Aktivitas Ekstrak Etanol Temu Ireng (Curcuma Aeruginosa Roxb.) Sebagai Antiproliferasi Pada Sel Lestari Tumor Mcm/Ipb-B3 Dan K562.
AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL TEMU IRENG
(Curcuma aeruginosa Roxb.) SEBAGAI ANTIPROLIFERASI
PADA SEL LESTARI TUMOR MCM/IPB-B3 DAN K562
FITRI HARDIANI FATHONAH
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan skripsi berjudul Aktivitas Ekstrak Etanol Temu
Ireng (Curcuma aeruginosa Roxb.) sebagai Antiproliferasi pada Sel Lestari
Tumor MCM/IPB-B3 dan K562 adalah benar karya saya dengan arahan dari
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan
tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2015
Fitri Hardiani Fathonah
NIM B04100127
ABSTRAK
FITRI HARDIANI FATHONAH. Aktivitas Ekstrak Etanol Temu Ireng (Curcuma
aeruginosa Roxb.) sebagai Antiproliferasi pada Sel Lestari Tumor MCM/IPB-B3
dan K562. Dibimbing oleh EVA HARLINA dan BAMBANG PONTJO
PRIOSOERYANTO.
Pengobatan tumor secara konvensional menimbulkan imunosupresi dan efek
samping lainnya sehingga memberikan peluang bagi pertumbuhan tumor yang
progresif dan rekurens. Obat tradisional dapat menjadi alternatif dalam
pengobatan tumor. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas
antiproliferasi ekstrak etanol temu ireng terhadap sel lestari tumor MCM/IPB-B3
dan K562 secara in vitro. Konsentrasi ekstrak etanol temu ireng yang digunakan
adalah 0 ppm (kontrol negatif), 12.5 ppm (P1), 25 ppm (P2), 37.5 ppm (P3), dan 50
ppm (P4). Sebagai kontrol positif digunakan doxorubicin. Pemanenan sel
dilakukan setelah confluence, yaitu pada hari ke tiga dan dilakukan penghitungan
jumlah seluruh sel menggunakan hemositometer Neubauer. Data yang diperoleh
dianalisis menggunakan ANOVA dan Duncan. Hasil penelitian menunjukkan
bahwa ekstrak etanol temu ireng memiliki daya penghambatan tertinggi pada
konsentrasi 50 ppm sebesar 63.33% pada sel lestari tumor (MCM/IPB-B3) dan
74.59% pada sel lestari tumor (K562). Hasil tersebut menunjukkan bahwa ekstrak
etanol temu ireng berpotensi untuk dikembangkan menjadi senyawa antitumor.
Kata kunci: antiproliferasi, ekstrak temu ireng, in vitro, K562, MCM/IPB-B3,
tumor
ABSTRACT
FITRI HARDIANI FATHONAH. Ethanol Extract of Temu Ireng (Curcuma
aerugnosa Roxb.) as Antiproliferation on MCM/IPB-B3 and K562 Cell Lines.
Supervised by EVA HARLINA and BAMBANG PONTJO PRIOSOERYANTO.
Conventional treatment on tumor cause immunosupression and other side
effect which provide opportunities for progressive tumor growth or recurrent.
Traditional medicine can be an alternative medicine for tumor treatment. The aim
of this research is to study the antiproliferation activities of ethanol extract of
temu ireng on MCM/IPB-B3 and K562 tumor cell lines by in vitro culture. The
concentration of ethanol extract of temu ireng were 0 ppm (negative control), 12.5
ppm (P1), 25 ppm (P2), 37.5 ppm (P3), and 50 ppm (P4) and as a positive control
was doxorubicin. The cells culture were harvested after three days or confluence
and all cells were counting by hemocytometer Neubauer. The data was analyzed
by ANOVA and Duncan. The result showed that ethanol extract of temu ireng had
the highest inhibitory effect on 50 ppm concentration both cell lines with
inhibitory activity were 63.33% (MCM/IPB-B3) cell line and 74.59% for (K562)
cell line. Based on those result concluded that ethanol extract temu ireng was
potentially develop as an antitumor.
