Identifikasi Karakter Aromatik berdasarkan PCR dan Organoleptik BC3F2 Ciherang x Mentikwangi
IDENTIFIKASI KARAKTER AROMATIK BERDASARKAN
PCR DAN ORGANOLEPTIK BC3F2
CIHERANG x MENTIKWANGI
HILDA NUR RIZKIANY
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Identifikasi Karakter
Aromatik berdasarkan PCR dan Organoleptik BC3F2 Ciherang x Mentikwangi
adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Penelitian ini
didanai oleh BB-Biogen atas nama Dr. Tri Joko Santoso, SP, MSi. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Oktober 2013
Hilda Nur Rizkiany
NIM G84090016
ABSTRAK
HILDA NUR RIZKIANY. Identifikasi Karakter Aromatik berdasarkan PCR dan
Organoleptik BC3F2 Ciherang x Mentikwangi. Dibimbing oleh DJAROT
SASONGKO HAMI SENO dan TRI JOKO SANTOSO.
Karakter aroma pada padi aromatik varietas asli Indonesia belum banyak
dilaporkan. Identifikasi karakter aroma pada padi varietas Mentikwangi dilakukan
dengan teknik PCR menggunakan primer Bradbury dan secara organoleptik
menggunakan KOH. Penggunaan kedua metode ini diharapkan dapat menyeleksi
tanaman padi hasil persilangan Ciherang x Mentikwangi galur BC3F2 menjadi
aromatik dan non-aromatik, sehingga diperoleh beberapa galur harapan baru
dengan latar belakang Ciherang yang membawa sifat aromatik. Hasil seleksi
tanaman padi menggunakan primer Bradbury, dari total 266 tanaman BC3F2 yang
diuji, diperoleh sebanyak 55 tanaman memiliki fragmen DNA berukuran sama
dengan tetua Mentikwangi yaitu 275 bp, sebanyak 34 tanaman memiliki fragmen
DNA berukuran sama dengan tetua Ciherang yaitu 355 bp, serta 177 tanaman
memiliki fragmen DNA heterozigot atau campuran keduanya yaitu 355 bp dan
275 bp. Hasil uji organoleptik dengan KOH tanaman yang membawa alel
homozigot resesif sebagian besar menunjukkan skor beraroma.
Kata kunci: Padi Mentikwangi, aromatik, badh2, Bradbury
ABSTRACT
HILDA NUR RIZKIANY. Identification of aromatic character by PCR and
organoleptic on paddy BC3F2 Ciherang x Mentikwangi. Supervised by DJAROT
SASONGKO HAMI SENO and TRI JOKO SANTOSO.
Aroma character of the original Indonesian aromatic rice varieties have not
been widely reported. Identification of aroma character in paddy Mentikwangi
will be done using PCR with primer Bradbury and organoleptic using KOH. Use
these methods are expected to select rice plants from crosses Ciherang x
Mentikwangi BC3F2 be aromatic and non-aromatic, in order to obtain some new
promising lines with background Ciherang carrying aromatic trait. Rice crop
selection results using primer Bradbury, of the total 266 BC3F2 plants were tested,
as many as 55 plants have the same sized DNA fragment with Mentikwangi about
257 bp, 34 plants have the same sized DNA fragments with Ciherang about 355
bp, and 177 plants had a heterozygous DNA fragments or a mixture of both about
355 bp and 257 bp. Organoleptic test results with 1.7% KOH homozygous
recessive allele showed most flavorful score.
Keywords: paddy Mentikwangi, aromatic, badh2, Bradbury
IDENTIFIKASI KARAKTER AROMATIK BERDASARKAN
PCR DAN ORGANOLEPTIK BC3F2
CIHERANG X MENTIKWANGI
HILDA NUR RIZKIANY
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi: Identifikasi Karakter Aromatik berdasarkan PCR dan Organoleptik
BC 3 F2 Ciherang x Mentikwangi
Nama
: Hilda Nur Rizkiany
: 084090016
NIM
Disetujui oleh
Dr Djarot Sasongko Hami Seno, MS
Pembimbing I
Tanggal Lulus:
U9 OCT 2011
Dr Tri loko Santoso, SP, MSi
Pembimbing II
Judul Skripsi : Identifikasi Karakter Aromatik berdasarkan PCR dan Organoleptik
BC3F2 Ciherang x Mentikwangi
Nama
: Hilda Nur Rizkiany
NIM
: G84090016
Disetujui oleh
Dr Djarot Sasongko Hami Seno, MS
Pembimbing I
Dr Tri Joko Santoso, SP, MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MApp, Sc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Bismillahirrahmanirrahim
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala nikmat dan
karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Karya
ilmiah yang berjudul “Identifikasi Karakter Aromatik berdasarkan PCR dan
Organoleptik BC3F2 Ciherang x Mentikwangi” ini telah dilakukan sejak bulan
Februari hingga Juni 2013.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr Djarot Sasongko Hami
Seno, MS dan Dr Tri Joko Santoso, SP, MSi selaku pembimbing. Penulis juga
mengucapkan terima kasih kepada kedua orang tua, Mba Dewi, Ka Falin, Mba
Mira, Apri, Vita, Tuhfah, Kiki, Sari, Siska, Sisca, Clara serta rekan-rekan
Biokimia 46 yang lain atas doa dan dukungannya.
