Identifikasi dan Karakterisasi Gen Toleran Genangan Populasi Padi BC4F1 Ciherang-Sub1
IDENTIFIKASI DAN KARAKTERISASI GEN TOLERAN
GENANGAN POPULASI PADI BC4F1 CIHERANG-Sub1
RESTU RAHAYU
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Identifikasi dan
Karakterisasi Gen Toleran Genangan Populasi Padi BC4F1 Ciherang-Sub1 adalah
benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing yang dipimpin oleh Dr
Djarot Sasongko Hami Seno, MSi dan belum diajukan dalam bentuk apa pun
kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip
dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juni 2013
Restu Rahayu
NIM G84080044
ABSTRAK
RESTU RAHAYU. Identifikasi dan Karakterisasi Gen Toleran Genangan
Populasi Padi BC4F1 Ciherang-Sub1. Dibimbing oleh DJAROT SASONGKO
HAMI SENO dan TRI JOKO SANTOSO.
Cekaman genangan merupakan salah satu faktor penghambat pada
produktivitas tanaman padi. Oleh karena itu, dalam rangka ketahanan pangan,
perlu dikembangkan padi toleran genangan. Introduksi gen toleran genangan
(Sub1) dilakukan melalui persilangan terarah antara padi Ciherang sebagai tetua
pemulih dengan padi IR64-Sub1 dan Swarna-Sub1 sebagai tetua donor Sub1.
Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi dan mengkarakterisasi tanaman BC4F1
Ciherang-Sub1 hasil persilangan balik antara tanaman BC3F1 Ciherang-Sub1
dengan Ciherang. Keberadaan gen Sub1 pada sampel dideteksi menggunakan
analisis PCR berbasis marka molekul terkait gen Sub1. Tahapan penelitian
dimulai dari penanaman benih padi BC4F1 Ciherang-Sub1, pengujian toleransi
genangan, isolasi DNA padi, pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA padi,
serta analisis PCR dengan marka AEX1 dan RM219. Hasil uji genangan diperoleh
15 tanaman BC4F1 Ciherang/Swarna-Sub1 dan 21 tanaman BC4F1 Ciherang/IR64Sub1. Hasil PCR dengan marka AEX1F dan AEX1R menunjukkan pita DNA
berukuran 231 bp sedangkan hasil PCR dengan marka gabungan RM219F dan
AEX1R dapat membedakan sifat heterozigot antara padi Ciherang, Swarna-Sub1
dan IR64-Sub1.
ABSTRACT
RESTU RAHAYU. Identification and Characterization Gene of Submergence
Tolerant BC4F1 Ciherang-Sub1 Rice Population. Supervised by DJAROT
SASONGKO HAMI SENO and TRI JOKO SANTOSO.
Submergence stress is one of the inhibitor factor at rice productivity.
Therefore, in order to improve food security, the rice of submergence-tolerant
need to be developed. Introduction of gene related to submergence-tolerant (Sub1)
was done by site-directed crossing between Ciherang rice as host with rice IR64Sub1 and Swarna-Sub1 as Sub1 donor. The aim of this study was to identify and
characterize BC4F1 Ciherang-Sub1 that resulted from backcross between BC3F1
Ciherang-Sub1 and Ciherang. The existence of Sub1 gene was detected by using
PCR analysis based on molecular marker that concerned Sub1 gene. Stages of
research was started from planting of BC4F1 Ciherang-Sub1 seed, testing of
submergence tolerance, isolation of rice DNA, measuring of concentration and
purity of rice DNA, and PCR analysis with AEX1 and RM219 markers. The test
results of the submergence showed that 15 plants of BC4F1 Ciherang/Swarna-Sub1
and 21 BC4F1 Ciherang/IR64-Sub1. PCR results with markers AEX1R and
AEX1F showed that the DNA band sized 231 bp, while the results of PCR with
the combined markers AEX1R and RM219F can distinguish heterozygote
between Ciherang rice, Swarna-Sub1 and IR64-Sub1.
IDENTIFIKASI DAN KARAKTERISASI GEN TOLERAN
GENANGAN POPULASI PADI BC4F1 CIHERANG-Sub1
RESTU RAHAYU
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi : Identifikasi dan Karakterisasi Oen To]eran Oenangan Populasi
Padi BC 4F] Ciherang-Subl
: Restu Rahayu
Nama
: 084080044
NIM
Disetujui o]eh
Dr Djarot Sasongko Hami Seno, MSi
Pembimbing I
Tanggal Lulus:
05 (, '::-', 2 3
c
Dr Tri Joko Santoso, SP MSi
Pembimbing II
Judul Skripsi : Identifikasi dan Karakterisasi Gen Toleran Genangan Populasi
Padi BC4F1 Ciherang-Sub1
Nama
: Restu Rahayu
NIM
: G84080044
Disetujui oleh
Dr Djarot Sasongko Hami Seno, MSi
Pembimbing I
Dr Tri Joko Santoso, SP MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Februari 2012 ini ialah
padi tahan genangan, dengan judul Identifikasi dan Karakterisasi Gen Toleran
Genangan Populasi Padi BC4F1 Ciherang-Sub1.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Djarot Sasongko
Hamiseno, M.Si dan Bapak Dr. Tri Joko Santoso, M.Si. selaku pembimbing yang
telah banyak memberi saran dalam penyusunan karya ilmiah ini. Di samping itu,
terima kasih pula kepada pak Umar, mbak Dewi Praptiwi, kak Falin, dan kak
Indra selaku laboran Laboratorium Biologi Molekuler dan Rumah Kaca Balai
Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik
Pertanian (BB Biogen) Bogor yang telah membantu selama pengumpulan data.
Tak lupa penulis sampaikan penghargaan sebesar-besarnya kepada ayah, ibu,
seluruh keluarga, dan rekan-rekan Biokimia 45 atas segala doa dan dukungannya.
Demikianlah skripsi ini disusun, semoga dapat bermanfaat baik bagi penulis
maupun para pembaca.
Bogor, Juni 2013
Restu Rahayu
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Bahan dan Alat
2
Metode
3
HASIL
6
Penanaman Benih Padi BC4F1 Ciherang-Sub1
6
Tanaman Padi Hasil Pengujian Toleransi Genangan
6
DNA Hasil Isolasi dan Karakterisasi
7
Identifikasi Padi BC4F1 Ciherang-Sub1 melalui Analisis PCR
9
Marka Sub1A (AEX1)
Marka Gabungan RM219F dan AEX1R
PEMBAHASAN
9
10
11
Pemuliaan Padi BC4F1 Ciherang-Sub1
11
Pengaruh Uji Toleransi Genangan terhadap Padi BC4F1 Ciherang-Sub1
11
Kuantifikasi DNA BC4F1 Ciherang-Sub1
12
Identifikasi Padi BC4F1 Ciherang-Sub1 melalui Analisis PCR
13
SIMPULAN
14
DAFTAR PUSTAKA
15
LAMPIRAN
17
RIWAYAT HIDUP
21
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
Pola tanam benih padi dalam satu bak
Padi hasil penanaman selama 14 hari
Uji genangan padi BC4F1 Ciherang-Sub1
Hasil elektroforesis padi BC4F1 Ciherang/Swarna-Sub1 dengan marka
AEX1F dan AEX1R
5 Hasil elektroforesis padi BC4F1 Ciherang/IR64-Sub1 dengan marka
AEX1F dan AEX1R
6 Hasil elektroforesis padi BC4F1 Ciherang-Sub1 dengan marka
RM219F dan AEX1R
3
6
7
9
9
10
DAFTAR LAMPIRAN
1 Diagram alir penelitian
2 Diagram alir pertumbuhan dan uji genangan benih padi BC4F1
Ciherang-Sub1
3 Diagram alir isolasi DNA (Doyle & Doyle 1987)
4 Komposisi bufer ekstraksi DNA (Marlina 2011)
5 Varietas-varietas padi hasil persilangan yang mengandung gen Sub1
(Xu et al. 2004; Sarkar et al. 2006)
17
18
19
20
20
PENDAHULUAN
Padi merupakan komoditas penting yang dapat menunjang ketahanan
pangan nasional. Hal ini dikarenakan padi adalah sumber makanan pokok bagi
sebagian besar penduduk Indonesia, terlihat dari tingkat konsumsi beras
penduduknya yaitu sekitar 141 kg/kapita/tahun. Nilai konsumsi beras tersebut
menuntut pemerintah dalam meningkatkan produksi padi nasional seiring
meningkatnya jumlah penduduk di Indonesia (Badan Ketahanan Pangan 2009).
Upaya peningkatan produksi padi nasional tidak terlepas dari program
intensifikasi pertanian yang didukung oleh inovasi teknologi panca usahatani,
terutama penggunaan benih padi varietas unggul. Kontribusi varietas unggul
dalam peningkatan produktivitas padi mencapai 75% jika diintegrasikan dengan
teknologi pengairan dan pemupukan. Benih padi varietas unggul merupakan
penyumbang terbesar (16%) terhadap peningkatan produksi padi nasional, jauh di
atas irigasi (5%) dan pupuk (4%) (Satoto et al. 2006). Varietas-varietas unggul
yang dominan digunakan dalam kurun waktu pengembangannya adalah varietas
PB-36 (1970-an), Cisadane (1980-an), IR-64 (1990-an), dan Ciherang (2000-an)
(Sitorus 2009).
Keberhasilan upaya peningkatan produksi padi dihadapkan kepada berbagai
kendala dan masalah, antara lain penurunan produktivitas lahan, penyimpangan
iklim, serta cekaman biotik dan abiotik. Salah satu bentuk cekaman abiotik ialah
genangan air. Genangan air terhadap tanaman terjadi akibat terhambatnya proses
fotosintesis dan respirasi, hal tersebut dikarenakan difusi gas dalam air lebih
lambat 104 kali dibandingkan dengan di udara dan rendahnya penetrasi cahaya
yang dapat diterima oleh tanaman (Armstrong & Drew 2002).
Genangan yang mengakibatkan cekaman terhadap tanaman padi di wilayah
Asia Tenggara diperkirakan mencapai 15 juta hektar setiap tahunnya (Septiningsih
et al. 2009). Adapun di Indonesia potensi areal persawahan yang terkena cekaman
genangan yaitu sekitar 13,3 juta ha yang terdiri atas 4,2 juta ha genangan dangkal,
6,1 juta ha genangan sedang, dan 3,0 juta ha genangan dalam (Nugroho et al.
2002). Cekaman genangan pada areal pertanaman padi ini akan semakin meluas
karena terjadi peningkatan curah hujan dan kenaikan permukaan air laut akibat
terjadinya pemanasan global (CGIAR 2006).
Varietas padi tahan genangan yang diproduksi di Indonesia diantaranya
adalah padi IR64-Sub1 dan Swarna-Sub1. Kedua varietas padi ini memiliki gen
Sub1 yang merupakan gen pemberi sifat toleran terhadap genangan. Hal ini
disebabkan adanya ethylene response factor yang memicu perpanjangan tanaman
pada kromosom 9 tanaman padi tersebut (Perata & Voesenek 2006). Namun,
kedua varietas tersebut memiliki kekurangan seperti usia produksi yang relatif
lama, produktivitas yang rendah, dan kurang tahan terhadap hama. Di satu sisi,
pemulia tanaman menemukan varietas padi yang memiliki keunggulan usia
produksi yang cepat, produktivitas yang tinggi, dan tahan terhadap hama. Salah
satu varietas padi unggulan yang memiliki karakteristik tersebut adalah padi
varietas Ciherang. Jenis padi Ciherang dapat menghasilkan 10 ton gabah kering
panen per hektar atau dapat juga mencapai 8-9 ton gabah kering giling (BBPTP
2009). Penggunaan padi varietas Ciherang sebagai tetua pemulih (host) pada
penelitian ini dapat mengurangi resiko kegagalan panen, dapat menjadi salah satu
2
solusi dalam upaya perbaikan produktivitas padi di daerah tergenang,
meningkatkan ekonomi petani sekaligus devisa negara jika diekspor, dan lebih
menggairahkan minat pertanian, baik petani maupun industri, serta mendukung
program ketahanan pangan nasional. Padi hasil persilangan tersebut merupakan
produk nontransgenik karena tidak melalui proses rekayasa genetik. Selain itu,
padi ini mempunyai keuntungan yaitu waktu tanam relatif singkat, resiko
kegagalan panen rendah, dan produktivitas tinggi.
Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi dan mengkarakterisasi tanaman
BC4F1 Ciherang-Sub1 hasil persilangan balik (backcross) antara tanaman BC3F1
Ciherang-Sub1 dengan Ciherang. Tanaman BC4F1 yang mengandung gen Sub1
diidentifikasi menggunakan marka molekuler terkait gen toleran genangan pada
proses PCR. Hipotesis penelitian ini adalah metode persilangan terarah (sitedirected crossing) digunakan untuk memperoleh F1 yang memiliki gen Sub1
tahan genangan dan analisis molekuler berbasis PCR digunakan untuk melacak
keberadaan alel gen Sub1. Manfaat dari penelitian ini adalah memberikan
informasi dan kesempatan kepada para petani atau industri dalam menggunakan
padi BC4F1 untuk meningkatkan produktivitas padi di daerah persawahan yang
tergenang air ataupun pada saat musim penghujan tiba.
METODE
Bahan dan Alat
Bahan tanaman padi diperoleh dari BB-BIOGEN dan LIPI. Tanaman padi
yang digunakan yaitu tetua host (Ciherang), padi BC4F1 Ciherang-Sub1, tetua
donor Sub1 (padi IR64-Sub1 dan padi Swarna-Sub1), dan padi IR42 sebagai
kontrol. Reagen untuk isolasi DNA yaitu etanol 70%, etanol 95%, bufer ekstraksi
(NaCl 5 M, Tris-HCl 1 M, EDTA 0,5 M, lauril sarkosin, dan urea), fenol
kloroform isoamilalkohol (PCI), isopropanol, dan larutan TE (Tris-EDTA).
Bahan-bahan yang digunakan untuk menguji hasil isolasi DNA dengan PCR
adalah bufer PCR 10x, MgCl2 50 mM, dNTP mix 10 mM, primer AEX1, primer
RM219, Taq polymerase, sampel DNA 50 ng/µL, dan MQ H2O. Bahan-bahan
yang digunakan untuk elektroforesis yaitu loading dye, bufer TAE (Tris-Acetic
Acid EDTA) 1x, agarosa, sampel DNA hasil PCR, marker DNA 1 kb, etidium
bromida, dan akuabides.
Alat-alat yang digunakan untuk penanaman benih dan pengujian genangan
padi BC4F1 Ciherang-Sub1 adalah bak tanam berukuran 60 cm x 30 cm, media
tanah, pinset, lidi, ember, kertas label, klip, dan bak plastik volume 100 liter.
Alat-alat yang digunakan untuk isolasi DNA adalah penangas air, cool box,
pinset, tabung mikro, mortar, tip, vorteks, mikrofuge (Beckman rotor 12),
autopipet, inkubator, dan oven. Alat-alat yang digunakan untuk elektroforesis
adalah microwave, tangki elektroforesis, dan kertas aluminium foil. Alat-alat lain
yang digunakan adalah NanoDrop 2000/2000c Spektrofotometer (Thermo Fisher
Scientific), mesin PCR PTC-100 (MJ Research, Inc), dan UV illuminator
Chemidoc EQ (Biorad).
