SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOL DAUN BENALU ALPUKAT (Dendrophthoe sp. grew on Persea americana) TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA (SEL T47D) DENGAN METODE MTT SECARA IN VITRO

BAB I
PENDAHULUAN

1.1

Latar Belakang
Kanker adalah suatu penyakit yang disebabkan oleh pertumbuhan sel-sel

jaringan tubuh yang tidak normal (Herien, 2010). Kanker merupakan salah satu
penyakit tidak menular yang telah menjadi masalah kesehatan di dunia, termasuk
di Indonesia. Data Badan Kesehatan dunia tahun (WHO) 2010 menunjukkan
penyakit kanker merupakan penyakit ke dua setelah penyakit kardiovaskuler
dengan data yang menunjukkan bahwa terdapat sekitar 7,6 juta kematian akibat
kanker. Di Indonesia menurut Riset Kesehatan Dasar (Reskisdes) 2007, kanker
menempati urutan ke enam penyebab kematian terbesar (Menkes RI, 2012).
Dengan angka penderita baru 230.000 penderita per tahun (Badri, 2013).
Salah satu jenis penyakit kanker yang sering terjadi pada wanita di dunia
adalah kanker payudara yang jumlahnya terus mengalami peningkatan. Di
Amerika Serikat pada tahun 2009 diperkirakan sekitar 192.370 kasus baru kanker
payudara infasif pada wanita (Faisel, 2012). Di Indonesia kanker payudara
menempati angka kejadian terbanyak di bandingkan dengan kanker serviks,

kanker payudara dengan angka kejadian 26 per 100.000 perempuan, sedangkan
kanker rahim dengan angka kejadian 16 per 100.000 perempuan (Fauziah &
Endang, 2012).
Kanker payudara terjadi karena adanya gangguan terhadap sistem
pertumbuhan sel di dalam jaringan payudara (Sirait, 2011). Struktur anatomi
payudara secara garis besar tersusun dari jaringan lemak, lobus, dan kelenjar getah
bening (CCRC, 2009). Kanker payudara adalah penyakit yang ditandai dengan
terjadinya pertumbuhan sel yang berlebihan atau perkembangan tidak terkontrol
dari sel-sel atau jaringan payudara. Kanker payudara dapat berasal dari
komponen kelenjarnya, maupun komponen selain kelenjar seperti jaringan lemak,
pembuluh darah, dan persarafan jaringan payudara (Maharani, 2009).

1

2

Masalah

utama

dalam

penanggulangan

kanker

adalah

kurangnya

pengetahuan masyarakat tentang kanker dan kesadaran masyarakat untuk
melakukan perilaku hidup sehat untuk mengurangi risiko kanker, serta kesadaran
masyarakat untuk melakukan deteksi kanker dini (YKI, 2013). Selain itu juga,
pola hidup yang tidak seimbang menyebabkan tingginya angka pertumbuhan
kanker di dunia (Ikawati dkk, 2008).
Pengobatan kanker sebaiknya dimulai sebelum sel ini dapat dideteksi oleh
jaringan (Dipiro, 2008). Metode pengobatan kanker yang banyak digunakan saat
ini adalah kemoterapi, radiasi dan operasi (Multiawati, 2013). Obat sitostatika
bekerja dengan mempengaruhi metabolisme asam nukleat terutama DNA atau
biosintesis protein. Hal inilah yang menyebabkan obat sitostatika bekerja tidak

selektif karena bersifat toksik baik pada sel kanker maupun sel normal
(Siswandono dkk, 2008). Tingkat keparahan efek samping yang ditimbulkan oleh
obat kimia tergantung pada sifat dan dosis obat serta lamanya pengobatan (Jong,
2005).
Kemoterapi adalah proses pengobatan dengan menggunakan obat-obatan
yang bertujuan untuk menghancurkan atau memperlambat pertumbuhan sel-sel
kanker. Akan tetapi metode tersebut belum maksimal, bahkan memberikan efek
samping pada sel normal yang berada pada sekitar sel kanker dan organ lain, efek
samping yang bisa muncul dari metode pengobatan tersebut antara lain lemas,
mual, muntah, kerontokan rambut dan gangguan pencernaan (Faisel, 2012).
Adanya efek samping yang ditimbulkan oleh obat-obat kimia tersebut, oleh
karena itu mulai banyak dilakukan penelitian tentang bahan obat dari alam yang
dapat berfungsi sebagai antikanker (Rossaria, 2007).
Indonesia sebagai negara tropis memiliki beraneka ragam tumbuhan yang
dapat di manfaatkan sebanyak-banyaknya untuk kepentingan manusia termasuk
dalam hal pengobatan (Waji & Sugrani, 2009). Penggunaan bahan alam sebagai
obat tradisional di Indonesia telah dilakukan oleh nenek moyang kita sejak
berabad-abad yang lalu dengan cara berinteraksi dengan lingkungan sekitar (Sari,
2006).
Salah satu penunjang terapi kanker berbahan alam yang mempunyai prospek

tinggi adalah benalu, benalu merupakan tanaman parasit yang pada awalnya

3

dianggap tidak bermanfaat ternyata berpotensi sebagai agen antikanker (Rahayu
dkk, 2010). Tanaman benalu merupakan tanaman yang unik, satu sisi merupakan
parasit bagi inang tempat tumbuhnya, tetapi disisi lain benalu dapat dimanfaatkan
sebagai obat (Multiawati, 2013).
Beberapa benalu dilaporkan memiliki efek sebagai obat kanker
(Multiawati, 2013). Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada benalu mangga
dengan famili Loranthaceae di dapat IC50 < 50 μg.ml-1 (Ikawati dkk, 2008). Hasil
penelitian pada benalu kelor didapat IC50 = 33,89 μg.ml-1 menunjukkan bahwa
ekstrak daun benalu tersebut mempunyai efek sitotoksik terhadap cell line kanker
payudara T47D. Nilai ini menunjukkan bahwa ekstrak tersebut tergolong aktif dan
bahkan sangat aktif sebagai antikanker (Multiawati, 2013).
Benalu alpukat (Dendrophthoe sp.grew on Persea americana) merupakan
salah satu benalu yang termasuk dalam famili Loranthaceae. Pada umumnya,
tanaman yang termasuk dalam satu famili memiliki proses fisiologi yang hampir
sama, hal ini menyebabkan banyak tanaman dalam satu famili mempunyai
kandungan senyawa kimia yang seje nis (Retno, 2013). Tanaman benalu alpukat

