Identifikasi Karakter Aromatik secara Molekuler dan Organoleptik pada Galur Padi BC5F2 Hasil Persilangan Ciherang dan Pandanwangi
IDENTIFIKASI KARAKTER AROMATIK SECARA MOLEKULER
DAN ORGANOLEPTIK PADA GALUR PADI BC5F2 HASIL
PERSILANGAN CIHERANG DAN PANDANWANGI
MUVITA DIAH SETYANISA
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Identifikasi Karakter
Aromatik secara Molekuler dan Organoleptik pada Galur Padi BC5F2 Hasil
Persilangan Ciherang dan Pandanwangi adalah benar karya saya dengan arahan
dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Penelitian ini didanai oleh BB-Biogen atas nama Dr
Tri Joko Santoso SP. MSi. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada BBBiogen.
Bogor, September 2013
Muvita Diah Setyanisa
NIM G84090085
ABSTRAK
MUVITA DIAH SETYANISA. Identifikasi Karakter Aromatik secara Molekuler
dan Organoleptik pada Galur Padi BC5F2 Hasil Persilangan Ciherang dan
Pandanwangi. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan REFLINUR.
Aroma pada padi menjadi bahan pertimbangan penting untuk
meningkatkan selera makan konsumen. Pemetaan gen yang terpaut dengan
karakter aromatik pada padi menggunakan marka molekuler dilaporkan terdapat
pada lokus mikrosatelit RM223. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi
karakter aromatik dari gen badh2 pada galur padi BC5F2 hasil persilangan padi
Ciherang dan Pandanwangi, baik secara molekuler dengan marka RM223 maupun
organoleptik dengan larutan KOH 1.7%. Berdasarkan hasil analisis seleksi pada
daerah target (foreground selection), dari total 272 galur BC5F2 yang diuji,
diperoleh sebanyak 105 galur yang memiliki fragmen atau pita DNA yang
berukuran sama dengan tetua Pandanwangi yaitu 160 bp. Sedangkan sebanyak 46
galur memiliki pita DNA yang berukuran sama dengan tetua Ciherang (140 bp)
dan 121 galur merupakan heterozigot (140 bp dan 160 bp). Hasil uji aroma
dengan larutan KOH 1.7% menunjukkan adanya variasi tingkat aroma pada galur
padi yang terseleksi dari skor sedikit beraroma hingga beraroma. Melalui kedua
pendekatan tersebut diperoleh beberapa galur padi harapan baru dengan latar
belakang Ciherang yang membawa sifat aromatik yang berasal dari Pandanwangi.
Kata kunci: aroma, badh2, Ciherang, Pandanwangi, RM223
ABSTRACT
MUVITA DIAH SETYANISA. Identification of the Aromatic Character in BC5F2
rice population derived from Ciherang and Pandanwangi crosses based on
Molecular and Organoleptic analysis. Supervised by I MADE ARTIKA and
REFLINUR.
Aroma in rice has become an important consideration in increasing
consumer appetite. Genetic mapping of molecular marker related to the
responsible for fragrance in rice was previouslyreported and it was closely linked
with microsatellite marker RM223. This study aimed to identify the aromatic
character of the gene badh2 in BC5F2 populations derived from crosses between
Ciherang and Pandanwangi, both with molecular marker RM223 and organoleptic
analysis using KOH 1.7% solution. Based on the foreground selection analysis of
the total 272 individual tested lines, 105 lines were found to be homozygous for
Pandanwangi (160 bp), 46 lines were homozygous for Ciherang (140 bp) and 121
lines were heterozygous (140 bp and 160 bp). Evaluation of aroma with KOH in
selected BC5F2 lines showed variation in quality value, such as slight, moderate,
and strong aroma. Thus, through these two selection methods, we were able to
select several BC5F2 lines carrying aromatic trait introgressed from Pandanwangi
at target region.
Keywords: aroma, badh2, Ciherang, Pandanwangi, RM223
IDENTIFIKASI KARAKTER AROMATIK SECARA MOLEKULER
DAN ORGANOLEPTIK PADA GALUR PADI BC5F2 HASIL
PERSILANGAN CIHERANG DAN PANDANWANGI
MUVITA DIAH SETYANISA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi : Identifikasi Karakter Aromatik secara Molekuler dan Organoleptik
pada Galur Padi BC5F2 Hasil Persilangan Ciherang dan
Pandanwangi
Nama
: Muvita Diah Setyanisa
NIM
: G84090085
Disetujui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Pembimbing I
Reflinur, Ph.D
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga
penulis dapat menyelesaikan penelitian ini, serta shalawat dan salam semoga
tercurahkan pada Rasulullah SAW. Ucapan terima kasih penulis sampaikan
kepada Dr Ir I Made Artika, MAppSc dan Reflinur, Ph.D, selaku pembimbing
pertama dan pembimbing kedua. Terima kasih pula penulis sampaikan kepada
Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik
Pertanian, Cimanggu-Bogor yang telah bersedia memberikan kesempatan kepada
penulis untuk melaksanakan penelitian di Laboratorium Biologi Molekuler.
Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada bapak Syamsudin
Amihadi SE dan ibu Ninuk Suhartinah, kakak Mita Febtyanisa M.Si, dan keluarga
atas segala doa, kasih sayang, dan motivasinya. Serta kepada Dr Tri Joko Santoso
SP. M.Si, Dewi Praptiwi S.Si, Mira Sitepu, dan teman-teman semuanya yang
senantiasa memberikan bimbingan, doa, dan bantuannya sehingga penelitian ini
dapat diselesaikan dengan baik.
Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penelitian ini. Oleh
karena itu, penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dan berguna
dalam pelaksanaan penelitian ini. Penulis juga berharap penelitian ini dapat
bermanfaat bagi semua pihak.