3
Metode
Penanaman Tanaman Padi (Septiningsih et al. 2009)
Tanaman padi yang ditanam adalah padi host (Ciherang), padi BC4F1- Sub1,
tetua Sub1 (padi IR64-Sub1 dan padi Swarna-Sub1), dan padi IR42. Semua jenis
padi tersebut ditanam secara bersamaan pada waktu dan tempat yang sama agar
umur tanaman tersebut relatif sama sehingga diharapkan dapat berbunga secara
bersamaan.
Terdapat 5 buah bak tanam yang setiap baknya ditanami benih padi
Ciherang, IR42, IR64-Sub1 dan Swarna-Sub1 serta 3 galur dari benih BC4F1.
Setiap bak ditanami benih BC4F1 dari 3 galur berbeda yang setiap galurnya
diplotkan dalam 2 barisan tanam. Dengan kata lain, dalam setiap bak terdapat 10
barisan tanam. Setiap barisan tanam tersebut berisi 15 benih padi dari galur yang
berbeda. Tersedia sebanyak 14 kantong berisi benih padi dari galur BC4F1 yaitu 8
kantong berisi BC4F1 (Ciherang/IR64-Sub1) dan sisanya yaitu 6 kantong lagi
berisi BC4F1 (Ciherang/Swarna-Sub1). Dengan demikian, terdapat 28 barisan
tanam yang kemudian dibagi ke dalam setiap bak sehingga setiap bak tersebut
berisi kira-kira 5-6 barisan tanam dari benih galur BC4F1. Ilustrasi tersebut dapat
dilihat pada Gambar 1.
Benih-benih dari galur BC4F1 diberi penomoran sesuai dengan kode masingmasing galur, contoh: BC4F1 Cih/Sw-Sub1 1-4, BC4F1 Cih/IR-Sub1 5-5, dan
seterusnya. Jarak tanam setiap bibit sekitar 3 cm x 3 cm dengan luasan bak sekitar
60 cm x 30 cm = 1.8 m2. Jumlah semua benih yang ditanam adalah sekitar 720
benih kemudian benih tersebut dibiarkan tumbuh sekitar 14 hari di rumah kaca
untuk siap dilakukan uji genangan.
Gambar 1 Pola tanam benih padi dalam satu bak
Pengujian Toleransi Genangan (Septiningsih et al. 2009)
Pengujian toleransi genangan pada penelitian ini mengikuti prosedur dari
Septiningsih et al (2009). Benih BC4F1 Ciherang/IR64-Sub1 dan BC4F1
Ciherang/Swarna-Sub1 masing-masing sebanyak 15 benih, tetua dari hasil
persilangan BC4F1 yaitu Ciherang, IR64-Sub1, serta Swarna-Sub1 masing-masing
sebanyak 15 benih serta padi IR42 juga sebanyak 15 benih disemai bersamaan
dalam bak bermedia tanah dan dibiarkan tumbuh sekitar 14 hari sampai cukup
tinggi untuk diuji genangan. Padi varietas IR42 biasanya digunakan sebagai
4
kontrol toleran genangan karena sensitif terhadap genangan sehingga dapat
memudahkan mengetahui batas uji genangan yang dilakukan.
Setelah padi berumur 14 hari dalam bak tanam, pengujian toleransi
genangan dilakukan pada tanaman padi yang telah disejajarkan dalam bak tanam
tersebut. Bak tanam dimasukkan ke dalam bak (tray) yang lebih besar. Kemudian
bak yang sudah berisi tanaman padi tersebut diisi dengan air (digenangi) sampai
keseluruhan padi tersebut terendam/tergenang. Ketika kontrol IR42 sudah
menunjukkan kerusakan >50 % biasanya setelah 14 hari maka genangan air dalam
bak tersebut dibuang. Setelah itu tanaman padi yang bertahan tersebut secara
keseluruhan dibiarkan selama 10 hari untuk melakukan recovery dan ditumbuhkan
sampai daunnya siap dipanen untuk proses isolasi DNA.
Isolasi DNA Padi (Doyle & Doyle 1987)
DNA genom total tanaman padi BC4F1 diisolasi dari daun menggunakan
metode Doyle & Doyle (1987). Isolasi DNA berlangsung dalam empat tahap yang
meliputi pemanenan, preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA, dan pemekatan
DNA. Tanaman padi yang sudah melewati masa recovery selama kurang lebih 3
minggu kemudian dipanen dan dimasukkan daunnya dalam tabung mikro.
Pemecahan sel dibantu dengan cara penggerusan dalam mortar dan
ditambah 1000 µL bufer ekstraksi CTAB hingga homogen. Suspensi diinkubasi di
dalam waterbath selama 15 menit suhu 65 ºC (setiap 5 menit dikocok dengan cara
tabung dibolak-balik secara perlahan). Pemurnian DNA dari pengotor dihilangkan
dengan penambahan 100 µL fenol kloroform isoamilalkohol (PCI) ke dalam
tabung dan dikocok selama 20 detik hingga merata.
Suspensi selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 10
menit. Pemekatan DNA dilakukan dengan menambahkan 500 µL isopropanol ke
supernatan dan dicampur selama 5 menit. Sampel divorteks dan disentrifugasi
kembali pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Pelet yang diperoleh dicuci
dengan 500 µL etanol 70%. Campuran disentrifugasi kembali selama 5 menit
pada kecepatan 12000 rpm. Pelet tersebut selanjutnya dikeringkan di oven dengan
suhu 60 0C selama 10 menit. Pelet yang telah kering dilarutkan dengan larutan TE
yang mengandung ribonuklease sebanyak 50-100 µL. Kemudian pelet yang telah
dilarutkan dengan TE diinkubasi suhu 37 °C selama 30 menit. Selanjutnya pelet
DNA tersebut siap untuk diukur konsentrasi dan kemurniannya secara kuantitatif
menggunakan spektrofotometer.
Pengukuran Konsentrasi dan Kemurnian DNA (Sambrook & Russel 1989)
Hasil isolasi DNA selanjutnya dikuantifikasi untuk mengetahui konsentrasi
dan kemurniannya. Konsentrasi DNA ditentukan dengan spektrofotometer pada
panjang gelombang 260 nm dengan bantuan sinar UV. Sedangkan kemurnian
DNA diukur pada panjang gelombang 260/280 nm. Spektrofotometer yang
digunakan dalam penelitian ini adalah NanoDrop 2000/2000c Spektrofotometer.
Konsentrasi sampel yang sangat tinggi dapat diukur dengan alat ini tanpa
memerlukan pengenceran sebelumnya dikarenakan mempunyai sistem retensi
sampel. Adapun rentang panjang gelombang yang dapat dibaca oleh
spektrofotometer ini menjangkau seluruh spektrum cahaya yaitu 190-840 nm.
Sampel DNA sebanyak 2 µL diambil menggunakan pipet mikro kemudian
diinjekkan pada sensor tumpuan pada alat tersebut lalu secara otomatis nilai
5
konsentrasi dan kemurnian sampel terbaca pada software NanoDrop. DNA yang
sudah diukur konsentrasinya diencerkan dengan faktor pengenceran 10 kali
sehingga didapatkan konsentrasi yang seragam yang akan digunakan dalam
analisis PCR. Kemurnian larutan DNA diperoleh dari nisbah rasio absorban yang
terbaca pada panjang gelombang 260 nm dibagi nilai absorban pada panjang
gelombang 280 nm. Nisbah rasio antara 1,8-2,0 menunjukkan kemurnian DNA
yang tinggi.
Analisis PCR dengan Marka AEX1 (Septiningsih et al. 2008)
Hasil isolasi DNA yang diperoleh disamakan terlebih dahulu konsentrasinya
yaitu dilakukan pengenceran hingga 50 ng/µL, selanjutnya dilakukan tahap PCR.
Campuran reaksi untuk PCR terdiri atas 2 µL DNA 50 ng/µL, 2 µL buffer PCR
10x, 0.6 µL MgCl2 50 mM, 0.4 µL dNTP mix 50 mM, 1 µL masing-masing
primer AEX1F ukuran 231 bp sebagai
forward dengan sekuen 5’
AGGCGGAGCTACGAGTACCA 3’ dan primer AEX1R sebagai reverse dengan
sekuen 5’ GCAGAGCGGCTGCGA 3’ (Septiningsih et al. 2008), 0.16 µL Taq
polymerase, dan 12.84 µL MW. Kemudian dilakukan amplifikasi PCR dengan
kondisi denaturasi awal 94ºC selama 5 menit, denaturasi 94ºC selama 1 menit,
penempelan primer 55ºC selama 1 menit, perpanjangan primer 72ºC selama 2
menit, dan perpanjangan primer akhir 72ºC selama 5 menit. Program PCR yang
dilakukan menggunakan program SUB1C sebanyak 34 siklus reaksi.
Elektroforesis yang dilakukan menggunakan gel agarosa 2 % dengan marker 1kb.
Analisis PCR dengan Marka RM219 (Xu et al. 2004)
Seleksi keberadaan gen Sub1 juga dilakukan dengan menggunakan marka
mikrosatelit RM219 dengan campuran reaksi untuk reaksi terdiri atas 1 µL DNA
50 ng/µL, 2µL buffer PCR 10x, 1.2 µL MgCl2 50 mM, 0.4 µL dNTP mix 50 mM,
1 µL masing-masing primer RM219F sebagai forward dengan sekuen 5’
CGTCGGATGATGTAAAGCCT 3’ dan primer AEX1R sebagai reverse dengan
sekuen 5’ GCAGAGCGGCTGCGA 3’, 0.16 µL Taq polimerase, dan 12.84 µL
MW. Selanjutnya dilakukan amplifikasi PCR seperti pada marka AEX1. Gel
agarosa yang digunakan dalam PCR dengan marka kombinasi antara RM219F dan
AEX1R ini adalah 1%.
Elektroforesis Produk PCR (Septiningsih et al. 2008)
Sebanyak 2% gel agarosa dan 1x buffer TAE (Tris Acetic Acid EDTA)
dimasukkan ke dalam cetakan. Setelah gel agarosa memadat kemudian
dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis yang berisi 1x buffer TAE. Sebanyak
10 µL produk PCR dari masing-masing sampel ditambahkan dengan 2 µL loading
dye dan dicampur sempurna, kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel.
Penentuan ukuran dari produk PCR disertakan juga DNA standar (100 bp ladder)
sebagai pembanding. Sampel dielektroforesis dengan tegangan 80 volt selama
kurang lebih 1.5 jam. Setelah itu, gel agarosa diwarnai dengan larutan etidium
bromide (EtBr) sebanyak 10 mg/L selama 10 menit dan dicuci dengan air selama
10-20 menit. Gel agarosa kemudian divisualisasi dengan Chemidoc gel system
(Biorad).
6
HASIL
Penanaman Benih Padi BC4F1 Ciherang-Sub1
Penanaman benih padi BC4F1 Ciherang-Sub1 bertujuan memperoleh
populasi tanaman padi BC4F1 Ciherang-Sub1 yang akan dipanen daunnya untuk
proses isolasi DNA. Benih padi BC4F1 Ciherang-Sub1 ditanam secara bersamaan
dengan benih padi Ciherang, IR64-Sub1, Swarna-Sub1, serta IR42 dalam 5 buah
bak tanam bermedia tanah. Benih-benih padi tersebut ditanam sejajar/sebaris
antara satu sama lain. Pengamatan dan perawatan tanaman selama masa
pertumbuhan dilakukan secara intensif seperti penyiraman, pencegahan dari
serangan hama, dan lain-lain.
Setelah penanaman padi selama 14 hari, dihasilkan tanaman padi berjumlah
720 tanaman dengan kondisi tinggi ± 20 cm dan lebar ± 5 cm. Tanaman-tanaman
padi ini tumbuh tegak dengan daun berwarna hijau muda dan rata-rata mempunyai
cabang/batang sebanyak tiga buah (Gambar 2). Selanjutnya tanaman padi tersebut
diuji ketahanannya terhadap cekaman genangan dengan merendam semua bagian
tubuhnya dalam air dan dibiarkan selama 14 hari.
Tanaman Padi Hasil Pengujian Toleransi Genangan
Pengujian padi terhadap cekaman genangan bertujuan untuk menyeleksi
padi yang dapat bertahan hidup (survival) jika digenangi air selama waktu
tertentu. Batas waktu pengujian genangan ini disesuaikan dengan tingkat
kerentanan tanaman padi tersebut terhadap cekaman genangan yaitu sekitar 14
hari (Septiningsih et al. 2009). Tanaman yang dapat bertahan terhadap genangan
diasumsikan sudah tersisipi gen Sub1 (positif Sub1) (Septiningsih et al. 2009).
Proses pengujian toleransi genangan selama dua minggu ditandai dengan
kerusakan pada padi IR42. Tahap selanjutnya adalah pengurangan air dari dalam
bak secara perlahan dan masih menyisakan sedikit air di dalam bak agar tanaman
tidak stress. Kemudian tanaman dibiarkan 10-21 hari untuk melakukan recovery
(tumbuh normal kembali) dengan kondisi daun yang tidak terlalu tegak dan batang
lebih menjuntai (Septiningsih et al. 2009). Kondisi padi dari awal penanaman
sampai proses uji toleransi genangan diperlihatkan pada Gambar 3.
Gambar 2 Padi hasil penanaman selama 14 hari
7
Hasil yang diperoleh dari uji genangan yaitu hanya sebagian kecil tanaman
BC4F1 yang mampu bertahan hidup yaitu 21 tanaman varietas Ciherang/IR64Sub1 dan 15 tanaman varietas Ciherang/Swarna-Sub1 dari 720 benih padi yang
ditanam. Tanaman-tanaman yang bertahan ini dapat dilihat pada Tabel 1.
DNA Hasil Isolasi dan Karakterisasi
DNA daun padi dapat dipisahkan dari kontaminan seperti polisakarida dan
metabolit sekunder menggunakan bufer ekstraksi CTAB. Menurut Ardiana
(2009), DNA seringkali terkontaminasi amilum, tanin, pigmen, alkaloid dan
flavonoid. Karakterisasi DNA adalah pengenalan substansi DNA melalui
identifikasi secara kualitatif dan kuantitatif (Subandi 2010). Secara kualitatif,
DNA diidentifikasi melalui visualisasi gel agarosa setelah proses elektroforesis.
Sedangkan secara kuantitatif, DNA dianalisis menggunakan spektrofotometer
dengan panjang gelombang 260 dan 280 nm.
Isolasi DNA padi BC4F1 Ciherang-Sub1 menggunakan metode CTAB
dikatakan berjalan baik dikarenakan DNA yang dihasilkan relatif banyak. Hal ini
sejalan dengan nilai konsentrasinya yang relatif besar yaitu antara rentang 1077.24418.4 ng/µl dengan rataan sekitar 1960.4 ng/µl setelah diukur dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm. Sedangkan nilai
kemurniannya bervariasi antar rentang 1,81 – 1,98 pada rasio panjang gelombang
260/280 nm dengan nilai rata-rata 1.94 (Tabel 1).
