Penentuan Konsentrasi Optimum Superoksida Dismutase, Linearitas, dan Stabilitas Biosensor Antioksidan Menggunakan Elektrode Pasta Karbon
ii
PENENTUAN KONSENTRASI OPTIMUM SUPEROKSIDA
DISMUTASE, LINEARITAS, DAN STABILITAS
BIOSENSOR ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN
ELEKTRODE PASTA KARBON
BARA TAUFAN SAFRIZAL
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
ABSTRAK
BARA TAUFAN SAFRIZAL. Penentuan Konsentrasi Optimum Superoksida
Dismutase, Linearitas, dan Stabilitas Biosensor Antioksidan Menggunakan
Elektrode Pasta Karbon. Dibimbing oleh DYAH ISWANTINI PRADONO dan
TRIVADILA.
Penelitian ini bertujuan mengoptimumkan konsentrasi superoksida
dismutase (SOD) imobilisasi dan menentukan aktivitas SOD imobilisasi. Metode
biosensor elektrokimia berbasis superoksida dismutase digunakan sebagai metode
alternatif karena instrumentasi sederhana, sentitivitas tinggi, dan biaya rendah.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa kondisi optimum untuk aktivitas SOD murni
adalah konsentrasi 10 unit dengan waktu respons 4 detik. Elektrode pasta kabon
yang terimobilisasi enzim mencapai kestabilan elektrode hingga 72 jam sebesar
85,7% dan mengalami penurunan kestabilan sesudahnya 72 jam. Hubungan
konsentrasi substrat dan aktivitas SOD imobilisasi menghasilkan persamaan garis
linear y = -2,2700 + 13,400x pada rentang konsentrasi xantina 0,200–0,275 mM
dengan nilai r sebesar 0,9761. Hasil tersebut menunjukkan analisis ini memiliki
linearitas yang tinggi dan untuk meningkatkan kestabilan aktivitas enzim
diperlukan pendekatan dengan parameter analisis yang lain.
Kata kunci: aktivitas enzim, biosensor antioksidan, superoksida dismutase
ABSTRACT
BARA TAUFAN SAFRIZAL. Optimum Concentration Determination of
Superoxide Dismutase, Linearity, and Stability of Antioxidants Biosensor Using
Carbon Paste Electrode. Supervised by DYAH ISWANTINI PRADONO and
TRIVADILA.
The objectives of this research was to optimize the concentration of
immobilized superoxide dismutase SOD and to determine the activity of the
immobilized SOD. Electrochemical biosensor method based on superoxide
dismutase is used as an alternative method due to simple instrumentation, high
sentitivity, and low cost. The results showed that the optimum conditions for pure
SOD activity is the concentration of 10 units with a response time of 4 seconds.
The immobilized enzyme on the carbon paste electrode achieved its stability up to
72 hours for 85.7% and decreased thereafter. Substrate concentration relationships
and SOD activity immobilization yield a linear equation y = -2.2700 + 13.400x
in the concentration range from 0.200 to 0.275 mM xanthine with r value of
0.9761. The results of this analysis showed a high linearity and to improve the
stability of the enzyme activity need another approach using analysis of other
parameters.
Keywords: antioxidant biosensor, enzyme activity, superoxide dismutase
PENENTUAN KONSENTRASI OPTIMUM SUPEROKSIDA
DISMUTASE, LINEARITAS, DAN STABILITAS
BIOSENSOR ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN
ELEKTRODE PASTA KARBON
BARA TAUFAN SAFRIZAL
Skripsi
sebagai salah satu syarat memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
v
Judul Skripsi : Penentuan Konsentrasi Optimum Superoksida Dismutase,
Linearitas, dan Stabilitas Biosensor Antioksidan Menggunakan
Elektrode Pasta Karbon
Nama
: Bara Taufan Safrizal
NIM
: G44070034
Disetujui
Pembimbing II
Pembimbing I
Dr Dyah Iswantini Pradono, MAgr
NIP 19670730 199103 2 001
Trivadila, SSi, MSi
Diketahui
Ketua Departemen Kimia
Prof Dr Ir Tun Tedja Irawadi, MS
NIP 19501227 197603 2 002
Tanggal lulus:
ii
PRAKATA
Penulis memanjatkan puji dan syukur kepada Allah SWT atas segala rahmat
dan karunia-Nya sehingga karya ilmiah yang bertema “Biosensor Antioksidan”
dengan judul “Penentuan Konsentrasi Optimum Superoksida Dismutase,
Linearitas, dan Stabilitas Biosensor Antioksidan Menggunakan Elektrode Pasta
Karbon” dapat diselesaikan. Penelitian ini mengoptimumkan konsentrasi SOD
murni imobilisasi serta menentukan aktivitasnya sebagai metode biosensor
antioksidan sejak bulan Februari hingga Agustus 2011 di Laboratorium Bersama
dan Laboratorium Kimia Fisik, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Penulis menyampaikan ucapan terima kasih kepada Dr Dyah Iswantini
Pradono, MAgr dan Trivadila, SSi, MSi selaku pembimbing yang selalu memberi
bimbingan, motivasi, saran, dan meluangkan waktunya kepada penulis selama
berkonsultasi. Terima kasih kepada Laboratorium Bersama yang telah
memberikan fasilitas dan penggunaan peralatan selama penulis melaksanakan
penelitian, serta kepada BUMN atas bantuan dana yang diberikan dalam
penelitian. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Mama, kakak
Nita Annisa Rachmi, dan adik Iqbal Zen Ramadhan Govinda, serta seluruh
keluarga yang senantiasa mendoakan, memberi motivasi, dan kasih sayang tiada
henti. Tidak lupa penulis ucapkan terima kasih kepada Pak Mail, Pak Nano,
Bu Ai, dan para pegawai di Laboratorium Kimia Fisik, juga kepada Mas Eko,
Pak Wawan dan Bu Heny, dan para pegawai di Laboratorium Bersama, serta
kepada Laboratorium Analitik yang telah memberikan izin untuk menggunakan
bahan untuk penelitian. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada
rekan-rekan IPB dari luar Departemen Kimia, rekan-rekan dari Departemen
Kimia, dan rekan-rekan Kimia 44 yang selalu memberi dukungan dan menjadi
teman diskusi yang menyenangkan. Akhir kata, semoga karya ilmiah ini
bermanfaat.
Bogor, Desember 2011
Bara Taufan Safrizal
1
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Surabaya pada tanggal 9 Februari 1990 dari Papa
Moch. Imron Fauzi dan Mama Sunarti. Penulis merupakan putra kedua dari tiga
bersaudara. Tahun 2007 penulis lulus dari SMA Negeri 5 Kediri Jawa Timur dan
pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi
Masuk IPB. Penulis memilih mayor Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi pengajar PRIVAT SMA
mata pelajaran, Fisika, Kimia, dan Matematika (2007-2008 dan 2011), pengajar
mahasiswa S1 mata kuliah Fisika (2008-2010) di bimbingan belajar EXPRESS
dibawah naungan Unit Kreativitas Mahasiswa (UKM) IAAS, pengajar mahasiswa
S1 mata kuliah Kimia (2009-2010) di bimbingan belajar AVOGADRO dibawah
naungan IMASIKA IPB, pengajar mahasiswa S1 mata kuliah Fisika
(2009-Des 2011), Fisika Umum, Fisika Dasar, Kimia, Kimia Umum (Juli-Des
2011) di bimbingan belajar MAFIA CLUBS, serta menjadi pengajar PRIVAT
mahasiswa S1 untuk mata kuliah Fisika dan Kimia pada tahun 2008 sampai
sekarang (Des 2011), Fisika Umum, Fisika Dasar, Kimia Dasar, Kimia Umum
(Juli-Des 2011). Penulis juga pernah menjadi asisten mata kuliah Praktikum
Kimia Fisik S1 Kimia dan layanan pada tahun ajaran 2010/2011. Pada tahun 2008
penulis menjadi Juara II Pertandingan Catur saat Dies Natalis Asrama Sylvalestari
ke-39, pemenang beregu Juara III Catur OMI IPB 2009, pemenang beregu Juara II
Catur OMI IPB 2010, pemenang beregu Juara III Catur OMI IPB 2011, pemenang
beregu Juara III Spirit FMIPA IPB 2011, dan pada tahun 2011 penulis berprestasi
mendapat gelar Karate sebagai pemegang sabuk hitam “DAN I”.
Penulis pernah mendapat bantuan dana dari SMA Negeri 5 Kediri tahun
2007, bantuan dana dari Walikota Kediri (2007), beasiswa Orang Tua Asuh
(2007-2008), beasiswa BBM (2008), beasiswa dari Alumni Fakultas Kehutanan,
beasiswa Eka Tjipta Foundation (2008-2009), beasiswa BUMN (2010-2011),
penulis bergabung dalam kegiatan, organisasi: Keluarga Mahasiswa JayabayaKediri (KAMAJAYA KEDIRI) (2007-sekarang), Asrama Sylvalestari IPB tahun
2008-2009, dan Ikatan Mahasiswa Jawa Timur (IMAJATIM) (2008-2010), Ikatan
Mahasiswa Kimia (IMASIKA) (2008-2009), aktif dalam Unit Kreativitas
Mahasiswa (UKM): CUA (Chess Unity of Agriculture) (2007-sekarang), Karate
(2007-sekarang), Koperasi Mahasiswa (KOPMA) (2008-2009), dan Perkumpulan
Bahasa Korea (HANSAMO) (2008-2009). Penulis juga berkesempatan menjalani
kegiatan Praktik Lapang di Laboratorium Pengolahan dan Proses di Balai Besar
Industri Agro (BBIA) Bogor Jawa Barat pada tahun 2010.
2
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ vii
DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... vii
PENDAHULUAN ...................................................................................................1
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan ....................................................................................................1
Metode Penelitian ................................................................................................2
Modifikasi Elektrode Pasta Karbon menggunakan Ferosena sebagai
Mediator .......................................................................................................... 2
Imobilisasi Enzim SOD pada Permukaan Elektrode Pasta Karbon
Termodifikasi .................................................................................................. 2
Pengukuran Elektrokimia................................................................................ 2
Penentuan Stabilitas Elektrode........................................................................ 2
Pengoptimuman Konsentrasi SOD ................................................................. 3
Pengukuran aktivitas SOD secara Elektrokimia ............................................. 3
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengoptimuman Aktivitas SOD Terimobilisasi ...................................................3
Penentuan Stabilitas Elektrode.............................................................................4
Penentuan Linearitas Pengukuran Aktivitas SOD ...............................................4
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan ..............................................................................................................5
Saran.....................................................................................................................5
DAFTAR PUSTAKA ..............................................................................................6
LAMPIRAN .............................................................................................................8
3
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Data optimisasi SOD dengan konsentrasi xantina 2,1 mM. ............................. 3
2
Kurva stabilitas antara waktu terhadap aktivitas SOD. ..................................... 4
3
Kurva hubungan antara konsentrasi substrat dengan aktivitas SOD. ............... 4
4
Kurva Linearitas konsentrasi xantina (0,200; 0,225, 0,250; dan 0,275 mM). .. 5
5
Voltamogram linearitas pada konsentrasi xantina 0,200; 0,225, 0,250, dan
0,275 mM. .......................................................................................................... 5
6
Voltamogram siklik untuk bufer fosfat, XO, dan xantina. ............................... 5
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Elektrode rujukan, kerja, pembantu, dan sel elektrokimia, serta alat
potensiostat/galvanostat .................................................................................... 9
2
Bagan alir kerja penelitian secara umum .......................................................... 9
3
Pembuatan elektrode pasta karbon dan imobilisasi enzim (Trivadila 2011) .. 10
4
Optimisasi konsentrasi SOD imobilisasi ........................................................ 11
5
Stabilitas elektrode pasta karbon yang diimobilisasi 10 unit SOD ................. 11
6
Pengaruh konsentrasi xantina terhadap aktivitas SOD imobilisasi................. 11
1
PENDAHULUAN
Pengukuran kapasitas antioksidan dengan
metode in vitro dan in vivo telah banyak
diperkenalkan. Kapasitas antioksidan diukur
melalui efek antioksidan untuk mengontrol
proses oksidasi sehingga pengukuran aktivitas
antioksidan perlu diperhatikan sumber radikal
bebasnya (O’Brien et al. 2007). Antiradikal
bebas (antioksidan) adalah bahan yang dalam
kadar rendah dapat mencegah terjadinya
oksidasi dari substrat yang mudah teroksidasi.
