Elektrode Komposit Zeolit sebagai Biosensor Berbasis Tirosinase

ELEKTRODE KOMPOSIT ZEOLIT SEBAGAI BIOSENSOR
BERBASIS TIROSINASE

MARYANI YUNITA

DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Elektrode Komposit
Zeolit sebagai Biosensor Berbasis Tirosinase adalah benar karya saya dengan
arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.

Bogor, Februari 2014
Maryani Yunita
NIM G44090001

ABSTRAK
MARYANI YUNITA. Elektrode Komposit Zeolit sebagai Biosensor Berbasis
Tirosinase. Dibimbing oleh LATIFAH K DARUSMAN dan ZULHAN ARIF.
Tirosinase merupakan enzim mengandung tembaga yang mengkatalisis 2
tahap reaksi biosintesis melanin pada mamalia dan berperan dalam reaksi
pencokelatan enzimatis. Penelitian ini bertujuan membuat dan menguji biosensor
inhibitor komposit zeolit berbasis tirosinase serta pengujian stabilitasnya. Enzim
atau komponen hayati yang digunakan diimobilisasi pada permukaan transduser
untuk menjaga aktivitas enzim. Aktivitas tirosinase diukur menggunakan substrat
L-DOPA. Kondisi optimum aktivitas tirosinase berdasarkan respons optimizer
adalah tirosinase 50 U/mL dan zeolit 150 mg/mL. Penggunaan mediator ferosena
dan material penyangga zeolit meningkatkan aktivitas tirosinase. Nilai KMapp dan
Imaks app tirosinase ditentukan dengan metode Lineweaver-Burk. Nilai KM app dan Imaks
app sebesar 6.04 mM dan sebesar 6.42 mM. Elektrode menggunakan zeolit sebagai
matriks imobilisasi relatif stabil hingga 2 jam; aktivitas tirosinase yang tersisa sebesar
87.45%.

Kata kunci: biosensor, elektrode berbasis tirosinase, inhibitor tirosinase

ABSTRACT
MARYANI YUNITA. Zeolite Composite Electrode for Tyrosinase-Based
Biosensor. Supervised by LATIFAH K DARUSMAN and ZULHAN ARIF.
Tyrosinase is a copper-containing oxidase, which catalyzes the first 2 steps in
mammalian melanogenesis and responsible for enzymatic browning reactions. This
study aims to develop and characterize tyrosinase biosensor of zeolite composite
and its stability. The enzyme should be properly attached to the transducer for
maintaining enzyme activity. Tyrosinase activity was monitored by L-DOPA as a
substrate. The optimum conditions of tyrosinase activity obtained by respon
optimizer were tyrosinase 50 U/mL and zeolite 150 mg/mL. Using of ferrocene as
mediator and zeolite as the immobilization matrix on electrode increased the
activity of tyrosinase. KMapp and Imaks app values of tyrosinase were determined by
Lineweaver-Burk method, giving 6.04 mM and 6.42 mM, respectively. The
electrode of zeolite as immobilizing matrix was relatively stable until 2 hours, the
remaining tyrosinase activity was 87.45%.
Keywords: biosensor, tyrosinase-based electrode, tyrosinase inhibitor

ELEKTRODE KOMPOSIT ZEOLIT SEBAGAI BIOSENSOR

BERBASIS TIROSINASE

MARYANI YUNITA

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Kimia

DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

Judul Skripsi : Elektrode Komposit Zeolit sebagai Biosensor Berbasis Tirosinase
Nama
: Maryani Yunita
NIM

: G44090001

Disetujui oleh

Prof Dr Ir Latifah K. Darusman, MS
Pembimbing I

Zulhan Arif, S.Si, M.Si
Pembimbing II

Diketahui oleh

Prof Dr Dra Purwantiningsih Sugita, MS
Ketua Departemen

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Kuasa atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang

dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Maret 2013 ini ialah
Biosensor, dengan judul Elektrode Komposit Zeolit sebagai Biosensor Berbasis
Tirosinase.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Prof Dr Ir Latifah K. Darusman,
MS dan Zulhan Arif, MSi selaku pembimbing yang telah memberi arahan dan
bimbingan kepada penulis. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada Pak Deden
Saprudin yang telah membantu dalam perbaikan karya ilmiah ini serta staf Kimia
Analitik IPB, Ibu Nunung, Om Eman, Pak Dede, staf Pusat Studi Biofarmaka IPB
atas segala bantuan selama penulis menjalani penelitian di Laboratorium Kimia
Analitik dan Pusat Studi Biofarmaka IPB. Penulis juga mengucapkan terima kasih
kepada kedua orang tua, Om, Tante, Adik, Mbak dan Mas yang telah memberikan
bantuan dan semangat kepada penulis. Tak lupa terima kasih juga disampaikan
kepada Elin dan Dwi atas bantuannya dalam penulisan karya ilmiah ini.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Februari 2014
Maryani Yunita

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vi

DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

PENDAHULUAN

1

Tujuan Penelitian

2

METODE

2

Bahan

2

Alat

2

HASIL DAN PEMBAHASAN

5

Ekstraksi dan Aktivitas Inhibitor Ekstrak Rhizopora apiculata

5

Aktivasi Zeolit

6

Imobilisasi Enzim

7

Pengoptimuman Aktivitas Tirosinase

8

Penentuan Kinerja Elektrode

10

Stabilitas Biosensor

12

SIMPULAN DAN SARAN

13

Simpulan

13

Saran

13

DAFTAR PUSTAKA

13

LAMPIRAN

16

RIWAYAT HIDUP

22

DAFTAR TABEL
1 Nilai IC50 inhibitor tirosinase (monofenolase dan difenolase)
pada ekstrak kasar bakau Rhizopora. apiculata
2 Puncak arus dan potensial modifikasi metode imobilisasi

6
7

DAFTAR GAMBAR
1 Tapak aktif tirosinase
2 Aktivasi zeolit
3 Voltammogram puncak arus anode dan katode tirosinase
Tir/PC, Tir/Zeolit/PC, Tir/Zeolit/PCf
4 Voltammogram siklik hasil pengoptimuman enzim dan zeolit
5 Reaksi oksidasi dopa menjadi dopakuinon
6 Hubungan aktivitas tirosinase dan konsentrasi inhibitor
7 Hubungan konsentrasi L-DOPA dengan aktivitas

tirosinase terimobilisasi pada matrik zeolit
8 Rentang Linear antara L-DOPA dengan tirosinase
9 Alur Lineweaver-Burk substrat L-DOPA dengan tirosinase
10 Stabilitas biosensor

1
6
7
9
9
10
11
11
12
12

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7

8
9
10

Diagram alir penelitian
Rendemen ekstraksi bakau
Difraktogram zeolit Cikalong
Data JCPDS zeolit mordernit
Pengoptimuman enzim tirosinase
Arus puncak dan potensial oksidasi substrat dengan
penambahan dan tanpa penambahan inhibitor
Contoh perhitungan IC50 Inhibitor Tirosinase baik monofenolase dan
difenolase ekstrak teraktif (ekstrak metanol kulit batang Rhizophora
apiculata)
Analisis kinetika tirosinase terimobilisasi dengan metode
Lineweaver-Burk
Arus dan potensial penentuan stabilitas tirosinase
Stabilitas biosensor