Bogor, September 2013
Muvita Diah Setyanisa
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Bahan
2
Alat
3
Prosedur Analisis Data
3
Penumbuhan Benih Padi BC5F2
3
Isolasi DNA Padi
3
Pengukuran Kuantitas dan Kualitas DNA Padi
4
Amplifikasi DNA Padi
4
Elektroforesis Hasil Amplifikasi
4
Analisis Padi secara Organoleptik
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
5
5
Kuantitas dan Kualitas DNA Padi BC5F2
5
Seleksi BC5F2 secara Molekuler
5
Seleksi BC5F2 secara Organoleptik
6
Pembahasan
9
Kuantitas dan Kualitas DNA Padi BC5F2
9
Hasil seleksi BC5F2 secara Molekuler
9
Hasil seleksi BC5F2 secara Organoleptik
SIMPULAN DAN SARAN
10
13
Simpulan
13
Saran
13
DAFTAR PUSTAKA
13
LAMPIRAN
13
RIWAYAT HIDUP
15
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
Hasil kuantitas dan kemurnian DNA hasil isolasi sampel 9-12-8
Hasil scoring pita elektroforegram padi BC5F2
Hasil uji aroma tanaman padi BC5F2 9-12-8 (Kelompok I)
Hasil uji aroma semua sampel BC5F2 yang mengandung gen aroma
5
6
7
7
DAFTAR GAMBAR
1 Elektroforegram beberapa DNA templat hasil isolasi DNA
2 Elektroforegram PAGE 8% padi Ciherang-Pandanwangi BC5F2 9-12-8
3 Jalur pembentukan 2-AP
6
7
12
DAFTAR LAMPIRAN
1 Kuantitas DNA Padi
2 Elektroforegram PAGE 8% padi BC5F2 17-6 (sampel II), 17-8 (sampel
III), 45-7-5 (sampel IV), dan 45-11-7 (sampel V)
3 Hasil uji aroma tanaman padi BC5F2 sampel II-V
4 Komposisi larutan yang digunakan dalam penelitian
16
19
20
22
PENDAHULUAN
Kebutuhan padi yang merupakan salah satu sumber bahan makanan pokok
bagi penduduk lndonesia terus meningkat dari tahun ke tahun. Menurut data BPS
(2012), produksi padi tahun 2012 mengalami kenaikan sebesar 68.59 juta ton atau
naik sebesar 2.84 ton (4.31%) dibandingkan tahun 2011. Pemerintah terus
berupaya merealisasikan program utama ketahanan pangan, seperti usaha
peningkatan produktivitas padi dalam rangka mencukupi kebutuhan pangan
seluruh penduduk. Namun usaha tersebut mengalami berbagai kendala, antara lain
terbatasnya terobosan teknologi baru khususnya dalam hal pengembangan varietas
padi unggul serta alih fungsi lahan subur untuk kepentingan industri, perumahan
dan penggunaan lahan non pertanian lainnya (Krisnamurthi 2006).
Perkembangan teknik biologi molekuler yang semakin pesat dapat menjadi
solusi dalam mengatasi kendala pengembangan produktivitas padi serta
mempermudah pekerjaan analisis hingga tahap molekuler (Padmadi 2009). Salah
satu pengembangan tersebut yaitu melakukan analisis molekuler terhadap kualitas
padi seperti karakter aromatik. Aroma pada padi menjadi bahan pertimbangan
penting untuk meningkatkan selera makan konsumen, karena padi aromatik
memiliki tekstur yang pulen sehingga disukai oleh konsumen (Praptiwi 2010).
Padi lokal seperti Pandanwangi dari Jawa Barat merupakan salah satu
contoh padi aromatik. Padi ini dapat digunakan sebagai tetua donor dalam
pembentukkan varietas unggul padi aromatik (Adijono et al. 1995). Selain
memiliki aroma, padi aromatik juga memiliki harga jual yang tinggi bagi petani.
Namun, sifat agronomi (produktivitas, waktu tanam, ketahanan terhadap hama
dan penyakit, kemudahan tanam dan pemeliharaan) padi aromatik ini juga tidak
sebaik padi nonaromatik. Hal ini menjadi kendala untuk menanam padi aromatik
(Hamiseno et al. 2009). Padi Ciherang yang merupakan varietas padi nonaromatik
unggul nasional dilaporkan memiliki produktivitas tinggi, tahan terhadap beberapa
jenis penyakit, umur tanam singkat, dan bersifat nontransgenik (Hermanto 2006).
Oleh sebab itu, Hamiseno et al. (2009) telah melakukan persilangan antara padi
Ciherang (nonaromatik) dan Pandanwangi untuk memperoleh galur padi dengan
komposisi genom seperti Ciherang yang memiliki produktivitas tinggi dan unggul
dalam karakter agronomi lainnya, tetapi juga membawa sifat wangi (aromatik).
Identifikasi dan seleksi menggunakan marka molekuler yang lebih spesifik
terpaut dengan karakter aromatik pada galur-galur turunan hasil persilangan
tersebut belum dilakukan. Hal ini disebabkan karena masih dibutuhkannya
pengembangan galur-galur persilangan tersebut ke generasi lebih lanjut melalui
pendekatan silang balik untuk mendapatkan populasi yang cocok dalam
kesuksesan identifikasi karakter aromatik yang bersifat resesif (Hamiseno et al.
2009). Lang & Buu (2008) telah berhasil memetakan marka SSR (Simple
Sequence Repeats) yang terkait dengan lokus pengendali sifat aromatik pada padi.
Lokus SSR tersebut adalah primer RM223 yang terletak pada kromosom 8 yang
dapat membedakan antara padi aromatik-nonaromatik dan diketahui bahwa marka
tersebut berkosegregasi dengan lokus target dari gen aroma.