Metode yang umum digunakan untuk
mengukur sifat-sifat antioksidan adalah
spektrofotometri, fluoresensi, kromatografi
gas, kromatografi cairan (Prieto-Simon et al.
2008), voltametri siklik (Kilmartin 2001), dan
biosensor (Campanella et al. 2005).
Metode
spektrofotometri
memiliki
kelemahan, yaitu sulit mengukur pada
konsentrasi tinggi. Pengukuran antioksidan
menggunakan
metode
spektrofotometri
seringkali terkendala terhadap preparasi
sampel, sebagai contoh metode 1,1-difenil-2pikrilhidrazil atau DPPH (Diphenyl Picril
Hydrazil Hydrate) sangat peka terhadap
cahaya sehingga harus dilakukan dalam
kondisi gelap dan sangat dipengaruhi oleh
tingkat kekeruhan. Metode ABTS atau 2,2bis-azino
(asam
3-etil-benzotiazolina-6sulfonat) dan FRAP (Ferric Reducing
Antioxidant Power) juga sangat sensitif
terhadap cahaya bahkan pembentukan ABTS
memerlukan waktu inkubasi selama 12–16
jam dalam kondisi gelap (Tawaha et al. 2007).
Pengukuran kapasitas antioksidan selain
terkendala masalah preparasi sampel, juga ada
beberapa pengukuran yang memerlukan
peralatan yang mahal, seperti Kapasitas
Serapan Radikal Oksigen dengan Fluorescen
atau ORAC-FL (Oxygen Radical Absorbance
Capacity with Fluorescein) dan Kromatografi
Cair Kinerja Tinggi atau HPLC (High
Pressure Liquid Chromathography) (Du et al.
2009). Oleh karena itu dibutuhkan metode
yang lebih tepat, cepat, dan sensitif untuk
mengukur sifat-sifat antioksidan.
Biosensor merupakan suatu piranti yang
memanfaatkan
interaksi
hayati
untuk
mendeteksi analat target (Hartati et al. 2005).
Biosensor mengkombinasikan keunggulan
analisis dari teknik elektrokimia dengan
kespesifikan proses pengenalan hayati untuk
menghasilkan
sinyal
listrik
sebagai
konsentrasi suatu analat (Wang 1994).
Penelitian dan pengembangan biosensor
sangat luas dan multidisiplin mencakup
biokimia, ilmu bioreaktor, kimia fisik,
elektrokimia, elektronik, dan rekayasa
perangkat lunak (Chaplin 2004).
Biosensor
elektrokimia
merupakan
alternatif metode yang dikembangkan untuk
mengukur kapasitas antioksidan. Metode ini
sangat menjanjikan, karena analisisnya cepat,
membutuhkan instrumen yang tidak mahal,
protokol operasi yang sederhana, dan
biayanya rendah (Campanella et al. 2004).
Metode biosensor berbasis enzim superoksida
dismutase (SOD) digunakan untuk menguji
aktivitas suatu sampel yang berpotensi sebagai
antioksidan telah dilakukan oleh Campanella
et al. (2004) dan Trivadila (2011).
Enzim superoksida dismutase merupakan
suatu metaloenzim yang bertindak sebagai
intraseluler utama yang melindungi kerusakan
sel karena radikal superoksida dengan cara
mengkatalisis radikal O2- menjadi hidrogen
peroksida (H2O2) dan oksigen (O2)
berdasarkan reaksi 2O2- + 2H+ → O2 + H2O2
(Kankofer 2002). Pemanfaatan SOD untuk
biosensor antioksidan telah banyak dilakukan.
Hal ini dikarenakan beberapa kelebihan yang
dimiliki oleh SOD, yaitu enzim ini spesifik
mengakatalisis radikal superoksida menjadi
oksigen dan peroksida (Donnely et al. 1989).
Perkembangan biosensor antioksidan berbasis
enzim SOD dengan pengukuran secara
elektrokimia hingga saat ini baru pada tahap
penelitian dan belum terdapat biosensor
antioksidan komersial yang diproduksi.
Penelitian oleh Trivadila (2011) telah
mendapatkan parameter pH dan suhu yang
optimum bagi aktivitas SOD murni yang
berasal dari eritrosit sapi yang diimobilisasi
pada pH 11 dan suhu 20 oC. Namun,
penelitian yang telah dilakukan sebelumnya
belum menentukan konsentrasi enzim SOD
imobilisasi yang optimum sehingga penelitian
ini mengoptimumkan konsentrasi SOD
imobilisasi, linearitas pengukuran, dan juga
stabilitas elektrode enzim yang dihasilkan.
Penelitian bertujuan mengoptimumkan
konsentrasi SOD imobilisasi, menentukan
linearitas pengukuran, dan mengukur stabilitas
elektrode pasta karbon terimobilisasi SOD
yang dihasilkan untuk mengukur aktivitas
SOD.
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan adalah eDAQ
Potentiostat-Galvanostat yang dilengkapi
dengan perangkat lunak Echem v2.1.0,
elektrode Ag/AgCl, badan elektrode, platina,
2
sel elektrokimia (Lampiran 1), peralatan gelas,
tabung mikro, pipet mikro, neraca analitik, pH
meter, dan oven.
Bahan-bahan yang digunakan adalah
superoksida dismutase (SOD), xantina
oksidase (XO), xantina, grafit, ferosena,
dimetil sulfoksida (DMSO), parafin cair,
larutan bufer fosfat pH 11, membran dialisis,
dan jaring nilon.
Metode Penelitian
Metode penelitian ini meliputi, preparasi
elektrode rujukan Ag/AgCl, modifikasi
elektrode pasta karbon, imobilisasi enzim
SOD pada permukaan elektrode pasta karbon,
optimisasi serta stabilitas aktivitas SOD
imobilisasi. Bagan alir penelitian secara
umum dilampirkan pada Lampiran 2.
Modifikasi Elektrode Pasta Karbon
menggunakan Ferosena sebagai Mediator
(Campanella et al. 1997, Ikeda et al. 1998)
Sebanyak 1 mL DMSO digunakan untuk
melarutkan 3 mg ferosena (mediator) dan
campuran ditambahkan 100 mg grafit
kemudian didiamkan selama 2 jam. Setelah 2
jam
didiamkan,
pelarut
diuapkan
menggunakan pengering vakum sehingga
diperoleh grafit termodifikasi mediator. Grafit
termodifikasi kemudian dicampur dengan
parafin cair sampai membentuk pasta dengan
perbandingan campuran 100 mg grafit
termodifikasi dan 35 µL parafin cair. Pasta
karbon yang terbentuk dimasukkan ke dalam
badan elektrode hingga padat sampai
permukaan. Permukaan gelas elektrode
dihaluskan dan dibersihkan dengan amplas
serta kertas minyak (Lampiran 3).
Imobilisasi Enzim SOD pada Permukaan
Elektrode Pasta Karbon Termodifikasi
(Ikeda et al. 1998)
Larutan SOD sebanyak 5 L diteteskan
pada permukaan elektrode pasta karbon
kemudian
didiamkan
agar
pelarutnya
menguap. Selanjutnya permukaan elektrode
dilapisi dengan membran dialisis, ditutup
dengan jaring nilon dan diikat dengan
parafilm. Elektrode kemudian direndam dalam
larutan bufer fosfat 50 mM (pH 11) pada suhu
4 ºC ketika tidak digunakan, untuk
memberikan keadaan yang sama dengan
lingkungan sebenarnya. Elektrode dapat
langsung digunakan untuk pengukuran
aktivitas SOD dengan metode elektrokimia.
Pengukuran Elektrokimia
Pengukuran
elektrokimia
metode
voltametri
siklik
dilakukan
dengan
menggunakan
seperangkat
alat
potensiostat/galvanostat eDAQ dan komputer
beserta perangkat lunak pengolah data Echem
v2.1.0. Elektrode yang digunakan, yaitu
elektrode Ag/AgCl, platina, dan elektrode
pasta karbon-enzim berturut-turut sebagai
elektrode rujukan, counter, dan kerja.
Parameter pengukuran diatur sebagai berikut;
Mode: Cyclic, Initial E: 100 mV, Final E: 100
mV, Rate: 250 mV/s, Step W: 25ms, Upper E:
600 mV, Lower E: 50 mV, dan Range: 10V.
xantina
asam urat
(Campanella 2000).
Radikal superoksida dihasilkan oleh
oksidasi dalam larutan xantin untuk asam urat
dalam enzim xanthine oksidase.
xantina+ H2O + O2
XO
>
asam urat + 2H+ +
2O2•-
Radikal superoksida dihasilkan melalui
reaksi enzimatis xantina dengan xantina
oksidase (XO). Selanjutnya radikal yang
dihasilkan akan didismutasi membentuk O2
dengan katalis SOD melalui reaksi:
2O2•- + 2H+
SOD
>
O 2 + H 2O 2
Larutan bufer fosfat sebanyak 1,9 mL dan
larutan XO 0,1 U/mL sebanyak 100 µL
ditambahkan ke dalam sel pengukuran dan
puncak arus anoda yang terbentuk diamati
sebagai
puncak
blangko.
Selanjutnya
ditambahkan substrat xantina 2,1 mM
sebanyak 1 mL dan diukur kembali perubahan
atau kenaikan puncak arus anode yang terjadi.
Penentuan Stabilitas Elektrode
Stabilitas elektrode ditentukan dari
pengukuran aktivitas enzim SOD setelah
didapatkan kondisi optimum aktivitas SOD
secara langsung melalui pengukuran arus yang
didapat. Pengukuran aktivitas secara langsung
dilakukan pada elektrode yang telah dibuat
dengan imobilisasi enzim SOD pada
permukaan elektrode. Nilai aktivitas yang
diperoleh pada pengukuran awal dianggap
aktivitas 100%. Aktivitas diukur ulang pada
3
Aktivitas SOD (%) =
I saat
aat ke - jam (µA)
× 100 %
I saat
sa awal (µA)
Pengoptimuman Konsen
sentrasi SOD
Optimisasi yang dilak
lakukan untuk aktivitas
SOD murni adalah optimisasi
opt
konsentrasi
SOD pada pH dan suhu optimum
o
(pH 11 dan
suhu 20 ºC). Konsentra
trasi SOD imobilisasi
yang digunakan pada elektrode
ele
pasta karbon
adalah 0,2; 0,5; 1,0; 2,0;; 5,0; 10,0; 20,0; dan
50,0 unit.
Pengukuran
Elektrokimia
aktivitas
itas
SOD
secara
Uji aktivitas dilakuk
ukan dengan variasi
rentang
konsentrasi
substrat
xantina
0,200–0,325 mM (interv
erval 0,05 mM) pada
prosedur elektrokimia se
sebelumnya sehingga
adanya hubungan linear
ar digunakan koefisien
korelasi (r) pada anal
nalisis regresi linear
(y = a + bx).
kan dengan variasi
Linearitas dilakukan
rentang
konsentrasi
substrat
xantina
0,200–0,275 mM (interv
erval 0,05 mM) pada
prosedur pengukuran el
elektrokimia di atas,
kemudian dibuat kurva
rva hubungan antara
konsentrasi substrat xant
ntina dengan aktivitas
SOD murni.