16
17
17
17
18
18

18
19
20
21

PENDAHULUAN
Tirosinase merupakan enzim yang berperan dalam biosintesis melanin.
Tirosinase (EC 1. 14. 18. 1) mengandung tembaga dan berperan mengkatalisis
reaksi hidroksilasi monofenol menjadi o-difenol (reaksi monofenolase) dan
oksidasi o-difenol menjadi o-kuinon (reaksi difenolase). Substrat yang berperan
dalam reaksi monofenolase dan difenolase yaitu L-tirosin (Chang 2009). Tirosinase
banyak ditemukan pada mamalia, buah-buahan, dan juga di dalam proses
pencoklatan jamur secara enzimatik (Chang 2009). Tirosinase berfungsi
mengkatalisis reaksi pencoklatan melalui proses metabolisme biosintesis melanin.
Melanin memiliki fungsi perlindungan kulit terhadap radiasi sinar ultraviolet. Akan
tetapi produksi melanin yang berlebihan menyebabkan terjadinya akumulasi
melanin atau hiperpigmentasi pada kulit serta pencoklatan pada buah yang tidak
diharapkan. Saat ini telah banyak dilakukan penelitian tentang senyawa inhibitor
tirosinase yang berasal dari bahan alam. Arung et al. (2006) menemukan
Artocarpanone dari Artocarpus heterophyllus memiliki kemampuan menghambat
biosintesis melanin. Batubara et al. (2010) telah melakukan penelitian terhadap
tanaman obat Indonesia dari 35 spesies dan diperoleh bahwa ekstrak metanol dari
kayu Rhizophora sp memiliki kemampuan inhibisi yang cukup baik terhadap
tirosinase.

Gambar 1 Tapak Aktif Tirosinase (Eslami et al. 2012)
Senyawa-senyawa inhibitor tirosinase telah banyak ditemukan baik senyawa
bahan alam maupun sintetik. Penghambatan enzim tirosinase ditentukan oleh
keberadaan tirosine dan DOPA sebagai substrat serta pembentukan dopakrom.
Senyawa yang berasal dari bahan alam telah dilaporkan dapat menghambat enzim
tirosinase, seperti senyawa yang berasal dari golongan flavonol (kuersetin, mirisetin,
kaempferol), golongan isoflavon, flavanol, kalkon, dan stilbenoid (Chang 2009).
Penghambatan pembentukan melanin umumnya dilakukan dengan menghambat
aktivitas tirosinase (Hartanti dan Setiawan 2009)
Penentuan aktivitas hambatan suatu enzim umumnya digunakan dengan
metode ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) (Sheng et al 2009),
spektrofotometri (Arung et al 2006). Metode tersebut memiliki beberapa
kekurangan diantaranya ialah memerlukan bahan kimia dalam jumlah besar serta
penanganan yang cukup rumit dalam preparasi contoh. Metode alternatif yang dapat
digunakan untuk pengukuran aktivitas inhibisi enzim yaitu biosensor. Biosensor
adalah suatu piranti yang memanfaatkan interaksi hayati untuk mendeteksi analat
(Serra 2010). Biosensor memiliki beberapa keunggulan yaitu instrumentasinya
sederhana, tidak mahal, serta memiliki sensitivitas dan selektivitas tinggi dengan
pendeteksian yang cepat (Zhang et al. 2011).
Pemanfaatan biosensor telah berkembang pesat. Salah satu pembuatan
biosensor sering menggunakan teknik imobilisasi enzim guna peningkatan
efektivitas biosensor. Metode imobilisasi yang dilakukan diantaranya pengikatan
kimia (covalent binding), penjebakan (entrapment), taut silang (cross-link), serta

2
adsorbsi (Serra 2010). Material yang digunakan sebagai bahan imobilisasi
glutaraldehida (Anh et al. 2002), kitosan (Lin et al. 2003), partikel nano emas (Dai
et al. 2004), zeolite alam (Weniarti 2011). Metode imobilisasi yang paling menarik
adalah menggunakan teknik adsorpsi karena relatif mudah dalam
pengaplikasiannya. Salah satu material yang dapat digunakan sebagai bahan
imobilisasi adalah zeolit. Zeolit merupakan suatu kristal alumina silika yang terdiri
dari tiga bagian yaitu kation yang dapat dipertukarkan, kerangka alumina silikat dan
air. Zeolit memiliki struktur yang sebagian besar tersusun dari silikon tetrahedral yang
terhubung satu sama lain dengan atom oksigen membentuk pori yang khas dengan
ukuran nano. Pori adalah tempat masuknya molekul gas maupun cairan dan
menjerapnya dengan kuat. Zeolit memiliki beberapa keunggulan, yaitu stabil pada suhu
tinggi, bersifat semikonduktor sehingga dapat mentransfer elektron.

Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan membuat dan menguji elektrode komposit zeolit
berbasis enzim tirosinase serta pengujian stabilitasnya.

METODE
Penelitian ini terdiri dari beberapa tahap percobaan, yaitu ekstraksi Rhizopora
apiculata, aktivasi zeolit atas pelarut asam, karakterisasi elektrode, imobilisasi
enzim pada elektrode, optimasi aktivitas tirosinase terimobilisasi, penentuan
stabilitas biosensor, serta penentuan kemampuan inhibisi enzim.

Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah, Rhizopora apiculata
diperoleh dari Makassar Sulawesi selatan, enzim tirosinase (Sigma, 333 unit/mL
dalam larutan penyangga fosfat), zeolit, grafit, ferosena, parafin cair, dimetil
sulfoksida (DMSO), larutan larutan penyangga fosfat pH 7 dan pH 6.5, membran
dialisis , L-DOPA, L-tirosin, metanol, gliserol.

Alat
Alat dan instrumen yang akan digunakan adalah eDAQ Potensiostat –
Galvanostat yang dilengkapi perangkat lunak Echem v2.1.0, laminar air flow,
Spektroscopy UV-Pharmaspec 1700 (Shidmazu, Kyoto, Japan), pipet mikro, batang
gelas, sel elektrokimia serta alat-alat gelas lainnya.

3
Preparasi dan Ekstraksi Rhizopora apiculata (Batubara et al. 2010)
Sampel dikeringkan dan dihaluskan selanjutnya dimaserasi dengan metanol
50% dengan nisbah 1:10 (1 g = 10 mL metanol) selama 12 jam sebanyak tiga kali
ulangan. Ekstrak yang diperoleh disaring dengan menggunakan kertas saring
Whatman nomor 1 dan dipekatkan dengan penguap putar pada suhu 30 °C.