Keywords: antiproliferation, in vitro, K562, MCM/IPB-B3, temu ireng extract,
tumor
AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL TEMU IRENG
(Curcuma aeruginosa Roxb.) SEBAGAI ANTIPROLIFERASI
PADA SEL LESTARI TUMOR MCM/IPB-B3 DAN K562
FITRI HARDIANI FATHONAH
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Kedokteran Hewan
pada
Fakultas Kedokteran Hewan
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Agustus 2014 ini ialah
tumor, dengan judul Aktivitas Ekstrak Etanol Temu Ireng (Curcuma aeruginosa
Roxb.) sebagai Antiproliferasi pada Sel Lestari Tumor MCM/IPB-B3 dan K562.
Terima kasih penulis ucapkan kepada ayahanda Lenur Komar, ibunda Titin
Kustinah, serta seluruh keluarga atas segala doa dan kasih sayangnya. Ungkapan
terima kasih juga disampaikan kepada Ibu Dr Drh Eva Harlina, MSi, APVet dan
Bapak Prof Drh Bambang Pontjo Priosoeryanto, MS, Ph.D, APVet selaku
pembimbing skripsi. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Dr Drh Elok
Budi Retnani, MS selaku dosen pembimbing akademik yang telah membimbing
dan memberi nasihat positif.
Penghargaan penulis sampaikan kepada teman satu penelitian Ansenora
Bekris dan Faizal Rafiq, teman-teman Ganglion, serta sahabat terbaik penulis
Sefi, Dwi, Asa, Nadia, Nova, Mayah, Sinta, Firman, Danu, Abel, Gerard, Sri,
Ulfah, Benli, dan Faisal.
Penulis menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini masih terdapat
kekurangan, namun penulis berharap semoga skripsi ini bermanfaat.
Bogor, September 2015
Fitri Hardiani Fathonah
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vii
DAFTAR GAMBAR
vii
DAFTAR LAMPIRAN
vii
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Perumusan Masalah
1
Tujuan Penelitian
2
Manfaat Penelitian
2
TINJAUAN PUSTAKA
2
Tumor
2
Biakan Sel Lestari Tumor
2
Temu Ireng
3
Doxorubicin
4
Kematian Sel
5
METODE
6
Tempat dan Waktu Penelitian
6
Alat dan Bahan
7
Metode Penelitian
7
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penurunan Jumlah Sel Lestari Tumor MCM/IPB-B3 dan K562
8
8
Aktivitas Penghambatan (Antiprolifersi) Ekstrak Etanol Temu Ireng terhadap
Sel Lestari Tumor MCM/IPB-B3 dan K562
9
SIMPULAN DAN SARAN
13
Simpulan
13
Saran
13
DAFTAR PUSTAKA
13
LAMPIRAN
16
RIWAYAT HIDUP
17
DAFTAR TABEL
1 Aktivitas antiproliferasi ekstrak etanol temu ireng
pertumbuhan sel lestari tumor MCM/IPB-B3 dan K562
terhadap
10
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
Tanaman temu ireng dan rimpang temu ireng yang berkhasiat obat
Mekanisme kerja doxorubicin pada sel kanker
Mekanisme apoptosis melalui jalur ekstrinsik
Mekanisme apoptosis melalui jalur intrinsik
Skema hemositometer Neubauer
Penurunan jumlah sel lestari tumor MCM/IPB-B3 dan K562
Mekanisme kerja kurkumin pada sel tumor
3
4
5
6
8
9
11
DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil uji statistik sidik ragam ANOVA terhadap
penghambatan pertumbuhan sel lestari tumor MCM/IPB-B3
2 Hasil uji statistik wilayah berganda Duncan terhadap
penghambatan pertumbuhan sel lestari tumor MCM/IPB-B3
3 Hasil uji statistik sidik ragam ANOVA terhadap
penghambatan pertumbuhan sel lestari tumor K562
4 Hasil uji statistik wilayah berganda Duncan terhadap
penghambatan pertumbuhan sel lestari tumor K562
aktivitas
16
aktivitas
16
aktivitas
16
aktivitas
16
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tumor merupakan salah satu penyakit yang sering menyerang hewan piara
khususnya anjing. Selain tingkat kejadian yang cukup tinggi (mencapai 22%),
jenis tumor yang menyerang sangat beragam dengan tingkat keparahan penyakit
yang berbeda-beda (Priosoeryanto et al. 2000). Penyakit tumor atau neoplasma
merupakan salah satu masalah dalam dunia medis yang sangat penting untuk
segera ditangani. Penyebab tumor sangat bervariasi dan sangat kompleks sehingga
dalam penanganannya sangat sulit, apalagi biasanya penyakit diketahui sudah
mencapai stadium lanjut (Priosoeryanto et al. 2008).