Penulis menyadari masih terdapat kekurangan dalam penulisan karya ilmiah
ini. Oleh karena itu, saran serta kritik yang membangun sangat penulis harapkan
demi perbaikan di kemudian hari. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Oktober 2013
Hilda Nur Rizkiany
DAFTAR ISI
ABSTRAK
ii
DAFTAR TABEL
viii
DAFTAR GAMBAR
viii
DAFTAR LAMPIRAN
viii
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Waktu dan Tempat Penelitian
2
Bahan
2
Alat
3
Prosedur Penelitian
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
5
Hasil
5
Pembahasan
8
SIMPULAN DAN SARAN
13
Simpulan
13
Saran
13
DAFTAR PUSTAKA
13
LAMPIRAN
15
RIWAYAT HIDUP
22
DAFTAR TABEL
1 Skor evaluasi aroma padi menggunakan metode kimia KOH
5
2 Benih tanaman padi BC3F2 yang mampu tumbuh sampai masa
penumbuhan di media tanah
5
3 Kuantitas dan kemurnian DNA hasil isolasi tanaman padi BC3F2 galur
7.3
6
4 Pola amplifikasi fragmen DNA tanaman padi BC3F2 Ciherang x
Mentikwangi dengan primer Bradbury
7
5 Hasil evaluasi aroma tanaman padi BC3F2 Ciherang x Mentikwangi
7
6 Hasil evaluasi aroma tanaman padi BC3F2 Ciherang x Mentikwangi
galur 7.3
8
DAFTAR GAMBAR
1 Alur penumbuhan benih padi BC3F2 Ciherang x Mentikwangi
2 Elektroforegram hasil seleksi tanaman padi BC3F2 Ciherang x
Mentikwangi dengan primer Bradbury
5
7
3 Diagram dan prosentase progeni gen pada metode persilangan terarah
9
4 Jalur pembentukan 2-asetil-1-pirolin (2AP)
10
5 Pola amplifikasi dengan marka Bradbury
11
DAFTAR LAMPIRAN
1 Elektroforegram hasil seleksi tanaman padi BC3F2 Ciherang x
Mentikwangi
15
2 Hasil evaluasi aroma tanaman padi BC3F2 menggunakan KOH 1,7%
19
PENDAHULUAN
Tuntutan konsumen terhadap beras semakin meningkat baik dari segi
kuantitas maupun kualitas. Segi kualitas dipengaruhi oleh banyak komponen
seperti mutu giling, gizi, tanak, rasa, serta penampilan. Di antara sifat-sifat
tersebut, konsumen banyak memberi perhatian lebih terhadap mutu rasa,
sedangkan faktor yang mempengaruhi mutu rasa antara lain kadar amilosa, warna
beras, bentuk beras, dan aroma (Wijaya 2010; Litbang 2001; Somantri et al.
1985). Aroma pada padi menjadi bahan pertimbangan penting untuk
meningkatkan selera makan konsumen, karena padi aromatik mengandung butiran
beras yang harum dan memiliki aroma, rasa, dan tekstur yang pulen (Weber et al.
2000).
Padi aromatik juga lebih dipilih oleh para petani daripada padi non-aromatik
karena mengandung butiran beras dengan keharuman yang akan menarik
konsumen dengan harga jual yang lebih tinggi. Indonesia memiliki padi aromatik
varietas lokal seperti padi Mentikwangi yang banyak berkembang di Jawa Tengah
dan banyak digemari oleh masyarakat karena aroma dan kepulenannya. Namun
padi ini sering tidak dikehendaki karena produktivitas padi ini rendah, umur
tanamnya panjang, dan kurang tahan terhadap hama atau penyakit, sehingga tidak
cukup untuk memenuhi permintaan pasar (Litbang 2006). Tingginya permintaan
padi aromatik dipasaran mendorong penelitian untuk memperbaiki kualitas aroma
pada tanaman padi. Sejauh ini penelitian mengenai aroma pada padi belum banyak
dikembangkan di Indonesia.
Dalam rangka mewujudkan ketahanan pangan nasional akan sangat
prospektif jika aroma pada padi Mentikwangi dapat ditambahkan ke padi nonaromatik yang memiliki sifat unggul seperti produktivitas tinggi, tahan terhadap
hama, dan memiliki kualitas yang baik, seperti padi Ciherang. Apabila tanaman
padi Mentikwangi disilangkan dengan padi Ciherang akan didapatkan padi
varietas unggul baru dengan sifat agronomi sebaik padi Ciherang ditambah
dengan sifat aroma dari padi Mentikwangi tanpa merusak kelebihan-kelebihan
padi tetua pemulih (Ciherang). Hal ini akan membuat petani mendapatkan produk
beras aromatik dengan kemudahan, waktu, resiko dan produktivitas seperti
menanam padi non-aromatik, serta memberikan nilai tambah bagi petani karena
harga padi aromatik relatif mahal dibandingkan padi non-aromatik (Taufiq 2011).
Sifat aromatik sendiri pada tanaman padi disebabkan oleh mutasi gen badh2
di kromosom no. 8 dan menyebabkan enzim BADH2 terpotong sehingga
mengakumulasi senyawa 2-asetil-1-pirolin (2AP), yang merupakan senyawa
utama yang bertanggung jawab terhadap aroma pada padi (Bradbury et al. 2005a).
Gen badh2 dalam tanaman padi terletak di dalam inti sel dan bersifat homozigot
resesif. Oleh karena itu, karakter aroma pada padi aromatik dapat dimasukkan ke
padi non-aromatik melalui inaktivasi gen badh2nya. Inaktivasi ini dapat dilakukan
dengan metode persilangan terarah. Metode ini banyak digunakan karena akan
didapatkan turunan yang homozigot resesif sehingga didapatkan produk bukan
transgenik (Hami Seno et al. 2009).