Uji Aktivitas Inhibitor Tirosinase (Batubara et al. 2010)
Ekstrak sampel dilarutkan dalam DMSO hingga konsentrasi 20 mg/ml.
larutan ini selanjutnya disebut sebagai larutan stok. Larutan stok disiapkan dengan
melarutkan ekstrak pekat hingga diperoleh konsentrasi 2000 µg/mL dalam 50 mM
Kalium buffer fosfat (pH 6.5). Dilakukan pengujian ekstrak dengan rentang
konsentrasi 7.8125 -2000 µg/mL. Asam kojat digunakan sebagai kontrol positif dan
dilakukan pengujian pada rentang konsentrasi 7.8125 -2000 µg/mL. Pada pelat tetes
96 sumur, masing-masing dimasukkan sebanyak 70 µL ekstrak ditambahkan 30 µL
tirosinase (Sigma, 333 units/mL dalam buffer fosfat) kemudian campuran
diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit. Setelah inkubasi sebanyak 110 µL
substrat (2 mM L-tirosin atau 12 mM L-DOPA) ditambahkan pada masing-masing
sumur dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang. Dilakukan pengukuran
absorbansi larutan masing-masing sumur dengan menggunakan micro plate reader
pada panjang gelombang 510 nm untuk menentukan persen inhibisi dan konsentrasi
hambat 50 % (LC50). Persen inhibisi ditentukan dengan persamaan berikut:
−
×
%
% Inhibisi =
Keterangan:
A = Absorbans sampel tanpa penambahan ekstrak
B = Absorbans sampel dengan penambahan ekstrak

Aktivasi Zeolit Alam (Arif 2011)
Aktivasi zeolit dilakukan dengan dua cara yaitu aktivasi fisika dan aktivasi
kimia. Zeolit yang digunakan pada penelitian diperoleh dari daerah Cikalong.
Batuan zeolit dihancurkan dengan penggilingan hingga diperoleh ukuran 200 mesh.
Serbuk zeolit kemudian dicuci dengan akuades dan dikeringkan pada suhu 105 ˚C
selama 3 jam. Sebanyak 50 gram zeolit selanjutnya direndam dengan menggunakan
asam klorida (HCl) 4 M selama 90 menit, selanjutnya dienaptuangkan dan disaring.
Zeolit hasil penyaringan dicuci dengan menggunakan akuades hingga pH netral dan
bebas klorida. Contoh serbuk zeolit ini selanjutnya dikarakterisasi dengan
menggunakan difraksi sinar X.

Analisis Kristalinitas dengan Difraktometer Sinar X.
Difraksi sinar X dihasilkan oleh difraktometer Rigaku D/Max 2500. Radiasi
yang digunakan adalah Ni-filtered Cu Kα pada panjang gelombang 0,1541 nm.

4
Difraktometer dioperasikan pada 40 kV dan 200 mA. Contoh dipayar pada kisaran
2θ = 10-80 ˚.
Elektrode Pasta Karbon Termodifikasi Ferosena (Trivadilla 2011)
Elektrode dibuat dengan melarutkan 3 mg ferosenaa dalam 1 mL DMSO dan
ke dalam larutan tersebut ditambahkan 100 mg grafit. Campuran didiamkan selama
2 jam. Setelah 2 jam pelarut dikeringkan menggunakan pengering vakum, sehingga
diperoleh grafit termodifikasi mediator. Kemudian grafit dicampur dengan 35 μL
paraffin cair hingga membentuk pasta. Kemudian pasta karbon dimasukkan ke
dalam badan elektrode. Permukaan elektrode dihaluskan dan dibersihkan dengan
amplas dan kertas minyak.

Optimasi Aktivitas Tirosinase
Optimasi yang dilakukan adalah konsentrasi tirosinase (50-250 U/mL) dan zeolit
200 mesh (25-250mg). Metode yang digunakan untuk pengoptimuman aktivitas
tirosinase adalah Response Surface Method. Metode ini dilakukan dengan cara
memasukkan kombinasi faktor-faktor peubah bebas pada perangkat lunak statistika
Minitab16. Selanjutnya percobaan dilakukan sesuai dengan kombinasi yang dihasilkan
untuk mendapatkan nilai aktivitas optimumnya. Lampiran 1 menampilkan kombinasi
faktor-faktor peubah bebas untuk pengoptimuman aktivitas tirosinase.

Imobilisasi Enzim (Saiapina et al. 2011)
Matriks nanokomposit divariasikan pada selang konsentrasi 50-250 mg
yang disuspensikan dalam 1 mL buffer fosfat yang mengandung enzim dengan
rentang konsentrasi 50-250 U/mL. Sebanyak 15 µL ekstrak tirosinase dalam
larutan penyangga fosfat pH 6.8 diteteskan pada permukaaan elektrode pasta
karbon didiamkan hingga pelarutnya menguap, dilapisi dengan membran dialisis,
ditutup dengan jaring nilon, dan diikat dengan parafilm. Elektrode dapat langsung
digunakan untuk pengukuran metode voltammetri siklik. Elektrode direndam dalam
larutan penyangga pH 7.5 pada suhu 4 ºC ketika tidak digunakan untuk memberikan
keadaan yang sama dengan lingkungan sebenarnya.
Pengukuran Elektrokimia (Wang et al. 2006)
Pengukuran elektrokimia dilakukan dengan metode voltametri siklik dengan
menggunakan eDAQ potensiostat–Galvanostat yang dilengkapi perangkat lunak
Echem v2.1.0. Elektrode yang digunakan adalah elektrode Ag/AgCl sebagai
elektrode rujukan, platina sebagai counter dan elektrode pasta karbon termodifikasi
sebagai elektrode kerja. Parameter pengukuran dibuat sebagai berikut: Mode:
Cyclic; Initial: -800 mV; Final: -800 mV; Rate: 250 mV/s; Step W: 20 ms
Upper E: 1000 mV; Lower E: -800 mV; Range: 5 V.

5
Pengukuran dilakukan pada setiap elektrode pada suhu 25 ° C dengan
menggunakan vessel yang diisi dengan 5 mL larutan penyangga 5 mM (pH 7).
Elektrode yang telah disiapkan dimasukan dalam vessel lalu dilakukan pengukuran
dengan menggunakan parameter seperti di atas. Sinyal yang dihasilkan dicatat
sebagai blangko, kemudian substrat berupa L-DOPA dengan konsentrasi 0-5 mM
dimasukan dalam vessel dan dibiarkan selama 30 menit kemudian dilakukan
pengukuran arus kembali. Pengukuran dilanjutkan dengan menggunakan ekstrak
tanaman Rhizopora sp sebagai inhibitor. Ekstrak bakau ditambahkan dengan
konsentrasi konsentrasi 250 -2000 µg/mL sebanyak 35 µL dan dilakukan
pengukuran arus kembali.