Sebagai parameter adanya
ada
hubungan linier
digunakan koefisien kore
orelasi r pada analisis
regresi linier y = a + bx.. Hubungan
H
linier yang
ideal dicapai jika nilai b = 0 dan r = +1 atau -1
bergantung pada arah gari
aris. Sedangkan nilai a
menunjukkan kepekaan
an analisis terutama
instrumen yang digunakan
kan (Harmita 2004).
Trivadila (2011) dan Wen
eniarti (2011), yaitu
berurutan sebesar 0,12 µA pada konsentrasi
Mn-SOD 701,02 µg/mL dan 0,43 µA pada
konsentrasi SOD 1500 µg/mL, sedangkan
aktivitas SOD murnii yang didapatkan
Trivadila (2011) sebesarr 0,09 µA sehingga
aktivitasnya lebih rend
ndah dibandingkan
dengan aktivitas yang
ng didapat dalam
penelitian ini.
Perbedaan hasil inii dapat disebabkan
karena adanya perlakuann yang berbeda saat
penyimpanan elektrode pasta
pa
karbon-enzim.
Elektrode disimpan dala
alam larutan bufer
pH 11. Nilai Penyimpanan
an pada kondisi yang
berbeda ini menyebabkan
an hasil pengukuran
yang
berbeda.
Penga
garuhnya
terhadap
pengukuran aktivitas SOD
D pada elektrode agar
memberikan keadaan yang
ng sama ketika tidak
digunakan dengan saat peng
engukuran.
Gambar 1 memperliha
hatkan secara umum
semakin besar konsentra
trasi SOD, semakin
besar kenaikan arus dan aktivitas
a
maksimum
yang dihasilkan, serta sem
semakin cepat waktu
yang dibutuhkan aruss untuk mencapai
maksimum. Hasil peng
engamatan aktivitas
konsentrasi
SOD
dib
ibawah
10
unit
menunjukkan
arus
bbelum
mencapai
maksimum.
2.5
2
Irerata (µA)
tiap kurun waktu tertentu
ntu dan aktivitas yang
tersisa diukur.
1.5
1
0.5
0
0,2 0,5
1,0 2,0
5
5,0
10,0 20,0
50,0
HASIL DAN PEM
EMBAHASAN
waktu (jam
am)
Pengoptimuman Aktivitas
A
SOD
Terimobil
bilisasi
isasi SOD dengan
Gambar 1 Data optimisa
konsentrasi xant
antina 2,1 mM.
Pengoptimuman aktivi
tivitas SOD imobilisasi
untuk kerja optimum SOD
OD ditentukan dengan
menggunakan
metod
tode
elektrokimia.
Konsentrasi optimisasii SOD murni yang
digunakan adalah 0,2; 0,5
0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0;
20,0; dan 50,0 unit pada
da larutan bufer fosfat
pH 11, suhu 20 oC. Konsentrasi SOD
memiliki nilai konsentras
trasi optimum 10 unit,
karena arus rerata memil
iliki nilai terbesar dan
nilai koefisien variasi berada
ber
pada persentase
dibawah 10% sebesar 3,99%.
3
Arus puncak
oksidasi pada konsentrasi
asi SOD optimum 10,0
unit sebesar 2,371 µA (Lampiran
(La
4). Hasil ini
lebih tinggi dari yan
ang dihasilkan oleh
Berdasarkan hasil pengukuran, arus
konsentrasi SOD pada 0,2
0
dan 0,5 unit
memiliki koefisien varias
iasi (KV) dan arus
rerata (Irerata) negatif
if setiap ulangan
pengukuran. Artinya pada
da 0,2 dan 0,5 unit
aktivitasnya tidak ada atau
au sangat kecil. Irerata
terbesar dihasilkan ketikaa kkonsentrasi SOD 10
unit, yaitu sebesar 2,371
710 µA. Jadi dapat
disimpulkan bahwa konse
nsentrasi SOD yang
optimum sebesar 10,0 unit
nit. Konsentrasi SOD
yang lebih besar dari 10
10,0 unit mengalami
penurunan aktivitas. Arus
rus puncak oksidasi
tertinggi dihasilkan dala
alam waktu respon
4 detik. Waktu respon ini
in lebih baik dari
4
waktu respon rata-rata pada
biosensor urea
p
berbasis membran khitin
itin, yakni 3-6 menit
(Nazaruddin 2007) sedangkan
se
biosensor
elektrokimia untuk deteks
eksi urutan DNA tanpa
indikator hibridisasi wakt
aktu responnya sebesar
20 menit agar diperoleh
eh deteksi pada DNA
target (Hartati et al. 2007)
07).
Berbagai macam tekni
knik immobilisasi telah
digunakan, meliputi adsor
sorpsi pada penyangga
padat (Yao et al. 2007, Wang et al. 2009),
pengikatan kovalen (Kun
unzelmann & Botther
2007, Wu et al. 1999)) dan pemerangkapan
dalam polimer (Fei et al.
l. 2003, Li et al. 2004,
Pan et al. 2005, Hiratsuka
ka et al. 2008). Sol-gel
menawarkan metode untu
ntuk mengimmobilisasi
biomolekul agar dapat me
menunjukkan aktivitas
fungsional biomolekull yang terselubungi
dengan matriks yang ber
berpori (Coradin et al.
2006, Gupta et al. 2007)
07). Nur et al. (2010)
mengembangkan teknikk immobilisasi enzim
kedalam silica gel dengan
an teknik sol-gel untuk
membentuk sensor sebaga
agai lapisan tipis yang
dapat
dipasangkan
dengan
teknik
elektrokimia.
berturut-turut. Arus meningkat
m
secara
signifikan, yaitu sebesa
esar lebih kurang
0,398 µA dan mencapai puncak
pu
dalam waktu
10 jam dan cenderung turu
run hingga mencapai
waktu 168 jam.
Salah satu faktor penentu
p
kestabilan
elektrode adalah kestabilan
lan aktivitas enzim itu
sendiri. Proses imobilis
ilisasi enzim pada
permukaan
elektrode
diketahui
dapat
meningkatkan kestabilan enzim.
en
Menurut Nur
et al. (2010) imobilisasi enzim
enz metode sol gel,
enzim yang telah berha
rhasil diimmobilisasi
mempunyai aktivitas dan
da stabilitas yang
cukup bagus sehingga dapa
apat digunakan untuk
aplikasi biosensor.
Berdasarkan hasil pengujian
pe
diperoleh
kondisi stabil elektrode dari
dar pengukuran SOD
setelah 72 jam inkubasi pada
pa elektrode pasta
karbon dengan enzim SOD
D imobilisasi karena
aktivitas SOD (dalam 10-3 A) dari 0 jam
sampai dengan 72 jam tidak
tid berbeda secara
signifikan namun aktivitas
tas SOD turun secara
drastis setelah 72 jam.
Penentuan Linearitas
itas Pengukuran
Aktivitass SOD
S
Penentuan Stabilit
ilitas Elektrode
400
Setelah diperoleh kondisi
k
optimum,
elektrode pasta karbon-SOD
OD digunakan untuk
mengukur aktivitas SOD imobilisasi dengan
variasi substrat xantina,, sehingga
s
diperoleh
hubungan antara konsentra
trasi substrat dengan
aktivitas SOD Gambar 3.. Konsentrasi
K
xantina
yang digunakan, yaitu antara
a
0,200–0,325
mM.
350
300
Aktivitas SOD (µA)
Aktivitas SOD (dalam 10 -3 µA)
Stabilitas elektrode
de ditentukan dari
pengukuran aktivitas en
enzim SOD setelah
didapatkan kondisi optim
timum aktivitas SOD
secara langsung melaluii ppengukuran arus yang
didapat. Stabilitas elek
lektrode digambarkan
sebagai
hubungan
w
waktu dan arus,
ditunjukkan dalam Gamba
bar 2.
250
200
150
100
50
0
0
2
10 24
waktu (jam)
48
72
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0.175
120 168
0.200
0.225 0.250
[xantina]
a] ((mM)
0.275
0.300
waktu
Gambar 3 Kurva hubungan
gan antara konsentrasi
substrat dengan
an aktivitas SOD.
Arus puncak oks
ksidasi pada saat
pengukuran awal (waktu
ktu untuk jam ke-0)
dikondisikan 100%. K
Kestabilan elektrode
untuk 72 jam sebesar 85
85,68% dan semakin
menurun sampai 4,52%
2% untuk 168 jam.
Pengukuran dilakukan sebanyak
s
6 ulangan
pada hari yang sama (intr
intraday) dan pada hari
yang berlainan (interda
rday) selama 5 hari
Hubungan
linear
diperoleh
ketika
konsentrasi
xantina
00,200–0,275
mM
(Gambar 4). Kurva yangg dihasilkan
d
memiliki
persamaan garis y = -2,27
2700 + 13,400x dan
R2 = 95,28%. Berdasarka
rkan hasil pengujian,
diperoleh koefisien regres
resi untuk linearitas
sebesar 0,9761. Menurut
ut ICH (1995 diacu
dalam Chan 2004), nilai ini hampir memenuhi
syarat yang ditetapkan, yaitu
y
0,9970. Nilai
Gambar 2 Kurva stabili
bilitas antara
terhadap aktivi
tivitas SOD.
5
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0.175
y = 13,4400x - 2,2700
r = 0,9761
-5
2,0x10
-5
1,5x10
-5
1,0x10
-6
5,0x10
0,0
-6
-5,0x10
-5
-1,0x10
-5
-1,5x10
-5
-2,0x10
-5
-2,5x10
-5
-3,0x10
-5
-3,5x10
-5
-4,0x10
-5
-4,5x10
-5
-5,0x10
0,0
0.200
0.225 0.250
[xantina] (mM)
0.275
0.300
Gambar 4 Kurva
Linearitas
konsentrasi
xantina (0,200; 0,225, 0,250; dan
0,275 mM).
Linearitas dinyatakan dengan koefisien
korelasi (r). Nilai koefisien korelasi yang
tinggi menunjukkan hubungan yang linear
antara konsentrasi xantina dengan aktivitas
SOD. Gambar 6 menyajikan voltamogram
siklik pada konsentrasi persamaan linearitas
tersebut.
3
2
1
0
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-7
-8
-9
-10
-11
0.0
yang semakin jauh dari nol disebabkan oleh
semakin besarnya pengaruh matriks dalam
substrat. Hal ini dapat mengganggu penentuan
aktivitas SOD dalam variasi konsentrasi
xantina sebagai substrat.
I (A)
Aktivitas SOD ( A)
koefisien yang tinggi menyatakan bahwa
kenaikan konsentrasi, akan memberikan
kenaikan arus yang sebanding. Semakin besar
konsentrasi xantina maka aktivitas SOD
semakin tinggi pada rentang konsentrasi
xantina 0,200–0,275 Mm (Lampiran 6),
sedangkan konsentrasi xantina lebih dari
0,275 mM mengalami penurunan aktivitas
SOD.
0.200Unit
0.225Unit
0.250Unit
0.275Unit
Buferfosfat
XO
xantina
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
E (V) vs Ag/AgCl
Gambar 6 Voltamogram siklik untuk bufer
fosfat, XO, dan xantina.
Konsentrasi xantina yang digunakan pada
kurva linearitas sebesar 0,200; 0,225, 0,250;
dan 0,275 mM. Kisaran linear yang diperoleh
dalam penelitian ini lebih kecil dibandingkan
dengan penelitian Trivadila (2011), dalam
teknik imobilisasi yang sama, hasil kisaran
yang diperoleh lebih besar, yaitu 0,1–0,7 mM.