Pemanfaatan marka DNA yang berhubungan dengan sifat aromatik
tersebut dapat membantu pemulia tanaman dalam melakukan seleksi terhadap
galur-galur hasil persilangan yang telah disisipi oleh gen target. Oleh sebab itu,
2
pada penelitian ini dilakukan validasi primer RM223 untuk menyeleksi sifat
aromatik pada galur padi BC5F2 turunan persilangan antara Ciherang dan
Pandanwangi. Galur-galur yang telah terseleksi dengan marka molekuler yakni
yang membawa fragmen DNA Pandanwangi pada daerah target dikonfirmasi sifat
aromatiknya dengan metode pengujian secara organoleptik menggunakan larutan
KOH. Pada akhirnya diharapkan dapat diperoleh galur-galur harapan baru yang
membawa sifat aromatik hasil introgresi dari padi Pandanwangi dengan latar
belakang Ciherang.
Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi karakter aromatik dari gen badh2
pada galur padi BC5F2 hasil persilangan padi Ciherang dan Pandanwangi (padi
nonaromatik varietas unggul yang membawa sifat aroma), baik secara molekuler
dengan marka SSR maupun organoleptik dengan larutan KOH. Penelitian ini
diharapkan dapat membantu dan memberikan informasi mengenai karakter
aromatik pada padi galur BC5F2 Ciherang-Pandanwangi secara molekuler dan
organoleptik dalam usaha perbaikan kualitas dan kuantitas varietas unggul
Ciherang.
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan selama lima bulan mulai bulan Februari hingga
Juni 2013. Tempat pelaksanaannya di laboratorium Biologi Molekuler, Balai
Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik
Pertanian, Jalan Tentara Pelajar No.3A, Bogor.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini meliputi bahan-bahan yang
dibutuhkan untuk isolasi DNA tanaman, analisis PCR dan elektroforesis. Material
tanaman (daun) terdiri atas galur-galur padi turunan silang balik antara Ciherang
dan Pandanwangi (BC5F2). Bahan utama yang digunakan untuk isolasi DNA
tanaman antara lain adalah bufer ekstraksi yang mengandung Tris-HCl (pH 8.0),
etilendiamina tetra-asetat (EDTA), natrium klorida (NaCl), setiltrimetil
ammonium bromide (CTAB), polivinil pirolidon (PVP), dan beta-merkaptoetanol.
Disamping itu, juga digunakan etanol 70%, etanol 95%, bufer Tris-EDTA 1x (TE)
yang mengandung enzim ribonuklease. Sedangkan untuk analisis PCR, bahanbahan utama yang dibutuhkan meliputi bufer pereaksi PCR, seperti MgCl2, dNTP
(dATP, dTTP, dGTP, dCTP), primer RM223, DNA, enzim Taq polymerase, dan
ddH2O. Sementara itu, bahan lain yang digunakan untuk elektroforesis adalah gel
poliakrilamid
(campuran
antara
akrilamid,
bis-akrilamid,
TEMED
(tetramethylethylendiamine), dan APS (Amonium persulfat)), bufer Tris asam
borat-EDTA 1x (TBE), loading dye, GelRed BIOTIUM, dan 50 bp dan 100 bp
DNA ladder.
3
Alat
Alat yang digunakan pada penelitian ini meliputi alat-alat yang dibutuhkan
untuk menumbuhkan benih padi seperti cawan petri, kertas saring, bak
pembibitan, dan ember. Pada kegiatan isolasi DNA digunakan tabung mikro, alat
penggerus/sumpit, satu set pipet mikro, tip pipet mikro, spin, sentrifus, coolbox,
ice maker, waterbath, dan inkubator. Sedangkan alat-alat yang digunakan pada
analisis PCR antara lain adalah mesin PCR Tetrad PTC-225, dan separasi serta
visualisasi hasil PCR menggunakan seperangkat alat elektroforesis yang terdiri
atas tangki elektroforesis, Chemidoc gel system BIORADTM, gelas piala, tabung
Erlenmeyer, microwave. Selain itu juga digunakan spektrofotometer nanodrop
(Thermo Scientific), neraca analitik, pinset, magnetic stirrer, autoklaf, dan vortex.
Prosedur Analisis Data
Penumbuhan Benih Padi BC5F2
Penumbuhan benih padi dilakukan secara bertahap. Benih padi yang
digunakan pada penelitian ini terdapat lima nomor aksesi yaitu BC5F1 9-12-8
(kelompok I), BC5F1 17-6 (kelompok II), BC5F1 17-8 (kelompok III), BC5F1 45-75 (kelompok IV), dan BC5F1 45-11-7 (kelompok V). Benih padi tersebut dipilih
masing-masing 60 biji, kemudian disemai dan ditumbuhkan selama satu minggu
di dalam cawan petri yang telah dialasi kertas saring. Penyiraman dilakukan setiap
hari untuk menjaga kelembaban media kecambah. Padi yang sudah cukup tinggi
dipindahkan ke dalam bak secara berkelompok. Setelah tanaman berumur dua
minggu pada bak semai, tanaman dipindahkan ke dalam ember yang telah berisi
tanah dan pupuk dengan komposisi yang sesuai bagi pertumbuhan padi.
Selanjutnya material tanaman tersebut disimpan di rumah kaca dan dipelihara
sampai galur-galur padi tersebut menyelesaikan generatifnya.
Isolasi DNA Padi
Isolasi DNA dilakukan mengikuti metode CTAB yang mengacu pada
Doyle et al. (1987). Metode ini dilakukan melalui tiga tahap yaitu ekstraksi DNA,
pemurnian DNA, dan pemekatan DNA. Preparasi ekstrak sel dimulai dengan
menyiapkan daun padi dalam bentuk potongan kecil dan dimasukkan ke dalam
tabung mikro berukuran 2 mL, kemudian ditempatkan pada suatu wadah berisi
liquid nitrogen (LN). Selanjutnya, sampel daun digerus menggunakan sumpit, dan
ditambahkan bufer CTAB sebanyak 800 μL. Hasil gerusan diinkubasi di dalam
penangas air pada suhu 65 °C selama 15 menit dan untuk menghomogenkan bufer
ekstraksi pada sampel serta penyempurnaan reaksi lisis, tabung dibolak-balik
secara hati-hatipada selang waktu setiap 5 menit.