Penentuan Stabilitas Elektrode
Stabilitas elektrode dilakukan dengan pengukuran secara langsung pada
elektrode yang telah dibuat dengan imobilisasi enzim tirosinase pada permukaan
elektrode. Nilai aktivitas yang diperoleh pada pengukuran awal dianggap aktivitas
100%. Aktivitas diukur ulang pada jam ke 0, 1, 2, 4, 8 dan 16. Aktivitas tirosinase
ditentukan dengan persamaan:
Aktivitas tirosinase =

� ��

�− �

� �� � �

µ

µ

x 100%

HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstraksi dan Aktivitas Inhibitor Ekstrak Rhizopora apiculata
Ekstraksi bakau dengan teknik maserasi memberikan hasil rendemen batang,
akar, buah, batang buah dan daun bakau secara berturut-turut sebesar 8.11%,
12.94%, 20.95%, 15.56 % dan 22.10 % (Lampiran 2). Hasil yang didapatkan tidak
berbeda jauh dengan Abdullah (2011) dengan rendemen akar, dan batang bakau
berturut-turut sebesar 8.85%, dan 8.53%. Pelarut yang digunakan pada maserasi
adalah etanol, hal ini bertujuan untuk mengekstrak senyawa polar dalam sampel.
Uji aktivitas inhibisi digunakan untuk mengetahui ada tidaknya daya inhibisi
senyawa bioaktif pada ekstrak metanol bakau. Aktivitas inhibisi ekstrak bakau
ditentukan dengan metode spektrofotometri. Data hasil pengujian aktivitas inhibitor
tirosinase dan antioksidan pada ekstrak kasar dapat dilihat pada Tabel 1. Aktivitas
inhibitor terbaik ekstrak bakau ditunjukkan oleh ekstrak metanol batang bakau
dengan IC50 sebesar 1690 µg/mL (difenolase) dan 2266 µg/mL (monofenolase).
Abdullah (2011) memperoleh aktivitas inhibitor terbaik ekstrak bakau diperoleh
dari ekstrak metanol kulit batang dengan nilai IC50 1116.65 μg/mL (difenolase),
Batubara et al. (2010) memperoleh IC50 ekstrak metanol Rhizopara sp. dengan
sebesar 108 µg/mL (monofenolase) dan 124 µg/mL (difenolase) ekstrak bakau
menghambat aktivitas tirosinase melalui mekanisme penghambatan campuran,
yaitu kompetitif dan nonkompetitif. Selanjutnya aktivitas inhibisi ekstrak bakau
akan ditentukan dengan sensor hayati yang dibuat dalam penelitian ini.

6
Tabel 1 Nilai IC50 inhibitor tirosinase (monofenolase dan difenolase) pada ekstrak
kasar bakau R. apiculata
Ekstrak

Batang
Akar
Buah
Daun
Batang Buah

Inhibitor Tirosinase
Monofenolase
Difenolase
(μgmL-1)
(μgmL-1)
2266
1690
5757
2118
1982
2972
3589
2483
1425
1763

Aktivasi Zeolit
Zeolit alam banyak mengandung pengotor. Keberadaan pengotor dapat
mengurangi aktivitas zeolit sehingga perlu dilakukan aktivasi zeolit (Lestari 2010).
Aktivasi secara fisik dilakukan melalui pengecilan ukuran butir, pengayakan hingga
ukuran 200 mesh dan pemanasan pada suhu 300 ˚C bertujuan menghilangkan
pengotor-pengotor organik, memperbesar pori, dan memperluas permukaan
(Lestari 2011). Pemanasan pada suhu 300 ˚ C dapat mengeluarkan air dari pori-pori
zeolit sehingga pori-pori zeolit menjadi kosong dan dapat digunakan sebagai
adsorben pada biosensor (Kirdeciler et al 2011). Aktivasi secara kimia dilakukan
dengan penambahan asam kuat HCl 4 M. Aktivasi asam ini mengakibatkan
hilangnya pengotor anorganik pada zeolit melalui pertukaran kation H+.
Penambahan asam menyebabkan terjadinya proses dealuminasi pada zeolit.
Dealuminasi merupakan proses penggantian aluminium dengan hidrogen yang
melibatkan perubahan struktur aluminosilikat Si-O-Al menjadi struktur silika yang
berbentuk silanol –Si-OH (Heraldy et al. 2003). Reaksi dealuminasi seperti
ditunjukkan oleh Gambar 2.

Gambar 2 Aktivasi zeolit (Weitkamp dan Puppe 1991)
Zeolit yang telah diaktivasi dikarakterisasi menggunakan difraksi sinar X.
Pola difraktogram zeolit Cikalong (Lampiran 3) menunjukkan puncak 2 θ yang
sama dengan zeolit tipe mordernit (Lampiran 4). Hasil yang diperoleh sama dengan
Arif (2011) yang menyatakan bahwa zeolit alam asal Cikalong merupakan zeolit
tipe mordenit. Zeolit mordenit (Na8(Al8Si40O96).24H2O) memiliki bentuk
ortorombik dan membentuk 6 cincin yang terhubung paralel (Armbuster dan Gunter
2001). Karakterisasi zeolit dilakukan untuk mengetahui jenis dari zeolit yang
digunakan pada proses imobilisasi tirosinase. Zeolit Cikalong yang telah
dikarakterisasi dan diaktivasi selanjutnya digunakan sebagai material penyangga
enzim tirosinase pada elektrode.

7
Imobilisasi Enzim
Enzim merupakan material yang memiliki selektivitas dan sensitivitas yang
tinggi dalam keadaan bebas, namun sangat sensitif terhadap perubahan pH dan suhu
lingkungan. Untuk mempertahankan sifat enzim maka dilakukan suatu proses
imobilisasi. Enzim yang diimobilisasi pada elektrode pasta karbon dapat
meningkatkan sensitivitas, selektivitas dan stabilitas dari enzim. Sifat enzim
terimobilisasi berbeda dari enzim bebas karena adanya pengaruh dari material
penyangga, perubahan konformasi enzim yang berasal dari interaksi enzim dengan
material penyangga, dan modifikasi kovalen dari residu asam amino. Chen et al.
(2008) melakukan imobilisasi tirosinase pada nanopartikel zeolit, Balal et al. (2008)
mengimobilisasi tirosinase pada nanopartikel zeolit untuk penentuan Dopamin,
Wang et al. (2010) mengimobilisasi tirosinase pada nanopartikel Fe3O4-kitosan.
Tabel 2 Puncak arus dan potensial modifikasi metode imobilisasi
Modifikasi
Ipa
Tir/PC
Tir/Zeolit/PC
Tir/Zeolit/PCf

Arus Puncak (µA)
Ipc

2.85
8.34
13.76

E (mV) Vs Ag/AgCl (mV)
Epa
Epc

-2.85
-2.12
-5.55

865
690
650

-445
-210
-375

Pada penelitian ini dilakukan imobilisasi enzim tirosinase dengan
menggunakan zeolit untuk menghasilkan respon yang lebih baik. Modifikasi yang
dilakukan dengan membandingkan tirosinase diimobilisasi dengan zeolit kemudian
diteteskan di atas permukaan pasta karbon termodifikasi ferosena (Tir/PCf/zeolit),
tirosinase diimobilisasi dengan zeolit diteteskan pada permukaan elektrode pasta
karbon (Tir/ zeolit/PC) dan tirosinase diteteskan pada permukaan elektrode pasta
karbon (Tir/PC). Tabel 1 menunjukkan sensor Tir/ zeolit/ PCf memiliki arus yang
lebih besar dari Tir/ Zeolit/PC dan lebih besar dibandingkan Tir/PC dengan nilai
berturut-turut sebesar 7.94 µA, 4.19 µA,dan 2.85 µA.
30,0µ
25,0µ
20,0µ

Puncak
oksidas
i

15,0µ

I (A)

10,0µ
5,0µ
0,0
-5,0µ
-10,0µ

Puncak
reduksi

-15,0µ
-20,0µ
-25,0µ
-1,0

-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

E (mV) vs. Ag/AgCl

Gambar 3 Voltammogram puncak arus anode dan katode (Tir/PC), (Tir/zeolit/PC),
(Tir/zeolit/PCf)