(Dendrophthoe sp.grew on Persea americana) ini juga memiliki aktivitas yang
sama dengan benalu duku, benalu teh, dan benalu mangga, walaupun berasal dari
inang yang berbeda.
Ditinjau dari tumbuhan alpukat itu sendiri, jika dilihat dari hasil skrining
fitokimia yang dilakukan oleh Zuhrotun (2007) terhadap simplisia dan ekstrak
etanol biji alpukat menunjukkan bahwa biji alpukat mengandung polifenol,
flavonoid,

triterpenoid,

kuinon,

saponin,

tanin,

monoterpenoid

dan

seskuiterpenoid. Tanin yang terdapat pada ekstrak etanol biji alpukat tersebut
terbukti mempunyai berbagai khasiat yaitu salah satunya adalah antioksidan.
Antioksidan dalam pengertian kimia, merupakan senyawa pemberi elektron.
Antioksidan bekerja dengan cara mendonorkan satu elektronnya kepada senyawa
yang bersifat oksidan sehingga aktivitas senyawa oksidan tersebut bisa terhambat,
dalam hal ini dalam hal ini seluruh bioaktif yang dimiliki alpukat akan bekerja
sama menyingkirkan
(Malangngi dkk, 2012).

radikal bebas yang berpotensi mengawali kanker

4

Berdasarkan kedekatan antara famili benalu alpukat dengan benalu mangga
dan kandungan senyawa dari tumbuhan alpukat, oleh karena itu perlu diadakan
penelitian

untuk

mengetahui

sitotoksisitas

dari

daun

benalu

alpukat

(Dendrophthoe sp. grew on Persea americana) terhadap salah satu jenis sel
kanker

payudara continous cell line (T47D) secara invitro dengan metode

Microculture Tetrazolium Salt (MTT).
Microculture Tetrazolium Salt (MTT) merupakan metode yang banyak
digunakan pada penelitian mengenai agen atikanker. Metode ini digunakan untuk
menguji aktivitas sitotoksik sampel penelitian pada kultur sel yang digunakan.

Metode ini berdasarkan pada perubahan garam tetrazolium (3-(4,5-dimerilitiazol2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromide) menjadi formazan dalam mitokondria yang
aktif pada sel hidup (CCRC, 2009). MTT merupakan metode kolorimetri, dimana
pereaksi MTT ini merupakan garam tetrazolium yang dapat dipecah menjadi
kristal formazan oleh sistem suksinat tetrazolium reduktase yang terdapat dalam
jalur respirasi sel pada mitokondria yang aktif pada sel yang masih hidup. Kristal
formazan ini memberi warna ungu yang dapat dibaca absorbansinya dengan
menggunakan Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) reader (Rahmawati,
2013).
Pada pengujian in vitro dengan metode MTT tersebut langsung diujikan
pada sel kanker payudara. Salah satu jenis sel kanker payudara yang sering
digunakan dalam penelitian adalah sel T47D (continous cell line) yang diisolasi
dari jaringan tumor duktal seorang wanita berusia 54 tahun. Sel T47D memiliki
morfologi seperti epitel (CCRC, 2009). Sel T47D memiliki karakteristik ER
(Estrogen Reseptor)/PR (Progesteron Reseptor)-positif. Sel secara molekuler
mengalami mutasi pada p53, sehingga sel kehilangan kontrol pada regulasi cell
linenya (Nurani, 2012).

1.2

Rumusan Masalah Penelitian

Berdasarkan latar belakang di atas, maka rumusan masalah pada penelitian

ini adalah sebagai berikut :

5

Bagaimana sitotoksisitas ekstrak etanol dari daun

benalu alpukat

(Dendrophthoe sp. grew on Persea americana) terhadap sel kanker payudara (sel
T47D) dengan metode MTT secara in vitro ?

1.3

Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian adalah mengetahui sitotoksisitas dari ekstrak etanol

daun tanaman benalu alpukat (Dendrophthoe sp. grew on Persea americana)
terhadap sel kanker payudara (sel T47D) dengan metode MTT secara in vitro.

1.4

Hipotesis Penelitian
Hipotesis penelitian ini adalah ekstrak etanol daun benalu alpukat

(Dendrophthoe sp. grew on Persea americana) memiliki sitotoksisitas terhadap
sel kanker payudara (sel T47D) dengan metode MTT secara in vitro.

1.5

Manfaat penelitian

1.5.1 Segi Akademik
Dari segi akademik, manfaat penelitian ini antara lain :
1.

Dapat memberikan sumbangan bagi perkembangan ilmu pengetahuan,
khususnya di bidang farmasi dalam penggunaan bahan alam sebagai obat.

2.

Dapat memberikan informasi ilmiah mengenai tanaman benalu alpukat
sebagai antikanker yang dapat ditindaklanjuti dengan penelitian lebih lanjut.

3.

Dapat diketahui manfaat tanaman benalu sebagai alternatif penggunaan
pengobatan penyakit kanker payudara.

1.5.2 Segi Masyarakat
Dari segi masyarakat, manfaat penelitian ini antara lain:
1.

Dapat memberi informasi kepada masyarakat tentang alternatif terapi
pengobatan kanker.

2.

Dari data-data yang diperoleh dapat digunakan untuk menunjang
penggunaan obat tradisional untuk pengobatan agar dapat diterima oleh
masyarakat pada umumnya dan praktisi pada khususnya.

6

3.

Bila

dalam

penelitian

ini

terbukti

bahwa

daun

benalu

alpukat

(Dendrophthoe sp.grew on Persea americana) sitotoksisitas terhadap sel
T47D, dapat diproduksi massal sebagai obat kanker payudara terutama sel
T47D.