Gambar 3 Uji genangan padi BC4F1 Ciherang-Sub1. Ket : (1) Benih-benih
padi ditabur dalam media tanah dengan pola barisan mendatar; (2)
Padi yang sudah berumur 14 minggu; (3) Padi dalam cekaman
genangan air; (4) Kondisi padi setelah uji genangan (elongasi sel)
dan dibiarkan selama 10 hari untuk proses recovery (pemulihan
kembali)
8
Tabel 1 Pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA daun padi hasil isolasi
Varietas padi
Ciherang
Swarna-Sub1
IR64-Sub1
IR42
11-3 C/IR 3
12-1 C/Sw 4
13-1 C/IR 4
14 C/IR 6
1-1 C/IR 6
12-2 C/Sw 4
13-2 C/IR 5
13-1 C/IR 2
13-2 C/IR 8
12-2 C/Sw 7
5 C/Sw 5
13-2 C/IR 3
12-1 C/Sw 1
14-1 C/Sw 9
14 C/IR 7
12-2 C/Sw 2
5 C/Sw 8
13-1 C/IR 7
13-1 C/IR 2
13-2 C/IR 11
1-2 C/IR 7
12-1 C/Sw 6
11-3 C/IR 8
1-1 C/IR 10
12-1 C/Sw 11
11-4 C/IR 6
12-2 C/Sw 1
12-2 C/Sw 5
11-3 C/IR 3
13-1 C/IR 8
14-2 C/Sw 1
5 C/Sw 4
14 C/IR 3
12-1 C/Sw 9
13-2 C/IR 7
14 C/IR 2
Konsentrasi
(ng/µl)
1253.7
1521.3
1504.7
1568.4
1880.4
1378.7
1203.7
2365.2
2080.1
2543.5
4418.4
2473.9
3249.9
2285.2
1321.7
1468.3
2745.2
2587.1
1811.6
1410.4
2339.7
1983.7
1343.5
1589.8
2071.8
2771.6
1521.3
1137.0
1077.2
2247.0
1350.0
1730.5
1787.3
1912.6
1590.0
1860.1
1313.8
2574.6
2907.8
2235.8
A260/280
1.93
1.97
1.93
1.96
1.95
1.97
1.94
1.93
1.91
1.91
1.98
1.90
1.96
1.95
1.97
1.98
1.87
1.92
1.97
1.93
1.96
1.98
1.95
1.92
1.94
1.88
1.94
1.97
1.97
1.95
1.93
1.92
1.92
1.98
1.93
1.89
1.81
1.88
1.91
1.95
9
Identifikasi Padi BC4F1 Ciherang-Sub1 melalui Analisis PCR
Marka Sub1A (AEX1)
Seleksi tanaman BC4F1 secara spesifik dilakukan dengan analisis PCR
berbasis marka molekul gen Sub1. Adapun marka molekul gen Sub1 yang
digunakan dalam PCR ini adalah marka AEX1. Marka ini secara spesifik
dirancang untuk mendeteksi keberadaan alel toleran genangan.
Data yang diperoleh dari hasil PCR dan elektroforesis menunjukkan hasil
yang positif baik pada sampel DNA BC4F1 Ciherang/Swarna-Sub1 (Gambar 4)
maupun pada BC4F1 Ciherang/IR64-Sub1 (Gambar 5). Hal ini terlihat dari adanya
deretan pita-pita DNA berukuran 231 bp hasil visualisasi gel agarosa yang relatif
jelas.
Gambar 4 Hasil elektroforesis padi BC4F1 Ciherang/Swarna-Sub1 dengan marka
AEX1F dan AEX1R. Padi Ciherang (C), donor Swarna-Sub1 (S),
donor IR64-Sub1, kontrol peka IR42, dan sampel BC4F1
Ciherang/Swarna-Sub1 dengan marker (m) DNA 1kb
Gambar 5 Hasil elektroforesis padi BC4F1 Ciherang/IR64-Sub1 dengan marka
AEX1F dan AEX1R. Padi Ciherang (C), donor Swarna-Sub1 (S),
donor IR64-Sub1, kontrol peka IR42, dan sampel BC4F1
Ciherang/IR64-Sub1 dengan marker (m) DNA 1kb
10
Pada hasil visualisasi terlihat bahwa padi Ciherang (host) sebagai kontrol
negatif dan padi IR42 sebagai kontrol sensitif (peka) tidak mempunyai pita pada
ukuran 231 bp, sehingga terbukti kedua tanaman tersebut tidak toleran genangan
(Septingsih et al. 2009). Padi BC4F1 Ciherang/Swarna-Sub1 dan BC4F1
Ciherang/IR64-Sub1 mempunyai pita DNA berukuran 231 bp yang berarti kedua
jenis padi ini memiliki gen toleran genangan (Sub1).
Marka Gabungan RM219F dan AEX1R
Penelitian ini menggunakan marka mikrosatelit yang bertujuan
membedakan heterozigositas pada tanaman padi BC4F1 Ciherang-Sub1. Marka
mikrosatelit yang digunakan dalam penelitian ini adalah marka RM219. Marka ini
dipilih karena terkait dan ideal untuk seleksi toleran genangan (Xu et al. 2004).
Analisis PCR dilakukan dengan marka gabungan antara primer RM219F sebagai
forward dan AEX1R sebagai reverse. Hal ini bertujuan untuk membedakan tetua
Ciherang, Swarna-Sub1, IR64-Sub1, dan BC4F1 Ciherang-Sub1, serta mendeteksi
pola heterozigositas masing-masing tanaman tersebut.
Hasil yang diperoleh dari visualisasi elektroforesis menunjukkan pola
sebaran pita dari semua tanaman. Sampel Swarna dan IR64 menunjukkan pita
yang tidak ada pada padi Ciherang. Pita Ciherang (host) dan pita Swarna/IR64
(donor) yang dimiliki oleh tanaman BC4F1 Ciherang-Sub1 dalam pola sebaran
pitanya menunjukkan bahwa padi tersebut bersifat heterozigot (Moeljopawiro
2010). Tanaman nomor 2 dan nomor 5 masing-masing memiliki pita dari kedua
tetua yaitu berukuran 740 bp. Oleh karena itu dapat disimpulkan bahwa kedua
tanaman tersebut bersifat heterozigot sedangkan tanaman lainnya bersifat
homozigot (Gambar 6).
Gambar 6 Hasil elektroforesis padi BC4F1 Ciherang-Sub1 dengan marka RM219F
dan AEX1R. Padi Ciherang (C), donor Sub1 (Swarna-Sub1 (S) dan
IR64-Sub1) sampel BC4F1 Ciherang- Sub1 dengan marker (m) DNA
1kb
11
PEMBAHASAN
Pemuliaan Padi BC4F1 Ciherang-Sub1
Benih padi BC4F1 Ciherang-Sub1 pada penelitian ini merupakan hasil
penggabungan sifat yang dimiliki dari dua jenis tetua yang berbeda melalui
persilangan antara benang sari dari padi Ciherang dan putik dari padi SwarnaSub1 maupun IR64-Sub1. Penggabungan sifat yang dihasilkan dari kedua tetua
pada BC4F1 terjadi secara acak, sehingga kombinasi sifat yang dihasilkan bersifat
lebih menguntungkan dari kedua tetuanya. Keturunan yang dihasilkan memiliki
sifat baru yang berbeda dengan kedua induknya (Susanto 2008). Hasil persilangan
antara Ciherang (host) dengan BC3F1 Ciherang-Sub1 menghasilkan komposisi gen
96,375% : 3,625% yang artinya gen dari kedua tetua telah bersegregasi dalam
tanaman BC4F1 dengan komposisi paling dominan adalah gen Ciherang (Marlina
2011).
Pemuliaan padi BC4F1 Ciherang-Sub1 dilakukan melalui metode
persilangan terarah (site-directed crossing). Metode site-directed crossing atau
lebih dikenal dengan sebutan marker-assisted backcrossing (MAB) dapat
meminimalisasi intogresi gen donor sehingga hanya sifat yang diinginkan saja
yang terintroduksi pada host, dengan kata lain sifat-sifat yang baik pada host dapat
dipertahankan (Mackill et al. 2007). Metode ini lebih menguntungkan bila
dibandingkan dengan seleksi fenotip karena berdasarkan pada sifat genetik saja
dan tidak dipengaruhi oleh lingkungan. Oleh karena itu, kegiatan pemuliaan
menjadi lebih cepat, tepat, dan relatif lebih hemat biaya dan waktu (Azrai 2005).
Perbanyakan padi BC4F1 Ciherang-Sub1 dilakukan melalui penanaman
selama 14 hari. Benih- benih padi BC4F1 Ciherang-Sub1 ditanam hingga tumbuh
menjadi tanaman padi seutuhnya. Populasi padi yang dihasilkan memiliki tubuh
tegak berukuran tinggi ± 20 cm dan lebar ± 5 cm sesuai metode penanaman
Septiningsih et al. (2009). Populasi padi terintrogesi gen Sub1 memiliki tubuh
tegak setelah ditanam selama 14 hari dan cukup umur untuk pengujian terhadap
genangan (Septiningsih et al. 2009). Oleh karena itu padi yang akan diuji terhadap
cekaman genangan harus memiliki tubuh tegak sehingga seluruh tubuhnya kuat
jika digenangi dengan air.
Pengaruh Uji Toleransi Genangan terhadap Padi BC4F1 Ciherang-Sub1
Tanaman padi melakukan respon ketika seluruh bagian tubuhnya tergenang
oleh air. Respon tanaman pada kondisi seperti itu adalah dengan melakukan dua
proses pertahanan diri, yaitu pemanjangan sel (elongasi) dan toleransi terhadap
cekaman tersebut (Fukao & Bailey-Serres 2008). Proses pemanjangan sel
(elongasi) pada kondisi ini secara simultan dilakukan tanaman untuk bertahan
hidup (survival). Konsekuensinya adalah tanaman harus menghabiskan cadangan
makanannya untuk proses tersebut tanpa memperoleh asupan nutrisi dari
lingkungan. Hal ini berdampak buruk pada tanaman jika kondisi tersebut
berlangsung terus-menerus dalam waktu yang relatif lama. Tanaman dapat mati
sebelum air kembali surut karena dalam kondisi tergenang proses fotosintesis
12
terhambat akibat rendahnya ketersediaan CO2 dan penetrasi cahaya (Jackson &
Ram 2003). Ketersediaan CO2 dalam air lebih rendah dibandingkan di udara yaitu
dengan konsentrasi sebanyak 0.004 mol m-3 sedangkan di udara
kesetimbangannya sebanyak 0.01 mol m-3 (Sarkar et al. 2006).
Padi juga merespon kondisi cekaman genangan melalui sifat ketahanannya
terhadap genangan tersebut. Sifat tahan/toleran ini dimiliki padi yang sudah
tersisipi gen toleran genangan (Sub1). Sub1 (Submergence 1) merupakan gen
pengendali sifat toleran terhadap genangan (Xu et al. 2004). Gen ini menghambat
gen yang berkaitan dengan elongasi sel dan katabolisme karbohidrat. Introgesi
Sub1 pada padi mengakibatkan tanaman lebih toleran terhadap genangan.
Beberapa gejala metabolisme padi toleran ini meliputi karbohidratnya bersifat
terlarut dalam air (soluble), lambatnya penurunan pati yang dikonsumsi padi,
mRNA α-amilase dan sukrosa sintasenya berukuran relatif kecil, tingginya
aktivitas piruvat dekarboksilase (Pdc) dan alkohol dehidrogenase (Adh), produksi
etilennya relatif sedikit, dan transkripsi gen ekspansinya semakin berkurang
(Fukao & Bailey-Serres 2008). Berdasarkan data-data fisiologi di atas dapat
disimpulkan bahwa strategi survival padi terhadap genangan berlangsung melalui
konservasi karbohidrat, represi elongasi sel, dan peningkatan kapasitas fermentasi
(Perata & Voesenek 2006; Fukao & Bailey-Serres 2008).
Berdasarkan hasil yang diperoleh, tanaman padi BC4F1 yang mampu
bertahan hidup terdapat 21 tanaman varietas Ciherang/IR64-Sub1 dan 15 tanaman
varietas Ciherang/Swarna-Sub1. Hal ini sesuai dengan prosedur Septiningsih et al.
(2009) yang menyatakan bahwa tanaman yang dapat bertahan (survival) terhadap
genangan diasumsikan sudah tersisipi gen Sub1 (positif Sub1). Sedangkan
sebaliknya, padi yang mati diasumsikan tidak terintroduksi gen Sub1 (negatif
Sub1). Padi intoleran genangan akan mati setelah 14 hari dalam cekaman
genangan karena strategi pertahanan dirinya melalui elongasi sel yang
menitikberatkan sejumlah karbohidratnya untuk dipakai memperpanjang sel-sel
tubuhnya. Padi mengalami kondisi kekurangan cadangan makanan karena
terhambatnya proses fotosintesis dalam air. Fotosintesis terhambat akibat
rendahnya ketersediaan CO2 dan penetrasi cahaya di dalam air. Oleh karena itu
dapat disimpulkan bahwa hanya padi yang memiliki gen Sub1 saja yang dapat
bertahan hidup terhadap cekaman genangan selama 14 hari.
Kuantifikasi DNA Padi BC4F1 Ciherang-Sub1
Kuantifikasi DNA adalah suatu cara identifikasi DNA yang meliputi
pengukuran konsentrasi serta kemurniaan DNA. Konsentrasi DNA dapat
terkuantifikasi menggunakan bantuan sinar UV (ultraviolet) pada panjang
gelombang 260 dan 280 nm. Sedangkan kemurnian dan kualitas isolat DNA
diukur melalui nisbah rasio panjang gelombang 260/280 (William et al. 2007).
Apabila rasionya bernilai < 1.8 maka DNA tersebut terkontaminasi oleh protein
sedangkan jika nilainya > 2.0 maka DNA terkontaminasi oleh fenol, kloroform,
atau RNA. DNA murni diperoleh pada rentang nilai 1.8-2.0 (Sambrook et al.
1989).
Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses
destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman
13
memiliki dinding sel yang kuat dan seringkali pada beberapa jenis tanaman,
kontaminasi tersebut sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Pemakaian suatu
bufer ekstraksi dapat memudahkan proses memperoleh DNA. Bufer ekstraksi
CTAB dapat memisahkan DNA dari kontaminan lain dan menghasilkan
konsentrasi DNA yang relatif lebih banyak jika dibandingkan dengan bufer lain
(Jose & Usha 2000).
Berdasarkan hasil pengukuran konsentrasi DNA, diperoleh jumlah DNA
yang relatif banyak yaitu dengan nilai konsentrasi antara rentang 1077.2-4418.4
ng/µl. Nilai ini sangat berpengaruh pada analisis PCR dalam proses
amplifikasinya. Menurut Nurhaimi-Haris et al. (2003), konsentrasi DNA akan
berdampak pada kualitas fragmen hasil amplifikasi. Jika konsentrasi DNA terlalu
rendah fragmen yang dihasilkan sebagai pita akan sangat tipis pada gel atau
bahkan pita tidak terlihat secara visual, sebaliknya jika konsentrasi DNA terlalu
tinggi akan menyebabkan fragmen terlihat tebal sehingga sulit dibedakan antara
satu pita dengan pita lainnya.
DNA padi BC4F1 Ciherang-Sub1 yang diperoleh tergolong memiliki tingkat
kemurnian yang relatif tinggi. Nilai kemurniannya bervariasi antar rentang 1,811,98 pada rasio panjang gelombang 260/280 nm. Hal ini sesuai pernyataan
Sambrook et al. (1989) yaitu DNA murni berada pada rentang nilai 1.8-2.0. Hal
ini diperkuat dengan teori Murray et al. (2003) yang menyatakan bahwa DNA
dapat menyerap sinar UV pada panjang gelombang 260 nm karena adanya ikatan
rangkap terkonjugasi pada basa heterosiklik purin dan pirimidin. Hal ini
menyebabkan nukleosida, nukleotida, dan polinukleotida dapat menyerap sinar
tersebut. Oleh karena itu makromolekul lain selain DNA seperti protein dan
karbohidrat tidak dapat terdeteksi pada panjang gelombang tersebut.