8
Penggunaan mediator ferosena pada modifikasi elektrode pasta karbon
(Tir/zeolit/PCf) menghasilkan respon arus sebesar 7.94 µA. Arus yang dihasilkan
lebih besar dibanding elektrode tanpa modifikasi (Tir/zeolit/PC), yaitu sebesar 4.19
µA (Gambar 3). Pada elektrode dengan modifikasi ferosena terjadi transfer elektron
melalui mediator ferosena sehingga respon arus yang dihasilkan lebih besar.
Potensial puncak memberikan informasi tentang identitas analat dan proses kinetika
oksidasi atau reduksi, sedangkan arus puncak memberikan informasi tentang
konsentrasi analat dan stabilitas spesi (Trivadilla 2011). Arus puncak anode pada
penyapuan maju (forward scan) berhubungan dengan oksidasi inti ferosena (Fc)
menjadi ion ferosenaium Fc+ ([ FeIII(C5H5)2]+), sedangkan penyapuan balik
(reverse scan) pada arus puncak katode muncul akibat reduksi Fc+ menjadi Fc
(Trivadilla 2011). Siklus reaksi redoks tersebut mengikuti persamaan reaksi
berikut:
FeII(C5H5)2
[ FeIII(C5H5)2]+ + e-

[ FeIII(C5H5)2]+ + eFeII(C5H5)2

Imobilisasi enzim dengan menggunakan matriks penyangga zeolit dapat
meningkatkan arus puncak yang dihasilkan, yaitu sebesar 4.19 µA sedangkan
biosensor tanpa imobilisasi dengan menggunakan zeolit menghasilkan arus sebesar
2.85 µA. Penggunaan zeolit sebagai material penyangga pada biosensor dapat
meningkatkan aktivitas enzim terimobilisasi ditandai dengan terjadinya penngkatan
arus puncak oksidasi pada voltammogram (Gambar 3). Enzim yang telah
teradsorbsi pada permukaan zeolit dapat meningkatkan aktivitas dan stabilitas
biosensor (Kinderciler et al. 2011). Kemampuan zeolit dalam menjaga efektivitas
biosensor disebabkan sifatnya yang hidrofilik oleh adanya gugus –OH disekitar pori
sehingga baik digunakan sebagai matriks imobilisasi enzim.

Pengoptimuman Aktivitas Tirosinase
Optimasi konsentrasi enzim dan zeolit pada elektrode menggunakan
perangkat lunak Minitab 16.2.1 metode respon permukaan (RSM) dengan
melakukan unit eksperimen seperti terdapat pada Lampiran 5. Pengoptimuman
dilakukan pada elektrode termodifikasi ferosena (Tir/Zeolit/PCf) dan
nonmodifikasi ferosena (Tir/Zeolit/PC). Optimasi didapatkan pada elektrode
Tir/Zeolit/PCf konsentrasi Tirosinase sebesar 50 U/mL dengan zeolit sebesar 150
mg. Arus puncak anode pada kondisi tersebut adalah 7.85 µA pada potensial 620
mV. Hasil yang didapatkan ini lebih kecil jika dibandingkan dengan Wang et al.
(2013) menghasilkan respon arus sebesar 492 µA/mM dengan mengimobilisasi
tirosinase 15 mg/ml pada nanokomposit karbon taut silang polianilin, Kim et al.
(2002) respon arus sebesar 200 mA/M dengan mengimobilisasi tirosinase 1 mg/mL
pada film sol-gel silikat/Nafion dengan substrat fenol. Perbedaan respon arus ini
disebabkan perbedaan matriks penyangga serta mediator yang digunakan.
Reaksi enzimatis sangat sulit terjadi sehingga diperlukan suatu mediator yang
dapat mengalirkan arus dari reaksi enzimatis menuju elektrode pasta karbon
(Trivadilla 2011). Gambar 5 menunjukkan voltammogram siklik hasil optimasi
zeolit (150 mg/mL) dan tirosinase 50 U/mL. Voltammogram siklik menunjukkan

9
bahwa tanpa keberadaan substrat dan waktu inkubasi tidak dihasilkan puncak
reduksi dan oksidasi. Reaksi enzimatis antara enzim tirosinase dan substrat LDOPA memerlukan waktu inkubasi. Mediator ferosena yang digunakan pada
penelitian ini dapat mentransfer elektron dari reaksi enzimatis menuju permukaan
elektrode tetapi tidak dapat mengkatalisis reaksi enzim dan substrat sehingga perlu
waktu respons terlebih dahulu agar enzim mampu bereaksi dengan substrat.
20,0µ
15,0µ
10,0µ

Puncak
oksidasi

I(A)

5,0µ
0,0
-5,0µ
-10,0µ

Puncak
reduksi

-15,0µ
-1,0

-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

E (mV) vs. Ag/AgCl

Gambar 5 Voltammogram siklik hasil pengoptimuman enzim dan zeolit

Tirosinase merupakan enzim yang berperan dalam proses oksidasi senyawa
fenolik. L-DOPA merupakan salah satu substrat dari tirosinase yang dapat
dioksidasi menjadi dopakuinon. Potensial oksidasi L-DOPA yang diperoleh pada
kondisi optimum sebesar 620 mV (Lampiran5), Eslami et al. (2012) memperoleh
potensial oksidasi pada 745 mV. Dopakuinon ini selanjutnya akan direduksi
kembali oleh enzim yang diimobilisasi pada permukaan elektrode pasta karbon
yang ditunjukkan oleh puncak katodik (Gambar 5) dengan arus sebesar -5.55 µA
pada potensial -370 mV. Voltammogram pada Gambar 5 menunjukkan adanya dua
puncak oksidasi dan reduksi. Hal ini dapat dilihat bahwa pada L-DOPA terdapat
dua gugus –OH yang dapat dioksidasi oleh tirosinase (Eslami et al 2012). Reaksi
antara tirosinase dan L-DOPA berlangsung seperti Gambar 6:

Gambar 6 Reaksi oksidasi L-Dopa menjadi dopakuinon

10
Penentuan Kinerja Elektrode
Ekstrak metanol kulit batang bakau diketahui mempunyai aktivitas inhibisi
tirosinase. Enzim tirosinase yang diimobilisasi dengan zeolit pada permukaan
elektrode pasta karbon akan mengoksidasi L-DOPA menjadi dopakuinon ditandai
dengan munculnya puncak arus anode dan katode dengan metode voltametri siklik.
Penambahan suatu inhibitor tirosinase akan menghambat reaksi oksidasi L-DOPA
menjadi dopakuinon sehingga puncak arus reduksi yang dihasilkan akan berkurang
(Gambar 7). Voltammogram siklik menyatakan besarnya konsentrasi analat dalam
pengukuran (Trivadilla 2011).
Ekstrak kulit bakau digunakan pada penelitian ini dengan rentang konsentrasi
250-2000 ppm. Pada penambahan substrat sebesar 250 ppm arus puncak oksidasi
berubah dari 9.91 µA menjadi 9.28 µA dan pada penambahan ekstrak 2000 ppm
arus berubah dari 2.78 µA menjadi 2.15 µA (Lampiran 6). Terjadinya penurunan
arus pada voltammogram patut diduga adanya inhibitor tirosinase dari ekstrak
Rhizopora apiculata menurunkan aktivitas tirosinase dalam mengoksidasi LDOPA. Hal ini sesuai dengan kemampuan inhibisi ekstrak bakau dengan IC50
sebesar 1690 µg/mL (Lampiran 7).
12