SKRIPSI
INWANI ADI SIMPANG SORENGGANI
SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOL
DAUN BENALU ALPUKAT
(Dendrophthoe sp. grew on Persea americana)
TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA
(SEL T47D) DENGAN METODE MTT
SECARA IN VITRO

PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH MALANG
2014

i

Lembar Pengesahan

SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOL
DAUN BENALU ALPUKAT
(Dendrophthoe sp. grew on Persea americana)
TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA
(SEL T47D) DENGAN METODE MTT
SECARA IN VITRO
SKRIPSI

Dibuat Untuk Memenuhi Syarat Mencapai Gelar Sarjana Farmasi pada
Program Studi Farmasi Fakultas Ilmu Kesehatan
Universitas Muhammadiyah Malang
2014

Oleh:

Inwani Adi Simpang Sorenggani
201010410311096

Disetujui oleh:

Pembimbing I

Pembimbing II

Siti Rofida, S.Si.,M.Farm.,Apt
NIP 114. 0804. 0453

Ahmad Sobrun Jamil,S.Si.,M.P
NIP 113. 0907. 0469

ii

Lembar Pengujian

SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOL
DAUN BENALU ALPUKAT
(Dendrophthoe sp. grew on Persea americana)
TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA
(SEL T47D) DENGAN METODE MTT
SECARA IN VITRO
SKRIPSI
Telah diuji dan dipertahankan di depan tim penguji
Pada tanggal 24 Juni 2014

Oleh:

Inwani Adi Simpang Sorenggani
201010410311096
Tim Penguji
Penguji I

Penguji II

Siti Rofida, S.Si.,M.Farm.,Apt

Ahmad Sobrun Jamil,S.Si.,M.P

NIP 114. 0804. 0453

NIP 113. 0907. 0469

Penguji III

Penguji IV

Drs. H. Inoni, Apt

Nailis Syifa, S.Farm.,M.Sc.,Apt.

NIP 0020124205

NIP 11413110522

iii

KATA PENGANTAR

Assalamu’alaikum warohmatullahi wabarokatuh
Puji syukur tercurahkan kepada Allah SWT, Tuhan semesta alam karena
berkat rahmat dan ridhonya, penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul

SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOL DAUN BENALU
ALPUKAT (Dendrophthoe sp. grew on Persea americana)
TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA (SEL T47D) DENGAN
METODE MTT SECARA In Vitro.
Skripsi ini diajukan untuk memenuhi syarat untuk mencapai gelar Sarjana
Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Ilmu Kesehatan Universitas
Muhammadiyah Malang. Dalam penyusunan skripsi ini penulis tidak terlepas dari
peranan pembimbing dan bantuan dari seluruh pihak. Oleh karena itu, dengan
segala kerendahan hati, penulis ingin mengucapkan banyak terima kasih kepada:
1.

Allah SWT, Tuhan semesta alam yang memberikan rahmat, nikmat dan
hidayahnya kepada umatnya, Rasulullah SAW, yang sudah menuntun kita
menuju jalan yang lurus.

2.

Siti Rofida, M.Farm.,Apt dan

Ahmad Sobrun Jamil,S.Si.,M.P selaku

Dosen Pembimbig, terimakasih atas saran dan kritikan yang diberikan
sehingga penyusunan skripsi ini menjadi lebih baik.
3.

Drs. H. Achmad Inoni Apt dan Nailis Syifa, S.Farm.,M.Sc.,Apt. selaku
Dosen Penguji atas saran dan kritikan yang diberikan sehingga
penyusunan skripsi ini menjadi lebih baik.

4.

Nailis Syifa, S.Farm.,M.Sc.,Apt selaku Ketua Program Studi Farmasi
Universitas Muhammadiyah Malang yang telah member motivasi dan
kesempatan penulis belajar di Program

Studi

Farmasi

Universitas

Muhammadiyah Malang.
5.

Yoyok Bekti,M.Kes.,Sp.Kom selaku Dekan Fakultas Ilmu Kesehatan
Universitas Muhammadiyah Malang yang telah memberikan kesempatan

iv

penulis belajar di Fakultas Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Malang.

6.

Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gajah Mada,
khususnya Prof.Dr.Supargiyono,DTM&H.,SU.,PhD.,Sp.ParK dan Ibu
Rumbiwati, S.T.,M.Sc yang telah bersedia meluangkan waktu dan
memberikan tempat agar penulis dapat melaksanakan penelitiannya
dengan baik.

7.

Ibu Hidajah Rachmawati, S.Si.,Sp.FRS. selaku Dosen wali. Terima kasih
banyak atas arahan ibu selama ini.

8.

Untuk semua Dosen Farmasi Universitas Muhamadiyah Malang yang
sudah memberikan waktunya untuk mengajarkan ilmu-ilmu yang sangat
bermanfaat. Terutama Ibu Arina Swastika Maulita, S.Farm., Apt., yang
telah susah payah membantu jalanya ujian skripsi sehingga kami dapat
melaksanakan ujian skripsi dengan baik.

9.

Staff Tata Usaha Program Studi Farmasi Fakultas Ilmu kesehatan
Universitas Muhammadiyah Malang terima kasih karena telah banyak
membantu dalam hal administrasi.

10. Kedua orang tua penulis yang tercinta, Bapak Muliadi Sorenggana, dan
Ibu Hj. Madinawati, yang tiada hentinya memotivasi dalam segala hal,
terima kasih atas didikan dan kerja kerasnya untuk membahagiakan
putrinya serta dengan sabar mendoakan untuk kebaikan dan kesuksesan
putrinya. Semoga dengan menyelesaikan skripsi ini adalah awal untuk
suatu pencapaian yang bisa membuat kalian tersenyum bahagia.
11. Sahabat seperjuanganku Rosyidah, Mifta, dan Ina dengan banyak
keceriaan, kebersamaan, bantuan, motivasi, semangat serta kerja samanya
sehingga skripsi ini dapat terwujud.
12. NMA, selama 4 tahun ini terimakasih sudah membuat saya semangat
menjalani hari-hari di Universitas Muhammadiyah malang. Semoga dapat
bertemu di Pulau yang sama.
13. Teman-teman Farmasi 2010 terimakasih atas kebersamaannnya selama 4
tahun terakhir ini, kalian memberikan warna baru dalam kehidupan saya,