Pemurnian DNA dilakukan melalui penambahan natrium asetat 3M
(sebanyak 1/10 volume atau sekitar 100 μL) dan kloroform isoamilalkohol
(sebanyak 1 kali volume atau sekitar 1000 μL) ke dalam tabung. Kemudian
campuran ini dikocok hingga merata. Untuk memisahkan supernatan dengan sel
debris dan kontaminan lainnya, selanjutnya dilakukan sentrifugasi dengan alat
sentrifus dengan kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Supernatan hasil sentrifus
dipindahkan ke tube baru.
4
Pemekatan DNA dilakukan dengan penambahan Na-asetat sebanyak 70
μL (1/10 volume) dan isopropanol sebanyak 600 μL (2/3 volume) ke dalam
supernatan dan dicampur perlahan. Sampel disentrifus pada kecepatan 12000 rpm
selama 5 menit. Pelet yang diperoleh dicuci dengan 200 μL etanol 70 %.
Campuran disentrifus kembali selama 5 menit dengan kecepatan 12000 rpm. Pelet
selanjutnya dikeringkan dalam oven selama 10 menit. Pelet yang telah kering
diresuspensi dalam bufer TE 1X yang mengandung ribonuklease 50 μL dan
diinkubasi pada 37 °C selama 30 menit.
Pengukuran Kuantitas dan Kualitas DNA Padi
Kuantitas DNA padi dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer
nanodrop. Blanko yang digunakan adalah larutan TE 1X. Sebelum digunakan
lubang optik dibersihkan terlebih dahulu. Larutan TE 1X dimasukkan ke dalam
lubang optik sebanyak 2 µL. Selanjutnya alat nanodrop ditutup lalu dipilih menu
measure blank pada komputer. Kemudian, lubang optik dibersihkan kembali dan
sebanyak 2 µL sampel DNA dimasukkan ke dalam lubang optik. Setelah itu, hasil
pengukuran akan muncul dalam bentuk konsentrasi (ng/µL) dan kemurnian DNA
dapat dilihat langsung berdasarkan nilai rasio absorbansi pada panjang gelombang
A280 dan A260 nm. DNA yang memiliki kemurnian paling bagus memiliki nilai
OD (Optical Density) dari rasio 260/280 berada pada kisaran 1.8 hingga 2.0.
Adanya kontaminan protein pada larutan DNA ditunjukan dengan nilai OD
kurang dari 1.8 dan untuk menghilangkannya dapat ditambahkan proteinase.
Sedangkan kontaminan RNA ditunjukan dengan nilai OD lebih dari 2.0 dan untuk
menghilangkannya ditambahkan RNAse. Disamping itu, kualitas dan kuantitas
DNA padi juga diuji menggunakan teknik elektroforesis gel agarosa 1% dengan
cara membandingkan intensitas sampel DNA dengan marker lambda DNA
tertentu yang telah diketahui konsentrasinya.
Amplifikasi DNA Padi
Reaksi PCR dilakukan dengan total volume 10 l yang mengandung 1 x
bufer PCR (10 mM Tris-HCl (pH 8.3)), 25 mM MgCl2, 100 M dNTPs, 0,5 M
primer SSR RM223(forward dan reverse), 10 ng/ l DNA template, dan 0.04
unit/μl enzim Taq polymerase. Program PCR dilakukan dengan cara perlakuan
denaturasi awal DNA template pada suhu 94 °C selama 5 menit, diikuti dengan 35
siklus proses amplifikasi PCR dibawah parameter berikut: 30 detik proses
denaturasi pada suhu 94 °C, 30 detik proses penempelan primer pada suhu 55 °C,
dan 45 detik proses pemanjangan primer pada suhu 72 °C. Proses PCR ini diakhiri
dengan proses pemanjangan akhir melalui inkubasi pada suhu 72 °C selama 7
menit.
Elektroforesis Hasil Amplifikasi
Produk hasil PCR selanjutnya diseparasi menggunakan gel poliakrilamid
8% di dalam bufer TBE 1X dan divisualisasi menggunakan silver nitrat (silver
staining) yang dapat langsung didokumentasi. Selain itu pewarnaan gel juga dapat
dilakukan dengan menambahkan gel red (BIOTIUM) pada gel dan produk hasil
PCR. Kemudian pita-pita DNA hasil amplifikasi (amplikon) didokumentasikan
menggunakan chemidoc gel system.
5
Analisis Padi Secara Organoleptik
Galur-galur BC5F2 yang sudah terseleksi positif membawa fragmen
Pandanwangi pada lokus RM223 selanjutnya dikonfirmasi sifat aromanya secara
organoleptik menggunakan larutan KOH 1.7%, mengacu pada Dong et al. (2001).
Analisis secara organoleptik ini meliputi uji aroma. Tahapan pengujian sifat
aroma pada galur-galur tersebut diawali denganpemotongan daun padi menjadi
kecil-kecil dan ditempatkan dalam plastik tertutup, serta disimpan di freezer pada
suhu -20 °C atau menggunakan nitrogen cair hingga beku. Daun yang telah beku
ditimbang sekitar 0.8 g kemudian ditempatkan di dalam tabung reaksi yang
sebelumnya telah diisi dengan 5 ml larutan KOH 1.7 %. Kemudian tabung reaksi
ditutup dengan aluminium foil dan dimasukkan ke dalam oven 50 °C selama 10
menit. Aroma daun dievaluasi oleh empat panelis dan memberi skor/nilai pada 03: skor 0 adalah tidak beraroma, 1 adalah aroma samar, 2 aroma yang sedang, dan
3 merupakan aroma yang kuat. Nilai dari masing-masing panelis dirata-rata dan
dibedakan menjadi tiga kelompok, yaitu aromatik (skor> 1.0), sedikit aromatik
(skor 0.6-1.0), dan tidak aromatik (skor
DAN ORGANOLEPTIK PADA GALUR PADI BC5F2 HASIL
PERSILANGAN CIHERANG DAN PANDANWANGI
MUVITA DIAH SETYANISA
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Identifikasi Karakter
Aromatik secara Molekuler dan Organoleptik pada Galur Padi BC5F2 Hasil
Persilangan Ciherang dan Pandanwangi adalah benar karya saya dengan arahan
dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Penelitian ini didanai oleh BB-Biogen atas nama Dr
Tri Joko Santoso SP. MSi. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada BBBiogen.
