disentrifugasi pada kecepatan, suhu dan waktu yang sama.
Penambahan etanol 96% dan 70% disebut dengan tahap pencucian yang hasilnya
berupa pelet. Pelet kemudian dikering anginkan dan ditambahkan air bebas
nuclease sebanyak 50 µl.
Hasil preparasi sampel DNA kemudian diamplifikasi. Amplifikasi gen 16S
rRNA menggunakan mesin Polymerase Chain Reaction (PCR, dice mini
TAKARA). Primer forward dan reverse yang digunakan yaitu 16F27 (5’-AGA
GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’) dan R1492 (5’-TAC GGY TAC CTT GTT
ACG ACTT-3’) (Santosa 2001). PCR master mix disiapkan dalam volume akhir
25 µ l yang mengandung 1,25 µl primer F konsentrasi 10 µM, 1,25 µl primer R
konsentrasi 10 µM , 1 µ l ekstrak DNA, 12,5 µl reagen 2x Kappa G dan air bebas
nuclease sampai volume akhir tercapai. Program PCR mencakup 30 siklus yang
terdiri denaturasi pada suhu 95oC selama 30 detik, annealing pada suhu 48oC
selama 30 detik dan extension pada suhu 72oC selama 2 menit. Siklus tersebut
didahului oleh pra-denaturasi pada suhu 95oC selama 3 menit dan diakhiri dengan
final extension pada suhu 72oC selama 15 menit. Polimerisasi dilakukan pada
suhu 700C selama 2 menit, lalu pada siklus terakhir waktu polimerisasi
diperpanjang menjadi 15 menit.
Hasil PCR divisualisasi menggunakan elektroforesis gel agarosa 1% dalam
1x buffer TAE. Hasil dari PCR kemudian di sekuensing menggunakan AB1
PRISM 3730xl DNA Analyzer. Hasil sekuensing dicocokkan dengan data pada

8

database EMBL (European Molecular Biology Laboratory) pada situs
http://www.ebi.ac.uk.. Hasil sekuensing didepositkan di EMBL Nucleotide
Sequence Database. Analisis filogeni bakteri endofit menggunakan perangkat
lunak The Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) versi 6.0 (Tamura
et al. 2013).
Karakterisasi Morfologi dan Biokimia
Karakterisasi morfologi dan biokimia bakteri meliputi pengamatan
morfologi koloni dan morfologi sel bakteri, pewarnaan Gram dan uji biokimia
bakteri endofit. Parameter pengamatan morfologi koloni mencakup warna, bentuk
koloni, elevasi (kenampakan dari samping), bentuk pinggiran dan tekstur
permukaan. Morfologi Sel bakteri meliputi bentuk sel, ukuran sel serta pewarnaan
Gram. Uji biokimia bakteri endofit meliputi uji motilitas, uji KOH, uji katalase,
uji oksidase, uji fermentasi karbohidrat (glukosa, innositol, xylose, sorbitol,
mannitol, cellubios), dan uji urease berdasarkan Mac Faddin (1979).

9

HASIL DAN PEMBAHASAN

Lokasi Pengambilan Sampel
Lokasi pengambilan sampel terletak di kawasan taman nasional gunung
Merapi dan Merbabu. Lokasi pertama yaitu di kawasan Taman Nasional Gunung
Merapi daerah Selo, titik koordinat lokasi S 07 031’22.5” E 110027’05.07” dengan
ketinggian 2111 mdpl. Lokasi kedua yaitu pada kawasan Taman Nasional Gunung
Merbabu daerah Selo dengan titik koordinat S 07028’44.0” E 110027’35.4”
dengan ketinggian 1975 mdpl. Lokasi ketiga yaitu pada Kawasan Taman Nasional
Gunung Merapi daerah Cangkringan dengan titik koordinat S 07034,843” E
110026,586” dengan ketinggian 1140 mdpl (Gambar 1).

Gambar 1 lokasi pengambilan contoh

Gambar 2 Lokasi pengambilan sampel di 3 lokasi, (a) kawasan TNG merapi
daerah selo, (b) kawasan TNG merbabu, dan (c) kawasan TNG
merapi daerah cangkringan.