Aktivitas (µA)

10
8
6
4
2
0
250

1000

1500

2000

Ekstrak bakau [ppm]
tanpa inhibitor inhibitor

Gambar 7 Hubungan aktivitas tirosinase dan konsentrasi inhibitor
Kinerja biosensor yang dihasilkan juga ditentukan oleh kinetika enzim
terimobilisasi pada elektrode. Kinetika enzim menunjukkan kespesifikan enzim
dalam bereaksi dengan substrat. Aktivitas tirosinase diukur dengan variasi
konsentrasi L-DOPA antara 0.5-4 mM. Proses pengukuran dilakukan pada suhu
ruang dan kondisi optimum. Gambar 8 menunjukkan hubungan antara konsentrasi
L-DOPA dengan aktivitas tirosinase pada rentang konsentrasi dari 0.5-4 mM.
Peningkatan konsentrasi substrat meningkatkan aktivitas tirosinase secara linear
hingga konsentrasi 4 mM. Penambahan konsentrasi substrat mencapai maksimum
pada konsentrasi tertentu. Pada konsentrasi maksimum penambahan substrat tidak
meningkatkan aktivitas enzim. Hal ini disebabkan karena penambahan substrat
yang lebih banyak dapat menghambat aktivitas enzim. Karena semua tapak aktif
enzim telah bereaksi dengan substrat (Arnaut et al 2007). Keadaan maksimum
diperoleh pada konsentrasi substrat 4 mM dengan arus oksidasi sebesar 6.04 µA
(Lampiran 8).

11
7
Aktivita Tirosinase (µA)

6
5
4
3
2
1
0
0

1

2
3
[L-DOPA] mM

4

5

Gambar 8 Hubungan konsentrasi L-DOPA dengan aktivitas
tirosinase terimobilisasi pada matrik zeolit
Penentuan rentang linear pengukuran bertujuan untuk mengetahui daerah
kerja maksimum dari elektrode yang digunakan. Kisaran linearitas substrat LDOPA ditunjukkan oleh Gambar 9. Berdasarkan gambar tersebut rentang linearitas
diperoleh pada rentang konsentrasi 0.5-4 mM. Persamaan regresi yang diperoleh y
= 1.5043x + 0.121 dengan nilai R2 yang diperoleh pada pengukuran aktivitas
tirosinase sebesar 98.24%.
7
y = 1,5043x + 0,121
R² = 0,9824

6

I (µA)

5
4
3
2
1
0
0

1

2
3
[L-DOPA] mM

4

5

Gambar 9 Rentang linier antara L-DOPA dengan tirosinase
Parameter kinetika enzim terimobilisasi adalah KMapp dan laju reaksi nyata Vmaks app
yang dianalogikan dengan arus maksimum nyata (Imaks app). Kinetika enzim
mengikuti alur Lineaweaver – Burk dengan nilai R sebesar 0.9634 ( Lampiran 8).
Nilai KMapp menunjukkan afinitas atau daya ikat enzim tirosinase terhadap substrat
L-DOPA. Nilai KMapp kecil maka enzim mengikat kuat substrat sehingga untuk
menjenuhkan enzim hanya memerlukan substrat yang lebih sedikit dan sebaliknya jika
nilai KMapp besar maka enzim tidak terlalu kuat mengikat substrat sehingga substrat
yang dibutuhkan untuk menjenuhkan enzim lebih banyak. Nilai KMapp pada penelitian
ini sebesar 6.04 mM dan Imaks app sebesar 6.42 mM. Hasil yang diperoleh jauh lebih
besar jika dibandingkan dengan hasil yang didapatkan oleh Liu et al (2003) yang
mengimobilisasi tirosinase pada elektrode pasta karbon termodifikasi emas yang
memeperoleh nilai KMapp sebesar 53 µM dan nilai Imaks app sebesar 12.3 µA.
Perbedaan ini dapat disebabkan oleh perbedaan jenis material penyangga yang
digunakan sebagai matriks pengimobilisasi dan teknik pengimobilisasi yang
digunakan.

12

2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0

1/IPA (ΜA-1)

y = 0,9393x - 0,1556
R² = 0,9634

0

0,5

1

1,5

2

I/[L-DOPA] (MM

2,5

Gambar 10 Alur Lineweaver-Burk substrat L-DOPA dengan tirosinase

Stabilitas Biosensor
Penggunaan voltametri juga dapat dilakukan untuk menentukan stabilitas dari
aktivitas tirosinase yang diimobilisasi dengan menggunakan matrik zeolit pada
permukaan elektrode pasta karbon. Stabilitas biosensor ditentukan dengan
pengukuran pada waktu ke-0 hingga 16 jam. Hasil pengukuran stabilitas
menunjukkan semakin lama penyimpanan biosensor arus puncak yang dihasilkan
semakin menurun (Lampiran 9).
120

Aktivitas (%)

100
80
60
40
20
0
0

2

4

8

16

Waktu (Jam)

Gambar 11 Stabilitas biosensor
Gambar 11 menunjukkan bahwa stabilitas biosensor mengalami penurunan
hingga 81% setelah satu jam penyimpanan. Penyimpanan biosensor selama 16 jam
mengakibatkan stabilitas turun hingga mencapai 19% (Lampiran 10). Penurunan
stabilitas biosensor disebabkan karena penggunaan pengukuran secara terus
menerus. Ketika biosensor digunakan secara terus menerus seluruh tapak aktif
enzim pada biosensor telah jenuh oleh substrat, sehingga ketika biosensor
digunakan kembali enzim tidak mampu mengikat substrat dan bereaksi membentuk
produk ( Bisswanger 2008).

13

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Penggunaan zeolit sebagai matrik pengimobilisasi dan mediator ferosena
dapat meningkatkan aktivitas biosensor. Kondisi optimum diperoleh pada
konsentrasi enzim 50 U/mL dan 150 mg zeolit. Kinetika enzim terimobilisasi
mengikuti kinetika enzim Lineweaver & Burk dengan nilai KMapp sebesar 6.04 mM
dan Imaks app 6.42 mM. Penurunan aktivitas biosensor berbanding lurus dengan
waktu penyimpanan.

Saran
Diharapkan dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai matriks imobilisasi
yang tepat untuk tirosinase serta mediator yang baik guna peningkatan efektivitas
serta stabilitas biosensor tirosinase, serta penggunaan metode amperometri pada
kondisi optimum guna peningkatan sensitivitas pengukuran.