v

warna yang membuat hidup saya InsyaAllah lebih indah. Terimakasih
teman-temanku.
14. Teman-teman kos 51 (Via, Elin, Ros, Putri, Ratna) canda tawa yang tidak
akan terlupakan, terimakasih telah memberikan semangat sehingga skripsi
ini dapat terselesaikan dengan baik.
15. Untuk semua pihak yang belum disebutkan namanya, penulis mohon maaf
dan terima kasih yang sebesar-besarnya. Semua keberhasilan ini tak luput
dari bantuan, doa yang telah kalian semua berikan.
Jasa dari semua pihak yang telah membantu dalam penelitian ini, penulis
tidak mampu membalas dengan apapun. Semoga amal baik semua pihak
mendapat imbalan dari Allah SWT. Penulis menyadari bahwa skripsi ini
jauh dari kesempurnaan, oleh karena itu penulis mengharapkan saran dan
kritik yang membangun dari pembaca demi kebaikan skripsi ini. Semoga
penulisan ini dapat berguna bagi penelitian berikutnya, amiin.

Wassalamu’alaikum warohmatullohi wabarokatuh

Malang, 31 Juli 2013
Penyusun

(Inwani Adi Simpang Sorenggani)

vi

RINGKASAN
Kanker menempati urutan ke enam penyebab kematian terbesar di Indonesia
(Menkes RI, 2013). Salah satu jenis penyakit kanker yang sering terjadi pada
wanita di dunia adalah kanker payudara yang jumlahnya terus mengalami
peningkatan. Di Amerika Serikat pada tahun 2009 diperkirakan sekitar 192.370
kasus baru kanker payudara infasif pada wanita (Faisel, 2012). Umumnya,
pengobatan kanker seperti pembedahan, radiasi, pemberian obat antikanker atau
kemoterapi menimbulkan efek samping yang merugikan penderita. Sehingga saat
ini mulai dikembangkan obat-obat baru yang mempunyai efek terapi yang baik.
Dalam pengembangan obat antikanker baru sebagai agen-agen kemoterapi kanker,
evaluasi preklinik merupakan salah satu hal yang penting untuk mengetahui
potensi aktivitas neoplastiknya. Evaluasi yang telah terstandarisasi untuk
menentukan apakah suatu material mengandung bahan yang berbahaya (toksik)
secara biologis disebut uji sitotoksisitas (CCRC,2009).
Salah satu tanaman yang dapat dimanfaatkan adalah benalu alpukat
(Dendrophthoe sp. grew on Persea americana). Tanaman ini termasuk kedalam
famili Loranthaceae, dimana telah dilaporkan dalam beberapa penelitian
sebelumnya, bahwa benalu dengan famili Loranthaceae ini memiliki kandungan
kimia utama yaitu flavonoid, tanin, asam amino, karbohidrat, alkaloid, dan
saponin dan memiliki aktivitas sebagai antikanker dengan menguji sitotoksisitas
dari tanaman tersebut. Pada penelitian sebelumnta dilaporkan bahwa pada
tanaman benalu yaitu pada tanaman benalu mangga yang memiliki sitotoksisitas
yang berpotensi sebagai aktivitas antikanker, dengan hasil IC50 < 50 μg.ml-1
(Ikawatii dkk, 2008), dan pada benalu kelor yang didapat IC50 = 33,89 μg.ml-1
menunjukkan bahwa daun benalu tersebut memiliki efek sitotoksik terhadap cell
line payudara T47D (Multiawati, 2013).
Benalu alpukat merupakan salah satu benalu yang termasuk dalam famili
Loranthaceae dan sampai saat ini belum ada penelitian mengenai sitotoksisitas
dari benalu alpukat. Pada umumnya tanaman yang termasuk dalam satu famili
memiliki proses fisiologi yang hampir sama, hal ini menyebabkan banyak
tanaman dalam satu famili mempunyai kandungan senyawa kimia yang sejenis
(Astuti, 2013). Selanjutnya dilakukan pengujian dari ekstrak etanol daun benalu
alpukat (Dendrophthoe sp. grew on Persea americana) secara in vitro dengan
metode MTT untuk mengetahui sitotoksistasnya. Terlebih dahulu penelitian
dimulai dengan pembuatan ekstrak daun benalu alpukat menggunakan pelarut
etanol 96% dengan metode maserasi. Kemudian dibuat konsentrai bahan uji yaitu
800 µg/ml, 400 µg/ml, 100 µg/ml dan 50 µg/ml serta dilanjutkan dengan uji
secara in vitro dengan metode MTT.
Microculture Tetrazolium Salt (MTT) Assay merupakan uji yang sensitif,
kuantitatif dan terpercaya. Reaksi MTT merupakan reaksi reduksi selular yang
didasarkan pada pemecahan garam tetrazolium berwarna kuning menjadi Kristal
formazan berwarna biru keunguan (CCRC, 2009). Metode ini menggunakan sel
kanker payudara (Sel T47D) sebagai sel uji coba. Uji MTT digunakan untuk
menentukan parameter nilai IC50, yaitu bilangan yang menunjukkan konsentrasi
ekstrak yang mampu menghambat aktivitas sebesar 50%. Semakin kecil nilai IC50,
menunjukkan semakin toksik ekstrak terhadap sel kanker.

vii

Hasil dari uji tersebut kemudian diolah dengan analisis probit menggunakan
program SPSS edisi 16. Dari hasil tersebut disimpulkan bahwa ekstrak etanol
memiliki sitotoksisitas dengan nilai IC50 sebesar 19.598 µg/ml terhadap sel kanker
payudara (Sel T47D). Hasil dari uji kromatografi lapis tipis (KLT) menunjukkan
adanya senyawa flavonoid, steroid/triterpenoid, dan saponin pada ekstrak etanol
daun benalu alpukat (Dendrophthoe sp. grew on Persea americana) .
Kandungan kimia yang memiliki sifat sitotoksik dari penelitian ini perlu
dilakukan penelitian lanjutan melakukan penelitian lebih lanjut dengan
menggunakan jenis sel kanker lainnya, seperti sel kanker myeloma, sel kanker
raji, kanker pankreas dan sel normal. Selain itu, juga perlu dilakukan optimasi
dengan menggunakan pelarut lain untuk mendapatkan IC50 yang lebih aktif
terhadap sel kanker payudara (Sel T47D).