10

Kondisi lokasi pengambilan sampel seperti yang terlihat pada Gambar 2.
Pertumbuhan tanaman A. decurrens tampak lebih padat di daerah Cangkringan
dibandingkan dengan 2 lokasi lainnya. Selain itu, perbedaan lain dari ketiga lokasi
pengambilan sampel tersebut yaitu ukuran pohon dan umur tanaman A. decurrens.
A. decurrens yang tumbuh dilokasi Selo relatif lebih tua terlihat dari pohon yang
lebih besar dan tampak berbunga. Sedangkan di Cangkringan tampak sebagian
besar akasia yang tumbuh di lokasi tersebut masih muda.

Hasil Isolasi Bakteri Endofit pada Tanaman Acacia decurrens
Sejauh ini, telah banyak penelitian yang melaporkan tentang keberadaan
bakteri endofit dari berbagai jenis tanaman (Mocali et al. 2003; Gao et al. 2015).
Kebanyakan bakteri endofit berasal dari rizosfer dan filosfer (Ryan et al. 2008).
Pada penelitian ini, sebanyak 48 isolat bakteri endofit (24 dari akar, 10 dari
batang, 11 dari daun) berhasil diisolasi dari jaringan tanaman A. decurrens yang
tumbuh pada kawasan taman nasional gunung Merapi dan Merbabu. Ciri
morfologi koloni isolat-isolat tersebut disajikan pada Lampiran 2. Isolat-isolat
tersebut merupakan hasil seleksi berdasarkan penampakan warna dan bentuk
koloni yang berbeda. Penelitian ini merupakan penelitian pertama yang
melaporkan tentang keberadaan bakteri endofit pada tanaman A. decurrens
khususnya yang tumbuh pada kawasan taman nasional gunung Merapi dan
Merbabu.
Tabel 1

Jumlah dan keragaman bakteri endofit yang diisolasi dari tanaman
Acacia decurrens

Lokasi pengambilan sampel
Merbabu
Merapi (Cangkringan)
Merapi (Selo)
Jaringan
Jumlah
Jumlah
Jumlah
tanaman
populasi Keragaman populasi Keragaman
Keragaman
populasi
-1
-1
-1
(CFU ml )
(CFU ml )
(CFU ml )
Akar
105
10
104
5
105
9
2
3
2
Batang
10
3
10
4
10
3
3
4
2
Daun
10
6
10
5
10
3
Total
19
14
15
Tabel 1 menunjukkan sebaran bakteri endofit yang diisolasi dari tanaman A.
decurrens dari tiga lokasi yang berbeda. Lokasi eksplorasi serta bagian jaringan
tanaman yang diisolasi mempengaruhi jumlah isolat bakteri endofit yang ada.
Jumlah isolat bakteri endofit dari jaringan akar lebih banyak dibandingkan
jaringan lainnya. Diduga karena hasil adaptasi antara akar tanaman dengan bakteri
tanah khususnya daerah rizosfer yang kemudian masuk dan mengkolonisasi
jaringan pada akar tanaman tersebut. Selain itu, sejarah keberadaan suatu tanaman
akan mempengaruhi tingkat adaptasi bakteri lokal terhadap tanaman tersebut.
Bakteri endofit pada batang dan daun lebih sedikit dibanding akar. Hal tersebut
diduga dipengaruhi oleh keberadaan bakteri di udara lingkungan sekitar (Sundin
dan Jacobs 1999).

11

Seleksi Isolat Bakteri Endofit
Uji Hemolisis
Hasil uji hemolisis 48 bakteri endofit disajikan pada Tabel 2. Pada
pengujian ini, reaksi hemolisis dapat diamati setelah ± 17 jam masa inkubasi yaitu
melaui zona bening yang terbentuk disekitar koloni (Gambar 3). Diantara 48 isolat
bakteri endofit terdapat 13 isolat yang menunjukkan reaksi hemolisis bertipe beta
(β) pada media agar darah dengan zona bening yang terbentuk di sekitar koloni
pada ± 17 jam masa inkubasi, dan 35 dengan hasil negatif atau tidak berpotensi
pathogen terhadap hewan dan manusia (Tabel 2). Menurut Zimbro et al. (2009),
terdapat 4 tipe hemolisis pada pengujian menggunakan media agar darah, alpha
(α)-hemolysis yaitu media disekitar koloni berwarna kehijau-hijauan akibat
reduksi hemoglobin menjadi met-hemoglobin, beta ( )-hemolysis yaitu sel darah
merah lisis menghasilkan zona bening disekitar koloni, gamma ( )-hemolysis
berarti tidak ada hemolisis dikarenakan tidak adanya kerusakan sel darah merah
dan perubahan pada media, dan alpha-prime (ά)-hemolysis yaitu suatu zona kecil
dari hemolisis sempurna yang dikelilingi oleh sebagian area lisis.