Identifikasi Padi BC4F1 Ciherang-Sub1 melalui Analisis PCR
Identifikasi padi BC4F1 Ciherang-Sub1 melalui analisis PCR dibantu dengan
beberapa marka molekuler. Marka molekuler yang digunakan terkait dalam
toleransi genangan pada penelitian ini adalah marka AEX1 dan RM219. Marka
molekuler yang dirancang khusus untuk mendeteksi keberadaan alel toleran
genangan (gen Sub1) adalah marka AEX1. Sedangkan RM219 adalah marka
mikrosatelit yang digunakan khusus untuk melacak pola heterozigositas alel-alel
genom pada tanaman.
Analisis PCR dengan marka AEX1 bertujuan untuk mengamplifikasi
fragmen DNA Sub1 yang telah terlacak oleh marka AEX1 yaitu pada ukuran 231
bp. Marka ini dapat melacak keberadaan gen Sub1 pada ukuran pita 231 bp
(Septiningsih et al. 2009). Analisis ini pun secara tidak langsung dapat
menyeleksi DNA padi yang tidak terintrogesi alel toleran genangan. Apabila pada
proses visualisasinya tidak terlihat pita berukuran 231 bp, maka DNA tersebut
tidak mengandung alel toleran genangan.
Berdasarkan data yang diperoleh, DNA padi BC4F1 Ciherang-Sub1 baik itu
dari golongan BC4F1 Ciherang/Swarna-Sub1 maupun golongan BC4F1
Ciherang/IR64-Sub1 menunjukkan hasil yang positif. Hal ini terlihat dari adanya
deretan pita-pita DNA berukuran 231 bp hasil visualisasi gel agarosa yang relatif
jelas. Hasil ini sesuai dengan penelitian Septingsih et al. (2009) yang menyatakan
14
bahwa padi yang telah terintroduksi gen Sub1 mempunyai pita DNA pada ukuran
231 bp mengikuti tetua donornya yaitu IR64-Sub1 dan Swarna-Sub1. Di sisi lain
terlihat pula bahwa padi Ciherang (host) sebagai kontrol negatif dan padi IR42
sebagai kontrol sensitif (peka) tidak mempunyai pita pada ukuran 231 bp,
sehingga terbukti kedua tanaman tersebut tidak toleran genangan. Keberadaan gen
Sub1 pada padi BC4F1 ini berimplikasi pada keberhasilan metode persilangan
terarah yang telah dilakukan pada generasi sebelumnya yaitu BC3F1.
Marka mikrosatelit atau SSR (Simple Sequence Repeat) adalah marka
molekul berupa urutan dinukleotida atau tetranukleotida yang berulang dan
berurutan. Marka ini mampu membedakan homozigot dan heterozigot
(codominant) serta dapat melacak banyak alel pada genom tanaman (McCouch et
al. 2002). Selain itu marka ini mempunyai kelebihan yaitu penggunaannya tidak
merusak bahan tanaman karena jumlah DNA sampel yang dibutuhkan relatif
rendah dan dapat melacak gen secara akurat. Marka mikrosatelit yang digunakan
dalam penelitian ini adalah marka RM219. Marka ini dipilih karena terkait dan
ideal untuk seleksi toleran genangan, selain itu relatif praktis dan efisien. Marka
mikrosatelit RM219 memiliki ukuran pita 204 dan 194 bp (Xu et al. 2004).
Analisis PCR dilakukan dengan marka gabungan antara primer RM219F sebagai
forward dan AEX1R sebagai reverse. Hal ini bertujuan untuk membedakan tetua
Ciherang, Swarna-Sub1, IR64-Sub1, dan BC4F1 Ciherang-Sub1, serta mendeteksi
pola heterozigositas masing-masing tanaman tersebut.
Berdasarkan data yang diperoleh dari hasil visualisasi elektroforesis
menunjukan bahwa terlihat pola sebaran pita dari semua tanaman. Sampel Swarna
dan IR64 menunjukkan pita yang tidak ada pada padi Ciherang. Pita Ciherang
(host) dan pita Swarna/IR64 (donor) yang dimiliki oleh tanaman BC4F1 CiherangSub1 dalam pola sebaran pitanya menunjukkan bahwa padi tersebut bersifat
heterozigot (Moeljopawiro 2010). Terdapat dua tanaman yang masing-masing
memiliki pita yang sama dari kedua tetua pada ukuran 740 bp yaitu sampel 2 dan
5. Kedua tanaman tersebut bersifat heterozigot karena masing-masing mempunyai
pita yang sama dari kedua tetuanya sedangkan tanaman lainnya bersifat
homozigot.
SIMPULAN
Identifikasi dan karakterisasi tanaman BC4F1 Ciherang-Sub1 telah berhasil
dilakukan menggunakan PCR berbasis marka toleran genangan AEX1 dan
RM219. Sebanyak 21 tanaman Ciherang/IR64-Sub1 dan 15 tanaman
Ciherang/Swarna-Sub1 yang bertahan hidup memiliki konsentrasi yang relatif
besar antara rentang 1077.2-4418.4 ng/µl dengan nilai kemurnian diantara rentang
1.81-1.98 yang tergolong DNA murni. Hasil elektroforesis amplikon
menunjukkan keberadaan gen Sub1 (pita 231 bp) pada tanaman BC4F1 CiherangSub1, sekaligus menunjukkan keberhasilan metode persilangan terarah yang telah
dilakukan pada generasi sebelumnya (BC3F1 Ciherang-Sub1). Penggunaan marka
gabungan RM219F dan AEX1R dapat menunjukkan heterozigositas pada sampel
hasil persilangan.
15
DAFTAR PUSTAKA
Ardiana DW. 2009. Teknologi isolasi DNA genom tanaman padi dengan
menggunakan modifikasi bufer CTAB. Buletin Teknik Pertanian Vol. 14 No. 1
2009: 12-16.
Armstrong W, Drew MC. 2002. Root Growth and Metabolism Under Oxygen
Deficiency. Di dalam: Waisel Y, Eshel A, Kafkafi U, editor. Plant roots: the
hidden half. Ed ke-3. New York: Marcel Dekker. hlm 729–761.
Azrai M. 2005. Pemanfaatan marka molekuler dalam proses seleksi pemuliaan
tanaman. J Agro Biogen 1:26-37.
Badan Ketahanan Pangan. 2009. Konsumsi Padi Indonesia 2009. [internet].
[diunduh 23 Juli 2012]. Tersedia pada: http://www.badanketahananpangan.com
[BBPTP] Balai Besar Penelitian Tanaman Padi. 2009. Deskripsi Varietas Padi.
[internet].
[diunduh
10
Juli
2012].
Tersedia
pada:
pustaka.litbang.deptan.go.id/bppi/lengkap/bpp09001.pdf.
CGIAR (Consultative Group on International Agriculture Research). 2006.
Intensified Research Effort Yields Climate-Resilient Agriculture To Blunt
Impact of Global Warming, Prevent Widespread Hunger.Heat-tolerant Wheat,
Flood-proof Rice, Satellites for Carbon Trading Among New Technologies.
Doyle JJ, Doyle JL. 1987. A rapid DNA isolation from small amount of fresh leaf
tissue. J Phytochem Bull 19:11-15.
Fukao T, Bailey-Serres J. 2008. Submergence tolerance conferred by Sub1A is
mediated by SLR1 and SLRL1 restriction of gibberellin responses in rice.
PNAS 105: 16814-19.
Jackson MB, Ram PC. 2003. Physiological and molecular basis of susceptibility
and tolerance of rice plants to complete submergence. Annals of Botany 91:
227–241.
Jose J, Usha R. 2000. Extraction of geminiviral DNA from a highly mucilaginous
plant (Abelmoschus esculentus). Plant Mol. Biol. Rep. 18: 349-355.
Mackill DJ et al. 2007. Marker assisted selection for submergence tolerance in
rice. Mol Plant Breeding 5:207-208.
Marlina E. 2011. Aplikasi PCR berbasis marka Sub1 (AEX1 dan RM219) pada
seleksi padi BC1F1 Ciherang-Sub1 [Skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
McCouch et al. 2002. Development and mapping of 2240 new SSR markas for
rice (Oryza sativa L.). DNA Res 9: 199-207.
Moeljopawiro S. 2010. Aplikasi marka molekuler terkait dengan umur genjah 90
hari dan produktivitas 7 ton/ha pada padi. Balai Besar Penelitian dan
Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian.
Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. 2003. Biokimia Harper. Edisi
ke-27. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC.
Nugroho et al. 2002. Peta areal untuk pengembangan pertanian lahan pasang
surut dan pantai. Proyek Penelitian Sumber Daya Lahan. Pusat Penelitian
Tanah dan Agro Klimat. Badan Litbang Pertanian.
Nurhaimi-Haris et al. 2003. Kemiripan genetik klon karet (Hevea brasiliensis
Muell. Arg.) berdasarkan metode Amplifies Fragment Length. Men Perk 71:
1-15.
16
Perata P, Voesenek L. 2006. Submergence tolerance in rice requires Sub1A, an
ethylene-response-factor-like gene. Trends in Plant Science 12 (2).
Sambrook J, Fritsch EF, and Manuatis T. 1989. Moleculer Cloning : A Laboratory
Manual. New York : Harbour Lab press.
Sarkar RK, Reddy JN, Sharma SG, Ismail AM. 2006. Physiological basis of
submergence tolerant in rice and implications on crop development. Current
Science 91: 899-906.
Septiningsih et al. 2009. Development of submergence tolerant rice cultivars: The
Sub1 locus and beyond. Annals of Botany 103: 151-160.
Sitorus FMT. 2009. Benih bersertifikat basis swasembada beras. Suara
Pembaharuan 21 Agustus 2009.
Subandi. 2010. Isolasi dan karakterisasi DNA dari tanaman kina : Cinchona
ledgeriana. MIPA: Jurnal matematika, Ilmu pengetahuan alam dan
pengajarannya No 1 Vol 29, Januari-2010.
Susanto U. 2008. Padi Hibrida Vs Padi Inhibrida. Buletin Organik th.II/ edisi
I/Sept-Okt 2008. [internet]. [diacu 23 Juli 2012]. Tersedia pada:
www.ri1organik.com
William W, Wilfinger, Karol Mackey, Chomczynski P. 2007. Effect of pH and
ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity.
BioTechniques 22: 474-481.
Xu K, Deb R, Mackill DJ. 2004. A microsatellite Marker and a Codominant
PCR-Based Marker for Marker assisted selection of Submergence Tolerance in
Rice. Crop Sci. 44: 248–253.
17
Lampiran 1 Diagram alir penelitian
Penanaman dan pengujian genangan padi BC4F1 Ciherang-Sub1
selama masing-masing 14 hari dalam bak selanjutnya dibiarkan
selama 3-4 minggu untuk proses recovery
Isolasi DNA
Kuantifikasi analisis kemurnian DNA
(Spektrofotometri)
Amplifikasi menggunakan marka AEX1
dan gabungan AEX1-RM219 (PCR)
Visualisasi sampel (Elektroforesis)
Identifikasi dan karakterisasi tanaman BC4F1
Ciherang-Sub1
18
Lampiran 2 Diagram alir uji genangan benih padi BC4F1 Ciherang-Sub1
Penanaman benih padi Ciherang (host),
padi donor Sub1 (IR64-Sub1 dan SwarnaSub1), padi IR42, dan galur-galur padi
BC4F1 Ciherang/Swarna-Sub1 dalam bak
tanam berukuran 60 cm x 30 cm
BC F Ciherang/IR64-Sub1
Benih-benih disebar merata mengikuti pola
barisan
Tanaman setelah 14 hari masa
pertumbuhan
Uji genangan selama 14 hari dalam bak
tanam dimasukkan ke dalam bak plastik
yang dapat menampung 100 L air
Pemulihan (recovery) selama 10-21 hari
dalam ember dan tanaman siap untuk
proses isolasi
19
Lampiran 3 Diagram alir isolasi DNA (Doyle & Doyle 1987)
20
Lampiran 4 Komposisi bufer ekstraksi DNA (Marlina 2011)
Larutan Stok
Jumlah untuk 500
mL
Tris-Cl 1 M (pH = 8,5)
NaCl 5 M
EDTA 0.25 M
CTAB
PVP
Merkaptoetanol
Konsentrasi akhir
50 mL
140 mL
40 mL
10 g
10 g
1 mL
100 mM
1.4 M
20 mM
2% (b/v)
2% (b/v)
0.2% (v/v)
Lampiran 5 Varietas-varietas padi hasil persilangan yang mengandung gen Sub1
(Xu et al. 2004; Sarkar et al. 2006)
Varietas
IR64-Sub1 (IR07F102)
Swarna-Sub1 (IR05F102)
Samba MahsuriSub1 (IR07F101)
TDK1-Sub1 (IR07F289)
BR11-Sub1 (IR07F290)
CR1009Sub1 (IR07F291)
PSB RC68
IR49830-7-1-2-3
Lama
berbunga
(hari)
Lama
matang
(hari)
Tinggi
(cm)
Produktivitas
(ton/ha)
86
104
116
134
95
85
5.9
5.3
98
126
85
6.5
Sedang dikarakterisasi oleh IRRI
98
100
121
130
121
110
6.5
-
21
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor, Jawa Barat pada tanggal 13 Mei 1990 dari ayah
Yunus dan Ibu Dedeh. Penulis merupakan anak keempat dari enam bersaudara.
Pendidikan formal penulis dimulai dari SD Negeri Kotabatu I dan melanjutkan
pendidikan di SMP Rimba Teruna Bogor. Penulis lulus tahun 2008 dari SMA
Negeri 4 Bogor dan pada tahun yang sama diterima di Institut Pertanian Bogor
(IPB) melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis terpilih
sebagai mahasiswa mayor Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah melakukan Praktik Lapangan
(PL) di Laboratorium Biologi Molekuler dan Rekayasa Genetika, Balai Penelitian
Bioteknologi Perkebunan Indonesia Jl. Taman Kencana 1 Bogor selama periode
Juli hingga Agustus 2011 dengan judul Amplifikasi dan kloning daerah promotor
gen yang terkait dengan abnormalitas pembungaan kelapa sawit (Elaeis
guineensis Jacq.)
Penulis pernah mengikuti organisasi selama perkuliahan yaitu anggota
Divisi Cyber Community Koperasi Mahasiswa (Kopma) IPB pada tahun 20092010. Penulis juga pernah mengikuti berbagai kepanitiaan seperti Kesehatan dan
Keselamatan Kerja tahun 2009, Lomba Karya Ilmiah Populer tahun 2010, Masa
Pengenalan Departemen tahun 2010, dan Biochemistry Expo 2010. Penulis
pernah mengikuti kegiatan dari IPB yaitu IPB Goes to field Peduli Merapi 2011
yang bertempat di dusun Pule, Magelang Jawa Tengah. Penulis juga pernah
mendapat penghargaan dalam bidang olahraga dan seni berupa juara 3 Futsal TPB
CUP 2008, juara 1 Drama Musikal SPIRIT 2010, juara 2 Futsal BCL 2012, dan
juara 1 Akustik BCL 2012.