viii

ABSTRAK
Benalu (Dendrophthoe sp.) adalah tanaman yang dapat tumbuh pada
tanaman lain dengan cara menempel dan dapat dimanfaatkan sebagai obat batuk,
diuretik, analgesik, serta sebagai obat antikanker secara tradisional. Tujuan
penelitian ini adalah mengetahui sitotoksisitas atau potensi untuk dikembangkan
sebagai antikanker dari ekstrak etanol daun benalu alpukat (Dendrophthoe sp.
grew on Persea americana) terhadap sel kanker payudara (Sel T47D) dengan
metode MTT (Microculture Tetrazolium Salt) secara in vitro. Aktivitas dari sel
kanker dapat dilihat dari persentase sel hidup yang diinkubasi selama semalam
kemudian dianalisis probit log dengan menggunakan SPSS edisi 16 untuk
mengetahui harga IC50 ekstrak tersebut. Menurut National Cancer Institute (NCI)
suatu ekstrak dinyatakan aktif memiliki aktivitas antikanker apabila memiliki nilai
IC50 < 30 µg/ml. Dari hasil penelitian yang telah dilakukan, disimpulkan bahwa
ekstrak etanol daun benalu alpukat (Dendrophthoe sp. grew on Persea americana)
yang diuji pada sel kanker payudara sel T47D dengan metode MTT secara in vitro
mengandung flavonoid, steroid/triterpen, dan saponin serta memiliki sitotoksisitas
dengan IC50 yaitu sebesar 19.598 µg/ml.
Kata Kunci

: Daun Benalu Alpukat (Dendrophthoe sp. grew on Persea
americana), Kanker Payudara (Sel T47D), Etanol, Microculture
Tetrazolium Salt (MTT) Assay.

ix

ABSTRACT
Dendrophthoe sp. by sticking and can used in traditional/alternative
medicine such as for cough, diuretic, analgesic, and anticancer. This research
aims to find out the in vitro cytotoxicity or potential source for natural anticancer
in ethanol extract of Dendrophthoe sp. grew on Persea americana leaves against
breast cancer cells (T47D cells) through MTT (Microculture Tetrazolium Salt)
assay. The anticancer activity can be seen from the percentage of the living cells
which are incubated during a night. Then analyzed probit logs by using SPSS ed.
16th to find out the value of IC50 from the extract. Based on National Cancer
Institute (NCI) if a cytotoxicity test of a compound shows IC50 > 30 µg/ml. The
result of this research is ethanol extract of Dendrophthoe sp. grew on Persea
americana leaves against breast cancer cells (T47D cells) through MTT contains
flavonoids, steroids/triterpen, and saponins and has in vitro cytotoxicity with
19.598 µg/ml.
Key words

: Dendrophthoe sp. grew on Persea americana, Breast Cancer Cell
(T47D cells), Ethanol, Microculture Tetrazolium Salt (MTT)
Assay.

x

DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL............................................................................................ i
LEMBAR PENGESAHAN ................................................................................ ii
LEMBAR PENGUJIAN ...................................................................................iii
KATA PENGANTAR ...................................................................................... iv
RINGKASAN .................................................................................................. vii
ABSTRAK ........................................................................................................ ix
ABSTRACT ....................................................................................................... x
DAFTAR ISI ...................................................................................................... xi
DAFTAR TABEL ............................................................................................xiii
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... xiv
DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xv
DAFTAR SINGKATAN ................................................................................. xvi
BAB I PENDAHULUAN ................................................................................... 1
1.1 Latar belakang ................................................................................... 1
1.2 Rumusan Masalah Penelitian ............................................................ 4
1.3 Tujuan Penelitian .............................................................................. 5
1.4 Hipotesis Penelitian........................................................................... 5
1.5 Manfaat Penelitian ............................................................................ 5
BAB II TINJAUAN PUSTAKA......................................................................... 7
2.1 Tinjauan Tentang Benalu Alpukat .................................................... 7
2.1.1 Klasifikasi................................................................................ 7
2.1.2 Sinonim ................................................................................... 8
2.1.3 Nama Daerah ........................................................................... 8
2.1.4 Morfologi ................................................................................ 8
2.1.5 Etiologi dan Penyebaran.......................................................... 8
2.1.6 Khasiat ..................................................................................... 9
2.1.7 Kandungan .............................................................................. 9
2.2 Tinjauan tentang Kanker ................................................................ 11
2.2.1 Definisi .................................................................................. 11
2.2.2 Perbedaan Sel Kanker dengan Sel Normal ........................... 11

xi

2.2.3 Penyebab Kanker................................................................... 12
2.2.4 Gejala Kanker ........................................................................ 13
2.2.5 Proses Karsinogenesis ...........................................................13
2.3 Tinjauan tentang Kanker Payudara ................................................. 14
2.3.1 Definisi .................................................................................. 14
2.3.2 Etiologi .................................................................................. 15
2.3.3 Faktor Resiko ........................................................................ 17
2.3.4 Gejala .................................................................................... 17
2.4 Tinjauan tentang Antikanker ........................................................... 18
2.5 Tinjauan tentang Sel T47D ............................................................ 21
2.6 Tinjauan tentang Ekstraksi .............................................................. 21
2.7 Tinjauan tentang MTT Assay .......................................................... 22
BAB III KERANGKA KONSEPTUAL .......................................................... 23
BAB IV METODE PENELITIAN ................................................................... 25
4.1 Bahan Penelitian ........................................................................... 25
4.1.1 Bahan Tanaman .................................................................... 25
4.1.2 Bahan Kimia dan Bahan Lain ............................................... 25
4.2 Alat-alat Penelitian........................................................................ 25
4.3 Variabel Penelitian ........................................................................ 26
4.3.1 Variabel Bebas ...................................................................... 26
4.3.2 Variabel Tergantung ............................................................. 26
4.4 Metode Penelitian ......................................................................... 26
4.4.1 Rancangan Penelitian ............................................................ 26
4.4.2 Kerangka Operasional ........................................................... 27
4.4.3 Prosedur Kerja ...................................................................... 28
4.4.3.1 Pembuatan Ekstrak Bahan Uji ....................................... 28
4.4.3.2 ..........................................................................................Id
entifikasi Golongan Senyawa dengan KLT ............................. 28