b
a

Gambar 3 Hasil uji hemolisis dengan media agar darah setelah 17 jam masa
inkubasi, a) reaksi positif ditandai dengan adanya zona bening
disekitar koloni, b) reaksi negatif
Tabel 2 Uji hemolisis dan hipersensitif isolat bakteri endofit
Kode
isolat
Aa1
Aa2
Aa3
Aa4
Aa5
Aa6
Aa7
Aa8
Aa9
Ab1

Sumber isolat
Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merapi
Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merapi
Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merapi
Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merapi
Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merapi
Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merapi
Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merapi
Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merapi
Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merapi
Batang A. decurrens asal Selo KTNG Merapi

Simbol: + (patogen), – (tidak patogen); td (tidak diuji)

Uji
hemolisis
+
+
+

Uji
hipersensitif
td
td
+
td

12

Lanjutan Tabel 2
Kode
isolat
Ab2
Ab3
Ad1
Ad2
Ad3
Ba1
Ba2
Ba3
Ba4
Ba5
Bb1
Bb2
Bb3
Bb4
Bd1
Bd2
Bd3
Bd4
Bd5
Ca1
Ca2
Ca3
Ca4
Ca5
Ca6
Ca7
Ca8
Ca9
Ca10
Cb1
Cb2
Cb3
Cd1
Cd2
Cd3
Cd4
Cd5
Cd6

Sumber isolat
Batang A. decurrens asal Selo KTNG Merapi
Batang A. decurrens asal Selo KTNG Merapi
Daun A. decurrens asal Selo KTNG Merapi
Daun A. decurrens asal Selo KTNG Merapi
Daun A. decurrens asal Selo KTNG Merapi
Akar A. decurrens asal Cangkringan KTNG Merapi
Akar A. decurrens asal Cangkringan KTNG Merapi
Akar A. decurrens asal Cangkringan KTNG Merapi
Akar A. decurrens asal cangkringan KTNG Merapi
Akar A. decurrens asal Cangkringan KTNG Merapi
Batang A. decurrens asal Cangkringan KTNG Merapi
Batang A. decurrens asal Cangkringan KTNG Merapi
Batang A. decurrens asal Cangkringan KTNG Merapi
Batang A. decurrens asal Cangkringan KTNG Merapi
Daun A. decurrens asal Cangkringan KTNG Merapi
Daun A. decurrens asal Cangkringan KTNG Merapi
Daun A. decurrens asal Cangkringan KTNG Merapi
Daun A. decurrens asal Cangkringan KTNG Merapi
Daun A. decurrens asal Cangkringan KTNG Merapi
Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu
Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu
Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu
Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu
Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu
Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu
Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu
Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu
Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu
Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu
Batang A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu
Batang A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu
Batang A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu
Daun A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu
Daun A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu
Daun A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu
Daun A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu
Daun A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu
Daun A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu

Uji
hemolisis
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-

Uji
hipersensitif
td
td
td
td
td
td
td
+
td
td
td
+
-

Simbol: + (patogen), – (tidak patogen); td (tidak diuji)

Uji Respon Hipersensitif
Hasil uji respon hipersensitif terhadap 35 bakteri endofit yaitu 32 yang
menunjukkan hasil negatif yang berarti tidak berpotensi patogen terhadap tanaman
dan 3 bakteri yang menunjukkan hasil positif atau berpotensi menyebabkan

13

penyakit pada tanaman (Tabel 2). Respon hipersensitif yang ditunjukkan dengan
reaksi nekrosis merupakan bentuk pertahanan yang ditunjukkan tanaman dari
serangan pathogen (Hammond-Kosack dan Jones 1996). 32 bakteri endofit
dengan hasil negatif setelah 48 jam pengamatan, tidak menunjukkan gejala seperti
bercak kuning (Gambar 4) ataupun mengering seperti 3 isolat dengan hasil positif.