Menurut Campanella et al. (2000), persamaan
kurva linear y = (328,9 ± 6,4)x – (2,3 ± 1,3)
dengan koefisien korelasi 0,9761 dengan
kisaran variasi rentang konsentrasi substrat
xantina 0,02–2,00 mM. Artinya hasil pada
penelitian ini memiliki koefisien korelasi yang
lebih sempit dengan hasil pada Campanella et
al. sehingga pada penelitian ini dapat
dikatakan baik.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
E (V) vs Ag/AgCl
Gambar 5 Voltamogram linearitas pada
konsentrasi xantina 0,200; 0,225,
0,250, dan 0,275 mM.
Linearitas juga dapat diketahui dari
kemiringan garis, intersep, dan residual
(Ermer & Miller 2005). Berdasarkan hasil
pengujian didapat persamaan regresi linear
untuk kurva garis y = -2,2700 + 13,400x.
Berdasarkan persamaan tersebut didapat nilai
intersep (a) sebesar -2,2700. Nilai intersep
Konsentrasi SOD imobilisasi yang
optimum pada pH 11 dengan suhu 20 oC
adalah konsentrasi 10 unit. Kurva linearitas
konsentrasi xantina sebesar 0,200; 0,225,
0,250; dan 0,275 mM didapatkan persamaan
garis y = -2,2700 + 13,400x dengan r = 0,9761
dan R² = 95,28%. Elektrode akan stabil bila
disimpan dalam larutan bufer pH 11 pada
suhu 20 oC selama 72 jam.
Saran
Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk
meningkatkan kevalidan metode dan keajegan
metode analisis melalui pendekatan metode
dengan parameter yang lain.
6
DAFTAR PUSTAKA
Campanella L, Favero G, Tomasetti M. 1997.
A modified amperometric electrode for
the determination of free radical. Sens.
Actators B 44:559–565.
Campanella L, Favero G, Persi L, Tomassetti
M. 2000. Evaluation of radical
scavenging properties of several plants,
fresh or from a herbalist’s, using a
superoxide
dismutase
biosensor.
Pharmaceutical and Biomedical Analysis
24: 1055–1064.
Campanella L, Bonanni A, Finotti E,
Tomassetti M. 2004. Biosensors for
determination of total and natural
antioxidant capacity of red and white
wines:
comparison
with
other
spectrophotometric and
fluorimetric
methods. Biosensors and Bielectronics
19: 641–651.
Campanella L, Martini E, Tomasetti M. 2005.
Antioxidant capacity of the algae using a
biosensor method. Talanta 66: 902–911.
Chaplin M. 2004. Apa biosensor?. [terhubung
berkala].
http://www.lsbu.
ac.uk/biology/enztech/biosensors.html.
[24 Januari 2011].
Coradin T, Boissierre M, Livage J. 2006. SolGel Chemistry in Medicinal Science.
Current Medicinal Chemistry 13: 99–108.
Donnelly JK, Mc Lellan KM, Walker JL,
Robinson
DS.
1989.
Superoxide
Dismutase in Foods. A Review. J Food
Chem. 33: 243-270.
Du G, Li M, Ma F, Liang D. 2009.
Antioxidant capacity and the relationship
with polyfenol and Vitamin C in
Actinidia fruits. J. Foodchem 113: 557–
562.
Ermer J, Miller JH, editor. 2005. Method
Validation in Pharmaceutical Analysis.
Weinheim: Wiley-VCH.
Fei J, Wu Y, Ji X, Wang J, Hu S, Gao Z.
2003. An Amperometric Biosensor for
Glucose Based on Electrodeposited
Redox polymer/Glucose Oxidase Film on
a Gold Electrode. Analitical sciences, 19.
Gupta R, Chaudhury NK. 2007. Entrapment
of Biomolecules in Sol-Gel Matrix for
Applications in Biosensors: Problems and
Future Prospects. Biosensors and
Bioelectronics, 22p: 2387–2399.
Harmita. 2004. Petunjuk pelaksanaan validasi
metode dan cara perhitungannya.
Majalah Ilmu Kefarmasian 1: 117–135.
Hartati YW, Rochani S, Bahti HH, Agma M.
2005. Biosensor elektrokimia untuk
deteksi urutan DNA tanpa indikator
hibridisasi. [Seminar]. Bandung: Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Padjadjaran.
Hartati YW, Rochani S, Bahti HH, Agma M.
2007. Elektrokimia untuk Deteksi Urutan
DNA Tanpa Indikator Hibridisasi.
[Seminar].
Bandung:
Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Padjadjaran.
Hattu N. 2009. Studi voltametri dan analisis
antihistamin setirizin dihidroklorida dan
deksklorfeniramin maleat dalam medium
surfaktan menggunakan elektroda pasta
karbon. [Disertasi]. Bandung: Program
Studi Kimia, Institut Teknologi Bandung.
Hiratsuka A, Fujisawa K, Muguruma H. 2008.
Amperometric Biosensor based on
Glucose Dehydrogenase and Plasmapolymerized Thin Films. Analitical
sciences, 24.
Huda M, Kurniawan F, Suprapto. 2010.
Pembuatan
elektrode
pembanding
Ag/AgCl dengan menggunakan membran
komposit
karbon-rotan.
[Prosiding
Skripsi]. Surabaya: Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut
Teknologi Sepuluh Nopember.
[ICH]
International
Conference
on
Harmonization. 1995. Validation of
Analytical Prosedures: Methodology Q2B
[terhubung
berkala].
www.ich.org.
[20 Maret 2011].
Ikeda et al. 1998. Electrochemical monitoring
of in vivo recronstitution of glucose
dehydrogenase in Escherichia coli cells
with externally added pyrroloquinoline
quinone.
J.
Electroanal.
Chem
449: 219–224.
7
and
in
and
Vet
Tawaha K, Alali FQ, Gharaibeth M,
Mohammad M, El-Elimat T. 2007.
Antioxidant activity and total phenolic
content of selected Jordanian plant
species. J. Foodchem 104: 1372–1378.
Kilmartin
PA.
2001.
Electrochemical
detection
of
natural
antioxidant:
principles and protocol. Antioxidant &
redox signaling. Marry Ann Lieb Inc.
Trivadila. 2011. Biosensor antioksidan
menggunakan superoksida dismutase
Deinococcus
radiodurans
yang
diimobilisasi pada permukaan elektrode
pasta karbon dan parameter kinetikanya.
[Tesis]. Bogor: Fakultas Matematika dan
Ilmu
Pengetahuan
Alam,
Institut
Pertanian Bogor.
Kankofer M. 2002. Superoxide dismutase
glutathione peroxidase activities
bovine placenta: spectrophotometric
electrophoretic analysis. Revue Med
153: 121–124.
Kunzelmann U, Bottcher H. 1997. Biosensor
Properties
of
Glucose
Oxidase
Immobilized within SiO2 gels. Sensors
and Actutors, 38–39: 222–228.
Li CX, Deng KQ, Shen GL, Yu RQ. 2004.
Amperometric
Hydrogen
Peroxide
Biosensor Based on Horse Peroxidase
labeled Nano-Au Colloids Immobilized
on Poly (2,6-pyridinedicarboxylic acid)
Layer by Cysteamine. Analytic Sciences
20: 1277–1281.
Nazaruddin. 2007. Biosensor Urea Berbasis
Biopolimer Khitin sebagai Matriks
Immobilisasi. Jurnal Rekayasa Kimia dan
Lingkungan 6: 41–44.
Nur A, Dhini SUW, Febriana Y, Setyawan H.
2010 immobilisasi enzim glucose oxidase
(god) dan horse radish peroxidase (hrp)
untuk aplikasi biosensor dengan metode
sol-gel. Seminar Rekayasa Kimia dan
Proses. Surabaya: Fakultas Teknologi
Industri, Institut Teknologi Sepuluh
Nopember.
O’Brien KB, Killoran SJ, O’Neill RD,
Lowrya JP. 2007. Development and
characterization in vitro of a catalasebased biosensor for hydrogen peroxide
monitoring.
Biosensors
and
Bioelectronics 22: 2994–3000.
Pan D, Chen J, Yao S, Tao W, Nie L. 2005.
An Amperometric Glucose Biosensor
Based on Glucose Oxidase Immobilized
in
Electropolymerized
Poly
(oaminophenol) and Carbon Nanotubes
Composite Film on a Gold Electrode.
Analitic Sciences 21p: 367–371.
Prieto-Simon B, Cortina M, Campas M,
Calas-Blanchard
C.
2008.
Electrochemical biosensor as a tool for
antioxidant capacity assessment. Sens
Actuators B 129: 459–466.
Wang J. 1994. Analytical Electrochemistry.
New York: VCH.
Wang K, et al. 2009. Direct Electrochemistry
and Electrocatalysis of Glucose Oxidase
Immobilized on Glassy Carbon Electrode
Modified by Nafion and Ordered
Mesoporous. Journal of molecular
Catalysis B: Enzymatic 58: 194–198
Weniarti. 2011. Biosensor antioxidant
berbasis superoksida dismutase dari
mikroba Indonesia yang diimobilisasi
dalam
nanokomposit
zeolit
alam
Indonesia. [Tesis]. Bogor: Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Institut Pertanian Bogor.
Wu J, Suls J, Sansen W. 1999. Amperometric
Glucose sensor with Enzyme Covalently
Immobilized by Sol-Gel Technology.
Analitical science 15.
Yao K, Zhu Y, Wang P, Yang X, Cheng P, Lu
H. 2007. ENFET Glucose Biosensor
Produced with Mesoporous Silica
Microspheres. Materials Science and
Engineering C 27p: 736–740.
8
LAMPIRAN
9
Lampiran 1
Elektrode rujukan, kerja,
potensiostat
tat/galvanostat
pembantu,
dan
sel
elektrok
okimia,
serta
alat
(a) Elektrode rujuka
ukan, kerja, pembantu,
dan sel elektrokim
kimia.
nsiostat/galvanostat
(b) Seperangkat alat potensi
ke penelitian secara umum
Lampiran 2 Bagan alir kerja
Preparasi elektro
trode pendukung Ag/AgCl dan elektrode pasta karbon serta
se
modifikasi grafit dengan mediator
Im
Imobilisasi
SOD pada elektrode pasta karbon
Elektrode pasta karbon–SOD
Optimisasi konsentrasi SOD
Linearitas
Pengukuran elektrokimia
Stabilitas &aktivitas
&
SOD imobiliasasi
10
Lampiran 3 Pembuatan elektrode pasta karbon dan imobilisasi enzim (Trivadila 2011)
parafin cair : grafit (1 : 2)
campuran digerus
pasta karbon
dimasukkan ke dalam badan elektrode
hingga padat sampai permukaan
permukaan karbon dihaluskan
dengan kertas minyak
pipet mikro
5 µL enzim SOD diimobilisasi
pada permukaan elektrode
pelarut diuapkan
permukaan elektrode dilapisi
dengan membran dialisis
tutup dengan jaring nilon dan
ikat dengan parafilm
elektrode disimpan dalam
larutan bufer fosfat pH 11
dengan suhu 20 oC
11
Lampiran 4 Optimisasi konsentrasi SOD imobilisasi
Konsentrasi SOD
(unit)
0,2
0,5
1,0
2,0
5,0
10,0
20,0
50,0
∆Ipa
(µA)
-0,3977
-0,3583
0,4627
1,5845
1,5655
2,3710
0,3310
0,2445
Lampiran 5 Stabilitas elektrode pasta karbon yang diimobilisasi 10 unit SOD
Waktu
(jam)
0
2
10
24
48
72
120
168
Aktivitas SOD
∆I( A
(%)
0,360
0,375
0,398
100,00
0,369
92,71
0,359
90,20
0,341
85,68
0,191
47,99
0,018
4,52
Lampiran 6 Pengaruh konsentrasi xantina terhadap aktivitas SOD imobilisasi
[Xantina]
(mM)
Aktivitas
SOD (μA)
0,200
0,225
0,250
0,275
0,481
0,660
1,089
1,458
12
PENENTUAN KONSENTRASI OPTIMUM SUPEROKSIDA
DISMUTASE, LINEARITAS, DAN STABILITAS
BIOSENSOR ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN
ELEKTRODE PASTA KARBON
BARA TAUFAN SAFRIZAL
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
ABSTRAK
BARA TAUFAN SAFRIZAL. Penentuan Konsentrasi Optimum Superoksida
Dismutase, Linearitas, dan Stabilitas Biosensor Antioksidan Menggunakan
Elektrode Pasta Karbon. Dibimbing oleh DYAH ISWANTINI PRADONO dan
TRIVADILA.