Pengobatan tumor yang telah dilakukan diantaranya pembedahan,
cryosurgery, radioterapi, kemoterapi, terapi hormonal, imunoterapi, inhibitor
angiogenesis, dan metode lainnya seperti hipertermia (terapi panas) serta
fototerapi (terapi cahaya) (Sari 2008). Cara pengobatan kemoterapi dan radiasi
menurut Priosoeryanto et al. (2000) memiliki beberapa kelemahan antara lain sifat
toksiknya dapat menurunkan fungsi organ-organ tubuh. Oleh karena itu obat
tradisional dapat menjadi pilihan yang baik dalam pengobatan tumor. Hal ini
dikarenakan obat tradisional kurang memiliki efek samping dibandingkan obatobatan kimia. Selain itu obat tradisional juga mudah diperoleh dan dapat diramu
sendiri (Nugrahaningtyas et al. 2005). Depkes RI (1981) mendefinisikan obat
tradisional merupakan bahan-bahan obat yang berasal dari tumbuhan, hewan,
maupun bahan-bahan mineral.
Indonesia merupakan salah satu negara yang memiliki kekayaan alam yang
sangat besar, termasuk didalamnya adalah berbagai tanaman obat. Depkes RI
(1981) mengindikasikan bahwa dari sekitar 326 perusahaan di Indonesia yang
bergerak dalam bidang farmasi, kosmetik dan makanan, menggunakan 180 jenis
tanaman. Jumlah total bahan baku yang digunakan kurang lebih sebanyak 6.223
ton. Depkes RI (1981) juga mencatat terdapat 45 jenis obat penting di Amerika
yang berasal dari tanaman, dan 18 jenis diantaranya berasal dari Indonesia. Temu
ireng (Curcuma aeruginosa Roxb.) merupakan salah satu dari sekian banyak
tanaman obat tradisional Indonesia. Temu ireng dipilih menjadi salah satu obat
tradisional untuk alternatif pengobatan tumor karena berkhasiat sebagai
antiradang, antibakteri, pembersih darah, antikoagulan, tonikum, pelindung hati
(hepatoprotektor), antibiotik, dan antineoplastik (antikanker).
Perumusan Masalah
Pengobatan tumor secara konvensional menyebabkan imunosupresi dan
efek samping lainnya, sehingga memberikan peluang bagi tumor untuk tumbuh
progresif dan rekurens.
2
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari aktivitas antiproliferasi ekstrak
etanol temu ireng terhadap sel lestari tumor MCM/IPB-B3 dan K562 secara in
vitro.
Manfaat Penelitian
Pengetahuan tentang aktivitas antiproliferasi ekstrak etanol temu ireng
terhadap sel lestari tumor MCM/IPB-B3 dan K562 akan bermanfaat sebagai dasar
untuk mempelajari khasiat temu ireng dalam mengatasi tumor.