4.4.3.3Pembuatan Media ........................................................... 30
4.4.3.4 Penumbuhan Sel ............................................................ 30
4.4.3.5 Penggantian Media ........................................................ 31
4.4.3.6 Panen Sel ....................................................................... 32

xii

4.4.3.7 Perhitungan Sel .............................................................. 32
4.4.3.8 Pembuatan Larutan Induk dan Larutan Uji ................... 33
4.5 Uji Sitotoksisitas dengan Metode MTT ........................................ 34
4.6 Analisis Data ................................................................................. 36
BAB V HASIL PENELITIAN ......................................................................... 37
5.1 Hasil Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Benalu Alpukat
(Dendrophthoe sp. Grew On Persea Americana) ........................ 37
5.2 Hasil Identifikasi Flavonoid dengan Kromatografi Lapis Tipis ... 38
5.3 Perhitungan Sel T47D dan Volume Panen Sel yang di Transfer .. 38
5.4 Uji Sitotoksisitas dari Ekstrak Etanol Daun Benalu Alpukat
(Dendrophthoe sp. Grew On Persea Americana) Terhadap Sel
Kanker Payudara (Sel T47D) dengan Metode MTT secara In
Vitro ............................................................................................. 39
5.5 Analisis Data ................................................................................. 41
BAB VI PEMBAHASAN ................................................................................ 42
BAB VII KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................... 47
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................... 48
DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... 53

xiii

DAFTAR TABEL

Tabel

Halaman

IV.1 Kelompok Perlakuan Kultur Sel Kanker Payudara(Sel T47D) dalam Tiap
Percobaan ...................................................................................................27
V.1 Hasil Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Benalu Alpukat (Dendrophthoe sp.
Grew On Persea Americana) .......................................................................37
IV.2 Data Hasil Uji MTT Ekstrak Etanol Daun Benalu Alpukat (Dendrophthoe
sp. grew on Persea americana) Terhadap Sel Kanker Payudara (Sel T47D)
dengan Metode MTT secara in vitro ......................................................... 39

xiv

DAFTAR GAMBAR
Gambar

Halaman

2.1 Tanaman Benalu Alpukat (Dendrophthoe sp. grew on
Persea americana) .................................................................................. 7
2.2 Struktur Kuersetin .................................................................................... 10
2.3 Proses Terjadinya Karsinogenesis............................................................ 13
3.1 Skema Kerangka Konseptual.................................................................. 24
4.1 Skema Kerangka Operasional ................................................................. 24
4.2 Skema Ekstraksi dengan Serbuk Daun Benalu Alpukat dengan Pelarut
Etanol 96% ............................................................................................. 24
5.1 Ekstrak Etanol Daun Benalu Alpukat (Dendrophthoe sp. grew on
Persea americana) ................................................................................... 37
5.2 Hasil Identifikasi golongan Flavonoid dengan Kromatografi Lapis
Tipis ........................................................................................................ 38
5.3 Kondisi sel sebelum dan sesudah pemberian bahan uji yaitu pemberian
ekstrak etanol daun benalu alpukat (Dendrophthoe sp. grew on Persea
americana) dilihat di bawah mikroskop dengan perbesaran 40 kali ...... 40
5.4 Kondisi sel pada kontrol dan kelompok uji sesudah pemberian MTT
dilihat di bawah mikroskop dengan perbesaran 40 kali. (a) kelompok
kontrol dan (b) kelompok uji .................................................................. 40
5.5 Hubungan Antara Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Benalu Alpukat
(Dendrophthoe sp. grew on Persea americana) terhadap Persentase
Viabilitas Sel Hidup Kanker Payudara (Sel T47D) dengan Metode MTT
secara in vitro .......................................................................................... 41

xv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran

Halaman

1. Daftar Riwayat Hidup ................................................................................. 53
2. Surat Pernyataan .......................................................................................... 54
3. Surat Determinasi Tanaman ........................................................................ 55
4. Analisis Probit Log Ekstrak Etanol Daun Benalu Alpukat (Dendrophthoe
sp. grew on Persea americana) terhadap Sel Kanker Payuda (Sel T47D)
dengan Metode MTT secara In Vitro .......................................................... 56
5. Gambar Bahan dan Alat .............................................................................. 58

xvi

DAFTAR SINGKATAN

CCRC

= Cancer Chemoprevention Research Center

DMEM

= Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DMSO

= Dimethyl Sulfoxide

DNA

= Deoxyribose Nucleic Acid

EDTA

= Ethylenediamine tetraacetic acid

ELISA

= Enzyme Linked Immunosorbent Assay

ER

= Endoplasma Reticulum

FBS

= Fetal Bovine Serum

HCl

= Hidroclhoride Acid

HIV

= Human Immunodificiency Virus

IC50

= Inhibitory Concentration 50

LAF

= Laminar Air Flow

MK

= Media Kultur

MTT

= Microculture Tetrazolium Salt

NaOH

= Natrium Hidroksida

PBS

= Phospate Buffer Saline

RPMI

= Rosewell Park Memorial Institute

SDS

= Sodium Dedocyl Sulfate

T47D

= Continous Cell Line

USDA

= United State Department of Agricultural

WHO

= World Health Organization

xvii

DAFTAR PUSTAKA
Astuti, R.D., 2013. Uji Anti Poliferasi Estrak Etil Asetat Daun Benalu Kepel
(Dendrophtoe curvula (Blume) Miq.) Terhadap Cell Line Kanker
Payudara, Yogyakarta: Program Studi Kimia Universitas Islam Negeri
Sunan Kalijaga.
Anggorowati, L., 2013. Faktor Rresuki Kanker Payudara Wanita, Bandung:
Jurnal Kesehatan Masyarakat
Badri,

C., 2013. Penanggulangan Kanker Di Indonesia :
Nanotechnology Dalam Diagnosis Dan Terapi, Jakarta:
Departemen Radiologi FKUI/RSCM – DEPKES.