GENANGAN POPULASI PADI BC4F1 CIHERANG-Sub1
RESTU RAHAYU
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Identifikasi dan
Karakterisasi Gen Toleran Genangan Populasi Padi BC4F1 Ciherang-Sub1 adalah
benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing yang dipimpin oleh Dr
Djarot Sasongko Hami Seno, MSi dan belum diajukan dalam bentuk apa pun
kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip
dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juni 2013
Restu Rahayu
NIM G84080044
ABSTRAK
RESTU RAHAYU. Identifikasi dan Karakterisasi Gen Toleran Genangan
Populasi Padi BC4F1 Ciherang-Sub1. Dibimbing oleh DJAROT SASONGKO
HAMI SENO dan TRI JOKO SANTOSO.
Cekaman genangan merupakan salah satu faktor penghambat pada
produktivitas tanaman padi. Oleh karena itu, dalam rangka ketahanan pangan,
perlu dikembangkan padi toleran genangan. Introduksi gen toleran genangan
(Sub1) dilakukan melalui persilangan terarah antara padi Ciherang sebagai tetua
pemulih dengan padi IR64-Sub1 dan Swarna-Sub1 sebagai tetua donor Sub1.
Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi dan mengkarakterisasi tanaman BC4F1
Ciherang-Sub1 hasil persilangan balik antara tanaman BC3F1 Ciherang-Sub1
dengan Ciherang. Keberadaan gen Sub1 pada sampel dideteksi menggunakan
analisis PCR berbasis marka molekul terkait gen Sub1. Tahapan penelitian
dimulai dari penanaman benih padi BC4F1 Ciherang-Sub1, pengujian toleransi
genangan, isolasi DNA padi, pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA padi,
serta analisis PCR dengan marka AEX1 dan RM219. Hasil uji genangan diperoleh
15 tanaman BC4F1 Ciherang/Swarna-Sub1 dan 21 tanaman BC4F1 Ciherang/IR64Sub1. Hasil PCR dengan marka AEX1F dan AEX1R menunjukkan pita DNA
berukuran 231 bp sedangkan hasil PCR dengan marka gabungan RM219F dan
AEX1R dapat membedakan sifat heterozigot antara padi Ciherang, Swarna-Sub1
dan IR64-Sub1.
ABSTRACT
RESTU RAHAYU. Identification and Characterization Gene of Submergence
Tolerant BC4F1 Ciherang-Sub1 Rice Population. Supervised by DJAROT
SASONGKO HAMI SENO and TRI JOKO SANTOSO.
Submergence stress is one of the inhibitor factor at rice productivity.
Therefore, in order to improve food security, the rice of submergence-tolerant
need to be developed. Introduction of gene related to submergence-tolerant (Sub1)
was done by site-directed crossing between Ciherang rice as host with rice IR64Sub1 and Swarna-Sub1 as Sub1 donor. The aim of this study was to identify and
characterize BC4F1 Ciherang-Sub1 that resulted from backcross between BC3F1
Ciherang-Sub1 and Ciherang. The existence of Sub1 gene was detected by using
PCR analysis based on molecular marker that concerned Sub1 gene. Stages of
research was started from planting of BC4F1 Ciherang-Sub1 seed, testing of
submergence tolerance, isolation of rice DNA, measuring of concentration and
purity of rice DNA, and PCR analysis with AEX1 and RM219 markers. The test
results of the submergence showed that 15 plants of BC4F1 Ciherang/Swarna-Sub1
and 21 BC4F1 Ciherang/IR64-Sub1. PCR results with markers AEX1R and
AEX1F showed that the DNA band sized 231 bp, while the results of PCR with
the combined markers AEX1R and RM219F can distinguish heterozygote
between Ciherang rice, Swarna-Sub1 and IR64-Sub1.
IDENTIFIKASI DAN KARAKTERISASI GEN TOLERAN
GENANGAN POPULASI PADI BC4F1 CIHERANG-Sub1
RESTU RAHAYU
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi : Identifikasi dan Karakterisasi Oen To]eran Oenangan Populasi
Padi BC 4F] Ciherang-Subl
: Restu Rahayu
Nama
: 084080044
NIM
Disetujui o]eh
Dr Djarot Sasongko Hami Seno, MSi
Pembimbing I
Tanggal Lulus:
05 (, '::-', 2 3
c
Dr Tri Joko Santoso, SP MSi
Pembimbing II
Judul Skripsi : Identifikasi dan Karakterisasi Gen Toleran Genangan Populasi
Padi BC4F1 Ciherang-Sub1
Nama
: Restu Rahayu
NIM
: G84080044
Disetujui oleh
Dr Djarot Sasongko Hami Seno, MSi
Pembimbing I
Dr Tri Joko Santoso, SP MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Februari 2012 ini ialah
padi tahan genangan, dengan judul Identifikasi dan Karakterisasi Gen Toleran
Genangan Populasi Padi BC4F1 Ciherang-Sub1.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Djarot Sasongko
Hamiseno, M.Si dan Bapak Dr. Tri Joko Santoso, M.Si. selaku pembimbing yang
telah banyak memberi saran dalam penyusunan karya ilmiah ini. Di samping itu,
terima kasih pula kepada pak Umar, mbak Dewi Praptiwi, kak Falin, dan kak
Indra selaku laboran Laboratorium Biologi Molekuler dan Rumah Kaca Balai
Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik
Pertanian (BB Biogen) Bogor yang telah membantu selama pengumpulan data.
Tak lupa penulis sampaikan penghargaan sebesar-besarnya kepada ayah, ibu,
seluruh keluarga, dan rekan-rekan Biokimia 45 atas segala doa dan dukungannya.
Demikianlah skripsi ini disusun, semoga dapat bermanfaat baik bagi penulis
maupun para pembaca.
Bogor, Juni 2013
Restu Rahayu
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Bahan dan Alat
2
Metode
3
HASIL
6
Penanaman Benih Padi BC4F1 Ciherang-Sub1
6
Tanaman Padi Hasil Pengujian Toleransi Genangan
6
DNA Hasil Isolasi dan Karakterisasi
7
Identifikasi Padi BC4F1 Ciherang-Sub1 melalui Analisis PCR
9
Marka Sub1A (AEX1)
Marka Gabungan RM219F dan AEX1R
PEMBAHASAN
9
10
11
Pemuliaan Padi BC4F1 Ciherang-Sub1
11
Pengaruh Uji Toleransi Genangan terhadap Padi BC4F1 Ciherang-Sub1
11
Kuantifikasi DNA BC4F1 Ciherang-Sub1
12
Identifikasi Padi BC4F1 Ciherang-Sub1 melalui Analisis PCR
13
SIMPULAN
14
DAFTAR PUSTAKA
15
LAMPIRAN
17
RIWAYAT HIDUP
21
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
Pola tanam benih padi dalam satu bak
Padi hasil penanaman selama 14 hari
Uji genangan padi BC4F1 Ciherang-Sub1
Hasil elektroforesis padi BC4F1 Ciherang/Swarna-Sub1 dengan marka
AEX1F dan AEX1R
5 Hasil elektroforesis padi BC4F1 Ciherang/IR64-Sub1 dengan marka
AEX1F dan AEX1R
6 Hasil elektroforesis padi BC4F1 Ciherang-Sub1 dengan marka
RM219F dan AEX1R
3
6
7
9
9
10
DAFTAR LAMPIRAN
1 Diagram alir penelitian
2 Diagram alir pertumbuhan dan uji genangan benih padi BC4F1
Ciherang-Sub1
3 Diagram alir isolasi DNA (Doyle & Doyle 1987)
4 Komposisi bufer ekstraksi DNA (Marlina 2011)
5 Varietas-varietas padi hasil persilangan yang mengandung gen Sub1
(Xu et al. 2004; Sarkar et al. 2006)
17
18
19
20
20
PENDAHULUAN
Padi merupakan komoditas penting yang dapat menunjang ketahanan
pangan nasional. Hal ini dikarenakan padi adalah sumber makanan pokok bagi
sebagian besar penduduk Indonesia, terlihat dari tingkat konsumsi beras
penduduknya yaitu sekitar 141 kg/kapita/tahun. Nilai konsumsi beras tersebut
menuntut pemerintah dalam meningkatkan produksi padi nasional seiring
meningkatnya jumlah penduduk di Indonesia (Badan Ketahanan Pangan 2009).
Upaya peningkatan produksi padi nasional tidak terlepas dari program
intensifikasi pertanian yang didukung oleh inovasi teknologi panca usahatani,
terutama penggunaan benih padi varietas unggul. Kontribusi varietas unggul
dalam peningkatan produktivitas padi mencapai 75% jika diintegrasikan dengan
teknologi pengairan dan pemupukan. Benih padi varietas unggul merupakan
penyumbang terbesar (16%) terhadap peningkatan produksi padi nasional, jauh di
atas irigasi (5%) dan pupuk (4%) (Satoto et al. 2006). Varietas-varietas unggul
yang dominan digunakan dalam kurun waktu pengembangannya adalah varietas
PB-36 (1970-an), Cisadane (1980-an), IR-64 (1990-an), dan Ciherang (2000-an)
(Sitorus 2009).
Keberhasilan upaya peningkatan produksi padi dihadapkan kepada berbagai
kendala dan masalah, antara lain penurunan produktivitas lahan, penyimpangan
iklim, serta cekaman biotik dan abiotik. Salah satu bentuk cekaman abiotik ialah
genangan air. Genangan air terhadap tanaman terjadi akibat terhambatnya proses
fotosintesis dan respirasi, hal tersebut dikarenakan difusi gas dalam air lebih
lambat 104 kali dibandingkan dengan di udara dan rendahnya penetrasi cahaya
yang dapat diterima oleh tanaman (Armstrong & Drew 2002).
Genangan yang mengakibatkan cekaman terhadap tanaman padi di wilayah
Asia Tenggara diperkirakan mencapai 15 juta hektar setiap tahunnya (Septiningsih
et al. 2009). Adapun di Indonesia potensi areal persawahan yang terkena cekaman
genangan yaitu sekitar 13,3 juta ha yang terdiri atas 4,2 juta ha genangan dangkal,
6,1 juta ha genangan sedang, dan 3,0 juta ha genangan dalam (Nugroho et al.
2002). Cekaman genangan pada areal pertanaman padi ini akan semakin meluas
karena terjadi peningkatan curah hujan dan kenaikan permukaan air laut akibat
terjadinya pemanasan global (CGIAR 2006).
Varietas padi tahan genangan yang diproduksi di Indonesia diantaranya
adalah padi IR64-Sub1 dan Swarna-Sub1. Kedua varietas padi ini memiliki gen
Sub1 yang merupakan gen pemberi sifat toleran terhadap genangan. Hal ini
disebabkan adanya ethylene response factor yang memicu perpanjangan tanaman
pada kromosom 9 tanaman padi tersebut (Perata & Voesenek 2006). Namun,
kedua varietas tersebut memiliki kekurangan seperti usia produksi yang relatif
lama, produktivitas yang rendah, dan kurang tahan terhadap hama. Di satu sisi,
pemulia tanaman menemukan varietas padi yang memiliki keunggulan usia
produksi yang cepat, produktivitas yang tinggi, dan tahan terhadap hama. Salah
satu varietas padi unggulan yang memiliki karakteristik tersebut adalah padi
varietas Ciherang. Jenis padi Ciherang dapat menghasilkan 10 ton gabah kering
panen per hektar atau dapat juga mencapai 8-9 ton gabah kering giling (BBPTP
2009). Penggunaan padi varietas Ciherang sebagai tetua pemulih (host) pada
penelitian ini dapat mengurangi resiko kegagalan panen, dapat menjadi salah satu
2
solusi dalam upaya perbaikan produktivitas padi di daerah tergenang,
meningkatkan ekonomi petani sekaligus devisa negara jika diekspor, dan lebih
menggairahkan minat pertanian, baik petani maupun industri, serta mendukung
program ketahanan pangan nasional. Padi hasil persilangan tersebut merupakan
produk nontransgenik karena tidak melalui proses rekayasa genetik. Selain itu,
padi ini mempunyai keuntungan yaitu waktu tanam relatif singkat, resiko
kegagalan panen rendah, dan produktivitas tinggi.
Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi dan mengkarakterisasi tanaman
BC4F1 Ciherang-Sub1 hasil persilangan balik (backcross) antara tanaman BC3F1
Ciherang-Sub1 dengan Ciherang. Tanaman BC4F1 yang mengandung gen Sub1
diidentifikasi menggunakan marka molekuler terkait gen toleran genangan pada
proses PCR. Hipotesis penelitian ini adalah metode persilangan terarah (sitedirected crossing) digunakan untuk memperoleh F1 yang memiliki gen Sub1
tahan genangan dan analisis molekuler berbasis PCR digunakan untuk melacak
keberadaan alel gen Sub1. Manfaat dari penelitian ini adalah memberikan
informasi dan kesempatan kepada para petani atau industri dalam menggunakan
padi BC4F1 untuk meningkatkan produktivitas padi di daerah persawahan yang
tergenang air ataupun pada saat musim penghujan tiba.
METODE
Bahan dan Alat
Bahan tanaman padi diperoleh dari BB-BIOGEN dan LIPI. Tanaman padi
yang digunakan yaitu tetua host (Ciherang), padi BC4F1 Ciherang-Sub1, tetua
donor Sub1 (padi IR64-Sub1 dan padi Swarna-Sub1), dan padi IR42 sebagai
kontrol. Reagen untuk isolasi DNA yaitu etanol 70%, etanol 95%, bufer ekstraksi
(NaCl 5 M, Tris-HCl 1 M, EDTA 0,5 M, lauril sarkosin, dan urea), fenol
kloroform isoamilalkohol (PCI), isopropanol, dan larutan TE (Tris-EDTA).
Bahan-bahan yang digunakan untuk menguji hasil isolasi DNA dengan PCR
adalah bufer PCR 10x, MgCl2 50 mM, dNTP mix 10 mM, primer AEX1, primer
RM219, Taq polymerase, sampel DNA 50 ng/µL, dan MQ H2O. Bahan-bahan
yang digunakan untuk elektroforesis yaitu loading dye, bufer TAE (Tris-Acetic
Acid EDTA) 1x, agarosa, sampel DNA hasil PCR, marker DNA 1 kb, etidium
bromida, dan akuabides.
Alat-alat yang digunakan untuk penanaman benih dan pengujian genangan
padi BC4F1 Ciherang-Sub1 adalah bak tanam berukuran 60 cm x 30 cm, media
tanah, pinset, lidi, ember, kertas label, klip, dan bak plastik volume 100 liter.
Alat-alat yang digunakan untuk isolasi DNA adalah penangas air, cool box,
pinset, tabung mikro, mortar, tip, vorteks, mikrofuge (Beckman rotor 12),
autopipet, inkubator, dan oven. Alat-alat yang digunakan untuk elektroforesis
adalah microwave, tangki elektroforesis, dan kertas aluminium foil. Alat-alat lain
yang digunakan adalah NanoDrop 2000/2000c Spektrofotometer (Thermo Fisher
Scientific), mesin PCR PTC-100 (MJ Research, Inc), dan UV illuminator
Chemidoc EQ (Biorad).