DAFTAR PUSTAKA
Abdullah. 2011. Potensi Bakau Rhizophora apiculata BL sebagai inhibitor
tirosinase dan antioksidan. [Tesis]. Bogor (ID): Program Pascasarjana,
Institut Pertanian Bogor.
Arif Z. 2011. Karakterisasi dan modifikasi zeolit alam sebagai bahan media
pendeteksi studi kasus: kromium heksavalen [Tesis]. Bogor (ID): Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Anh T M, Dzyadvych SV, Soldatkin AP, Chien DN, Jaffrezic-Renault N, Chovelon
JM. 2002. Development of tyrosinase biosensor based on pH-sensitive fieldeffect transistors for phenol determination in water. Talanta 56:627-634.
Armbruster T, Gunter ME.2001. Crystal structures of natural zeolites. Didalam:
Bish DL, Ming DW, Ribbe PH, Rossa JJ, editor.Riviews in mineralogy &
geochemistry 45 natural zeolite : occurence, properties, application. New
York: Mineralogy society af america dan geochemical society.hlm 1-69.
Arnaut L, Formosinho S, Burrows H. 2007. Chemical Kinetics from Molecular
Structure to Chemical Reactivity. Amsterdam:Elsevier.
Arung ET, Shimizu K, Kondo R. 2006. Inhibitory effect of artocarpanone from
Artocarpus heterophyllus on melanin biosynthesis. J Biol 29:1966-1969.
Batubara I, Darusman LK, Mitsunaga T, Rahminiwati M, Djauhari E. 2010.
Potency of Indonesia medicinal plants as tyrosinase inhibitor andantioxidants
agent. J Biol Sci 10:138-144.
Bisswanger H. 2008. Enzyme Kinetics Prinsiples and Methods. Weinheim (DE):
Wiley-VCH.

14
Caixeiro JMR, Goncalves VT, Oliveira MCC, SantaAnna CMR, Rumjanek VM,
Dacosta JB. 2012. Dialkylphosphorylhydrazones as potent tyrosinase
inhibitors. J. of the Brazilian Chemichal Society 5 (23).
Chang TS. 2009. An update review of tyrosinase inhibitors. J Mol Sci 10:24402473. doi:10.3390/ijms10062440.
Dai Z, Liu S, Ju H. 2004. Direct electron transfer of cytochrome c immobilized on
a NaY zeolite matrix and its application in biosensing. Electro Acta 49: 2139–
2144.
Eslami M, Zare H R, Namazian M. 2012. Thermodynamic parameters of
electrochemical oxidation of l-DOPA: Experimental and Theoretical Studies.
J. Phys Chem. B 116 (41). DOI: 10.1021/jp3054229.
Hartanti Lanny, Setiawan K Henry. 2009. Inhibitory of some synthetic cinnamic
acid derivates towards tyrosinase enzyme. Indo J Chem 9(1):158-168.
Heraldy E, His Yam SW, Sulistiono. Characterization and activation zeolite from
ponorogo. Indonesian journal of chemistry. 3 (2): 91-97.
Likhitwitayawuid K. 2008. Stillbenes with tyrosinase inhibitory activity. J. Curr
Sci 94:44-52.
Liu S, Jiuhong Yu, Huangxian Ju. 2003. Renewable phenol biosensor based on a
tyrosinase-colloidal gold modified carbon paste electrode. J Electro Chem
540: 61-67.
Improvement of enzyme activity, stability and selectivity via immobilization
techniques. J Enzmictec 40: 1451–1463.
Kim MA, Yoong-Lee W. 2002. Amperometric phenol biosensor based on sol–gel
silicate/Nafion composite film. Analytica Chimica Acta 479:43–150.
doi:10.1016/S0003-2670(02)01538-6.
Monosik R, Stredansky M, Greif G, Sturdik E. 2012. A rapid method for
determination of L-lactic acid in real samples by amperometric biosensor
utilizing nanocomposite. Food Control 23:238-244.
Saiapina OY, Pyeshkova VM, Soldatkin OO, Melnik VG, Akata Kurç B, Walcarius
A, Dzyadevych SV, Jaffrezic-Renault N. 2011. Conductometric enzyme
biosensors based on natural zeolit clinoptilolit for urea determination.
Materials
and
Science
Engineering
C
31:1490-1497.
doi:10.1016/j.msec.2011.06.003
Serra PA. 2010. Biosensor. Intech: Croatia.
Sheng, W, Xua, T, Maa H, Wanga X, Li Q, Li J. 2009. Development of an indirect
competitive enzyme linked immunosorbent assay for detection of
danofloxacin Residues in Beef, Chicken and Pork Meats. Journal of Food
And Agricultural Immunology. 20:35-47.
Treachy M M J, Higgins J B. 2001. Collection of Simulated XRD Powder Patters
for zeolit. Amsterdam: Elsevier.
Trivadila. 2011. Biosensor antioksidan menggunakan superoksida dismutase
Deinococcus radiodurans diimobilisasi pada permukaan elektrode pasta
karbon dan parameter kinetikanya. [Tesis]. Bogor (ID): Sekolah Pascasarjana,
Institut Pertanian Bogor.
Valdes MG, Perez-Cordoves AI Dıaz-Garcıa ME. 2006. Zeolites and zeolite-based
materials in analytical chemistry. J. Trends Anal Chem 25: 24-30.
Wang B, Zheng J, Hae Y, Sheng Q. 2013. A sandwich-type phenolic biosensor
based on tyrosinase embeddinginto single-wall carbon nanotubes and

15
polyaniline nanocomposites. Sensors and Actuators B: Chemical 186 :417–
422.
Wang X, ChenL, Xia S, Zhu Z, Zhao J, Chovelomad J. 2006. Tyrosinase biosensor
based on interdigitated electrodes for herbicides determination. J.
Electrochem. Sci 1:55-61.
Weitkamp, J. dan Puppe. L. 1999. Catalysis and Zeolites: Fundamental and
Applications. Springer-Verlag Berlin Heidelberg: Germany.
Weniarti. 2011. Biosensor antioksidan berbasis superoksida dismutase (SOD)
Deinoccus Radiodurans diimobilisasi pada nanokomposit zeolit alam
Indonesia. [Tesis]. Bogor (ID): Program Sarjana, Institut Pertanian Bogor.
Zhang Qiang, Qu Yuanyuan, Zhou Jiti, Zhang Xuwang, Zhou Hao, Ma Qiao, Li
Xinliang. 2011. Optimization of 2,3-dihydroxybiphenyl 1,2-dioxygenase
expression and its application for biosensor. Bioresource Technology
102:10553-10560.