Penelitian ini bertujuan mengoptimumkan konsentrasi superoksida
dismutase (SOD) imobilisasi dan menentukan aktivitas SOD imobilisasi. Metode
biosensor elektrokimia berbasis superoksida dismutase digunakan sebagai metode
alternatif karena instrumentasi sederhana, sentitivitas tinggi, dan biaya rendah.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa kondisi optimum untuk aktivitas SOD murni
adalah konsentrasi 10 unit dengan waktu respons 4 detik. Elektrode pasta kabon
yang terimobilisasi enzim mencapai kestabilan elektrode hingga 72 jam sebesar
85,7% dan mengalami penurunan kestabilan sesudahnya 72 jam. Hubungan
konsentrasi substrat dan aktivitas SOD imobilisasi menghasilkan persamaan garis
linear y = -2,2700 + 13,400x pada rentang konsentrasi xantina 0,200–0,275 mM
dengan nilai r sebesar 0,9761. Hasil tersebut menunjukkan analisis ini memiliki
linearitas yang tinggi dan untuk meningkatkan kestabilan aktivitas enzim
diperlukan pendekatan dengan parameter analisis yang lain.
Kata kunci: aktivitas enzim, biosensor antioksidan, superoksida dismutase
ABSTRACT
BARA TAUFAN SAFRIZAL. Optimum Concentration Determination of
Superoxide Dismutase, Linearity, and Stability of Antioxidants Biosensor Using
Carbon Paste Electrode. Supervised by DYAH ISWANTINI PRADONO and
TRIVADILA.
The objectives of this research was to optimize the concentration of
immobilized superoxide dismutase SOD and to determine the activity of the
immobilized SOD. Electrochemical biosensor method based on superoxide
dismutase is used as an alternative method due to simple instrumentation, high
sentitivity, and low cost. The results showed that the optimum conditions for pure
SOD activity is the concentration of 10 units with a response time of 4 seconds.
The immobilized enzyme on the carbon paste electrode achieved its stability up to
72 hours for 85.7% and decreased thereafter. Substrate concentration relationships
and SOD activity immobilization yield a linear equation y = -2.2700 + 13.400x
in the concentration range from 0.200 to 0.275 mM xanthine with r value of
0.9761. The results of this analysis showed a high linearity and to improve the
stability of the enzyme activity need another approach using analysis of other
parameters.
Keywords: antioxidant biosensor, enzyme activity, superoxide dismutase
PENENTUAN KONSENTRASI OPTIMUM SUPEROKSIDA
DISMUTASE, LINEARITAS, DAN STABILITAS
BIOSENSOR ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN
ELEKTRODE PASTA KARBON
BARA TAUFAN SAFRIZAL
Skripsi
sebagai salah satu syarat memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
v
Judul Skripsi : Penentuan Konsentrasi Optimum Superoksida Dismutase,
Linearitas, dan Stabilitas Biosensor Antioksidan Menggunakan
Elektrode Pasta Karbon
Nama
: Bara Taufan Safrizal
NIM
: G44070034
Disetujui
Pembimbing II
Pembimbing I
Dr Dyah Iswantini Pradono, MAgr
NIP 19670730 199103 2 001
Trivadila, SSi, MSi
Diketahui
Ketua Departemen Kimia
Prof Dr Ir Tun Tedja Irawadi, MS
NIP 19501227 197603 2 002
Tanggal lulus:
ii
PRAKATA
Penulis memanjatkan puji dan syukur kepada Allah SWT atas segala rahmat
dan karunia-Nya sehingga karya ilmiah yang bertema “Biosensor Antioksidan”
dengan judul “Penentuan Konsentrasi Optimum Superoksida Dismutase,
Linearitas, dan Stabilitas Biosensor Antioksidan Menggunakan Elektrode Pasta
Karbon” dapat diselesaikan. Penelitian ini mengoptimumkan konsentrasi SOD
murni imobilisasi serta menentukan aktivitasnya sebagai metode biosensor
antioksidan sejak bulan Februari hingga Agustus 2011 di Laboratorium Bersama
dan Laboratorium Kimia Fisik, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Penulis menyampaikan ucapan terima kasih kepada Dr Dyah Iswantini
Pradono, MAgr dan Trivadila, SSi, MSi selaku pembimbing yang selalu memberi
bimbingan, motivasi, saran, dan meluangkan waktunya kepada penulis selama
berkonsultasi. Terima kasih kepada Laboratorium Bersama yang telah
memberikan fasilitas dan penggunaan peralatan selama penulis melaksanakan
penelitian, serta kepada BUMN atas bantuan dana yang diberikan dalam
penelitian. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Mama, kakak
Nita Annisa Rachmi, dan adik Iqbal Zen Ramadhan Govinda, serta seluruh
keluarga yang senantiasa mendoakan, memberi motivasi, dan kasih sayang tiada
henti. Tidak lupa penulis ucapkan terima kasih kepada Pak Mail, Pak Nano,
Bu Ai, dan para pegawai di Laboratorium Kimia Fisik, juga kepada Mas Eko,
Pak Wawan dan Bu Heny, dan para pegawai di Laboratorium Bersama, serta
kepada Laboratorium Analitik yang telah memberikan izin untuk menggunakan
bahan untuk penelitian. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada
rekan-rekan IPB dari luar Departemen Kimia, rekan-rekan dari Departemen
Kimia, dan rekan-rekan Kimia 44 yang selalu memberi dukungan dan menjadi
teman diskusi yang menyenangkan. Akhir kata, semoga karya ilmiah ini
bermanfaat.
Bogor, Desember 2011
Bara Taufan Safrizal
1
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Surabaya pada tanggal 9 Februari 1990 dari Papa
Moch. Imron Fauzi dan Mama Sunarti. Penulis merupakan putra kedua dari tiga
bersaudara. Tahun 2007 penulis lulus dari SMA Negeri 5 Kediri Jawa Timur dan
pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi
Masuk IPB. Penulis memilih mayor Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi pengajar PRIVAT SMA
mata pelajaran, Fisika, Kimia, dan Matematika (2007-2008 dan 2011), pengajar
mahasiswa S1 mata kuliah Fisika (2008-2010) di bimbingan belajar EXPRESS
dibawah naungan Unit Kreativitas Mahasiswa (UKM) IAAS, pengajar mahasiswa
S1 mata kuliah Kimia (2009-2010) di bimbingan belajar AVOGADRO dibawah
naungan IMASIKA IPB, pengajar mahasiswa S1 mata kuliah Fisika
(2009-Des 2011), Fisika Umum, Fisika Dasar, Kimia, Kimia Umum (Juli-Des
2011) di bimbingan belajar MAFIA CLUBS, serta menjadi pengajar PRIVAT
mahasiswa S1 untuk mata kuliah Fisika dan Kimia pada tahun 2008 sampai
sekarang (Des 2011), Fisika Umum, Fisika Dasar, Kimia Dasar, Kimia Umum
(Juli-Des 2011). Penulis juga pernah menjadi asisten mata kuliah Praktikum
Kimia Fisik S1 Kimia dan layanan pada tahun ajaran 2010/2011. Pada tahun 2008
penulis menjadi Juara II Pertandingan Catur saat Dies Natalis Asrama Sylvalestari
ke-39, pemenang beregu Juara III Catur OMI IPB 2009, pemenang beregu Juara II
Catur OMI IPB 2010, pemenang beregu Juara III Catur OMI IPB 2011, pemenang
beregu Juara III Spirit FMIPA IPB 2011, dan pada tahun 2011 penulis berprestasi
mendapat gelar Karate sebagai pemegang sabuk hitam “DAN I”.
Penulis pernah mendapat bantuan dana dari SMA Negeri 5 Kediri tahun
2007, bantuan dana dari Walikota Kediri (2007), beasiswa Orang Tua Asuh
(2007-2008), beasiswa BBM (2008), beasiswa dari Alumni Fakultas Kehutanan,
beasiswa Eka Tjipta Foundation (2008-2009), beasiswa BUMN (2010-2011),
penulis bergabung dalam kegiatan, organisasi: Keluarga Mahasiswa JayabayaKediri (KAMAJAYA KEDIRI) (2007-sekarang), Asrama Sylvalestari IPB tahun
2008-2009, dan Ikatan Mahasiswa Jawa Timur (IMAJATIM) (2008-2010), Ikatan
Mahasiswa Kimia (IMASIKA) (2008-2009), aktif dalam Unit Kreativitas
Mahasiswa (UKM): CUA (Chess Unity of Agriculture) (2007-sekarang), Karate
(2007-sekarang), Koperasi Mahasiswa (KOPMA) (2008-2009), dan Perkumpulan
Bahasa Korea (HANSAMO) (2008-2009). Penulis juga berkesempatan menjalani
kegiatan Praktik Lapang di Laboratorium Pengolahan dan Proses di Balai Besar
Industri Agro (BBIA) Bogor Jawa Barat pada tahun 2010.
2
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ vii
DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... vii
PENDAHULUAN ...................................................................................................1
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan ....................................................................................................1
Metode Penelitian ................................................................................................2
Modifikasi Elektrode Pasta Karbon menggunakan Ferosena sebagai
Mediator .......................................................................................................... 2
Imobilisasi Enzim SOD pada Permukaan Elektrode Pasta Karbon
Termodifikasi .................................................................................................. 2
Pengukuran Elektrokimia................................................................................ 2
Penentuan Stabilitas Elektrode........................................................................ 2
Pengoptimuman Konsentrasi SOD ................................................................. 3
Pengukuran aktivitas SOD secara Elektrokimia ............................................. 3
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengoptimuman Aktivitas SOD Terimobilisasi ...................................................3
Penentuan Stabilitas Elektrode.............................................................................4
Penentuan Linearitas Pengukuran Aktivitas SOD ...............................................4
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan ..............................................................................................................5
Saran.....................................................................................................................5
DAFTAR PUSTAKA ..............................................................................................6
LAMPIRAN .............................................................................................................8
3
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Data optimisasi SOD dengan konsentrasi xantina 2,1 mM. ............................. 3
2
Kurva stabilitas antara waktu terhadap aktivitas SOD. ..................................... 4
3
Kurva hubungan antara konsentrasi substrat dengan aktivitas SOD. ............... 4
4
Kurva Linearitas konsentrasi xantina (0,200; 0,225, 0,250; dan 0,275 mM). .. 5
5
Voltamogram linearitas pada konsentrasi xantina 0,200; 0,225, 0,250, dan
0,275 mM. .......................................................................................................... 5
6
Voltamogram siklik untuk bufer fosfat, XO, dan xantina. ............................... 5
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Elektrode rujukan, kerja, pembantu, dan sel elektrokimia, serta alat
potensiostat/galvanostat .................................................................................... 9
2
Bagan alir kerja penelitian secara umum .......................................................... 9
3
Pembuatan elektrode pasta karbon dan imobilisasi enzim (Trivadila 2011) .. 10
4
Optimisasi konsentrasi SOD imobilisasi ........................................................ 11
5
Stabilitas elektrode pasta karbon yang diimobilisasi 10 unit SOD ................. 11
6
Pengaruh konsentrasi xantina terhadap aktivitas SOD imobilisasi................. 11
1
PENDAHULUAN
Pengukuran kapasitas antioksidan dengan
metode in vitro dan in vivo telah banyak
diperkenalkan. Kapasitas antioksidan diukur
melalui efek antioksidan untuk mengontrol
proses oksidasi sehingga pengukuran aktivitas
antioksidan perlu diperhatikan sumber radikal
bebasnya (O’Brien et al. 2007). Antiradikal
bebas (antioksidan) adalah bahan yang dalam
kadar rendah dapat mencegah terjadinya
oksidasi dari substrat yang mudah teroksidasi.