3
Metode
Penanaman Tanaman Padi (Septiningsih et al. 2009)
Tanaman padi yang ditanam adalah padi host (Ciherang), padi BC4F1- Sub1,
tetua Sub1 (padi IR64-Sub1 dan padi Swarna-Sub1), dan padi IR42. Semua jenis
padi tersebut ditanam secara bersamaan pada waktu dan tempat yang sama agar
umur tanaman tersebut relatif sama sehingga diharapkan dapat berbunga secara
bersamaan.
Terdapat 5 buah bak tanam yang setiap baknya ditanami benih padi
Ciherang, IR42, IR64-Sub1 dan Swarna-Sub1 serta 3 galur dari benih BC4F1.
Setiap bak ditanami benih BC4F1 dari 3 galur berbeda yang setiap galurnya
diplotkan dalam 2 barisan tanam. Dengan kata lain, dalam setiap bak terdapat 10
barisan tanam. Setiap barisan tanam tersebut berisi 15 benih padi dari galur yang
berbeda. Tersedia sebanyak 14 kantong berisi benih padi dari galur BC4F1 yaitu 8
kantong berisi BC4F1 (Ciherang/IR64-Sub1) dan sisanya yaitu 6 kantong lagi
berisi BC4F1 (Ciherang/Swarna-Sub1). Dengan demikian, terdapat 28 barisan
tanam yang kemudian dibagi ke dalam setiap bak sehingga setiap bak tersebut
berisi kira-kira 5-6 barisan tanam dari benih galur BC4F1. Ilustrasi tersebut dapat
dilihat pada Gambar 1.
Benih-benih dari galur BC4F1 diberi penomoran sesuai dengan kode masingmasing galur, contoh: BC4F1 Cih/Sw-Sub1 1-4, BC4F1 Cih/IR-Sub1 5-5, dan
seterusnya. Jarak tanam setiap bibit sekitar 3 cm x 3 cm dengan luasan bak sekitar
60 cm x 30 cm = 1.8 m2. Jumlah semua benih yang ditanam adalah sekitar 720
benih kemudian benih tersebut dibiarkan tumbuh sekitar 14 hari di rumah kaca
untuk siap dilakukan uji genangan.
Gambar 1 Pola tanam benih padi dalam satu bak
Pengujian Toleransi Genangan (Septiningsih et al. 2009)
Pengujian toleransi genangan pada penelitian ini mengikuti prosedur dari
Septiningsih et al (2009). Benih BC4F1 Ciherang/IR64-Sub1 dan BC4F1
Ciherang/Swarna-Sub1 masing-masing sebanyak 15 benih, tetua dari hasil
persilangan BC4F1 yaitu Ciherang, IR64-Sub1, serta Swarna-Sub1 masing-masing
sebanyak 15 benih serta padi IR42 juga sebanyak 15 benih disemai bersamaan
dalam bak bermedia tanah dan dibiarkan tumbuh sekitar 14 hari sampai cukup
tinggi untuk diuji genangan. Padi varietas IR42 biasanya digunakan sebagai
4
kontrol toleran genangan karena sensitif terhadap genangan sehingga dapat
memudahkan mengetahui batas uji genangan yang dilakukan.
Setelah padi berumur 14 hari dalam bak tanam, pengujian toleransi
genangan dilakukan pada tanaman padi yang telah disejajarkan dalam bak tanam
tersebut. Bak tanam dimasukkan ke dalam bak (tray) yang lebih besar. Kemudian
bak yang sudah berisi tanaman padi tersebut diisi dengan air (digenangi) sampai
keseluruhan padi tersebut terendam/tergenang. Ketika kontrol IR42 sudah
menunjukkan kerusakan >50 % biasanya setelah 14 hari maka genangan air dalam
bak tersebut dibuang. Setelah itu tanaman padi yang bertahan tersebut secara
keseluruhan dibiarkan selama 10 hari untuk melakukan recovery dan ditumbuhkan
sampai daunnya siap dipanen untuk proses isolasi DNA.
Isolasi DNA Padi (Doyle & Doyle 1987)
DNA genom total tanaman padi BC4F1 diisolasi dari daun menggunakan
metode Doyle & Doyle (1987). Isolasi DNA berlangsung dalam empat tahap yang
meliputi pemanenan, preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA, dan pemekatan
DNA. Tanaman padi yang sudah melewati masa recovery selama kurang lebih 3
minggu kemudian dipanen dan dimasukkan daunnya dalam tabung mikro.
Pemecahan sel dibantu dengan cara penggerusan dalam mortar dan
ditambah 1000 µL bufer ekstraksi CTAB hingga homogen. Suspensi diinkubasi di
dalam waterbath selama 15 menit suhu 65 ºC (setiap 5 menit dikocok dengan cara
tabung dibolak-balik secara perlahan). Pemurnian DNA dari pengotor dihilangkan
dengan penambahan 100 µL fenol kloroform isoamilalkohol (PCI) ke dalam
tabung dan dikocok selama 20 detik hingga merata.
Suspensi selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 10
menit. Pemekatan DNA dilakukan dengan menambahkan 500 µL isopropanol ke
supernatan dan dicampur selama 5 menit. Sampel divorteks dan disentrifugasi
kembali pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Pelet yang diperoleh dicuci
dengan 500 µL etanol 70%. Campuran disentrifugasi kembali selama 5 menit
pada kecepatan 12000 rpm. Pelet tersebut selanjutnya dikeringkan di oven dengan
suhu 60 0C selama 10 menit. Pelet yang telah kering dilarutkan dengan larutan TE
yang mengandung ribonuklease sebanyak 50-100 µL. Kemudian pelet yang telah
dilarutkan dengan TE diinkubasi suhu 37 °C selama 30 menit. Selanjutnya pelet
DNA tersebut siap untuk diukur konsentrasi dan kemurniannya secara kuantitatif
menggunakan spektrofotometer.
Pengukuran Konsentrasi dan Kemurnian DNA (Sambrook & Russel 1989)
Hasil isolasi DNA selanjutnya dikuantifikasi untuk mengetahui konsentrasi
dan kemurniannya. Konsentrasi DNA ditentukan dengan spektrofotometer pada
panjang gelombang 260 nm dengan bantuan sinar UV. Sedangkan kemurnian
DNA diukur pada panjang gelombang 260/280 nm. Spektrofotometer yang
digunakan dalam penelitian ini adalah NanoDrop 2000/2000c Spektrofotometer.
Konsentrasi sampel yang sangat tinggi dapat diukur dengan alat ini tanpa
memerlukan pengenceran sebelumnya dikarenakan mempunyai sistem retensi
sampel. Adapun rentang panjang gelombang yang dapat dibaca oleh
spektrofotometer ini menjangkau seluruh spektrum cahaya yaitu 190-840 nm.
Sampel DNA sebanyak 2 µL diambil menggunakan pipet mikro kemudian
diinjekkan pada sensor tumpuan pada alat tersebut lalu secara otomatis nilai
5
konsentrasi dan kemurnian sampel terbaca pada software NanoDrop. DNA yang
sudah diukur konsentrasinya diencerkan dengan faktor pengenceran 10 kali
sehingga didapatkan konsentrasi yang seragam yang akan digunakan dalam
analisis PCR. Kemurnian larutan DNA diperoleh dari nisbah rasio absorban yang
terbaca pada panjang gelombang 260 nm dibagi nilai absorban pada panjang
gelombang 280 nm. Nisbah rasio antara 1,8-2,0 menunjukkan kemurnian DNA
yang tinggi.
Analisis PCR dengan Marka AEX1 (Septiningsih et al. 2008)
Hasil isolasi DNA yang diperoleh disamakan terlebih dahulu konsentrasinya
yaitu dilakukan pengenceran hingga 50 ng/µL, selanjutnya dilakukan tahap PCR.
Campuran reaksi untuk PCR terdiri atas 2 µL DNA 50 ng/µL, 2 µL buffer PCR
10x, 0.6 µL MgCl2 50 mM, 0.4 µL dNTP mix 50 mM, 1 µL masing-masing
primer AEX1F ukuran 231 bp sebagai
forward dengan sekuen 5’
AGGCGGAGCTACGAGTACCA 3’ dan primer AEX1R sebagai reverse dengan
sekuen 5’ GCAGAGCGGCTGCGA 3’ (Septiningsih et al. 2008), 0.16 µL Taq
polymerase, dan 12.84 µL MW. Kemudian dilakukan amplifikasi PCR dengan
kondisi denaturasi awal 94ºC selama 5 menit, denaturasi 94ºC selama 1 menit,
penempelan primer 55ºC selama 1 menit, perpanjangan primer 72ºC selama 2
menit, dan perpanjangan primer akhir 72ºC selama 5 menit. Program PCR yang
dilakukan menggunakan program SUB1C sebanyak 34 siklus reaksi.
Elektroforesis yang dilakukan menggunakan gel agarosa 2 % dengan marker 1kb.
Analisis PCR dengan Marka RM219 (Xu et al. 2004)
Seleksi keberadaan gen Sub1 juga dilakukan dengan menggunakan marka
mikrosatelit RM219 dengan campuran reaksi untuk reaksi terdiri atas 1 µL DNA
50 ng/µL, 2µL buffer PCR 10x, 1.2 µL MgCl2 50 mM, 0.4 µL dNTP mix 50 mM,
1 µL masing-masing primer RM219F sebagai forward dengan sekuen 5’
CGTCGGATGATGTAAAGCCT 3’ dan primer AEX1R sebagai reverse dengan
sekuen 5’ GCAGAGCGGCTGCGA 3’, 0.16 µL Taq polimerase, dan 12.84 µL
MW. Selanjutnya dilakukan amplifikasi PCR seperti pada marka AEX1. Gel
agarosa yang digunakan dalam PCR dengan marka kombinasi antara RM219F dan
AEX1R ini adalah 1%.
Elektroforesis Produk PCR (Septiningsih et al. 2008)
Sebanyak 2% gel agarosa dan 1x buffer TAE (Tris Acetic Acid EDTA)
dimasukkan ke dalam cetakan. Setelah gel agarosa memadat kemudian
dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis yang berisi 1x buffer TAE. Sebanyak
10 µL produk PCR dari masing-masing sampel ditambahkan dengan 2 µL loading
dye dan dicampur sempurna, kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel.
Penentuan ukuran dari produk PCR disertakan juga DNA standar (100 bp ladder)
sebagai pembanding. Sampel dielektroforesis dengan tegangan 80 volt selama
kurang lebih 1.5 jam. Setelah itu, gel agarosa diwarnai dengan larutan etidium
bromide (EtBr) sebanyak 10 mg/L selama 10 menit dan dicuci dengan air selama
10-20 menit. Gel agarosa kemudian divisualisasi dengan Chemidoc gel system
(Biorad).
6
HASIL
Penanaman Benih Padi BC4F1 Ciherang-Sub1
Penanaman benih padi BC4F1 Ciherang-Sub1 bertujuan memperoleh
populasi tanaman padi BC4F1 Ciherang-Sub1 yang akan dipanen daunnya untuk
proses isolasi DNA. Benih padi BC4F1 Ciherang-Sub1 ditanam secara bersamaan
dengan benih padi Ciherang, IR64-Sub1, Swarna-Sub1, serta IR42 dalam 5 buah
bak tanam bermedia tanah. Benih-benih padi tersebut ditanam sejajar/sebaris
antara satu sama lain. Pengamatan dan perawatan tanaman selama masa
pertumbuhan dilakukan secara intensif seperti penyiraman, pencegahan dari
serangan hama, dan lain-lain.
Setelah penanaman padi selama 14 hari, dihasilkan tanaman padi berjumlah
720 tanaman dengan kondisi tinggi ± 20 cm dan lebar ± 5 cm. Tanaman-tanaman
padi ini tumbuh tegak dengan daun berwarna hijau muda dan rata-rata mempunyai
cabang/batang sebanyak tiga buah (Gambar 2). Selanjutnya tanaman padi tersebut
diuji ketahanannya terhadap cekaman genangan dengan merendam semua bagian
tubuhnya dalam air dan dibiarkan selama 14 hari.
Tanaman Padi Hasil Pengujian Toleransi Genangan
Pengujian padi terhadap cekaman genangan bertujuan untuk menyeleksi
padi yang dapat bertahan hidup (survival) jika digenangi air selama waktu
tertentu. Batas waktu pengujian genangan ini disesuaikan dengan tingkat
kerentanan tanaman padi tersebut terhadap cekaman genangan yaitu sekitar 14
hari (Septiningsih et al. 2009). Tanaman yang dapat bertahan terhadap genangan
diasumsikan sudah tersisipi gen Sub1 (positif Sub1) (Septiningsih et al. 2009).
Proses pengujian toleransi genangan selama dua minggu ditandai dengan
kerusakan pada padi IR42. Tahap selanjutnya adalah pengurangan air dari dalam
bak secara perlahan dan masih menyisakan sedikit air di dalam bak agar tanaman
tidak stress. Kemudian tanaman dibiarkan 10-21 hari untuk melakukan recovery
(tumbuh normal kembali) dengan kondisi daun yang tidak terlalu tegak dan batang
lebih menjuntai (Septiningsih et al. 2009). Kondisi padi dari awal penanaman
sampai proses uji toleransi genangan diperlihatkan pada Gambar 3.
Gambar 2 Padi hasil penanaman selama 14 hari
7
Hasil yang diperoleh dari uji genangan yaitu hanya sebagian kecil tanaman
BC4F1 yang mampu bertahan hidup yaitu 21 tanaman varietas Ciherang/IR64Sub1 dan 15 tanaman varietas Ciherang/Swarna-Sub1 dari 720 benih padi yang
ditanam. Tanaman-tanaman yang bertahan ini dapat dilihat pada Tabel 1.
DNA Hasil Isolasi dan Karakterisasi
DNA daun padi dapat dipisahkan dari kontaminan seperti polisakarida dan
metabolit sekunder menggunakan bufer ekstraksi CTAB. Menurut Ardiana
(2009), DNA seringkali terkontaminasi amilum, tanin, pigmen, alkaloid dan
flavonoid. Karakterisasi DNA adalah pengenalan substansi DNA melalui
identifikasi secara kualitatif dan kuantitatif (Subandi 2010). Secara kualitatif,
DNA diidentifikasi melalui visualisasi gel agarosa setelah proses elektroforesis.
Sedangkan secara kuantitatif, DNA dianalisis menggunakan spektrofotometer
dengan panjang gelombang 260 dan 280 nm.
Isolasi DNA padi BC4F1 Ciherang-Sub1 menggunakan metode CTAB
dikatakan berjalan baik dikarenakan DNA yang dihasilkan relatif banyak. Hal ini
sejalan dengan nilai konsentrasinya yang relatif besar yaitu antara rentang 1077.24418.4 ng/µl dengan rataan sekitar 1960.4 ng/µl setelah diukur dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm. Sedangkan nilai
kemurniannya bervariasi antar rentang 1,81 – 1,98 pada rasio panjang gelombang
260/280 nm dengan nilai rata-rata 1.94 (Tabel 1).