Persilangan antara padi Mentikwangi sebagai padi pendonor dengan padi
Ciherang sebagi tetua telah dilakukan oleh Hami Seno et al. (2009). Persilangan
padi Ciherang x Mentikwangi (CM) baru sampai pada turunan BC 3F1 oleh
2
Nasodikin (2013). Hasil persilangan padi yang sudah sampai pada turunan BC3F1
akan dilakukan perkawinan secara selfing, seperti pada metode persilangan terarah
(Hami Seno et al. 2009) dan akan diperoleh galur BC3F2. Gen badh2 yang
terintroduksi ke dalam padi CM galur BC3F2 perlu untuk diidentifikasi dengan
marka aromatik berbasis PCR menggunakan primer Bradbury untuk mendapatkan
tanaman padi yang positif membawa sifat aromatik. Selanjutnya tanaman padi
yang positif membawa sifat aromatik, senyawanya akan dikonfirmasi secara
organoleptik menggunakan KOH. Identifikasi karakter aromatik menggunakan
kedua metode tersebut diharapkan diperoleh varietas unggul baru yaitu Ciherang
yang membawa sifat aromatik yang berasal dari Mentikwangi.
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi karakter aromatik dari gen
badh2 pada galur padi BC3F2 hasil persilangan padi Ciherang dan padi
Mentikwangi, baik secara molekuler dengan primer Bradbury maupun
organoleptik dengan KOH, supaya didapatkan galur-galur baru yaitu Ciherang
aromatik. Hipotesis penelitian ini adalah padi CM galur BC3F2 dapat
teridentifikasi dengan metode PCR menggunakan primer Bradbury berdasarkan
amplifikasi gennya sehingga dapat membedakan tanaman padi yang aromatik dan
non-aromatik, serta senyawa pembawa aromanya dapat terdeteksi secara
organoleptik menggunakan KOH. Diharapkan hasil dari penelitian ini dapat
menyumbangkan varietas unggul baru yaitu Ciherang aromatik yang mudah untuk
ditanam seperti menanam padi padi Ciherang, meningkatkan pendapatan petani,
serta memperkuat ketahanan pangan nasional.
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan selama lima bulan mulai bulan Februari hingga Juni
2013. Tempat penelitian adalah di laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar
Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian,
Jalan Tentara Pelajar No.3A, Bogor.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam peneletian ini adalah benih-benih padi
BC3F2 Ciherang x Mentikwangi yang terdiri dari galur 7.3, 9.2, 9.9, 11.3, dan 16.8
masing-masing berjumlah 60, benih kontrol tanaman padi yang terdiri dari tetua
(padi Ciherang) berjumlah 25, benih padi pendonor (padi Mentikwangi) berjumlah
25, nitrogen cair, bufer ekstrak (Tris-HCl (pH 8.0), etilen diamin tetraasetat
(EDTA), natrium klorida (NaCl), setiltrimetil amonium bromida (CTAB),
polivinil pirolidon (PVP), merkaptoetanol, isopropanol, etanol 70%, bufer TrisEDTA (TE) yang mengandung ribonuklease, 2x KAPA2G Fast, empat buah
primer Bradbury; EAP (external antisense primer); ESP (external sense primer);
IFAP (internal fragrant antisense primer); dan INSP (internal non-fragrant sense
primer), cetakan DNA, DMSO, ddH2O, bubuk agarosa, bufer Tris HCl asam
asetat-EDTA (TAE), GelRed, loading dye, DNA standar (1 kb ladder), serta KOH
1,7%.
3
Alat
Alat-alat yang digunakan adalah cawan Petri, bak plastik, ember, tabung
mikro, tabung reaksi, satu set pipet mikro, tip pipet mikro, sentrifus (Beckman
rotor 12), inkubator, oven, spektrofotometer Nanodrop, PCR PTC-100, tangki
elektroforesis, dan UV Illuminator ChemiDoc EQ Biorad.
Prosedur Penelitian
Penumbuhan tanaman padi galur BC3F2 Ciherang x Mentikwangi (CM)
Benih padi kontrol (Ciherang dan Mentikwangi) serta sampel (galur 7.3, 9.2,
9.9, 11.3, dan 16.8) dioven terlebih dahulu pada suhu 50oC selama semalam.
Selanjutnya benih-benih padi disemai di cawan Petri yang telah dilapisi kertas
saring basah. Setelah delapan hari akar dan batang tanaman padi sudah muncul ke
permukaan, lalu tanaman padi dipindahkan ke dalam bak plastik sebagai masa
adaptasi. Setelah dua minggu berada di dalam bak plastik, tanaman dipindahkan
ke dalam ember dan dibiarkan tumbuh selama satu bulan untuk dapat diisolasi
DNAnya.
Isolasi DNA Tanaman Padi (Doyle & Doyle 1987; Shure et al. 1983)
Isolasi DNA tanaman padi mengacu pada metode Shure et al. (1983) dan
Doyle & Doyle (1987). Daun tanaman padi dipotong sepanjang 10 cm, dipotong
kecil-kecil dan dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 mL. Kemudian sampel
direndam dalam nitrogen cair dan digerus dengan bantuan sumpit. Hasil gerusan
kemudian ditambahkan bufer CTAB sebanyak 200 µL dan diinkubasi pada suhu
65oC selama 15 menit (selang 5 menit tabung dibolak-balik). Setelah itu sampel
didinginkan dalam suhu ruang, kemudian ditambahkan natrium asetat 3M
sebanyak 100 µL dan chisam (perbandingan klorofom:isoamil sebanyak 24:1)
sebanyak 1 mL. Kocok hingga rata lalu disentrifugasi dengan kecepatan 12000
rpm selama 5 menit.