Peran
Jurnal

Balasubramaniam, M., 2011. Pengetahuan Wanita tentang Sadari Sebagai
Deteksi Dini Kanker Payudara di Kelurahan Petisah Tengah 20072009, USU Instutisional Repository.
BPOM RI., 2010. Acuan Sediaan Herbal. Volume ke-5. Edisi ke-1, Jakarta :
Direktorat Obat Asli Indonesia Deputi Bidang Pengawasan Obat
Tradisional, Kosmetik dan Produk Komplemen, hal 129.
CCRC (Cancer Chemoprevention Research Center), Farmasi, 2009. Prosedur Uji
MTT
Invitro.
Universitas
Gajah
MadaYogyakarta.
http://ccrcfarmasiugm.wordpress.com/ensiklopedia/ensiklopediakanker/kanker-mammae-2/, Oktober 2013
CCRC (Cancer Chemoprevention Research Center). 2009. Preparasi sampel.
Yogyakarta: Fakultas Farmasi UGM.
Corwin, Elizabeth, J. 2008. Buku Saku Patofisiologi. Jakarta: EGC
De Jong, Wim. 2004. Kanker, Apakah Itu?. Cetakan I. Jakarta : Arcan.
Diananda, Rahma. 2007. Mengenal Seluk Beluk Kanker. Yogyakarta: Katahati.
Dipiro, Joseph T., 2008. Pharmacotheraphy : A Phatophsyologic Approach.
Seventh Edition. The McGraw-Hill Companies, Inc.,pp.
Faisel, C.T.W., 2012. Gambaran Efek Samping Kemoterapi Berbasis
Antrasiklin Pada Pasien Kanker Payudara Di RSUD Dokter Soedarso
Pontianak, Pontianak: Naskah Publikasi Fakultas Kedokteran Universitas
Tanjungpura.

xviii

Fauziah, J.P & Endang, S., 2012. Hubungan Antara Efikasi Diri dengan
Perilaku Mencari Pengobatan pada Penderita Kanker Payudara di
RSUD Ibnu Sina Gresik: Jurnal Fakultas Psikologi Universitas
Airlangga, Vol 1, No 2.
Fitrya, L., 2009. Uji Aktivitas Antikanker Secara In Vitro dengan Sel Murine
P-388 Senyawa Flavonoid dari Fraksi Etilasetat Akar Tumbuhan
Tunjuk Langit (Helmynthostachis zeylanica (Linn) Hook). Jurnal
Penelitian Sains Universitas Sumatera Utara Vol. 12 Nomer 1(C) 12106,
hal 1.
Ghofar, A., 2009. Cara Mudah Mengenal & Mengobati Kanker.Cetakan I.
Flamingo. Jogjakarta. Hal 126.
Harahap, Y., Syahfan & H.N., Karsono, B., 2007.Uji Sitotoksisitas Sedian Jadi
Daging Buah Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa) Terhadap Sel
MCF-7 Secara IN VITRO.Jurnal Bahan Alam Indonesia. ISSN Vol 6. No
2 : 1412 – 2855.
Haryadi, D., 2012. Senyawa Fitokimia Dan Sitotoksis Ekstrak Daun Surian
(Toona sinensis) Terhadap Sel Vero Dan MCF7. Institut pertanian
Bogor.
Herien, Y., 2010. Hubungan Berbagai Dukungan Sosial dengan Tingkat
Depresi Penderita Kanker Payudara di IRNA Bedah RSUD Dr.
ADNAAN WD Payakumbuh Tahun 2010. Penelitian Keperawatan
Jiwa Fakultas Keperawatan Universitas Andalas.
Hidayanti, D.N., Arifin, I.,Susilowati, S., 2012.uji Sitotoksisitas Fraksi Etil
Asetat Ekstrak Etanol Herba Alfalfa (Medicago) Terhadap Sel
Kanker payudara T47D dan Sel Kanker Leher Rahim (Sel HeLa)
serta Uji Kandungan Senyawa Kimianya. Semarang: Universitas Wahid
Hasyim.
Ikawati, M., Wibowo, E.A., Octa, N.S., Adelina, R., 2008. Pemanfaatan Benalu
Sebagai Agen Antikanker,Yogyakarta:
Jurnal Fakultas Farmasi
Universitas Gadjah Mada.
Ilham, F.Y., Wahyuni, F.S., husni, E.,2013. Uji Efek Sitotoksik Hasil Fraksinasi
Ekstrak Etanol Akar Kandis (Garcinia cowa Roxb.) terhadap Sel
Kanker Payudara T47d dengan Metoda MTT. Sumatera Utara:
Fakultas Andalas Padang.

xix

Joen, P.F., 2001. Handbook of Pathophysiology. Springhouse Coporation, hal
16-17.
Kementrian Kesehatan Nasional Republik Indonesia. 2012. Penderita Kanker
Diperkirakan Menjadi Penyebab Utama Beban Ekonomi Terus
Meningkat.
Diakses
dari
http://www.depkes.go.id/index.php?vw=2&id=1937. Agustus 2013.
Lubis, A.A., 2010. Gambaran Klinik Terbanyak Pada Penderita Kanker
Payudara di RSUP H. Adam Malik Medan Tahun 2007-2009. Medan:
Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara.
Maharani, Sabrina. 2009. Kanker: Mengenal 13 Jenis Kanker dan Pengobatan.
Jogjakarta: Ar-Ruz Media.
Malangngi. L.P., Sangi, M.S.,Paendong, J.J.E., 2012. Penentuan Kandungan
Tanin dan Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Biji Buah Alpukat
(Persea americana Mill.), Manado: Jurnal FMIPA, Unsrat.
Muharni., Dachriyanus., Bahti, H.H., Supriyanto.,2011. Evaluasi Aktivitas
Sitotoksik Senyawa Fenol dari kulit Batang Manggis Hutan (Garcinia
bancana Miq.). Jurnal Fakultas MIPA Universitas Mulawarman. Vol.10,
No 1.
Multiawati, N., 2013. Uji Antikanker Ekstrak Metanol Daun Benalu Kelor
(Helixanthera sessiliflora (Merr.) Denser) Terhadap Cell Line kanker
Payudara T47D, Yogyakarta: Skripsi Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas Islam negeri Sunan Kalijaga.
Mulyani, D., 2010. Stop Kanker. Cetakan pertama. Jakarta : Agromedia Pustaka.
hal 21-27.
Nafrialdi., Gunawan, S.G., 2007. Antikanker, Farmakologi dan Terapi. Edisi
Ke-5. Jakarta: Departemen Farmakologi dan Terapetik Fakultas
Kedokteran Universitas Indonesia.
National Cancer Institute. 2001. Measuring Cancer Death. Cited from
http://www.cancer.gov/csr. Maret 2010.
Nurani, Laela Hayu. 2012. Citotoxicity and Antipoliferative Test on T47D and
Verro Cell Lines of Nigella sativa, L SEED, Yogyakarta: Jurnal
Universitas Ahmad Dahlan, Vol. 2, No 1.
Nursid, M.,Pratitis, A, chasanah, E., 2010. Kultivasi kapang MFW-01-08 yang
Di Isolasi dari Ascidia aplidium longithorax dan Uji Aktivitas
xx