Gambar 3 Uji genangan padi BC4F1 Ciherang-Sub1. Ket : (1) Benih-benih
padi ditabur dalam media tanah dengan pola barisan mendatar; (2)
Padi yang sudah berumur 14 minggu; (3) Padi dalam cekaman
genangan air; (4) Kondisi padi setelah uji genangan (elongasi sel)
dan dibiarkan selama 10 hari untuk proses recovery (pemulihan
kembali)
8
Tabel 1 Pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA daun padi hasil isolasi
Varietas padi
Ciherang
Swarna-Sub1
IR64-Sub1
IR42
11-3 C/IR 3
12-1 C/Sw 4
13-1 C/IR 4
14 C/IR 6
1-1 C/IR 6
12-2 C/Sw 4
13-2 C/IR 5
13-1 C/IR 2
13-2 C/IR 8
12-2 C/Sw 7
5 C/Sw 5
13-2 C/IR 3
12-1 C/Sw 1
14-1 C/Sw 9
14 C/IR 7
12-2 C/Sw 2
5 C/Sw 8
13-1 C/IR 7
13-1 C/IR 2
13-2 C/IR 11
1-2 C/IR 7
12-1 C/Sw 6
11-3 C/IR 8
1-1 C/IR 10
12-1 C/Sw 11
11-4 C/IR 6
12-2 C/Sw 1
12-2 C/Sw 5
11-3 C/IR 3
13-1 C/IR 8
14-2 C/Sw 1
5 C/Sw 4
14 C/IR 3
12-1 C/Sw 9
13-2 C/IR 7
14 C/IR 2
Konsentrasi
(ng/µl)
1253.7
1521.3
1504.7
1568.4
1880.4
1378.7
1203.7
2365.2
2080.1
2543.5
4418.4
2473.9
3249.9
2285.2
1321.7
1468.3
2745.2
2587.1
1811.6
1410.4
2339.7
1983.7
1343.5
1589.8
2071.8
2771.6
1521.3
1137.0
1077.2
2247.0
1350.0
1730.5
1787.3
1912.6
1590.0
1860.1
1313.8
2574.6
2907.8
2235.8
A260/280
1.93
1.97
1.93
1.96
1.95
1.97
1.94
1.93
1.91
1.91
1.98
1.90
1.96
1.95
1.97
1.98
1.87
1.92
1.97
1.93
1.96
1.98
1.95
1.92
1.94
1.88
1.94
1.97
1.97
1.95
1.93
1.92
1.92
1.98
1.93
1.89
1.81
1.88
1.91
1.95
9
Identifikasi Padi BC4F1 Ciherang-Sub1 melalui Analisis PCR
Marka Sub1A (AEX1)
Seleksi tanaman BC4F1 secara spesifik dilakukan dengan analisis PCR
berbasis marka molekul gen Sub1. Adapun marka molekul gen Sub1 yang
digunakan dalam PCR ini adalah marka AEX1. Marka ini secara spesifik
dirancang untuk mendeteksi keberadaan alel toleran genangan.
Data yang diperoleh dari hasil PCR dan elektroforesis menunjukkan hasil
yang positif baik pada sampel DNA BC4F1 Ciherang/Swarna-Sub1 (Gambar 4)
maupun pada BC4F1 Ciherang/IR64-Sub1 (Gambar 5). Hal ini terlihat dari adanya
deretan pita-pita DNA berukuran 231 bp hasil visualisasi gel agarosa yang relatif
jelas.
Gambar 4 Hasil elektroforesis padi BC4F1 Ciherang/Swarna-Sub1 dengan marka
AEX1F dan AEX1R. Padi Ciherang (C), donor Swarna-Sub1 (S),
donor IR64-Sub1, kontrol peka IR42, dan sampel BC4F1
Ciherang/Swarna-Sub1 dengan marker (m) DNA 1kb
Gambar 5 Hasil elektroforesis padi BC4F1 Ciherang/IR64-Sub1 dengan marka
AEX1F dan AEX1R. Padi Ciherang (C), donor Swarna-Sub1 (S),
donor IR64-Sub1, kontrol peka IR42, dan sampel BC4F1
Ciherang/IR64-Sub1 dengan marker (m) DNA 1kb
10
Pada hasil visualisasi terlihat bahwa padi Ciherang (host) sebagai kontrol
negatif dan padi IR42 sebagai kontrol sensitif (peka) tidak mempunyai pita pada
ukuran 231 bp, sehingga terbukti kedua tanaman tersebut tidak toleran genangan
(Septingsih et al. 2009). Padi BC4F1 Ciherang/Swarna-Sub1 dan BC4F1
Ciherang/IR64-Sub1 mempunyai pita DNA berukuran 231 bp yang berarti kedua
jenis padi ini memiliki gen toleran genangan (Sub1).
Marka Gabungan RM219F dan AEX1R
Penelitian ini menggunakan marka mikrosatelit yang bertujuan
membedakan heterozigositas pada tanaman padi BC4F1 Ciherang-Sub1. Marka
mikrosatelit yang digunakan dalam penelitian ini adalah marka RM219. Marka ini
dipilih karena terkait dan ideal untuk seleksi toleran genangan (Xu et al. 2004).
Analisis PCR dilakukan dengan marka gabungan antara primer RM219F sebagai
forward dan AEX1R sebagai reverse. Hal ini bertujuan untuk membedakan tetua
Ciherang, Swarna-Sub1, IR64-Sub1, dan BC4F1 Ciherang-Sub1, serta mendeteksi
pola heterozigositas masing-masing tanaman tersebut.
Hasil yang diperoleh dari visualisasi elektroforesis menunjukkan pola
sebaran pita dari semua tanaman. Sampel Swarna dan IR64 menunjukkan pita
yang tidak ada pada padi Ciherang. Pita Ciherang (host) dan pita Swarna/IR64
(donor) yang dimiliki oleh tanaman BC4F1 Ciherang-Sub1 dalam pola sebaran
pitanya menunjukkan bahwa padi tersebut bersifat heterozigot (Moeljopawiro
2010). Tanaman nomor 2 dan nomor 5 masing-masing memiliki pita dari kedua
tetua yaitu berukuran 740 bp. Oleh karena itu dapat disimpulkan bahwa kedua
tanaman tersebut bersifat heterozigot sedangkan tanaman lainnya bersifat
homozigot (Gambar 6).
Gambar 6 Hasil elektroforesis padi BC4F1 Ciherang-Sub1 dengan marka RM219F
dan AEX1R. Padi Ciherang (C), donor Sub1 (Swarna-Sub1 (S) dan
IR64-Sub1) sampel BC4F1 Ciherang- Sub1 dengan marker (m) DNA
1kb
11
PEMBAHASAN
Pemuliaan Padi BC4F1 Ciherang-Sub1
Benih padi BC4F1 Ciherang-Sub1 pada penelitian ini merupakan hasil
penggabungan sifat yang dimiliki dari dua jenis tetua yang berbeda melalui
persilangan antara benang sari dari padi Ciherang dan putik dari padi SwarnaSub1 maupun IR64-Sub1. Penggabungan sifat yang dihasilkan dari kedua tetua
pada BC4F1 terjadi secara acak, sehingga kombinasi sifat yang dihasilkan bersifat
lebih menguntungkan dari kedua tetuanya. Keturunan yang dihasilkan memiliki
sifat baru yang berbeda dengan kedua induknya (Susanto 2008). Hasil persilangan
antara Ciherang (host) dengan BC3F1 Ciherang-Sub1 menghasilkan komposisi gen
96,375% : 3,625% yang artinya gen dari kedua tetua telah bersegregasi dalam
tanaman BC4F1 dengan komposisi paling dominan adalah gen Ciherang (Marlina
2011).
Pemuliaan padi BC4F1 Ciherang-Sub1 dilakukan melalui metode
persilangan terarah (site-directed crossing). Metode site-directed crossing atau
lebih dikenal dengan sebutan marker-assisted backcrossing (MAB) dapat
meminimalisasi intogresi gen donor sehingga hanya sifat yang diinginkan saja
yang terintroduksi pada host, dengan kata lain sifat-sifat yang baik pada host dapat
dipertahankan (Mackill et al. 2007). Metode ini lebih menguntungkan bila
dibandingkan dengan seleksi fenotip karena berdasarkan pada sifat genetik saja
dan tidak dipengaruhi oleh lingkungan. Oleh karena itu, kegiatan pemuliaan
menjadi lebih cepat, tepat, dan relatif lebih hemat biaya dan waktu (Azrai 2005).
Perbanyakan padi BC4F1 Ciherang-Sub1 dilakukan melalui penanaman
selama 14 hari. Benih- benih padi BC4F1 Ciherang-Sub1 ditanam hingga tumbuh
menjadi tanaman padi seutuhnya. Populasi padi yang dihasilkan memiliki tubuh
tegak berukuran tinggi ± 20 cm dan lebar ± 5 cm sesuai metode penanaman
Septiningsih et al. (2009). Populasi padi terintrogesi gen Sub1 memiliki tubuh
tegak setelah ditanam selama 14 hari dan cukup umur untuk pengujian terhadap
genangan (Septiningsih et al. 2009). Oleh karena itu padi yang akan diuji terhadap
cekaman genangan harus memiliki tubuh tegak sehingga seluruh tubuhnya kuat
jika digenangi dengan air.
Pengaruh Uji Toleransi Genangan terhadap Padi BC4F1 Ciherang-Sub1
Tanaman padi melakukan respon ketika seluruh bagian tubuhnya tergenang
oleh air. Respon tanaman pada kondisi seperti itu adalah dengan melakukan dua
proses pertahanan diri, yaitu pemanjangan sel (elongasi) dan toleransi terhadap
cekaman tersebut (Fukao & Bailey-Serres 2008). Proses pemanjangan sel
(elongasi) pada kondisi ini secara simultan dilakukan tanaman untuk bertahan
hidup (survival). Konsekuensinya adalah tanaman harus menghabiskan cadangan
makanannya untuk proses tersebut tanpa memperoleh asupan nutrisi dari
lingkungan. Hal ini berdampak buruk pada tanaman jika kondisi tersebut
berlangsung terus-menerus dalam waktu yang relatif lama. Tanaman dapat mati
sebelum air kembali surut karena dalam kondisi tergenang proses fotosintesis
12
terhambat akibat rendahnya ketersediaan CO2 dan penetrasi cahaya (Jackson &
Ram 2003). Ketersediaan CO2 dalam air lebih rendah dibandingkan di udara yaitu
dengan konsentrasi sebanyak 0.004 mol m-3 sedangkan di udara
kesetimbangannya sebanyak 0.01 mol m-3 (Sarkar et al. 2006).
Padi juga merespon kondisi cekaman genangan melalui sifat ketahanannya
terhadap genangan tersebut. Sifat tahan/toleran ini dimiliki padi yang sudah
tersisipi gen toleran genangan (Sub1). Sub1 (Submergence 1) merupakan gen
pengendali sifat toleran terhadap genangan (Xu et al. 2004). Gen ini menghambat
gen yang berkaitan dengan elongasi sel dan katabolisme karbohidrat. Introgesi
Sub1 pada padi mengakibatkan tanaman lebih toleran terhadap genangan.
Beberapa gejala metabolisme padi toleran ini meliputi karbohidratnya bersifat
terlarut dalam air (soluble), lambatnya penurunan pati yang dikonsumsi padi,
mRNA α-amilase dan sukrosa sintasenya berukuran relatif kecil, tingginya
aktivitas piruvat dekarboksilase (Pdc) dan alkohol dehidrogenase (Adh), produksi
etilennya relatif sedikit, dan transkripsi gen ekspansinya semakin berkurang
(Fukao & Bailey-Serres 2008). Berdasarkan data-data fisiologi di atas dapat
disimpulkan bahwa strategi survival padi terhadap genangan berlangsung melalui
konservasi karbohidrat, represi elongasi sel, dan peningkatan kapasitas fermentasi
(Perata & Voesenek 2006; Fukao & Bailey-Serres 2008).
Berdasarkan hasil yang diperoleh, tanaman padi BC4F1 yang mampu
bertahan hidup terdapat 21 tanaman varietas Ciherang/IR64-Sub1 dan 15 tanaman
varietas Ciherang/Swarna-Sub1. Hal ini sesuai dengan prosedur Septiningsih et al.
(2009) yang menyatakan bahwa tanaman yang dapat bertahan (survival) terhadap
genangan diasumsikan sudah tersisipi gen Sub1 (positif Sub1). Sedangkan
sebaliknya, padi yang mati diasumsikan tidak terintroduksi gen Sub1 (negatif
Sub1). Padi intoleran genangan akan mati setelah 14 hari dalam cekaman
genangan karena strategi pertahanan dirinya melalui elongasi sel yang
menitikberatkan sejumlah karbohidratnya untuk dipakai memperpanjang sel-sel
tubuhnya. Padi mengalami kondisi kekurangan cadangan makanan karena
terhambatnya proses fotosintesis dalam air. Fotosintesis terhambat akibat
rendahnya ketersediaan CO2 dan penetrasi cahaya di dalam air. Oleh karena itu
dapat disimpulkan bahwa hanya padi yang memiliki gen Sub1 saja yang dapat
bertahan hidup terhadap cekaman genangan selama 14 hari.
Kuantifikasi DNA Padi BC4F1 Ciherang-Sub1
Kuantifikasi DNA adalah suatu cara identifikasi DNA yang meliputi
pengukuran konsentrasi serta kemurniaan DNA. Konsentrasi DNA dapat
terkuantifikasi menggunakan bantuan sinar UV (ultraviolet) pada panjang
gelombang 260 dan 280 nm. Sedangkan kemurnian dan kualitas isolat DNA
diukur melalui nisbah rasio panjang gelombang 260/280 (William et al. 2007).
Apabila rasionya bernilai < 1.8 maka DNA tersebut terkontaminasi oleh protein
sedangkan jika nilainya > 2.0 maka DNA terkontaminasi oleh fenol, kloroform,
atau RNA. DNA murni diperoleh pada rentang nilai 1.8-2.0 (Sambrook et al.
1989).
Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses
destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman
13
memiliki dinding sel yang kuat dan seringkali pada beberapa jenis tanaman,
kontaminasi tersebut sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Pemakaian suatu
bufer ekstraksi dapat memudahkan proses memperoleh DNA. Bufer ekstraksi
CTAB dapat memisahkan DNA dari kontaminan lain dan menghasilkan
konsentrasi DNA yang relatif lebih banyak jika dibandingkan dengan bufer lain
(Jose & Usha 2000).
Berdasarkan hasil pengukuran konsentrasi DNA, diperoleh jumlah DNA
yang relatif banyak yaitu dengan nilai konsentrasi antara rentang 1077.2-4418.4
ng/µl. Nilai ini sangat berpengaruh pada analisis PCR dalam proses
amplifikasinya. Menurut Nurhaimi-Haris et al. (2003), konsentrasi DNA akan
berdampak pada kualitas fragmen hasil amplifikasi. Jika konsentrasi DNA terlalu
rendah fragmen yang dihasilkan sebagai pita akan sangat tipis pada gel atau
bahkan pita tidak terlihat secara visual, sebaliknya jika konsentrasi DNA terlalu
tinggi akan menyebabkan fragmen terlihat tebal sehingga sulit dibedakan antara
satu pita dengan pita lainnya.
DNA padi BC4F1 Ciherang-Sub1 yang diperoleh tergolong memiliki tingkat
kemurnian yang relatif tinggi. Nilai kemurniannya bervariasi antar rentang 1,811,98 pada rasio panjang gelombang 260/280 nm. Hal ini sesuai pernyataan
Sambrook et al. (1989) yaitu DNA murni berada pada rentang nilai 1.8-2.0. Hal
ini diperkuat dengan teori Murray et al. (2003) yang menyatakan bahwa DNA
dapat menyerap sinar UV pada panjang gelombang 260 nm karena adanya ikatan
rangkap terkonjugasi pada basa heterosiklik purin dan pirimidin. Hal ini
menyebabkan nukleosida, nukleotida, dan polinukleotida dapat menyerap sinar
tersebut. Oleh karena itu makromolekul lain selain DNA seperti protein dan
karbohidrat tidak dapat terdeteksi pada panjang gelombang tersebut.