Bogor, September 2013
Muvita Diah Setyanisa
NIM G84090085
ABSTRAK
MUVITA DIAH SETYANISA. Identifikasi Karakter Aromatik secara Molekuler
dan Organoleptik pada Galur Padi BC5F2 Hasil Persilangan Ciherang dan
Pandanwangi. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan REFLINUR.
Aroma pada padi menjadi bahan pertimbangan penting untuk
meningkatkan selera makan konsumen. Pemetaan gen yang terpaut dengan
karakter aromatik pada padi menggunakan marka molekuler dilaporkan terdapat
pada lokus mikrosatelit RM223. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi
karakter aromatik dari gen badh2 pada galur padi BC5F2 hasil persilangan padi
Ciherang dan Pandanwangi, baik secara molekuler dengan marka RM223 maupun
organoleptik dengan larutan KOH 1.7%. Berdasarkan hasil analisis seleksi pada
daerah target (foreground selection), dari total 272 galur BC5F2 yang diuji,
diperoleh sebanyak 105 galur yang memiliki fragmen atau pita DNA yang
berukuran sama dengan tetua Pandanwangi yaitu 160 bp. Sedangkan sebanyak 46
galur memiliki pita DNA yang berukuran sama dengan tetua Ciherang (140 bp)
dan 121 galur merupakan heterozigot (140 bp dan 160 bp). Hasil uji aroma
dengan larutan KOH 1.7% menunjukkan adanya variasi tingkat aroma pada galur
padi yang terseleksi dari skor sedikit beraroma hingga beraroma. Melalui kedua
pendekatan tersebut diperoleh beberapa galur padi harapan baru dengan latar
belakang Ciherang yang membawa sifat aromatik yang berasal dari Pandanwangi.
Kata kunci: aroma, badh2, Ciherang, Pandanwangi, RM223
ABSTRACT
MUVITA DIAH SETYANISA. Identification of the Aromatic Character in BC5F2
rice population derived from Ciherang and Pandanwangi crosses based on
Molecular and Organoleptic analysis. Supervised by I MADE ARTIKA and
REFLINUR.
Aroma in rice has become an important consideration in increasing
consumer appetite. Genetic mapping of molecular marker related to the
responsible for fragrance in rice was previouslyreported and it was closely linked
with microsatellite marker RM223. This study aimed to identify the aromatic
character of the gene badh2 in BC5F2 populations derived from crosses between
Ciherang and Pandanwangi, both with molecular marker RM223 and organoleptic
analysis using KOH 1.7% solution. Based on the foreground selection analysis of
the total 272 individual tested lines, 105 lines were found to be homozygous for
Pandanwangi (160 bp), 46 lines were homozygous for Ciherang (140 bp) and 121
lines were heterozygous (140 bp and 160 bp). Evaluation of aroma with KOH in
selected BC5F2 lines showed variation in quality value, such as slight, moderate,
and strong aroma. Thus, through these two selection methods, we were able to
select several BC5F2 lines carrying aromatic trait introgressed from Pandanwangi
at target region.
Keywords: aroma, badh2, Ciherang, Pandanwangi, RM223
IDENTIFIKASI KARAKTER AROMATIK SECARA MOLEKULER
DAN ORGANOLEPTIK PADA GALUR PADI BC5F2 HASIL
PERSILANGAN CIHERANG DAN PANDANWANGI
MUVITA DIAH SETYANISA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi : Identifikasi Karakter Aromatik secara Molekuler dan Organoleptik
pada Galur Padi BC5F2 Hasil Persilangan Ciherang dan
Pandanwangi
Nama
: Muvita Diah Setyanisa
NIM
: G84090085
Disetujui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Pembimbing I
Reflinur, Ph.D
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga
penulis dapat menyelesaikan penelitian ini, serta shalawat dan salam semoga
tercurahkan pada Rasulullah SAW. Ucapan terima kasih penulis sampaikan
kepada Dr Ir I Made Artika, MAppSc dan Reflinur, Ph.D, selaku pembimbing
pertama dan pembimbing kedua. Terima kasih pula penulis sampaikan kepada
Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik
Pertanian, Cimanggu-Bogor yang telah bersedia memberikan kesempatan kepada
penulis untuk melaksanakan penelitian di Laboratorium Biologi Molekuler.
Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada bapak Syamsudin
Amihadi SE dan ibu Ninuk Suhartinah, kakak Mita Febtyanisa M.Si, dan keluarga
atas segala doa, kasih sayang, dan motivasinya. Serta kepada Dr Tri Joko Santoso
SP. M.Si, Dewi Praptiwi S.Si, Mira Sitepu, dan teman-teman semuanya yang
senantiasa memberikan bimbingan, doa, dan bantuannya sehingga penelitian ini
dapat diselesaikan dengan baik.
Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penelitian ini. Oleh
karena itu, penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dan berguna
dalam pelaksanaan penelitian ini. Penulis juga berharap penelitian ini dapat
bermanfaat bagi semua pihak.