16

LAMPIRAN
Lampiran 1 Diagram Alir

Pembuatan
elektroda pasta karbon

Imobilisasi
tirosinase pada zeolit

Penentuan biosensor
terbaik

Penentuan stabilitas
biosensor

Pengukuran uji
inhibitor ekstrak

Sampel
Bakau

Ekstrak kasar

Pengujian aktivitas
inhibitor metode
spektrofotometer

17
Lampiran 2 Rendemen Ekstraksi Bakau
Sampel

Batang Bakau
Akar Bakau
Buah Bakau
Batang Buah
Daun

Bobot
Serbuk
(gram)
10.0284
10.0324
10.0099
10.0048
10.0092

Ekstrak
(gram)
0.8128
1.2984
2.0975
1.5565
2.2122

Lampiran 3 Difraktogram Zeolit Cikalong

Lampiran 4 Data JCPDS Zeolit Mordernit

Rendemen
(%)
8.11
12.94
20.95
15.56
22.10

18
Lampiran 5 Pengoptimuman Enzim Tirosinase
Modifikasi
Enzim
Zeolit
U/mL
mg

79
150
250
50
150

221
150
150
150
250

Mediator ferosena
Arus Puncak I
E (mV) Vs
(µA)
Ag/AgCl
(mV)
Ipa
Ipc
Epa
Epc
3.44
-2.44 745
-250
2.7
-0.44 830
-275
10.76
-8.01 660
-115
7.94
-5.55 620
-370
1.04
-1.02 620
-60

Tanpa Mediator
Arus Puncak I
E (mV) Vs
(µA)
Ag/AgCl
(mV)
Ipa
Ipc
Epa
Epc
4.54
-5.01 665
-220
4.3
-3.99 720
-240
5.26
-4.81 605
-65
4.19
-2.12 670
-210
0.3
-0.64 995
-640

Lampiran 6 Arus Puncak dan Potensial Oksidasi Substrat dengan Penambahan
dan Tanpa Penambahan Inhibitor
Konsentrasi
Inhibitor

Arus Oksidasi (µA)
Penambahan inhibitor

Tanpa inhibitor

250

9.91

9.28

1000

8.55

7.48

1500

3.87

3.52

2000

2.78

2.15

Lampiran 7 Contoh Perhitungan IC50 Inhibitor Tirosinase baik Monofenolase dan
Difenolase Ekstrak Teraktif (ekstrak metanol batang Rhizophora
apiculata)
Konsentrasi
(μgmL-1)
2000
1000
500
250
125
63
31

% inhibisi monofenolase
45.18
28.29
19.52
14.25
15.79
16.12
5.04

% inhibisi difenolase
45.19
46.67
46.84
5.71
0.09
-4.50
-1.39

Kurva persamaan garis antara konsentrasi ekstrak (ppm) sebagai sumbu X dan %
inhibisi monofenolase sebagai sumbu Y sebagai berikut:

19
70,00
y = 0,0269x + 4,5375
R² = 0,6

% inhibisi difenolase

60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
-10,00 0

500

1000
1500
2000
konsentrasi ekstrak (µg/mL)

2500

Y = 0.0269 + 4.5375
50 = 0.0269 x + 4.5375
X = 1690
Jadi IC50 untuk jalur monofenolase adalah 78.79 μg/ml
Lampiran 8 Analisis Kinetika Tirosinase Terimobilisasi dengan Metode
Lineweaver-Burk
Ip (μA)

[L-Dopa]
(mM)

1/Ip (μA-1)

1/[L-Dopa]
(mM-1)

[L-Dopa]/Ip

Ip/[LDopa]

(mM/μA)

(μA/mM)

0.5

0.55

2

1.818

0.909

1.10

1

1.77

1

0.565

0.5649

1.77

2

3.55

0.5

0.282

0.5634

1.775

3

4.49

0.33

0.223

0.6682

1.496

4

6.04

0.25

0.166

0.6623

1.51

Metode Hanes-Woolf
1
0,9
0,8
[DOPA]/IP

0,7
0,6
y = -0,0332x + 0,7433
R² = 0,1138

0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0

1

2

[DOPA]

3

4

5

20
Metode Lineweaver & Burk
2
1,8
1,6
y = 0,9393x - 0,1556
R² = 0,9634

1/IPA (ΜA-1)

1,4
1,2
1

0,8
0,6
0,4
0,2
0
0

0,5

1

1,5

2

2,5

I/[L-DOPA] (MM

Metode Eadie-Hofstee
7
6

IP

5
y = 2,5721x - 0,6562
R² = 0,1065

4
3
2
1
0
0

0,5

1
IP/[DOPA]

1,5

2

Kinetika Tirosinase terimobilisasi mengikuti Alur Lineweaver-Burk
1

=

1

� maks ���

+

�M ���

1

� maks ��� �

Dengan asumsi Imaks app = Vmaks app, berdasarkan persamaan garis y = 0,9393x - 0,1556,
maka:
I maks app = 6.4274 μA
KM app = 6.0366 mM

Lampiran 9 Arus dan Potensial Penentuan Stabilitas Tirosinase
Jam
Ke0
2
4
8
16

Arus Puncak I (µA)
Ipa
8.55
6.94
3.82
1.86
1.68

Ipc
-6.08
-5.00
-2.35
-2.25
-1.05

E (mV) vs Ag/AgCl
Epa
765
840
810
820
845

Epc
-150
-185
-190
-235
-240

21
Voltammogram Stabilitas Biosensor
-5

2,5x10

-5

2,0x10

-5

1,5x10

-5

I(A)

1,0x10

-6

5,0x10

0,0
-6

-5,0x10

-5

-1,0x10

-1,0

-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

E (mV) vs. Ag/AgCl

2 jam

0 jam

4 jam

8 jam

Lampiran 10 Stabilitas Biosensor
Waktu
0
2
4
8
16

Aktivitas (%)
100
81.12
44.67
21.75
19.64

Perhitungan stabilitas biosensor Jam ke-2:
.
.

×

%=

.

%

16 jam

22

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Karang Rejo Sawah (Surabaya) pada 19 Juni 1991 dari
Ayah (Alm) Filipi Sunarto dan Ibu Suparmi. Penulis merupakan putri keempat dari
lima bersaudara.
Tahun 2009 Penulis lulus dari SMAN 1 Unggulan Muara Enim dan pada
tahun yang sama Penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur USMI pada
Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB.
Selama mengikuti perkuliahan penulis aktif sebagai anggota UKM Century
IPB staf divisi Produksi (2009-2011), koordinator UKM Keluarga Mahasiswa
Katolik IPB (koordinator paduan suara (2010-2011), koordinator pendidikan dan
pengembangan (2011-2012). Penulis juga aktif dalam berbagai kepanitiaan di IPB
diantaranya, Panitia Pesta Sains IPB 2010, Panitia Hypercem IPB 2012, Panitia
MPD 2011, Panitia Natal Civa IPB 2012 & 2013, Panitia Bisnis Simulasi jA Titan
Century 2011, Panitia Paskah Mahasiswa KEMAKI 2010. Selain itu Penulis juga
aktif sebagai Asisten Kimia TPB 2011-2013, Asisten Kimia Dasar TPB 2012- 2013,
Asisten Kimia analitik Layanan 2012, Asisten Kimia Biologi 2012, Asisten
Elektroanalitik dan Teknik Pemisahan 2012, Asisten Sensor Kimia 2013, Asisten
Kimia Bahan Alam 2013. Sejak tahun 2010 hingga saat ini penulis aktif sebagai
tentor di KATALIS IPB dan Ganesha Operation. Penulis merupakan penerima
beasiswa Korean Exchange Bank (KEB) 2013. Penulis juga pernah mengikuti The
4th International Conference on Sustainable Future for Human Security SUSTAIN
2013 pada Oktober 2013 di Kyoto, Jepang. Penulis pernah mengikuti praktik lapang
dari Juli hingga Agustus 2012 di Laboratorium Quality Assurance PT Coca Cola
Amatil Cibitung, Bekasi.