Identifikasi Padi BC4F1 Ciherang-Sub1 melalui Analisis PCR
Identifikasi padi BC4F1 Ciherang-Sub1 melalui analisis PCR dibantu dengan
beberapa marka molekuler. Marka molekuler yang digunakan terkait dalam
toleransi genangan pada penelitian ini adalah marka AEX1 dan RM219. Marka
molekuler yang dirancang khusus untuk mendeteksi keberadaan alel toleran
genangan (gen Sub1) adalah marka AEX1. Sedangkan RM219 adalah marka
mikrosatelit yang digunakan khusus untuk melacak pola heterozigositas alel-alel
genom pada tanaman.
Analisis PCR dengan marka AEX1 bertujuan untuk mengamplifikasi
fragmen DNA Sub1 yang telah terlacak oleh marka AEX1 yaitu pada ukuran 231
bp. Marka ini dapat melacak keberadaan gen Sub1 pada ukuran pita 231 bp
(Septiningsih et al. 2009). Analisis ini pun secara tidak langsung dapat
menyeleksi DNA padi yang tidak terintrogesi alel toleran genangan. Apabila pada
proses visualisasinya tidak terlihat pita berukuran 231 bp, maka DNA tersebut
tidak mengandung alel toleran genangan.
Berdasarkan data yang diperoleh, DNA padi BC4F1 Ciherang-Sub1 baik itu
dari golongan BC4F1 Ciherang/Swarna-Sub1 maupun golongan BC4F1
Ciherang/IR64-Sub1 menunjukkan hasil yang positif. Hal ini terlihat dari adanya
deretan pita-pita DNA berukuran 231 bp hasil visualisasi gel agarosa yang relatif
jelas. Hasil ini sesuai dengan penelitian Septingsih et al. (2009) yang menyatakan
14
bahwa padi yang telah terintroduksi gen Sub1 mempunyai pita DNA pada ukuran
231 bp mengikuti tetua donornya yaitu IR64-Sub1 dan Swarna-Sub1. Di sisi lain
terlihat pula bahwa padi Ciherang (host) sebagai kontrol negatif dan padi IR42
sebagai kontrol sensitif (peka) tidak mempunyai pita pada ukuran 231 bp,
sehingga terbukti kedua tanaman tersebut tidak toleran genangan. Keberadaan gen
Sub1 pada padi BC4F1 ini berimplikasi pada keberhasilan metode persilangan
terarah yang telah dilakukan pada generasi sebelumnya yaitu BC3F1.
Marka mikrosatelit atau SSR (Simple Sequence Repeat) adalah marka
molekul berupa urutan dinukleotida atau tetranukleotida yang berulang dan
berurutan. Marka ini mampu membedakan homozigot dan heterozigot
(codominant) serta dapat melacak banyak alel pada genom tanaman (McCouch et
al. 2002). Selain itu marka ini mempunyai kelebihan yaitu penggunaannya tidak
merusak bahan tanaman karena jumlah DNA sampel yang dibutuhkan relatif
rendah dan dapat melacak gen secara akurat. Marka mikrosatelit yang digunakan
dalam penelitian ini adalah marka RM219. Marka ini dipilih karena terkait dan
ideal untuk seleksi toleran genangan, selain itu relatif praktis dan efisien. Marka
mikrosatelit RM219 memiliki ukuran pita 204 dan 194 bp (Xu et al. 2004).
Analisis PCR dilakukan dengan marka gabungan antara primer RM219F sebagai
forward dan AEX1R sebagai reverse. Hal ini bertujuan untuk membedakan tetua
Ciherang, Swarna-Sub1, IR64-Sub1, dan BC4F1 Ciherang-Sub1, serta mendeteksi
pola heterozigositas masing-masing tanaman tersebut.
Berdasarkan data yang diperoleh dari hasil visualisasi elektroforesis
menunjukan bahwa terlihat pola sebaran pita dari semua tanaman. Sampel Swarna
dan IR64 menunjukkan pita yang tidak ada pada padi Ciherang. Pita Ciherang
(host) dan pita Swarna/IR64 (donor) yang dimiliki oleh tanaman BC4F1 CiherangSub1 dalam pola sebaran pitanya menunjukkan bahwa padi tersebut bersifat
heterozigot (Moeljopawiro 2010). Terdapat dua tanaman yang masing-masing
memiliki pita yang sama dari kedua tetua pada ukuran 740 bp yaitu sampel 2 dan
5. Kedua tanaman tersebut bersifat heterozigot karena masing-masing mempunyai
pita yang sama dari kedua tetuanya sedangkan tanaman lainnya bersifat
homozigot.
SIMPULAN
Identifikasi dan karakterisasi tanaman BC4F1 Ciherang-Sub1 telah berhasil
dilakukan menggunakan PCR berbasis marka toleran genangan AEX1 dan
RM219. Sebanyak 21 tanaman Ciherang/IR64-Sub1 dan 15 tanaman
Ciherang/Swarna-Sub1 yang bertahan hidup memiliki konsentrasi yang relatif
besar antara rentang 1077.2-4418.4 ng/µl dengan nilai kemurnian diantara rentang
1.81-1.98 yang tergolong DNA murni. Hasil elektroforesis amplikon
menunjukkan keberadaan gen Sub1 (pita 231 bp) pada tanaman BC4F1 CiherangSub1, sekaligus menunjukkan keberhasilan metode persilangan terarah yang telah
dilakukan pada generasi sebelumnya (BC3F1 Ciherang-Sub1). Penggunaan marka
gabungan RM219F dan AEX1R dapat menunjukkan heterozigositas pada sampel
hasil persilangan.
15
DAFTAR PUSTAKA
Ardiana DW. 2009. Teknologi isolasi DNA genom tanaman padi dengan
menggunakan modifikasi bufer CTAB. Buletin Teknik Pertanian Vol. 14 No. 1
2009: 12-16.
Armstrong W, Drew MC. 2002. Root Growth and Metabolism Under Oxygen
Deficiency. Di dalam: Waisel Y, Eshel A, Kafkafi U, editor. Plant roots: the
hidden half. Ed ke-3. New York: Marcel Dekker. hlm 729–761.
Azrai M. 2005. Pemanfaatan marka molekuler dalam proses seleksi pemuliaan
tanaman. J Agro Biogen 1:26-37.
Badan Ketahanan Pangan. 2009. Konsumsi Padi Indonesia 2009. [internet].
[diunduh 23 Juli 2012]. Tersedia pada: http://www.badanketahananpangan.com
[BBPTP] Balai Besar Penelitian Tanaman Padi. 2009. Deskripsi Varietas Padi.
[internet].
[diunduh
10
Juli
2012].
Tersedia
pada:
pustaka.litbang.deptan.go.id/bppi/lengkap/bpp09001.pdf.
CGIAR (Consultative Group on International Agriculture Research). 2006.
Intensified Research Effort Yields Climate-Resilient Agriculture To Blunt
Impact of Global Warming, Prevent Widespread Hunger.Heat-tolerant Wheat,
Flood-proof Rice, Satellites for Carbon Trading Among New Technologies.
Doyle JJ, Doyle JL. 1987. A rapid DNA isolation from small amount of fresh leaf
tissue. J Phytochem Bull 19:11-15.
Fukao T, Bailey-Serres J. 2008. Submergence tolerance conferred by Sub1A is
mediated by SLR1 and SLRL1 restriction of gibberellin responses in rice.
PNAS 105: 16814-19.
Jackson MB, Ram PC. 2003. Physiological and molecular basis of susceptibility
and tolerance of rice plants to complete submergence. Annals of Botany 91:
227–241.
Jose J, Usha R. 2000. Extraction of geminiviral DNA from a highly mucilaginous
plant (Abelmoschus esculentus). Plant Mol. Biol. Rep. 18: 349-355.
Mackill DJ et al. 2007. Marker assisted selection for submergence tolerance in
rice. Mol Plant Breeding 5:207-208.
Marlina E. 2011. Aplikasi PCR berbasis marka Sub1 (AEX1 dan RM219) pada
seleksi padi BC1F1 Ciherang-Sub1 [Skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
McCouch et al. 2002. Development and mapping of 2240 new SSR markas for
rice (Oryza sativa L.). DNA Res 9: 199-207.
Moeljopawiro S. 2010. Aplikasi marka molekuler terkait dengan umur genjah 90
hari dan produktivitas 7 ton/ha pada padi. Balai Besar Penelitian dan
Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian.
Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. 2003. Biokimia Harper. Edisi
ke-27. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC.
Nugroho et al. 2002. Peta areal untuk pengembangan pertanian lahan pasang
surut dan pantai. Proyek Penelitian Sumber Daya Lahan. Pusat Penelitian
Tanah dan Agro Klimat. Badan Litbang Pertanian.
Nurhaimi-Haris et al. 2003. Kemiripan genetik klon karet (Hevea brasiliensis
Muell. Arg.) berdasarkan metode Amplifies Fragment Length. Men Perk 71:
1-15.
16
Perata P, Voesenek L. 2006. Submergence tolerance in rice requires Sub1A, an
ethylene-response-factor-like gene. Trends in Plant Science 12 (2).
Sambrook J, Fritsch EF, and Manuatis T. 1989. Moleculer Cloning : A Laboratory
Manual. New York : Harbour Lab press.
Sarkar RK, Reddy JN, Sharma SG, Ismail AM. 2006. Physiological basis of
submergence tolerant in rice and implications on crop development. Current
Science 91: 899-906.
Septiningsih et al. 2009. Development of submergence tolerant rice cultivars: The
Sub1 locus and beyond. Annals of Botany 103: 151-160.
Sitorus FMT. 2009. Benih bersertifikat basis swasembada beras. Suara
Pembaharuan 21 Agustus 2009.
Subandi. 2010. Isolasi dan karakterisasi DNA dari tanaman kina : Cinchona
ledgeriana. MIPA: Jurnal matematika, Ilmu pengetahuan alam dan
pengajarannya No 1 Vol 29, Januari-2010.
Susanto U. 2008. Padi Hibrida Vs Padi Inhibrida. Buletin Organik th.II/ edisi
I/Sept-Okt 2008. [internet]. [diacu 23 Juli 2012]. Tersedia pada:
www.ri1organik.com
William W, Wilfinger, Karol Mackey, Chomczynski P. 2007. Effect of pH and
ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity.
BioTechniques 22: 474-481.
Xu K, Deb R, Mackill DJ. 2004. A microsatellite Marker and a Codominant
PCR-Based Marker for Marker assisted selection of Submergence Tolerance in
Rice. Crop Sci. 44: 248–253.
17
Lampiran 1 Diagram alir penelitian
Penanaman dan pengujian genangan padi BC4F1 Ciherang-Sub1
selama masing-masing 14 hari dalam bak selanjutnya dibiarkan
selama 3-4 minggu untuk proses recovery
Isolasi DNA
Kuantifikasi analisis kemurnian DNA
(Spektrofotometri)
Amplifikasi menggunakan marka AEX1
dan gabungan AEX1-RM219 (PCR)
Visualisasi sampel (Elektroforesis)
Identifikasi dan karakterisasi tanaman BC4F1
Ciherang-Sub1
18
Lampiran 2 Diagram alir uji genangan benih padi BC4F1 Ciherang-Sub1
Penanaman benih padi Ciherang (host),
padi donor Sub1 (IR64-Sub1 dan SwarnaSub1), padi IR42, dan galur-galur padi
BC4F1 Ciherang/Swarna-Sub1 dalam bak
tanam berukuran 60 cm x 30 cm
BC F Ciherang/IR64-Sub1
Benih-benih disebar merata mengikuti pola
barisan
Tanaman setelah 14 hari masa
pertumbuhan
Uji genangan selama 14 hari dalam bak
tanam dimasukkan ke dalam bak plastik
yang dapat menampung 100 L air
Pemulihan (recovery) selama 10-21 hari
dalam ember dan tanaman siap untuk
proses isolasi
19
Lampiran 3 Diagram alir isolasi DNA (Doyle & Doyle 1987)
20
Lampiran 4 Komposisi bufer ekstraksi DNA (Marlina 2011)
Larutan Stok
Jumlah untuk 500
mL
Tris-Cl 1 M (pH = 8,5)
NaCl 5 M
EDTA 0.25 M
CTAB
PVP
Merkaptoetanol
Konsentrasi akhir
50 mL
140 mL
40 mL
10 g
10 g
1 mL
100 mM
1.4 M
20 mM
2% (b/v)
2% (b/v)
0.2% (v/v)
Lampiran 5 Varietas-varietas padi hasil persilangan yang mengandung gen Sub1
(Xu et al. 2004; Sarkar et al. 2006)
Varietas
IR64-Sub1 (IR07F102)
Swarna-Sub1 (IR05F102)
Samba MahsuriSub1 (IR07F101)
TDK1-Sub1 (IR07F289)
BR11-Sub1 (IR07F290)
CR1009Sub1 (IR07F291)
PSB RC68
IR49830-7-1-2-3
Lama
berbunga
(hari)
Lama
matang
(hari)
Tinggi
(cm)
Produktivitas
(ton/ha)
86
104
116
134
95
85
5.9
5.3
98
126
85
6.5
Sedang dikarakterisasi oleh IRRI
98
100
121
130
121
110
6.5
-
21
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor, Jawa Barat pada tanggal 13 Mei 1990 dari ayah
Yunus dan Ibu Dedeh. Penulis merupakan anak keempat dari enam bersaudara.
Pendidikan formal penulis dimulai dari SD Negeri Kotabatu I dan melanjutkan
pendidikan di SMP Rimba Teruna Bogor. Penulis lulus tahun 2008 dari SMA
Negeri 4 Bogor dan pada tahun yang sama diterima di Institut Pertanian Bogor
(IPB) melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis terpilih
sebagai mahasiswa mayor Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah melakukan Praktik Lapangan
(PL) di Laboratorium Biologi Molekuler dan Rekayasa Genetika, Balai Penelitian
Bioteknologi Perkebunan Indonesia Jl. Taman Kencana 1 Bogor selama periode
Juli hingga Agustus 2011 dengan judul Amplifikasi dan kloning daerah promotor
gen yang terkait dengan abnormalitas pembungaan kelapa sawit (Elaeis
guineensis Jacq.)
Penulis pernah mengikuti organisasi selama perkuliahan yaitu anggota
Divisi Cyber Community Koperasi Mahasiswa (Kopma) IPB pada tahun 20092010. Penulis juga pernah mengikuti berbagai kepanitiaan seperti Kesehatan dan
Keselamatan Kerja tahun 2009, Lomba Karya Ilmiah Populer tahun 2010, Masa
Pengenalan Departemen tahun 2010, dan Biochemistry Expo 2010. Penulis
pernah mengikuti kegiatan dari IPB yaitu IPB Goes to field Peduli Merapi 2011
yang bertempat di dusun Pule, Magelang Jawa Tengah. Penulis juga pernah
mendapat penghargaan dalam bidang olahraga dan seni berupa juara 3 Futsal TPB
CUP 2008, juara 1 Drama Musikal SPIRIT 2010, juara 2 Futsal BCL 2012, dan
juara 1 Akustik BCL 2012.