Metode yang umum digunakan untuk
mengukur sifat-sifat antioksidan adalah
spektrofotometri, fluoresensi, kromatografi
gas, kromatografi cairan (Prieto-Simon et al.
2008), voltametri siklik (Kilmartin 2001), dan
biosensor (Campanella et al. 2005).
Metode
spektrofotometri
memiliki
kelemahan, yaitu sulit mengukur pada
konsentrasi tinggi. Pengukuran antioksidan
menggunakan
metode
spektrofotometri
seringkali terkendala terhadap preparasi
sampel, sebagai contoh metode 1,1-difenil-2pikrilhidrazil atau DPPH (Diphenyl Picril
Hydrazil Hydrate) sangat peka terhadap
cahaya sehingga harus dilakukan dalam
kondisi gelap dan sangat dipengaruhi oleh
tingkat kekeruhan. Metode ABTS atau 2,2bis-azino
(asam
3-etil-benzotiazolina-6sulfonat) dan FRAP (Ferric Reducing
Antioxidant Power) juga sangat sensitif
terhadap cahaya bahkan pembentukan ABTS
memerlukan waktu inkubasi selama 12–16
jam dalam kondisi gelap (Tawaha et al. 2007).
Pengukuran kapasitas antioksidan selain
terkendala masalah preparasi sampel, juga ada
beberapa pengukuran yang memerlukan
peralatan yang mahal, seperti Kapasitas
Serapan Radikal Oksigen dengan Fluorescen
atau ORAC-FL (Oxygen Radical Absorbance
Capacity with Fluorescein) dan Kromatografi
Cair Kinerja Tinggi atau HPLC (High
Pressure Liquid Chromathography) (Du et al.
2009). Oleh karena itu dibutuhkan metode
yang lebih tepat, cepat, dan sensitif untuk
mengukur sifat-sifat antioksidan.
Biosensor merupakan suatu piranti yang
memanfaatkan
interaksi
hayati
untuk
mendeteksi analat target (Hartati et al. 2005).
Biosensor mengkombinasikan keunggulan
analisis dari teknik elektrokimia dengan
kespesifikan proses pengenalan hayati untuk
menghasilkan
sinyal
listrik
sebagai
konsentrasi suatu analat (Wang 1994).
Penelitian dan pengembangan biosensor
sangat luas dan multidisiplin mencakup
biokimia, ilmu bioreaktor, kimia fisik,
elektrokimia, elektronik, dan rekayasa
perangkat lunak (Chaplin 2004).
Biosensor
elektrokimia
merupakan
alternatif metode yang dikembangkan untuk
mengukur kapasitas antioksidan. Metode ini
sangat menjanjikan, karena analisisnya cepat,
membutuhkan instrumen yang tidak mahal,
protokol operasi yang sederhana, dan
biayanya rendah (Campanella et al. 2004).
Metode biosensor berbasis enzim superoksida
dismutase (SOD) digunakan untuk menguji
aktivitas suatu sampel yang berpotensi sebagai
antioksidan telah dilakukan oleh Campanella
et al. (2004) dan Trivadila (2011).
Enzim superoksida dismutase merupakan
suatu metaloenzim yang bertindak sebagai
intraseluler utama yang melindungi kerusakan
sel karena radikal superoksida dengan cara
mengkatalisis radikal O2- menjadi hidrogen
peroksida (H2O2) dan oksigen (O2)
berdasarkan reaksi 2O2- + 2H+ → O2 + H2O2
(Kankofer 2002). Pemanfaatan SOD untuk
biosensor antioksidan telah banyak dilakukan.
Hal ini dikarenakan beberapa kelebihan yang
dimiliki oleh SOD, yaitu enzim ini spesifik
mengakatalisis radikal superoksida menjadi
oksigen dan peroksida (Donnely et al. 1989).
Perkembangan biosensor antioksidan berbasis
enzim SOD dengan pengukuran secara
elektrokimia hingga saat ini baru pada tahap
penelitian dan belum terdapat biosensor
antioksidan komersial yang diproduksi.
Penelitian oleh Trivadila (2011) telah
mendapatkan parameter pH dan suhu yang
optimum bagi aktivitas SOD murni yang
berasal dari eritrosit sapi yang diimobilisasi
pada pH 11 dan suhu 20 oC. Namun,
penelitian yang telah dilakukan sebelumnya
belum menentukan konsentrasi enzim SOD
imobilisasi yang optimum sehingga penelitian
ini mengoptimumkan konsentrasi SOD
imobilisasi, linearitas pengukuran, dan juga
stabilitas elektrode enzim yang dihasilkan.
Penelitian bertujuan mengoptimumkan
konsentrasi SOD imobilisasi, menentukan
linearitas pengukuran, dan mengukur stabilitas
elektrode pasta karbon terimobilisasi SOD
yang dihasilkan untuk mengukur aktivitas
SOD.
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan adalah eDAQ
Potentiostat-Galvanostat yang dilengkapi
dengan perangkat lunak Echem v2.1.0,
elektrode Ag/AgCl, badan elektrode, platina,
2
sel elektrokimia (Lampiran 1), peralatan gelas,
tabung mikro, pipet mikro, neraca analitik, pH
meter, dan oven.
Bahan-bahan yang digunakan adalah
superoksida dismutase (SOD), xantina
oksidase (XO), xantina, grafit, ferosena,
dimetil sulfoksida (DMSO), parafin cair,
larutan bufer fosfat pH 11, membran dialisis,
dan jaring nilon.
Metode Penelitian
Metode penelitian ini meliputi, preparasi
elektrode rujukan Ag/AgCl, modifikasi
elektrode pasta karbon, imobilisasi enzim
SOD pada permukaan elektrode pasta karbon,
optimisasi serta stabilitas aktivitas SOD
imobilisasi. Bagan alir penelitian secara
umum dilampirkan pada Lampiran 2.
Modifikasi Elektrode Pasta Karbon
menggunakan Ferosena sebagai Mediator
(Campanella et al. 1997, Ikeda et al. 1998)
Sebanyak 1 mL DMSO digunakan untuk
melarutkan 3 mg ferosena (mediator) dan
campuran ditambahkan 100 mg grafit
kemudian didiamkan selama 2 jam. Setelah 2
jam
didiamkan,
pelarut
diuapkan
menggunakan pengering vakum sehingga
diperoleh grafit termodifikasi mediator. Grafit
termodifikasi kemudian dicampur dengan
parafin cair sampai membentuk pasta dengan
perbandingan campuran 100 mg grafit
termodifikasi dan 35 µL parafin cair. Pasta
karbon yang terbentuk dimasukkan ke dalam
badan elektrode hingga padat sampai
permukaan. Permukaan gelas elektrode
dihaluskan dan dibersihkan dengan amplas
serta kertas minyak (Lampiran 3).
Imobilisasi Enzim SOD pada Permukaan
Elektrode Pasta Karbon Termodifikasi
(Ikeda et al. 1998)
Larutan SOD sebanyak 5 L diteteskan
pada permukaan elektrode pasta karbon
kemudian
didiamkan
agar
pelarutnya
menguap. Selanjutnya permukaan elektrode
dilapisi dengan membran dialisis, ditutup
dengan jaring nilon dan diikat dengan
parafilm. Elektrode kemudian direndam dalam
larutan bufer fosfat 50 mM (pH 11) pada suhu
4 ºC ketika tidak digunakan, untuk
memberikan keadaan yang sama dengan
lingkungan sebenarnya. Elektrode dapat
langsung digunakan untuk pengukuran
aktivitas SOD dengan metode elektrokimia.
Pengukuran Elektrokimia
Pengukuran
elektrokimia
metode
voltametri
siklik
dilakukan
dengan
menggunakan
seperangkat
alat
potensiostat/galvanostat eDAQ dan komputer
beserta perangkat lunak pengolah data Echem
v2.1.0. Elektrode yang digunakan, yaitu
elektrode Ag/AgCl, platina, dan elektrode
pasta karbon-enzim berturut-turut sebagai
elektrode rujukan, counter, dan kerja.
Parameter pengukuran diatur sebagai berikut;
Mode: Cyclic, Initial E: 100 mV, Final E: 100
mV, Rate: 250 mV/s, Step W: 25ms, Upper E:
600 mV, Lower E: 50 mV, dan Range: 10V.
xantina
asam urat
(Campanella 2000).
Radikal superoksida dihasilkan oleh
oksidasi dalam larutan xantin untuk asam urat
dalam enzim xanthine oksidase.
xantina+ H2O + O2
XO
>
asam urat + 2H+ +
2O2•-
Radikal superoksida dihasilkan melalui
reaksi enzimatis xantina dengan xantina
oksidase (XO). Selanjutnya radikal yang
dihasilkan akan didismutasi membentuk O2
dengan katalis SOD melalui reaksi:
2O2•- + 2H+
SOD
>
O 2 + H 2O 2
Larutan bufer fosfat sebanyak 1,9 mL dan
larutan XO 0,1 U/mL sebanyak 100 µL
ditambahkan ke dalam sel pengukuran dan
puncak arus anoda yang terbentuk diamati
sebagai
puncak
blangko.
Selanjutnya
ditambahkan substrat xantina 2,1 mM
sebanyak 1 mL dan diukur kembali perubahan
atau kenaikan puncak arus anode yang terjadi.
Penentuan Stabilitas Elektrode
Stabilitas elektrode ditentukan dari
pengukuran aktivitas enzim SOD setelah
didapatkan kondisi optimum aktivitas SOD
secara langsung melalui pengukuran arus yang
didapat. Pengukuran aktivitas secara langsung
dilakukan pada elektrode yang telah dibuat
dengan imobilisasi enzim SOD pada
permukaan elektrode. Nilai aktivitas yang
diperoleh pada pengukuran awal dianggap
aktivitas 100%. Aktivitas diukur ulang pada
3
Aktivitas SOD (%) =
I saat
aat ke - jam (µA)
× 100 %
I saat
sa awal (µA)
Pengoptimuman Konsen
sentrasi SOD
Optimisasi yang dilak
lakukan untuk aktivitas
SOD murni adalah optimisasi
opt
konsentrasi
SOD pada pH dan suhu optimum
o
(pH 11 dan
suhu 20 ºC). Konsentra
trasi SOD imobilisasi
yang digunakan pada elektrode
ele
pasta karbon
adalah 0,2; 0,5; 1,0; 2,0;; 5,0; 10,0; 20,0; dan
50,0 unit.
Pengukuran
Elektrokimia
aktivitas
itas
SOD
secara
Uji aktivitas dilakuk
ukan dengan variasi
rentang
konsentrasi
substrat
xantina
0,200–0,325 mM (interv
erval 0,05 mM) pada
prosedur elektrokimia se
sebelumnya sehingga
adanya hubungan linear
ar digunakan koefisien
korelasi (r) pada anal
nalisis regresi linear
(y = a + bx).
kan dengan variasi
Linearitas dilakukan
rentang
konsentrasi
substrat
xantina
0,200–0,275 mM (interv
erval 0,05 mM) pada
prosedur pengukuran el
elektrokimia di atas,
kemudian dibuat kurva
rva hubungan antara
konsentrasi substrat xant
ntina dengan aktivitas
SOD murni.