Supernatan diambil dipindahkan ke dalam tabung mikro 2 mL yang baru
dan ditambahkan natrium asetat sebanyak 1/10 µL volume supernatan dan
isopropanol sebanyak 2/3 µL volume supernatan, kemudian di bolak-balik secara
perlahan untuk pengendapan DNA. Sampel disentrifugasi kembali selama 15
menit dengan kecepatan 12000 rpm. Supernatan dibuang secara perlahan-lahan
agar pelet DNA tidak ikut terbuang. Pelet DNA yang terbentuk ditambahkan
etanol 70% sebanyak 200 µL dan disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama
5 menit. Selanjutnya supernatan dibuang dan pelet DNA dikeringkan di oven pada
suhu 60oC sampai kering. Setelah itu sampel dihilangkan RNAnya dengan
ditambahkan TE-RNase sebanyak 50µL dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 30
menit.
Uji Kuantitas DNA Genomik dengan Spektrofotometer Nanodrop
Hasil isolasi DNA tanaman padi selanjutnya dilakukan kuantifikasi untuk
melihat konsentrasi dan kemurniannya menggunakan spektrofotometer Nanodrop
pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Kemurnian DNA ditetapkan
berdasarkan nilai perbandingan A260/A280 dengan satuan ng/μL. Batas
4
kemurnian yang biasa dipakai dalam analisis molekuler pada rasio A260/A280
adalah 1.8-2.0 (Sambrook et al. 1989). Selain nilai kemurnian DNA, alat ini juga
dapat mengukur kemurnian DNA dengan satuan ng/ μL.
Lubang optik dibersihkan terlebih dahulu dengan tissue. Blanko yang
digunakan adalah larutan TE. Selanjutnya sebanyak 2 µL larutan TE dimasukkan
ke dalam lubang optik. Setelah itu lubang optik dibersihkan kembali sebelum
sampel dimasukkan. Sebanyak 2 µL sampel DNA dimasukkan ke dalam lubang
optik.
Seleksi Tanaman Padi BC3F2 Ciherang x Mentikwangi menggunakan PCR
(Bradbury et al. 2005)
Seleksi tanaman padi dilakukan dengan marka aromatik berbasis PCR
dengan primer Bradbury. Primer Bradbury terdiri atas dua buah primer eksternal
dan dua buah primer internal. Primer eksternal terdiri atas EAP (external antisense
primer) dengan sekuen 5’-AGTGCTTTACAAAGTCCCG-3’ dan ESP (external
sense primer) dengan sekuen 5’-TTGTTTGGAGCTTGCTGATG-3’. Primer
internal terdiri atas INSP (internal non-fragrant sense primer) dengan sekuen 5’CTGGTAAAAAGATTATGGCTTCA-3’ dan IFAP (internal fragrant antisense
primer) dengan sekuen 5’-CATAGGAGCAGCTGAAATATATACC-3’.
Reaksi PCR dilakukan dengan mesin PCR PTC-100 menggunakan program
CKX-fast. Total volume yang digunakan adalah 10 μL, berisi 2,0 μL ddH2O, 5 μL
2XKapa 2G, 0,5 μL masing-masing primer (ESP, EAP, INSP, dan IFAP), 0,5 μL
DMSO dan 0,5 μL cetakan DNA 100 ng/μL. Reaksi amplifikasi dilakukan
sebanyak 30 siklus, yang terdiri atas denaturasi awal selama 3 menit pada suhu
95ºC, denaturasi selama 15 detik pada suhu 95ºC, penempelan primer selama 15
detik pada suhu 55ºC, dan perpanjangan primer selama 20 detik pada suhu 72ºC.
Perpanjangan primer terakhir terjadi selama 10 menit pada suhu 72ºC
Konfirmasi DNA menggunakan Elektroforesis (Bradbury et al. 2005)
Produk PCR divisualisasi dengan elektroforesis gel agarosa 1%. Sebanyak
5 μL sampel DNA ditambahkan dengan 1 μL GelRed dan dimasukkan ke dalam
sumur gel agarosa. Marka 1 kb ladder disertakan untuk melihat ukuran basa DNA.
Tahap selanjutnya sampel DNA dialiri arus dengan tegangan listrik 70 volt selama
50 menit. Kemudian gel agarosa divisualisasi dengan chemidoc gel system.
Uji Aroma menggunakan Metode Organoleptik dengan KOH (Dong et al.
2001)
Daun tanaman padi dipotong sepanjang 10 cm, dibuat menjadi kecil-kecil
kemudian dimasukkan ke dalam plastik tertutup. Plastik yang berisi sampel
disimpan di dalam lemari pendingin (freezer) pada suhu -20oC. Padi yang telah
membeku ditimbang bobotnya 0,8 g, dibungkus dengan aluminium foil, kemudian
direndam dalam nitrogen cair selama dua menit. Setelah dua menit daun padi
dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi 5 mL KOH 1,7%, lalu
ditutup dengan aluminium foil dan diinkubasi di dalam oven pada suhu 50oC
selama 10 menit. Pembungkus aluminium foil di buka satu persatu dan aroma
yang dikeluarkan diuji oleh tiga orang panelis dengan skor evaluasi 0-3 (Tabel 1).