Reaksi
positif

Gambar 4 Hasil uji respon hipersensitif terhadap isolat bakteri endofit pada daun
tembakau. Contoh reaksi positif yang ditunjukkan oleh isolat Aa8
setelah masa inkubasi 48 jam
Uji Daya Kecambah dan Daya Tumbuh
Pada pengamatan daya kecambah benih padi, rata-rata daya kecambah
benih padi yang diaplikasikan dengan 32 isolat berkisar 95-100%. Selain daya
kecambah, parameter yang diamati yaitu daya tumbuh benih padi meliputi
panjang akar, panjang pucuk, berat segar dan berat kering. Respon yang beragam
ditunjukkan benih padi pada pengamatan panjang akar, panjang pucuk, bobot
segar dan bobot kering (Tabel 3). Hal tersebut menunjukkan bahwa bakteri
endofit berpengaruh terhadap daya tumbuh benih padi dengan kemampuan dalam
memacu pertumbuhan yang berbeda-beda.
Berdasarkan seluruh parameter pengamatan (Tabel 3), tidak semua
perlakuan pemberian isolat bakteri endofit menunjukkan reaksi positif atau lebih
baik dari kontrol. Beberapa isolat bahkan ada yang bereaksi negatif atau tidak
lebih baik dari kontrol. Hasil tersebut menunjukkan bahwa tidak semua bakteri
endofit yang diisolasi dari tanaman yang memiliki kemampuan tumbuh cepat
memiliki potensi pemacu pertumbuhan tanaman. Kemampuan bakteri endofit
berbeda-beda, ada yang berpotensi sebagai pemacu pertumbuhan (Feng et al.
2006) agen biokontrol (Duan et al. 2013), hingga pada pemanfaatan potensi
bakteri endofit dalam mendegradasi polutan organik (Afzal et al. 2014).
Isolat Ca1 menunjukkan nilai persentasi peningkatan pertumbuhan benih
padi terbaik dari yang lainnya. Reaksi positif tersebut berbanding terbalik dengan
hasil yang ditunjukkan isolat Bd5. Respon negatif dengan nilai persentasi
perbandingan lebih rendah dibanding kontrol juga bisa diartikan bahwa isolat Bd5
menghambat pertumbuhan benih padi. Pada parameter panjang akar, isolat Aa2
memilik persentasi panjang akar 55,7% di atas kontrol. Sebaliknya pada
parameter panjang pucuk perlakuan pemberian isolat Aa2 hanya mampu
meningkatkan 0,23% di atas kontrol.

14

Tabel 3 Rata-rata panjang akar, panjang pucuk, bobot basah dan bobot kering
serta hasil skoring pertumbuhan padi setelah 7 hari masa inkubasi
dibanding kontrol (%)
Kode
Isolat
Ca1
Aa2
Ba3
Ba2
Ad1
Ca9
Bb4
Bd3
Ba1
Ad2
Aa3
Cb1
Cd4
Ad3
Bd2
Ca4
Cd5
Cd3
Bb3
Aa6
Ba4
Aa5
Cb2
Ca5
Aa1
Cd1
Ca7
Bd1
Ca10
Ca3
Aa9
Bd5

Panjang
Akar
12.48
55.70
7.31
3.82
39.25
9.36
21.71
4.84
12.26
15.31
40.26
37.13
31.27
7.85
-10.46
-8.79
-16.31
-25.96
-1.57
25.57
-32.28
-2.28
-3.09
-19.86
-9.45
-29.93
-24.26
-22.16
-48.37
-47.38
-51.29
-65.35

Skor
(15%)
1.87
8.36
1.10
0.57
5.89
1.40
3.26
0.73
1.84
2.30
6.04
5.57
4.69
1.18
-1.57
-1.32
-2.45
-3.89
-0.24
3.84
-4.84
-0.34
-0.46
-2.98
-1.42
-4.49
-3.64
-3.32
-7.26
-7.11
-7.69
-9.80

Panjang
Pucuk
40.94
0.23
5.65
13.71
4.43
25.73
5.78
10.62
7.53
11.09
4.08
-6.18
-4.43
5.60
10.22
18.71
19.74
19.15
0.13
-9.10
6.45
-3.38
-10.27
17.84
-13.54
8.48
8.04
2.02
-3.65
-2.92
-18.95
-20.70