Sebagai parameter adanya
ada
hubungan linier
digunakan koefisien kore
orelasi r pada analisis
regresi linier y = a + bx.. Hubungan
H
linier yang
ideal dicapai jika nilai b = 0 dan r = +1 atau -1
bergantung pada arah gari
aris. Sedangkan nilai a
menunjukkan kepekaan
an analisis terutama
instrumen yang digunakan
kan (Harmita 2004).
Trivadila (2011) dan Wen
eniarti (2011), yaitu
berurutan sebesar 0,12 µA pada konsentrasi
Mn-SOD 701,02 µg/mL dan 0,43 µA pada
konsentrasi SOD 1500 µg/mL, sedangkan
aktivitas SOD murnii yang didapatkan
Trivadila (2011) sebesarr 0,09 µA sehingga
aktivitasnya lebih rend
ndah dibandingkan
dengan aktivitas yang
ng didapat dalam
penelitian ini.
Perbedaan hasil inii dapat disebabkan
karena adanya perlakuann yang berbeda saat
penyimpanan elektrode pasta
pa
karbon-enzim.
Elektrode disimpan dala
alam larutan bufer
pH 11. Nilai Penyimpanan
an pada kondisi yang
berbeda ini menyebabkan
an hasil pengukuran
yang
berbeda.
Penga
garuhnya
terhadap
pengukuran aktivitas SOD
D pada elektrode agar
memberikan keadaan yang
ng sama ketika tidak
digunakan dengan saat peng
engukuran.
Gambar 1 memperliha
hatkan secara umum
semakin besar konsentra
trasi SOD, semakin
besar kenaikan arus dan aktivitas
a
maksimum
yang dihasilkan, serta sem
semakin cepat waktu
yang dibutuhkan aruss untuk mencapai
maksimum. Hasil peng
engamatan aktivitas
konsentrasi
SOD
dib
ibawah
10
unit
menunjukkan
arus
bbelum
mencapai
maksimum.
2.5
2
Irerata (µA)
tiap kurun waktu tertentu
ntu dan aktivitas yang
tersisa diukur.
1.5
1
0.5
0
0,2 0,5
1,0 2,0
5
5,0
10,0 20,0
50,0
HASIL DAN PEM
EMBAHASAN
waktu (jam
am)
Pengoptimuman Aktivitas
A
SOD
Terimobil
bilisasi
isasi SOD dengan
Gambar 1 Data optimisa
konsentrasi xant
antina 2,1 mM.
Pengoptimuman aktivi
tivitas SOD imobilisasi
untuk kerja optimum SOD
OD ditentukan dengan
menggunakan
metod
tode
elektrokimia.
Konsentrasi optimisasii SOD murni yang
digunakan adalah 0,2; 0,5
0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0;
20,0; dan 50,0 unit pada
da larutan bufer fosfat
pH 11, suhu 20 oC. Konsentrasi SOD
memiliki nilai konsentras
trasi optimum 10 unit,
karena arus rerata memil
iliki nilai terbesar dan
nilai koefisien variasi berada
ber
pada persentase
dibawah 10% sebesar 3,99%.
3
Arus puncak
oksidasi pada konsentrasi
asi SOD optimum 10,0
unit sebesar 2,371 µA (Lampiran
(La
4). Hasil ini
lebih tinggi dari yan
ang dihasilkan oleh
Berdasarkan hasil pengukuran, arus
konsentrasi SOD pada 0,2
0
dan 0,5 unit
memiliki koefisien varias
iasi (KV) dan arus
rerata (Irerata) negatif
if setiap ulangan
pengukuran. Artinya pada
da 0,2 dan 0,5 unit
aktivitasnya tidak ada atau
au sangat kecil. Irerata
terbesar dihasilkan ketikaa kkonsentrasi SOD 10
unit, yaitu sebesar 2,371
710 µA. Jadi dapat
disimpulkan bahwa konse
nsentrasi SOD yang
optimum sebesar 10,0 unit
nit. Konsentrasi SOD
yang lebih besar dari 10
10,0 unit mengalami
penurunan aktivitas. Arus
rus puncak oksidasi
tertinggi dihasilkan dala
alam waktu respon
4 detik. Waktu respon ini
in lebih baik dari
4
waktu respon rata-rata pada
biosensor urea
p
berbasis membran khitin
itin, yakni 3-6 menit
(Nazaruddin 2007) sedangkan
se
biosensor
elektrokimia untuk deteks
eksi urutan DNA tanpa
indikator hibridisasi wakt
aktu responnya sebesar
20 menit agar diperoleh
eh deteksi pada DNA
target (Hartati et al. 2007)
07).
Berbagai macam tekni
knik immobilisasi telah
digunakan, meliputi adsor
sorpsi pada penyangga
padat (Yao et al. 2007, Wang et al. 2009),
pengikatan kovalen (Kun
unzelmann & Botther
2007, Wu et al. 1999)) dan pemerangkapan
dalam polimer (Fei et al.
l. 2003, Li et al. 2004,
Pan et al. 2005, Hiratsuka
ka et al. 2008). Sol-gel
menawarkan metode untu
ntuk mengimmobilisasi
biomolekul agar dapat me
menunjukkan aktivitas
fungsional biomolekull yang terselubungi
dengan matriks yang ber
berpori (Coradin et al.
2006, Gupta et al. 2007)
07). Nur et al. (2010)
mengembangkan teknikk immobilisasi enzim
kedalam silica gel dengan
an teknik sol-gel untuk
membentuk sensor sebaga
agai lapisan tipis yang
dapat
dipasangkan
dengan
teknik
elektrokimia.
berturut-turut. Arus meningkat
m
secara
signifikan, yaitu sebesa
esar lebih kurang
0,398 µA dan mencapai puncak
pu
dalam waktu
10 jam dan cenderung turu
run hingga mencapai
waktu 168 jam.
Salah satu faktor penentu
p
kestabilan
elektrode adalah kestabilan
lan aktivitas enzim itu
sendiri. Proses imobilis
ilisasi enzim pada
permukaan
elektrode
diketahui
dapat
meningkatkan kestabilan enzim.
en
Menurut Nur
et al. (2010) imobilisasi enzim
enz metode sol gel,
enzim yang telah berha
rhasil diimmobilisasi
mempunyai aktivitas dan
da stabilitas yang
cukup bagus sehingga dapa
apat digunakan untuk
aplikasi biosensor.
Berdasarkan hasil pengujian
pe
diperoleh
kondisi stabil elektrode dari
dar pengukuran SOD
setelah 72 jam inkubasi pada
pa elektrode pasta
karbon dengan enzim SOD
D imobilisasi karena
aktivitas SOD (dalam 10-3 A) dari 0 jam
sampai dengan 72 jam tidak
tid berbeda secara
signifikan namun aktivitas
tas SOD turun secara
drastis setelah 72 jam.
Penentuan Linearitas
itas Pengukuran
Aktivitass SOD
S
Penentuan Stabilit
ilitas Elektrode
400
Setelah diperoleh kondisi
k
optimum,
elektrode pasta karbon-SOD
OD digunakan untuk
mengukur aktivitas SOD imobilisasi dengan
variasi substrat xantina,, sehingga
s
diperoleh
hubungan antara konsentra
trasi substrat dengan
aktivitas SOD Gambar 3.. Konsentrasi
K
xantina
yang digunakan, yaitu antara
a
0,200–0,325
mM.
350
300
Aktivitas SOD (µA)
Aktivitas SOD (dalam 10 -3 µA)
Stabilitas elektrode
de ditentukan dari
pengukuran aktivitas en
enzim SOD setelah
didapatkan kondisi optim
timum aktivitas SOD
secara langsung melaluii ppengukuran arus yang
didapat. Stabilitas elek
lektrode digambarkan
sebagai
hubungan
w
waktu dan arus,
ditunjukkan dalam Gamba
bar 2.
250
200
150
100
50
0
0
2
10 24
waktu (jam)
48
72
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0.175
120 168
0.200
0.225 0.250
[xantina]
a] ((mM)
0.275
0.300
waktu
Gambar 3 Kurva hubungan
gan antara konsentrasi
substrat dengan
an aktivitas SOD.
Arus puncak oks
ksidasi pada saat
pengukuran awal (waktu
ktu untuk jam ke-0)
dikondisikan 100%. K
Kestabilan elektrode
untuk 72 jam sebesar 85
85,68% dan semakin
menurun sampai 4,52%
2% untuk 168 jam.
Pengukuran dilakukan sebanyak
s
6 ulangan
pada hari yang sama (intr
intraday) dan pada hari
yang berlainan (interda
rday) selama 5 hari
Hubungan
linear
diperoleh
ketika
konsentrasi
xantina
00,200–0,275
mM
(Gambar 4). Kurva yangg dihasilkan
d
memiliki
persamaan garis y = -2,27
2700 + 13,400x dan
R2 = 95,28%. Berdasarka
rkan hasil pengujian,
diperoleh koefisien regres
resi untuk linearitas
sebesar 0,9761. Menurut
ut ICH (1995 diacu
dalam Chan 2004), nilai ini hampir memenuhi
syarat yang ditetapkan, yaitu
y
0,9970. Nilai
Gambar 2 Kurva stabili
bilitas antara
terhadap aktivi
tivitas SOD.
5
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0.175
y = 13,4400x - 2,2700
r = 0,9761
-5
2,0x10
-5
1,5x10
-5
1,0x10
-6
5,0x10
0,0
-6
-5,0x10
-5
-1,0x10
-5
-1,5x10
-5
-2,0x10
-5
-2,5x10
-5
-3,0x10
-5
-3,5x10
-5
-4,0x10
-5
-4,5x10
-5
-5,0x10
0,0
0.200
0.225 0.250
[xantina] (mM)
0.275
0.300
Gambar 4 Kurva
Linearitas
konsentrasi
xantina (0,200; 0,225, 0,250; dan
0,275 mM).
Linearitas dinyatakan dengan koefisien
korelasi (r). Nilai koefisien korelasi yang
tinggi menunjukkan hubungan yang linear
antara konsentrasi xantina dengan aktivitas
SOD. Gambar 6 menyajikan voltamogram
siklik pada konsentrasi persamaan linearitas
tersebut.
3
2
1
0
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-7
-8
-9
-10
-11
0.0
yang semakin jauh dari nol disebabkan oleh
semakin besarnya pengaruh matriks dalam
substrat. Hal ini dapat mengganggu penentuan
aktivitas SOD dalam variasi konsentrasi
xantina sebagai substrat.
I (A)
Aktivitas SOD ( A)
koefisien yang tinggi menyatakan bahwa
kenaikan konsentrasi, akan memberikan
kenaikan arus yang sebanding. Semakin besar
konsentrasi xantina maka aktivitas SOD
semakin tinggi pada rentang konsentrasi
xantina 0,200–0,275 Mm (Lampiran 6),
sedangkan konsentrasi xantina lebih dari
0,275 mM mengalami penurunan aktivitas
SOD.
0.200Unit
0.225Unit
0.250Unit
0.275Unit
Buferfosfat
XO
xantina
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
E (V) vs Ag/AgCl
Gambar 6 Voltamogram siklik untuk bufer
fosfat, XO, dan xantina.
Konsentrasi xantina yang digunakan pada
kurva linearitas sebesar 0,200; 0,225, 0,250;
dan 0,275 mM. Kisaran linear yang diperoleh
dalam penelitian ini lebih kecil dibandingkan
dengan penelitian Trivadila (2011), dalam
teknik imobilisasi yang sama, hasil kisaran
yang diperoleh lebih besar, yaitu 0,1–0,7 mM.