5
Kemudian skor dari panelis dirata-rata dan dikelompokkan ke dalam tiga
kelompok, yaitu skor>1,0 digolongkan aroma, skor 0,6-1,0 digolongkan sedikit
beraroma, dan skor
PCR DAN ORGANOLEPTIK BC3F2
CIHERANG x MENTIKWANGI
HILDA NUR RIZKIANY
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Identifikasi Karakter
Aromatik berdasarkan PCR dan Organoleptik BC3F2 Ciherang x Mentikwangi
adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Penelitian ini
didanai oleh BB-Biogen atas nama Dr. Tri Joko Santoso, SP, MSi. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Oktober 2013
Hilda Nur Rizkiany
NIM G84090016
ABSTRAK
HILDA NUR RIZKIANY. Identifikasi Karakter Aromatik berdasarkan PCR dan
Organoleptik BC3F2 Ciherang x Mentikwangi. Dibimbing oleh DJAROT
SASONGKO HAMI SENO dan TRI JOKO SANTOSO.
Karakter aroma pada padi aromatik varietas asli Indonesia belum banyak
dilaporkan. Identifikasi karakter aroma pada padi varietas Mentikwangi dilakukan
dengan teknik PCR menggunakan primer Bradbury dan secara organoleptik
menggunakan KOH. Penggunaan kedua metode ini diharapkan dapat menyeleksi
tanaman padi hasil persilangan Ciherang x Mentikwangi galur BC3F2 menjadi
aromatik dan non-aromatik, sehingga diperoleh beberapa galur harapan baru
dengan latar belakang Ciherang yang membawa sifat aromatik. Hasil seleksi
tanaman padi menggunakan primer Bradbury, dari total 266 tanaman BC3F2 yang
diuji, diperoleh sebanyak 55 tanaman memiliki fragmen DNA berukuran sama
dengan tetua Mentikwangi yaitu 275 bp, sebanyak 34 tanaman memiliki fragmen
DNA berukuran sama dengan tetua Ciherang yaitu 355 bp, serta 177 tanaman
memiliki fragmen DNA heterozigot atau campuran keduanya yaitu 355 bp dan
275 bp. Hasil uji organoleptik dengan KOH tanaman yang membawa alel
homozigot resesif sebagian besar menunjukkan skor beraroma.
Kata kunci: Padi Mentikwangi, aromatik, badh2, Bradbury
ABSTRACT
HILDA NUR RIZKIANY. Identification of aromatic character by PCR and
organoleptic on paddy BC3F2 Ciherang x Mentikwangi. Supervised by DJAROT
SASONGKO HAMI SENO and TRI JOKO SANTOSO.
Aroma character of the original Indonesian aromatic rice varieties have not
been widely reported. Identification of aroma character in paddy Mentikwangi
will be done using PCR with primer Bradbury and organoleptic using KOH. Use
these methods are expected to select rice plants from crosses Ciherang x
Mentikwangi BC3F2 be aromatic and non-aromatic, in order to obtain some new
promising lines with background Ciherang carrying aromatic trait. Rice crop
selection results using primer Bradbury, of the total 266 BC3F2 plants were tested,
as many as 55 plants have the same sized DNA fragment with Mentikwangi about
257 bp, 34 plants have the same sized DNA fragments with Ciherang about 355
bp, and 177 plants had a heterozygous DNA fragments or a mixture of both about
355 bp and 257 bp. Organoleptic test results with 1.7% KOH homozygous
recessive allele showed most flavorful score.
Keywords: paddy Mentikwangi, aromatic, badh2, Bradbury
IDENTIFIKASI KARAKTER AROMATIK BERDASARKAN
PCR DAN ORGANOLEPTIK BC3F2
CIHERANG X MENTIKWANGI
HILDA NUR RIZKIANY
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi: Identifikasi Karakter Aromatik berdasarkan PCR dan Organoleptik
BC 3 F2 Ciherang x Mentikwangi
Nama
: Hilda Nur Rizkiany
: 084090016
NIM
Disetujui oleh
Dr Djarot Sasongko Hami Seno, MS
Pembimbing I
Tanggal Lulus:
U9 OCT 2011
Dr Tri loko Santoso, SP, MSi
Pembimbing II
Judul Skripsi : Identifikasi Karakter Aromatik berdasarkan PCR dan Organoleptik
BC3F2 Ciherang x Mentikwangi
Nama
: Hilda Nur Rizkiany
NIM
: G84090016
Disetujui oleh
Dr Djarot Sasongko Hami Seno, MS
Pembimbing I
Dr Tri Joko Santoso, SP, MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MApp, Sc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Bismillahirrahmanirrahim
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala nikmat dan
karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Karya
ilmiah yang berjudul “Identifikasi Karakter Aromatik berdasarkan PCR dan
Organoleptik BC3F2 Ciherang x Mentikwangi” ini telah dilakukan sejak bulan
Februari hingga Juni 2013.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr Djarot Sasongko Hami
Seno, MS dan Dr Tri Joko Santoso, SP, MSi selaku pembimbing. Penulis juga
mengucapkan terima kasih kepada kedua orang tua, Mba Dewi, Ka Falin, Mba
Mira, Apri, Vita, Tuhfah, Kiki, Sari, Siska, Sisca, Clara serta rekan-rekan
Biokimia 46 yang lain atas doa dan dukungannya.