Bogor, September 2013
Muvita Diah Setyanisa
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Bahan
2
Alat
3
Prosedur Analisis Data
3
Penumbuhan Benih Padi BC5F2
3
Isolasi DNA Padi
3
Pengukuran Kuantitas dan Kualitas DNA Padi
4
Amplifikasi DNA Padi
4
Elektroforesis Hasil Amplifikasi
4
Analisis Padi secara Organoleptik
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
5
5
Kuantitas dan Kualitas DNA Padi BC5F2
5
Seleksi BC5F2 secara Molekuler
5
Seleksi BC5F2 secara Organoleptik
6
Pembahasan
9
Kuantitas dan Kualitas DNA Padi BC5F2
9
Hasil seleksi BC5F2 secara Molekuler
9
Hasil seleksi BC5F2 secara Organoleptik
SIMPULAN DAN SARAN
10
13
Simpulan
13
Saran
13
DAFTAR PUSTAKA
13
LAMPIRAN
13
RIWAYAT HIDUP
15
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
Hasil kuantitas dan kemurnian DNA hasil isolasi sampel 9-12-8
Hasil scoring pita elektroforegram padi BC5F2
Hasil uji aroma tanaman padi BC5F2 9-12-8 (Kelompok I)
Hasil uji aroma semua sampel BC5F2 yang mengandung gen aroma
5
6
7
7
DAFTAR GAMBAR
1 Elektroforegram beberapa DNA templat hasil isolasi DNA
2 Elektroforegram PAGE 8% padi Ciherang-Pandanwangi BC5F2 9-12-8
3 Jalur pembentukan 2-AP
6
7
12
DAFTAR LAMPIRAN
1 Kuantitas DNA Padi
2 Elektroforegram PAGE 8% padi BC5F2 17-6 (sampel II), 17-8 (sampel
III), 45-7-5 (sampel IV), dan 45-11-7 (sampel V)
3 Hasil uji aroma tanaman padi BC5F2 sampel II-V
4 Komposisi larutan yang digunakan dalam penelitian
16
19
20
22
PENDAHULUAN
Kebutuhan padi yang merupakan salah satu sumber bahan makanan pokok
bagi penduduk lndonesia terus meningkat dari tahun ke tahun. Menurut data BPS
(2012), produksi padi tahun 2012 mengalami kenaikan sebesar 68.59 juta ton atau
naik sebesar 2.84 ton (4.31%) dibandingkan tahun 2011. Pemerintah terus
berupaya merealisasikan program utama ketahanan pangan, seperti usaha
peningkatan produktivitas padi dalam rangka mencukupi kebutuhan pangan
seluruh penduduk. Namun usaha tersebut mengalami berbagai kendala, antara lain
terbatasnya terobosan teknologi baru khususnya dalam hal pengembangan varietas
padi unggul serta alih fungsi lahan subur untuk kepentingan industri, perumahan
dan penggunaan lahan non pertanian lainnya (Krisnamurthi 2006).
Perkembangan teknik biologi molekuler yang semakin pesat dapat menjadi
solusi dalam mengatasi kendala pengembangan produktivitas padi serta
mempermudah pekerjaan analisis hingga tahap molekuler (Padmadi 2009). Salah
satu pengembangan tersebut yaitu melakukan analisis molekuler terhadap kualitas
padi seperti karakter aromatik. Aroma pada padi menjadi bahan pertimbangan
penting untuk meningkatkan selera makan konsumen, karena padi aromatik
memiliki tekstur yang pulen sehingga disukai oleh konsumen (Praptiwi 2010).
Padi lokal seperti Pandanwangi dari Jawa Barat merupakan salah satu
contoh padi aromatik. Padi ini dapat digunakan sebagai tetua donor dalam
pembentukkan varietas unggul padi aromatik (Adijono et al. 1995). Selain
memiliki aroma, padi aromatik juga memiliki harga jual yang tinggi bagi petani.
Namun, sifat agronomi (produktivitas, waktu tanam, ketahanan terhadap hama
dan penyakit, kemudahan tanam dan pemeliharaan) padi aromatik ini juga tidak
sebaik padi nonaromatik. Hal ini menjadi kendala untuk menanam padi aromatik
(Hamiseno et al. 2009). Padi Ciherang yang merupakan varietas padi nonaromatik
unggul nasional dilaporkan memiliki produktivitas tinggi, tahan terhadap beberapa
jenis penyakit, umur tanam singkat, dan bersifat nontransgenik (Hermanto 2006).
Oleh sebab itu, Hamiseno et al. (2009) telah melakukan persilangan antara padi
Ciherang (nonaromatik) dan Pandanwangi untuk memperoleh galur padi dengan
komposisi genom seperti Ciherang yang memiliki produktivitas tinggi dan unggul
dalam karakter agronomi lainnya, tetapi juga membawa sifat wangi (aromatik).
Identifikasi dan seleksi menggunakan marka molekuler yang lebih spesifik
terpaut dengan karakter aromatik pada galur-galur turunan hasil persilangan
tersebut belum dilakukan. Hal ini disebabkan karena masih dibutuhkannya
pengembangan galur-galur persilangan tersebut ke generasi lebih lanjut melalui
pendekatan silang balik untuk mendapatkan populasi yang cocok dalam
kesuksesan identifikasi karakter aromatik yang bersifat resesif (Hamiseno et al.
2009). Lang & Buu (2008) telah berhasil memetakan marka SSR (Simple
Sequence Repeats) yang terkait dengan lokus pengendali sifat aromatik pada padi.
Lokus SSR tersebut adalah primer RM223 yang terletak pada kromosom 8 yang
dapat membedakan antara padi aromatik-nonaromatik dan diketahui bahwa marka
tersebut berkosegregasi dengan lokus target dari gen aroma.