Menurut Campanella et al. (2000), persamaan
kurva linear y = (328,9 ± 6,4)x – (2,3 ± 1,3)
dengan koefisien korelasi 0,9761 dengan
kisaran variasi rentang konsentrasi substrat
xantina 0,02–2,00 mM. Artinya hasil pada
penelitian ini memiliki koefisien korelasi yang
lebih sempit dengan hasil pada Campanella et
al. sehingga pada penelitian ini dapat
dikatakan baik.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
E (V) vs Ag/AgCl
Gambar 5 Voltamogram linearitas pada
konsentrasi xantina 0,200; 0,225,
0,250, dan 0,275 mM.
Linearitas juga dapat diketahui dari
kemiringan garis, intersep, dan residual
(Ermer & Miller 2005). Berdasarkan hasil
pengujian didapat persamaan regresi linear
untuk kurva garis y = -2,2700 + 13,400x.
Berdasarkan persamaan tersebut didapat nilai
intersep (a) sebesar -2,2700. Nilai intersep
Konsentrasi SOD imobilisasi yang
optimum pada pH 11 dengan suhu 20 oC
adalah konsentrasi 10 unit. Kurva linearitas
konsentrasi xantina sebesar 0,200; 0,225,
0,250; dan 0,275 mM didapatkan persamaan
garis y = -2,2700 + 13,400x dengan r = 0,9761
dan R² = 95,28%. Elektrode akan stabil bila
disimpan dalam larutan bufer pH 11 pada
suhu 20 oC selama 72 jam.
Saran
Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk
meningkatkan kevalidan metode dan keajegan
metode analisis melalui pendekatan metode
dengan parameter yang lain.
6
DAFTAR PUSTAKA
Campanella L, Favero G, Tomasetti M. 1997.
A modified amperometric electrode for
the determination of free radical. Sens.
Actators B 44:559–565.
Campanella L, Favero G, Persi L, Tomassetti
M. 2000. Evaluation of radical
scavenging properties of several plants,
fresh or from a herbalist’s, using a
superoxide
dismutase
biosensor.
Pharmaceutical and Biomedical Analysis
24: 1055–1064.
Campanella L, Bonanni A, Finotti E,
Tomassetti M. 2004. Biosensors for
determination of total and natural
antioxidant capacity of red and white
wines:
comparison
with
other
spectrophotometric and
fluorimetric
methods. Biosensors and Bielectronics
19: 641–651.
Campanella L, Martini E, Tomasetti M. 2005.
Antioxidant capacity of the algae using a
biosensor method. Talanta 66: 902–911.
Chaplin M. 2004. Apa biosensor?. [terhubung
berkala].
http://www.lsbu.
ac.uk/biology/enztech/biosensors.html.
[24 Januari 2011].
Coradin T, Boissierre M, Livage J. 2006. SolGel Chemistry in Medicinal Science.
Current Medicinal Chemistry 13: 99–108.
Donnelly JK, Mc Lellan KM, Walker JL,
Robinson
DS.
1989.
Superoxide
Dismutase in Foods. A Review. J Food
Chem. 33: 243-270.
Du G, Li M, Ma F, Liang D. 2009.
Antioxidant capacity and the relationship
with polyfenol and Vitamin C in
Actinidia fruits. J. Foodchem 113: 557–
562.
Ermer J, Miller JH, editor. 2005. Method
Validation in Pharmaceutical Analysis.
Weinheim: Wiley-VCH.
Fei J, Wu Y, Ji X, Wang J, Hu S, Gao Z.
2003. An Amperometric Biosensor for
Glucose Based on Electrodeposited
Redox polymer/Glucose Oxidase Film on
a Gold Electrode. Analitical sciences, 19.
Gupta R, Chaudhury NK. 2007. Entrapment
of Biomolecules in Sol-Gel Matrix for
Applications in Biosensors: Problems and
Future Prospects. Biosensors and
Bioelectronics, 22p: 2387–2399.
Harmita. 2004. Petunjuk pelaksanaan validasi
metode dan cara perhitungannya.
Majalah Ilmu Kefarmasian 1: 117–135.
Hartati YW, Rochani S, Bahti HH, Agma M.
2005. Biosensor elektrokimia untuk
deteksi urutan DNA tanpa indikator
hibridisasi. [Seminar]. Bandung: Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Padjadjaran.
Hartati YW, Rochani S, Bahti HH, Agma M.
2007. Elektrokimia untuk Deteksi Urutan
DNA Tanpa Indikator Hibridisasi.
[Seminar].
Bandung:
Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Padjadjaran.
Hattu N. 2009. Studi voltametri dan analisis
antihistamin setirizin dihidroklorida dan
deksklorfeniramin maleat dalam medium
surfaktan menggunakan elektroda pasta
karbon. [Disertasi]. Bandung: Program
Studi Kimia, Institut Teknologi Bandung.
Hiratsuka A, Fujisawa K, Muguruma H. 2008.
Amperometric Biosensor based on
Glucose Dehydrogenase and Plasmapolymerized Thin Films. Analitical
sciences, 24.
Huda M, Kurniawan F, Suprapto. 2010.
Pembuatan
elektrode
pembanding
Ag/AgCl dengan menggunakan membran
komposit
karbon-rotan.
[Prosiding
Skripsi]. Surabaya: Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut
Teknologi Sepuluh Nopember.
[ICH]
International
Conference
on
Harmonization. 1995. Validation of
Analytical Prosedures: Methodology Q2B
[terhubung
berkala].
www.ich.org.
[20 Maret 2011].
Ikeda et al. 1998. Electrochemical monitoring
of in vivo recronstitution of glucose
dehydrogenase in Escherichia coli cells
with externally added pyrroloquinoline
quinone.
J.
Electroanal.
Chem
449: 219–224.
7
and
in
and
Vet
Tawaha K, Alali FQ, Gharaibeth M,
Mohammad M, El-Elimat T. 2007.
Antioxidant activity and total phenolic
content of selected Jordanian plant
species. J. Foodchem 104: 1372–1378.
Kilmartin
PA.
2001.
Electrochemical
detection
of
natural
antioxidant:
principles and protocol. Antioxidant &
redox signaling. Marry Ann Lieb Inc.
Trivadila. 2011. Biosensor antioksidan
menggunakan superoksida dismutase
Deinococcus
radiodurans
yang
diimobilisasi pada permukaan elektrode
pasta karbon dan parameter kinetikanya.
[Tesis]. Bogor: Fakultas Matematika dan
Ilmu
Pengetahuan
Alam,
Institut
Pertanian Bogor.
Kankofer M. 2002. Superoxide dismutase
glutathione peroxidase activities
bovine placenta: spectrophotometric
electrophoretic analysis. Revue Med
153: 121–124.
Kunzelmann U, Bottcher H. 1997. Biosensor
Properties
of
Glucose
Oxidase
Immobilized within SiO2 gels. Sensors
and Actutors, 38–39: 222–228.
Li CX, Deng KQ, Shen GL, Yu RQ. 2004.
Amperometric
Hydrogen
Peroxide
Biosensor Based on Horse Peroxidase
labeled Nano-Au Colloids Immobilized
on Poly (2,6-pyridinedicarboxylic acid)
Layer by Cysteamine. Analytic Sciences
20: 1277–1281.
Nazaruddin. 2007. Biosensor Urea Berbasis
Biopolimer Khitin sebagai Matriks
Immobilisasi. Jurnal Rekayasa Kimia dan
Lingkungan 6: 41–44.
Nur A, Dhini SUW, Febriana Y, Setyawan H.
2010 immobilisasi enzim glucose oxidase
(god) dan horse radish peroxidase (hrp)
untuk aplikasi biosensor dengan metode
sol-gel. Seminar Rekayasa Kimia dan
Proses. Surabaya: Fakultas Teknologi
Industri, Institut Teknologi Sepuluh
Nopember.
O’Brien KB, Killoran SJ, O’Neill RD,
Lowrya JP. 2007. Development and
characterization in vitro of a catalasebased biosensor for hydrogen peroxide
monitoring.
Biosensors
and
Bioelectronics 22: 2994–3000.
Pan D, Chen J, Yao S, Tao W, Nie L. 2005.
An Amperometric Glucose Biosensor
Based on Glucose Oxidase Immobilized
in
Electropolymerized
Poly
(oaminophenol) and Carbon Nanotubes
Composite Film on a Gold Electrode.
Analitic Sciences 21p: 367–371.
Prieto-Simon B, Cortina M, Campas M,
Calas-Blanchard
C.
2008.
Electrochemical biosensor as a tool for
antioxidant capacity assessment. Sens
Actuators B 129: 459–466.
Wang J. 1994. Analytical Electrochemistry.
New York: VCH.
Wang K, et al. 2009. Direct Electrochemistry
and Electrocatalysis of Glucose Oxidase
Immobilized on Glassy Carbon Electrode
Modified by Nafion and Ordered
Mesoporous. Journal of molecular
Catalysis B: Enzymatic 58: 194–198
Weniarti. 2011. Biosensor antioxidant
berbasis superoksida dismutase dari
mikroba Indonesia yang diimobilisasi
dalam
nanokomposit
zeolit
alam
Indonesia. [Tesis]. Bogor: Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Institut Pertanian Bogor.
Wu J, Suls J, Sansen W. 1999. Amperometric
Glucose sensor with Enzyme Covalently
Immobilized by Sol-Gel Technology.
Analitical science 15.
Yao K, Zhu Y, Wang P, Yang X, Cheng P, Lu
H. 2007. ENFET Glucose Biosensor
Produced with Mesoporous Silica
Microspheres. Materials Science and
Engineering C 27p: 736–740.
8
LAMPIRAN
9
Lampiran 1
Elektrode rujukan, kerja,
potensiostat
tat/galvanostat
pembantu,
dan
sel
elektrok
okimia,
serta
alat
(a) Elektrode rujuka
ukan, kerja, pembantu,
dan sel elektrokim
kimia.
nsiostat/galvanostat
(b) Seperangkat alat potensi
ke penelitian secara umum
Lampiran 2 Bagan alir kerja
Preparasi elektro
trode pendukung Ag/AgCl dan elektrode pasta karbon serta
se
modifikasi grafit dengan mediator
Im
Imobilisasi
SOD pada elektrode pasta karbon
Elektrode pasta karbon–SOD
Optimisasi konsentrasi SOD
Linearitas
Pengukuran elektrokimia
Stabilitas &aktivitas
&
SOD imobiliasasi
10
Lampiran 3 Pembuatan elektrode pasta karbon dan imobilisasi enzim (Trivadila 2011)
parafin cair : grafit (1 : 2)
campuran digerus
pasta karbon
dimasukkan ke dalam badan elektrode
hingga padat sampai permukaan
permukaan karbon dihaluskan
dengan kertas minyak
pipet mikro
5 µL enzim SOD diimobilisasi
pada permukaan elektrode
pelarut diuapkan
permukaan elektrode dilapisi
dengan membran dialisis
tutup dengan jaring nilon dan
ikat dengan parafilm
elektrode disimpan dalam
larutan bufer fosfat pH 11
dengan suhu 20 oC
11
Lampiran 4 Optimisasi konsentrasi SOD imobilisasi
Konsentrasi SOD
(unit)
0,2
0,5
1,0
2,0
5,0
10,0
20,0
50,0
∆Ipa
(µA)
-0,3977
-0,3583
0,4627
1,5845
1,5655
2,3710
0,3310
0,2445
Lampiran 5 Stabilitas elektrode pasta karbon yang diimobilisasi 10 unit SOD
Waktu
(jam)
0
2
10
24
48
72
120
168
Aktivitas SOD
∆I( A
(%)
0,360
0,375
0,398
100,00
0,369
92,71
0,359
90,20
0,341
85,68
0,191
47,99
0,018
4,52
Lampiran 6 Pengaruh konsentrasi xantina terhadap aktivitas SOD imobilisasi
[Xantina]
(mM)
Aktivitas
SOD (μA)
0,200
0,225
0,250
0,275
0,481
0,660
1,089
1,458
12