Penulis menyadari masih terdapat kekurangan dalam penulisan karya ilmiah
ini. Oleh karena itu, saran serta kritik yang membangun sangat penulis harapkan
demi perbaikan di kemudian hari. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Oktober 2013
Hilda Nur Rizkiany
DAFTAR ISI
ABSTRAK
ii
DAFTAR TABEL
viii
DAFTAR GAMBAR
viii
DAFTAR LAMPIRAN
viii
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Waktu dan Tempat Penelitian
2
Bahan
2
Alat
3
Prosedur Penelitian
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
5
Hasil
5
Pembahasan
8
SIMPULAN DAN SARAN
13
Simpulan
13
Saran
13
DAFTAR PUSTAKA
13
LAMPIRAN
15
RIWAYAT HIDUP
22
DAFTAR TABEL
1 Skor evaluasi aroma padi menggunakan metode kimia KOH
5
2 Benih tanaman padi BC3F2 yang mampu tumbuh sampai masa
penumbuhan di media tanah
5
3 Kuantitas dan kemurnian DNA hasil isolasi tanaman padi BC3F2 galur
7.3
6
4 Pola amplifikasi fragmen DNA tanaman padi BC3F2 Ciherang x
Mentikwangi dengan primer Bradbury
7
5 Hasil evaluasi aroma tanaman padi BC3F2 Ciherang x Mentikwangi
7
6 Hasil evaluasi aroma tanaman padi BC3F2 Ciherang x Mentikwangi
galur 7.3
8
DAFTAR GAMBAR
1 Alur penumbuhan benih padi BC3F2 Ciherang x Mentikwangi
2 Elektroforegram hasil seleksi tanaman padi BC3F2 Ciherang x
Mentikwangi dengan primer Bradbury
5
7
3 Diagram dan prosentase progeni gen pada metode persilangan terarah
9
4 Jalur pembentukan 2-asetil-1-pirolin (2AP)
10
5 Pola amplifikasi dengan marka Bradbury
11
DAFTAR LAMPIRAN
1 Elektroforegram hasil seleksi tanaman padi BC3F2 Ciherang x
Mentikwangi
15
2 Hasil evaluasi aroma tanaman padi BC3F2 menggunakan KOH 1,7%
19
PENDAHULUAN
Tuntutan konsumen terhadap beras semakin meningkat baik dari segi
kuantitas maupun kualitas. Segi kualitas dipengaruhi oleh banyak komponen
seperti mutu giling, gizi, tanak, rasa, serta penampilan. Di antara sifat-sifat
tersebut, konsumen banyak memberi perhatian lebih terhadap mutu rasa,
sedangkan faktor yang mempengaruhi mutu rasa antara lain kadar amilosa, warna
beras, bentuk beras, dan aroma (Wijaya 2010; Litbang 2001; Somantri et al.
1985). Aroma pada padi menjadi bahan pertimbangan penting untuk
meningkatkan selera makan konsumen, karena padi aromatik mengandung butiran
beras yang harum dan memiliki aroma, rasa, dan tekstur yang pulen (Weber et al.
2000).
Padi aromatik juga lebih dipilih oleh para petani daripada padi non-aromatik
karena mengandung butiran beras dengan keharuman yang akan menarik
konsumen dengan harga jual yang lebih tinggi. Indonesia memiliki padi aromatik
varietas lokal seperti padi Mentikwangi yang banyak berkembang di Jawa Tengah
dan banyak digemari oleh masyarakat karena aroma dan kepulenannya. Namun
padi ini sering tidak dikehendaki karena produktivitas padi ini rendah, umur
tanamnya panjang, dan kurang tahan terhadap hama atau penyakit, sehingga tidak
cukup untuk memenuhi permintaan pasar (Litbang 2006). Tingginya permintaan
padi aromatik dipasaran mendorong penelitian untuk memperbaiki kualitas aroma
pada tanaman padi. Sejauh ini penelitian mengenai aroma pada padi belum banyak
dikembangkan di Indonesia.
Dalam rangka mewujudkan ketahanan pangan nasional akan sangat
prospektif jika aroma pada padi Mentikwangi dapat ditambahkan ke padi nonaromatik yang memiliki sifat unggul seperti produktivitas tinggi, tahan terhadap
hama, dan memiliki kualitas yang baik, seperti padi Ciherang. Apabila tanaman
padi Mentikwangi disilangkan dengan padi Ciherang akan didapatkan padi
varietas unggul baru dengan sifat agronomi sebaik padi Ciherang ditambah
dengan sifat aroma dari padi Mentikwangi tanpa merusak kelebihan-kelebihan
padi tetua pemulih (Ciherang). Hal ini akan membuat petani mendapatkan produk
beras aromatik dengan kemudahan, waktu, resiko dan produktivitas seperti
menanam padi non-aromatik, serta memberikan nilai tambah bagi petani karena
harga padi aromatik relatif mahal dibandingkan padi non-aromatik (Taufiq 2011).
Sifat aromatik sendiri pada tanaman padi disebabkan oleh mutasi gen badh2
di kromosom no. 8 dan menyebabkan enzim BADH2 terpotong sehingga
mengakumulasi senyawa 2-asetil-1-pirolin (2AP), yang merupakan senyawa
utama yang bertanggung jawab terhadap aroma pada padi (Bradbury et al. 2005a).
Gen badh2 dalam tanaman padi terletak di dalam inti sel dan bersifat homozigot
resesif. Oleh karena itu, karakter aroma pada padi aromatik dapat dimasukkan ke
padi non-aromatik melalui inaktivasi gen badh2nya. Inaktivasi ini dapat dilakukan
dengan metode persilangan terarah. Metode ini banyak digunakan karena akan
didapatkan turunan yang homozigot resesif sehingga didapatkan produk bukan
transgenik (Hami Seno et al. 2009).