Sitotoksiknya Terhadap Sel Kanker Payudara T47D. Sulawesi: Jurnal
Pascapanen dan Bioteknologi kelautan dan Perikanan, Vol.5, No 2.
Piantelli., Mauro., 1995. Tamoxifen and Quercetin Interact with Type II
Estrogen Binding Sites and Inhibit the Growth of Human Melanoma
Cell. The Journal Of Investigative Dermatology.
Rahayu, S., Sofarih, A.E.,Permatasari, D.N., 2010. Teh Celup Benalu Mangga
(Dendrophthoe pentandra) :Minuman Sehat Penunjang Terapi
Kanker, Yogyakarta: PKM Universitas Gadjah Mada.
Rachmawati, A, E, V., Muliartha, I, K, G., Kusworini. 2013. Pengaruh Ekstrak
Daun Benalu Mangga (Dendrophthoe pentandra) Terhadap Viabilitas
dan Ekspresi Caspase 3 Aktif pada Sel Kanker Serviks (Sel HeLa).
Program Studi Pendidikan Dokter Fakultas Kedokteran Universitas
Brawijaya. Malang
Rahmawati, Emma., 2013. Uji Aktivitas antikanker Herba Pacar Air
(Impatients balsamina Linn.) Terhadap Sel kanker Payudara T47D
secara In Vitro dengan Metode MTT. Malang: Skripsi Program Sarjana.
Ramli, Muchlis., Umbas, Rainy, dan Panigoro, Sonar. S., 2002. Deteksi Dini
Kanker. Jakarta : Fakultas Kedokteran UI.
Redha, A., 2010. Struktur Sifat Antioksidatif dan Peranannya dalam Sistem
Biologis. Pontianak: Jurnal Teknologi Pertanian Politeknik Negeri
Pontianak, Vol 9, No 2.
Rossaria, N., 2007. Kajian Antiproliferatif Ekstrak Daun Benalu Duku
(Loranthaceae dendrophthoespecies) Terhadap Sel Mieloma Secara In
Vitro, Surabaya: Artikel Ilmiah Fakultas Kedokteran Hewan Universitas
Airlangga.
Sari, L.O.R., 2006. Pemamfaatan Obat Tradisional dengan Pertimbangan
Mamfaat dan Keamanan, Jember: Jurnal Prodi Studi Farmasi
Universitas Jember, Vol 1, No 2.
Sirait, M. 2011. Pengetahuan dan Sikap Suami Tentang Kanker Payudara
Yang Diderita Istri Di RSUD. Dr. Pirngadi Medan Tahun 2011.
Sumatera: Universitas Sumatera Utara.
Siswandono., Soekardjo, B., 2008. Kimia Medisinal. Edisi ke-2, Surabaya :
Airlangga University Press., hal 164-165.

xxi

Sudiana, I., Ketut. 2008. Patobiologi Molekuler Kanker. Jakarta: Salemba
Medika.
Suffness, M., Pezzuto, J.M., 1990. Assays Related to Cancer Drug Discovery.
In : Hostettman K (ed). Methods in Plant Biochemistry.
Sundaryono, A., 2011., Teratogenitas Senyawa Flavonoid Dalam Ekstrak
Metanol Daun Benalu (Dendrophthoe pentandra (L) Miq. ) pada Mus
musculus. Jurnal Exacta, Vol. IX No. 1.
Sutma, S., 2012. Uji Efek Sitotoksik Ekstrak Etanol Kulit Buah Asam Kandis
(Garcinia cowa Roxb.) Terhadap Sel Kanker Payudara T47D dengan
Metode MTT. Padang: Skripsi, Fakultas Farmasi UNAND.
Tjay, Tan Hoan., Rahardja, Kirana. 2007. Obat-Obat Penting. Jakarta:
Gramedia.
USDA., 2013. Species 2000 & ITIS Catalogue of Life. Taxonomic Information
for Dendrophthoe pentandra. http://eol.org/pages/2872661/names.
Diakses pada tanggal 08 Januari 2014.
Wahyuni, S.W., Firnando, E., Husni, E., Kajian Efek Sitotoksik Hasil Fraksinasi
Ekstrak Etanol Kulit Buah Asam Kandis (Garcinia cowa Roxb.)
Terhadap Sel Kanker Payudara T47D dngan Metoda
MICROTETRAZOLIUM (MTT) : Fakultas Farmasi Universitas Andalas.
Prosiding Seminar Nasional Perkembangan Terkini Sains Frmasi dan
Klinik III 2013.
Waji, R,A & Sugrani, A., 2009. Makalah Kimia Organik Bahan Alam
(Quercetin) , Makasar: Makalah Kimia Organik Program S2 Kimia
Fakultas Ilmu Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam UNHAS.
Winarno, Eko. 2011. Uji sitoksisitas Ekstrak Kapang Aspergillus sp. Terhadap
Sel Kanker Payudara T47D. Depok: Skripsi Program Sarjana
Universitas Indonesia.
Xia et al., 2013. Flavonoids as Potential Anti-hepatocellular Carcinoma
Agents: Recent Approaches Using HepG2 Cell Line, pp 1.
Yayasan Kanker Indonesia. 2013. Pencegahan dengan Cara Hidup Sehat dan
Menghindari Penyebab Kanker. Diakses dari Error! Hyperlink
reference not valid..

xxii