Skor
(15%)
6.14
0.04
0.85
2.06
0.67
3.86
0.87
1.59
1.13
1.66
0.61
-0.93
-0.67
0.84
1.53
2.81
2.96
2.87
0.02
-1.37
0.97
-0.51
-1.54
2.68
-2.03
1.27
1.21
0.30
-0.55
-0.44
-2.84
-3.10

Bobot
Segar
39.92
40.16
47.94
46.66
35.13
35.45
31.66
33.97
28.24
23.72
14.73
26.15
26.15
26.79
32.27
23.91
25.26
22.21
23.99
19.37
25.86
22.02
22.75
13.84
22.16
10.21
14.53
9.68
7.95
7.52
0.42
-15.22

Skor
(20 %)
7.98
8.03
9.59
9.33
7.03
7.09
6.33
6.79
5.65
4.74
2.95
5.23
5.23
5.36
6.45
4.78
5.05
4.44
4.80
3.87
5.17
4.40
4.55
2.77
4.43
2.04
2.91
1.94
1.59
1.50
0.08
-3.04

Bobot
Kering
5.97
0.67
6.72
5.73
4.09
5.67
2.28
1.62
6.62
5.89
4.73
-4.67
-3.51
2.01
-0.44
4.16
5.05
7.34
0.13
-4.82
3.17
-3.81
-2.32
1.67
-2.62
8.75
-0.03
2.44
8.36
6.72
5.73
1.27

Skor
(30%)
1.79
0.20
2.01
1.72
1.23
1.70
0.68
0.48
1.99
1.77
1.42
-1.40
-1.05
0.60
-0.13
1.25
1.51
2.20
0.04
-1.45
0.95
-1.14
-0.70
0.50
-0.79
2.63
-0.01
0.73
2.51
2.02
1.72
0.38

Total
Skor
25.77
24.65
23.13
23.01
21.83
21.15
17.47
16.39
16.25
15.21
13.96
13.70
13.43
13.34
12.74
12.30
12.13
10.07
9.42
8.77
7.42
6.81
6.40
5.74
4.63
3.49
3.37
1.58
-2.11
-2.52
-8.65
-18.62

Angka positif menunjukkan lebih tinggi dibanding kontrol, 0 sama dengan kontrol ,dan minus (-)
lebih rendah dari kontrol.

Respon yang berbeda-beda ditunjukkan pada masing-masing parameter
pengamatan. Respon positif benih padi yang telah diberi isolat bakteri endofit
menunjukkan kemampuan bakteri endofit tersebut dalam memacu pertumbuhan
benih padi. Hasil serupa dilaporkan pada penelitan sebelumnya dimana aplikasi
perlakuan bakteri endofit mampu meningkatkan pertumbuhan benih cardon cactus
(Pachycereus pringlei) (Puente et al. 2009). Bakteri endofit juga dilaporkan

15

mampu memacu pertumbuhan bibit batang bawah tanaman karet (Hidayati 2014)
dan meningkatkan pertumbuhan sambiloto (Gusmaini 2014). Berdasarkan hasil
uji daya kecambah dan daya tumbuh benih padi, dipilih 10 isolat terbaik untuk
diuji lebih lanjut. Sepuluh isolat tersebut yaitu: Ca1, Aa2, Ba3, Ba2, Ad1, Ca9,
Bb4,Bd3, Ba1 dan Ad2. Kesepuluh isolat tersebut merupakan isolat-isolat yang
memiliki total skor tertinggi dengan hasil lebih baik dari kontrol.