Persilangan antara padi Mentikwangi sebagai padi pendonor dengan padi
Ciherang sebagi tetua telah dilakukan oleh Hami Seno et al. (2009). Persilangan
padi Ciherang x Mentikwangi (CM) baru sampai pada turunan BC 3F1 oleh
2
Nasodikin (2013). Hasil persilangan padi yang sudah sampai pada turunan BC3F1
akan dilakukan perkawinan secara selfing, seperti pada metode persilangan terarah
(Hami Seno et al. 2009) dan akan diperoleh galur BC3F2. Gen badh2 yang
terintroduksi ke dalam padi CM galur BC3F2 perlu untuk diidentifikasi dengan
marka aromatik berbasis PCR menggunakan primer Bradbury untuk mendapatkan
tanaman padi yang positif membawa sifat aromatik. Selanjutnya tanaman padi
yang positif membawa sifat aromatik, senyawanya akan dikonfirmasi secara
organoleptik menggunakan KOH. Identifikasi karakter aromatik menggunakan
kedua metode tersebut diharapkan diperoleh varietas unggul baru yaitu Ciherang
yang membawa sifat aromatik yang berasal dari Mentikwangi.
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi karakter aromatik dari gen
badh2 pada galur padi BC3F2 hasil persilangan padi Ciherang dan padi
Mentikwangi, baik secara molekuler dengan primer Bradbury maupun
organoleptik dengan KOH, supaya didapatkan galur-galur baru yaitu Ciherang
aromatik. Hipotesis penelitian ini adalah padi CM galur BC3F2 dapat
teridentifikasi dengan metode PCR menggunakan primer Bradbury berdasarkan
amplifikasi gennya sehingga dapat membedakan tanaman padi yang aromatik dan
non-aromatik, serta senyawa pembawa aromanya dapat terdeteksi secara
organoleptik menggunakan KOH. Diharapkan hasil dari penelitian ini dapat
menyumbangkan varietas unggul baru yaitu Ciherang aromatik yang mudah untuk
ditanam seperti menanam padi padi Ciherang, meningkatkan pendapatan petani,
serta memperkuat ketahanan pangan nasional.
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan selama lima bulan mulai bulan Februari hingga Juni
2013. Tempat penelitian adalah di laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar
Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian,
Jalan Tentara Pelajar No.3A, Bogor.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam peneletian ini adalah benih-benih padi
BC3F2 Ciherang x Mentikwangi yang terdiri dari galur 7.3, 9.2, 9.9, 11.3, dan 16.8
masing-masing berjumlah 60, benih kontrol tanaman padi yang terdiri dari tetua
(padi Ciherang) berjumlah 25, benih padi pendonor (padi Mentikwangi) berjumlah
25, nitrogen cair, bufer ekstrak (Tris-HCl (pH 8.0), etilen diamin tetraasetat
(EDTA), natrium klorida (NaCl), setiltrimetil amonium bromida (CTAB),
polivinil pirolidon (PVP), merkaptoetanol, isopropanol, etanol 70%, bufer TrisEDTA (TE) yang mengandung ribonuklease, 2x KAPA2G Fast, empat buah
primer Bradbury; EAP (external antisense primer); ESP (external sense primer);
IFAP (internal fragrant antisense primer); dan INSP (internal non-fragrant sense
primer), cetakan DNA, DMSO, ddH2O, bubuk agarosa, bufer Tris HCl asam
asetat-EDTA (TAE), GelRed, loading dye, DNA standar (1 kb ladder), serta KOH
1,7%.
3
Alat
Alat-alat yang digunakan adalah cawan Petri, bak plastik, ember, tabung
mikro, tabung reaksi, satu set pipet mikro, tip pipet mikro, sentrifus (Beckman
rotor 12), inkubator, oven, spektrofotometer Nanodrop, PCR PTC-100, tangki
elektroforesis, dan UV Illuminator ChemiDoc EQ Biorad.
Prosedur Penelitian
Penumbuhan tanaman padi galur BC3F2 Ciherang x Mentikwangi (CM)
Benih padi kontrol (Ciherang dan Mentikwangi) serta sampel (galur 7.3, 9.2,
9.9, 11.3, dan 16.8) dioven terlebih dahulu pada suhu 50oC selama semalam.
Selanjutnya benih-benih padi disemai di cawan Petri yang telah dilapisi kertas
saring basah. Setelah delapan hari akar dan batang tanaman padi sudah muncul ke
permukaan, lalu tanaman padi dipindahkan ke dalam bak plastik sebagai masa
adaptasi. Setelah dua minggu berada di dalam bak plastik, tanaman dipindahkan
ke dalam ember dan dibiarkan tumbuh selama satu bulan untuk dapat diisolasi
DNAnya.
Isolasi DNA Tanaman Padi (Doyle & Doyle 1987; Shure et al. 1983)
Isolasi DNA tanaman padi mengacu pada metode Shure et al. (1983) dan
Doyle & Doyle (1987). Daun tanaman padi dipotong sepanjang 10 cm, dipotong
kecil-kecil dan dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 mL. Kemudian sampel
direndam dalam nitrogen cair dan digerus dengan bantuan sumpit. Hasil gerusan
kemudian ditambahkan bufer CTAB sebanyak 200 µL dan diinkubasi pada suhu
65oC selama 15 menit (selang 5 menit tabung dibolak-balik). Setelah itu sampel
didinginkan dalam suhu ruang, kemudian ditambahkan natrium asetat 3M
sebanyak 100 µL dan chisam (perbandingan klorofom:isoamil sebanyak 24:1)
sebanyak 1 mL. Kocok hingga rata lalu disentrifugasi dengan kecepatan 12000
rpm selama 5 menit.