Pemanfaatan marka DNA yang berhubungan dengan sifat aromatik
tersebut dapat membantu pemulia tanaman dalam melakukan seleksi terhadap
galur-galur hasil persilangan yang telah disisipi oleh gen target. Oleh sebab itu,
2
pada penelitian ini dilakukan validasi primer RM223 untuk menyeleksi sifat
aromatik pada galur padi BC5F2 turunan persilangan antara Ciherang dan
Pandanwangi. Galur-galur yang telah terseleksi dengan marka molekuler yakni
yang membawa fragmen DNA Pandanwangi pada daerah target dikonfirmasi sifat
aromatiknya dengan metode pengujian secara organoleptik menggunakan larutan
KOH. Pada akhirnya diharapkan dapat diperoleh galur-galur harapan baru yang
membawa sifat aromatik hasil introgresi dari padi Pandanwangi dengan latar
belakang Ciherang.
Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi karakter aromatik dari gen badh2
pada galur padi BC5F2 hasil persilangan padi Ciherang dan Pandanwangi (padi
nonaromatik varietas unggul yang membawa sifat aroma), baik secara molekuler
dengan marka SSR maupun organoleptik dengan larutan KOH. Penelitian ini
diharapkan dapat membantu dan memberikan informasi mengenai karakter
aromatik pada padi galur BC5F2 Ciherang-Pandanwangi secara molekuler dan
organoleptik dalam usaha perbaikan kualitas dan kuantitas varietas unggul
Ciherang.
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan selama lima bulan mulai bulan Februari hingga
Juni 2013. Tempat pelaksanaannya di laboratorium Biologi Molekuler, Balai
Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik
Pertanian, Jalan Tentara Pelajar No.3A, Bogor.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini meliputi bahan-bahan yang
dibutuhkan untuk isolasi DNA tanaman, analisis PCR dan elektroforesis. Material
tanaman (daun) terdiri atas galur-galur padi turunan silang balik antara Ciherang
dan Pandanwangi (BC5F2). Bahan utama yang digunakan untuk isolasi DNA
tanaman antara lain adalah bufer ekstraksi yang mengandung Tris-HCl (pH 8.0),
etilendiamina tetra-asetat (EDTA), natrium klorida (NaCl), setiltrimetil
ammonium bromide (CTAB), polivinil pirolidon (PVP), dan beta-merkaptoetanol.
Disamping itu, juga digunakan etanol 70%, etanol 95%, bufer Tris-EDTA 1x (TE)
yang mengandung enzim ribonuklease. Sedangkan untuk analisis PCR, bahanbahan utama yang dibutuhkan meliputi bufer pereaksi PCR, seperti MgCl2, dNTP
(dATP, dTTP, dGTP, dCTP), primer RM223, DNA, enzim Taq polymerase, dan
ddH2O. Sementara itu, bahan lain yang digunakan untuk elektroforesis adalah gel
poliakrilamid
(campuran
antara
akrilamid,
bis-akrilamid,
TEMED
(tetramethylethylendiamine), dan APS (Amonium persulfat)), bufer Tris asam
borat-EDTA 1x (TBE), loading dye, GelRed BIOTIUM, dan 50 bp dan 100 bp
DNA ladder.
3
Alat
Alat yang digunakan pada penelitian ini meliputi alat-alat yang dibutuhkan
untuk menumbuhkan benih padi seperti cawan petri, kertas saring, bak
pembibitan, dan ember. Pada kegiatan isolasi DNA digunakan tabung mikro, alat
penggerus/sumpit, satu set pipet mikro, tip pipet mikro, spin, sentrifus, coolbox,
ice maker, waterbath, dan inkubator. Sedangkan alat-alat yang digunakan pada
analisis PCR antara lain adalah mesin PCR Tetrad PTC-225, dan separasi serta
visualisasi hasil PCR menggunakan seperangkat alat elektroforesis yang terdiri
atas tangki elektroforesis, Chemidoc gel system BIORADTM, gelas piala, tabung
Erlenmeyer, microwave. Selain itu juga digunakan spektrofotometer nanodrop
(Thermo Scientific), neraca analitik, pinset, magnetic stirrer, autoklaf, dan vortex.
Prosedur Analisis Data
Penumbuhan Benih Padi BC5F2
Penumbuhan benih padi dilakukan secara bertahap. Benih padi yang
digunakan pada penelitian ini terdapat lima nomor aksesi yaitu BC5F1 9-12-8
(kelompok I), BC5F1 17-6 (kelompok II), BC5F1 17-8 (kelompok III), BC5F1 45-75 (kelompok IV), dan BC5F1 45-11-7 (kelompok V). Benih padi tersebut dipilih
masing-masing 60 biji, kemudian disemai dan ditumbuhkan selama satu minggu
di dalam cawan petri yang telah dialasi kertas saring. Penyiraman dilakukan setiap
hari untuk menjaga kelembaban media kecambah. Padi yang sudah cukup tinggi
dipindahkan ke dalam bak secara berkelompok. Setelah tanaman berumur dua
minggu pada bak semai, tanaman dipindahkan ke dalam ember yang telah berisi
tanah dan pupuk dengan komposisi yang sesuai bagi pertumbuhan padi.
Selanjutnya material tanaman tersebut disimpan di rumah kaca dan dipelihara
sampai galur-galur padi tersebut menyelesaikan generatifnya.
Isolasi DNA Padi
Isolasi DNA dilakukan mengikuti metode CTAB yang mengacu pada
Doyle et al. (1987). Metode ini dilakukan melalui tiga tahap yaitu ekstraksi DNA,
pemurnian DNA, dan pemekatan DNA. Preparasi ekstrak sel dimulai dengan
menyiapkan daun padi dalam bentuk potongan kecil dan dimasukkan ke dalam
tabung mikro berukuran 2 mL, kemudian ditempatkan pada suatu wadah berisi
liquid nitrogen (LN). Selanjutnya, sampel daun digerus menggunakan sumpit, dan
ditambahkan bufer CTAB sebanyak 800 μL. Hasil gerusan diinkubasi di dalam
penangas air pada suhu 65 °C selama 15 menit dan untuk menghomogenkan bufer
ekstraksi pada sampel serta penyempurnaan reaksi lisis, tabung dibolak-balik
secara hati-hatipada selang waktu setiap 5 menit.