Karakterisasi Isolat Bakteri Endofit
Kemampuan Menambat N2, Melarutkan Fosfat, Kalium dan Menghambat
Pertumbuhan Mikrob Patogen
Berbagai jenis bakteri endofit penambat N2 dari bermacam-macam tanaman
telah diteliti (Wang et al. 2006; Terakado-Tonooka et al. 2008) dan beberapa
metode yang umum digunakan seperti menumbuhkan pada media bebas N
(Baldani et al. 1992), mengukur aktifitas nitrogenase dengan menghitung
produksi gas C2H4 (Mollica et al. 1985; Zayed 2012) dan mendeteksi keberadaan
gen nif (Bürgmann et al. 2004; Zhang et al. 2007). Pada penelitian ini, 10 isolat
bakteri endofit yang diisolasi dari akar, batang dan daun A. decurrens
menunjukkan hasil positif baik secara kualitatif (menumbuhkan pada media bebas
N) maupun kuantitaif (aktifitas nitrogenase) dalam menambat N2 (Tabel 4).
Tabel 4 Kemampuan menambat N2, melarutkan fosfat, melarutkan kalium dan
menghambat pertumbuhan mikrob patogen
Kode
isolat
Ca1
Aa2
Ba3
Ba2
Ad1
Ca9
Bb4
Bd3
Ba1
Ad2

Menambat N2
ARA (µ mol
C2H4/µL/jam)

Media
NFB

0.222
0.141
0.394
0.258
0.241
0.252
0.338
1.168
0.566
0.145

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

Pelarut
fosfat

Pelarut
kalium

+
+
+
+
+
+

-

Antagonis terhadap
X. oryzae

R. solani

+
-

+
-

Simbol: + ( mampu), - (tidak mampu); ARA: acetylene reduction assay, NFB: nitrogen free broth

Kemampuan bakteri endofit dalam menambat N2 secara kualitatif dapat
dilihat pada Gambar 5. Keseluruhan isolat mampu tumbuh dan membentuk
pelikel putih dibawah permukaan media NFB semi padat setelah 5 hari masa
inkubasi. Karakteristik tersebut umumnya ditunjukkan oleh bakteri penambat N 2
dari kelompok Spirillum spp. (Muthukumarasamy et al. 2007). Hasil positif juga
ditunjukkan pada uji kemampuan bakteri endofit dalam menambat N2 secara
kuantitatif. Keseluruhan isolat positif dalam mereduksi acetilen berkisar dari

16

0.141 hingga 1.168 µmol C2H4/µL/jam. Acetylene reduction assay (ARA)
merupakan metode pengujian secara tidak langsung untuk mengetahui aktivitas
enzim nitrogenase dalam mereduksi acetilen menjadi gas etilen yang dapat
dihitung menggunakan gas chromatography (Doty et al. 2009). Semakin tinggi
produksi gas etilen berbanding lurus dengan aktivitas nitrogenase dan semakin
tinggi pula aktivitas penambatan N2.

Pelikel putih

Gambar 5

Kemampuan bakteri endofit dalam menambat N2 secara kualitatif
terlihat dengan terbentuknya pelikel putih di bawah permukaan
media NFB pada 10 isolat uji

Sepuluh isolat tersebut secara tidak langsung mewakili jaringan akar, batang
dan daun tanaman A. decurrens. Hasil dengan kemampuan terbaik ditunjukkan
pada isolat Bd3. Isolat tersebut merupakan salah satu isolat yang diisolasi dari
daun tanaman A. decurrens. Daun yang mendapatkan paparan langsung dari udara
diduga memberi kemungkinan bagi bakteri dari jaringan tersebut menambat N2
dengan optimal.
Pada uji kemampuan melarutkan fosfat, 6 diantara 10 isolat uji mampu
melarutkan tricalcium phosphate (Ca3(PO4)2) yang merupakan sumber P dalam
media Pikovskaya (Tabel 4). Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya zona
bening di sekitar koloni (Gambar 6). Kemampuan mikroorganisme dalam
melarutkan fosfat tergantung dari aktifitas biokimianya terutama dalam
memproduksi dan melepaskan asam-asam organik yang kemudian mengkelat
kation terikat dan mengkonversi fosfat kedalam bentuk terlarut (Kpomblekou-a
dan Tabatabai 1994). Hasil tersebut mengungkapkan bahwa beberapa bakteri
endofit yang diisolasi dari jaringan tanaman A. decurrens mampu menambat N2,
beberapa juga mampu melarutkan fosfat. Beberapa penelitian sebelumnya
mengungkapkan bahwa tidak jarang suatu mikroorganisme mampu mensekresikan
beberapa hasil metabolit yang bermanfaat bagi tanaman seperti IAA, fosfat dan
siderofor oleh Enterobacter asburiae strain PS2 (Ahemad dan Khan 2010) dan
Pseudomonas fluorescens (Parani dan Saha 2012) dan fosfat