Supernatan diambil dipindahkan ke dalam tabung mikro 2 mL yang baru
dan ditambahkan natrium asetat sebanyak 1/10 µL volume supernatan dan
isopropanol sebanyak 2/3 µL volume supernatan, kemudian di bolak-balik secara
perlahan untuk pengendapan DNA. Sampel disentrifugasi kembali selama 15
menit dengan kecepatan 12000 rpm. Supernatan dibuang secara perlahan-lahan
agar pelet DNA tidak ikut terbuang. Pelet DNA yang terbentuk ditambahkan
etanol 70% sebanyak 200 µL dan disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama
5 menit. Selanjutnya supernatan dibuang dan pelet DNA dikeringkan di oven pada
suhu 60oC sampai kering. Setelah itu sampel dihilangkan RNAnya dengan
ditambahkan TE-RNase sebanyak 50µL dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 30
menit.
Uji Kuantitas DNA Genomik dengan Spektrofotometer Nanodrop
Hasil isolasi DNA tanaman padi selanjutnya dilakukan kuantifikasi untuk
melihat konsentrasi dan kemurniannya menggunakan spektrofotometer Nanodrop
pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Kemurnian DNA ditetapkan
berdasarkan nilai perbandingan A260/A280 dengan satuan ng/μL. Batas
4
kemurnian yang biasa dipakai dalam analisis molekuler pada rasio A260/A280
adalah 1.8-2.0 (Sambrook et al. 1989). Selain nilai kemurnian DNA, alat ini juga
dapat mengukur kemurnian DNA dengan satuan ng/ μL.
Lubang optik dibersihkan terlebih dahulu dengan tissue. Blanko yang
digunakan adalah larutan TE. Selanjutnya sebanyak 2 µL larutan TE dimasukkan
ke dalam lubang optik. Setelah itu lubang optik dibersihkan kembali sebelum
sampel dimasukkan. Sebanyak 2 µL sampel DNA dimasukkan ke dalam lubang
optik.
Seleksi Tanaman Padi BC3F2 Ciherang x Mentikwangi menggunakan PCR
(Bradbury et al. 2005)
Seleksi tanaman padi dilakukan dengan marka aromatik berbasis PCR
dengan primer Bradbury. Primer Bradbury terdiri atas dua buah primer eksternal
dan dua buah primer internal. Primer eksternal terdiri atas EAP (external antisense
primer) dengan sekuen 5’-AGTGCTTTACAAAGTCCCG-3’ dan ESP (external
sense primer) dengan sekuen 5’-TTGTTTGGAGCTTGCTGATG-3’. Primer
internal terdiri atas INSP (internal non-fragrant sense primer) dengan sekuen 5’CTGGTAAAAAGATTATGGCTTCA-3’ dan IFAP (internal fragrant antisense
primer) dengan sekuen 5’-CATAGGAGCAGCTGAAATATATACC-3’.
Reaksi PCR dilakukan dengan mesin PCR PTC-100 menggunakan program
CKX-fast. Total volume yang digunakan adalah 10 μL, berisi 2,0 μL ddH2O, 5 μL
2XKapa 2G, 0,5 μL masing-masing primer (ESP, EAP, INSP, dan IFAP), 0,5 μL
DMSO dan 0,5 μL cetakan DNA 100 ng/μL. Reaksi amplifikasi dilakukan
sebanyak 30 siklus, yang terdiri atas denaturasi awal selama 3 menit pada suhu
95ºC, denaturasi selama 15 detik pada suhu 95ºC, penempelan primer selama 15
detik pada suhu 55ºC, dan perpanjangan primer selama 20 detik pada suhu 72ºC.
Perpanjangan primer terakhir terjadi selama 10 menit pada suhu 72ºC
Konfirmasi DNA menggunakan Elektroforesis (Bradbury et al. 2005)
Produk PCR divisualisasi dengan elektroforesis gel agarosa 1%. Sebanyak
5 μL sampel DNA ditambahkan dengan 1 μL GelRed dan dimasukkan ke dalam
sumur gel agarosa. Marka 1 kb ladder disertakan untuk melihat ukuran basa DNA.
Tahap selanjutnya sampel DNA dialiri arus dengan tegangan listrik 70 volt selama
50 menit. Kemudian gel agarosa divisualisasi dengan chemidoc gel system.
Uji Aroma menggunakan Metode Organoleptik dengan KOH (Dong et al.
2001)
Daun tanaman padi dipotong sepanjang 10 cm, dibuat menjadi kecil-kecil
kemudian dimasukkan ke dalam plastik tertutup. Plastik yang berisi sampel
disimpan di dalam lemari pendingin (freezer) pada suhu -20oC. Padi yang telah
membeku ditimbang bobotnya 0,8 g, dibungkus dengan aluminium foil, kemudian
direndam dalam nitrogen cair selama dua menit. Setelah dua menit daun padi
dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi 5 mL KOH 1,7%, lalu
ditutup dengan aluminium foil dan diinkubasi di dalam oven pada suhu 50oC
selama 10 menit. Pembungkus aluminium foil di buka satu persatu dan aroma
yang dikeluarkan diuji oleh tiga orang panelis dengan skor evaluasi 0-3 (Tabel 1).
5
Kemudian skor dari panelis dirata-rata dan dikelompokkan ke dalam tiga
kelompok, yaitu skor>1,0 digolongkan aroma, skor 0,6-1,0 digolongkan sedikit
beraroma, dan skor