Pemurnian DNA dilakukan melalui penambahan natrium asetat 3M
(sebanyak 1/10 volume atau sekitar 100 μL) dan kloroform isoamilalkohol
(sebanyak 1 kali volume atau sekitar 1000 μL) ke dalam tabung. Kemudian
campuran ini dikocok hingga merata. Untuk memisahkan supernatan dengan sel
debris dan kontaminan lainnya, selanjutnya dilakukan sentrifugasi dengan alat
sentrifus dengan kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Supernatan hasil sentrifus
dipindahkan ke tube baru.
4
Pemekatan DNA dilakukan dengan penambahan Na-asetat sebanyak 70
μL (1/10 volume) dan isopropanol sebanyak 600 μL (2/3 volume) ke dalam
supernatan dan dicampur perlahan. Sampel disentrifus pada kecepatan 12000 rpm
selama 5 menit. Pelet yang diperoleh dicuci dengan 200 μL etanol 70 %.
Campuran disentrifus kembali selama 5 menit dengan kecepatan 12000 rpm. Pelet
selanjutnya dikeringkan dalam oven selama 10 menit. Pelet yang telah kering
diresuspensi dalam bufer TE 1X yang mengandung ribonuklease 50 μL dan
diinkubasi pada 37 °C selama 30 menit.
Pengukuran Kuantitas dan Kualitas DNA Padi
Kuantitas DNA padi dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer
nanodrop. Blanko yang digunakan adalah larutan TE 1X. Sebelum digunakan
lubang optik dibersihkan terlebih dahulu. Larutan TE 1X dimasukkan ke dalam
lubang optik sebanyak 2 µL. Selanjutnya alat nanodrop ditutup lalu dipilih menu
measure blank pada komputer. Kemudian, lubang optik dibersihkan kembali dan
sebanyak 2 µL sampel DNA dimasukkan ke dalam lubang optik. Setelah itu, hasil
pengukuran akan muncul dalam bentuk konsentrasi (ng/µL) dan kemurnian DNA
dapat dilihat langsung berdasarkan nilai rasio absorbansi pada panjang gelombang
A280 dan A260 nm. DNA yang memiliki kemurnian paling bagus memiliki nilai
OD (Optical Density) dari rasio 260/280 berada pada kisaran 1.8 hingga 2.0.
Adanya kontaminan protein pada larutan DNA ditunjukan dengan nilai OD
kurang dari 1.8 dan untuk menghilangkannya dapat ditambahkan proteinase.
Sedangkan kontaminan RNA ditunjukan dengan nilai OD lebih dari 2.0 dan untuk
menghilangkannya ditambahkan RNAse. Disamping itu, kualitas dan kuantitas
DNA padi juga diuji menggunakan teknik elektroforesis gel agarosa 1% dengan
cara membandingkan intensitas sampel DNA dengan marker lambda DNA
tertentu yang telah diketahui konsentrasinya.
Amplifikasi DNA Padi
Reaksi PCR dilakukan dengan total volume 10 l yang mengandung 1 x
bufer PCR (10 mM Tris-HCl (pH 8.3)), 25 mM MgCl2, 100 M dNTPs, 0,5 M
primer SSR RM223(forward dan reverse), 10 ng/ l DNA template, dan 0.04
unit/μl enzim Taq polymerase. Program PCR dilakukan dengan cara perlakuan
denaturasi awal DNA template pada suhu 94 °C selama 5 menit, diikuti dengan 35
siklus proses amplifikasi PCR dibawah parameter berikut: 30 detik proses
denaturasi pada suhu 94 °C, 30 detik proses penempelan primer pada suhu 55 °C,
dan 45 detik proses pemanjangan primer pada suhu 72 °C. Proses PCR ini diakhiri
dengan proses pemanjangan akhir melalui inkubasi pada suhu 72 °C selama 7
menit.
Elektroforesis Hasil Amplifikasi
Produk hasil PCR selanjutnya diseparasi menggunakan gel poliakrilamid
8% di dalam bufer TBE 1X dan divisualisasi menggunakan silver nitrat (silver
staining) yang dapat langsung didokumentasi. Selain itu pewarnaan gel juga dapat
dilakukan dengan menambahkan gel red (BIOTIUM) pada gel dan produk hasil
PCR. Kemudian pita-pita DNA hasil amplifikasi (amplikon) didokumentasikan
menggunakan chemidoc gel system.
5
Analisis Padi Secara Organoleptik
Galur-galur BC5F2 yang sudah terseleksi positif membawa fragmen
Pandanwangi pada lokus RM223 selanjutnya dikonfirmasi sifat aromanya secara
organoleptik menggunakan larutan KOH 1.7%, mengacu pada Dong et al. (2001).
Analisis secara organoleptik ini meliputi uji aroma. Tahapan pengujian sifat
aroma pada galur-galur tersebut diawali denganpemotongan daun padi menjadi
kecil-kecil dan ditempatkan dalam plastik tertutup, serta disimpan di freezer pada
suhu -20 °C atau menggunakan nitrogen cair hingga beku. Daun yang telah beku
ditimbang sekitar 0.8 g kemudian ditempatkan di dalam tabung reaksi yang
sebelumnya telah diisi dengan 5 ml larutan KOH 1.7 %. Kemudian tabung reaksi
ditutup dengan aluminium foil dan dimasukkan ke dalam oven 50 °C selama 10
menit. Aroma daun dievaluasi oleh empat panelis dan memberi skor/nilai pada 03: skor 0 adalah tidak beraroma, 1 adalah aroma samar, 2 aroma yang sedang, dan
3 merupakan aroma yang kuat. Nilai dari masing-masing panelis dirata-rata dan
dibedakan menjadi tiga kelompok, yaitu aromatik (skor> 1.0), sedikit aromatik
(skor 0.6-1.0), dan tidak aromatik (skor