TINJAUAN PUSTAKA
Tumor
Tumor atau neoplasma diartikan sebagai suatu gangguan pertumbuhan
dengan karakteristik proliferasi sel yang berlebihan, abnormal dan tidak terkontrol
dari sel yang mengalami transformasi atau perubahan pada satu atau lebih tempat
utama dalam tubuh inang, dan umumnya disertai dengan metastasis atau
penyebaran ke bagian lain dari tubuh inang (Priosoeryanto et al. 2008). Aliza et
al. (2011) mendefinisikan tumor sebagai penyakit yang disebabkan adanya
pertumbuhan sel-sel yang telah kehilangan daya aturnya dengan menyerang
berbagai macam sel, jaringan, ataupun organ.
Penyebab tumor sangat kompleks, hal ini berkaitan dengan paparan agen
karsinogen, kokarsinogen lingkungan, dan faktor predisposisi inang
(Priosoeryanto et al. 2002). Menurut Pinilih (2006), penyebab tumor dapat
dibedakan menjadi faktor intrinsik dan ekstrinsik. Faktor intrinsik meliputi usia,
diet, dan hormon. Faktor ekstrinsik dapat berasal dari lingkungan seperti agen
biologik, fisik, dan kimia.
Beberapa cara pengobatan kanker yaitu dengan operasi (pembedahan),
radiasi, chemotherapy, dan cancer immunotherapy (Pinilih 2006). Priosoeryanto
et al. (2000) menyatakan bahwa cara pengobatan dengan menggunakan
kemoterapi dan radiasi memiliki beberapa kelemahan antara lain karena sifat
toksiknya dapat menurunkan fungsi fisiologik organ-organ tubuh.
Biakan Sel Lestari Tumor
Sel lestari tumor adalah sel yang berasal dari tumor atau jaringan yang
sudah dibiakkan secara berkala, ditumbuhkembangkan dan dipelihara serta
disimpan dalam nitrogen cair. Keistimewaan dari sel lestari adalah sifatnya yang
immortal karena dapat hidup pada kondisi media yang minimal (Suindra 2005).
Sel MCM/IPB-B3 merupakan sel lestari tumor hasil rekayasa dari sel
MCM-B2 yang telah dihilangkan enzim thymidine kinasenya, yaitu enzim yang
berhubungan dengan regulasi, katalitik dan struktur gen, dan berfungsi sebagai
3
pasokan metabolik. Sel MCM-B2 diisolasi dari benign mixed tumor kelenjar
mamari anjing pemburu betina berumur 10 tahun, dengan cara pembedahan,
dengan massa tumor berukuran 3 cm x 5 cm. Beberapa penemuan menunjukkan
adanya kemungkinan bahwa sel lestari tumor ini berasal dari sel induk (stem cell)
atau sel atipikal. Sel lestari ini digunakan sebagai model untuk mempelajari
diferensiasi dan proliferasi sel pada tumor mamari anjing (Priosoeryanto et al.
1995). Secara mikroskopis kultur sel menunjukkan koloni monolayer. Di dalam
matriks gel kolagen, sel tumbuh membentuk koloni tiga dimensi berukuran besar
dengan pola bercabang. Nukleus besar, organel-organel intrasitoplasmik dan
filamen-filamen intermediet yang bervariasi diantara sel terlihat dengan
pemeriksaan sitoplasmik. Sel tumor ini memiliki jumlah kromosom abnormal.
Secara histologis, hasil transplantasi tumor dari sel kultur serupa dengan
karsinoma anaplastik.
Sel K562 adalah sel lestari yang berasal dari darah seorang wanita penderita
leukemia kronis, yang berusia 53 tahun pada tahun 1970, dan bersifat suspensi.
Leukemia (kanker darah) merupakan penyakit kanker yang ditandai oleh
pertambahan sel darah putih atau leukosit, dengan bentuk yang tidak normal,
proses berlangsung cepat dan tidak terkendali (Pinilih 2006).
Kedua jenis sel lestari dipelihara dan ditumbuhkembangkan dalam medium
BME/F-12 yang berisi 10% Fetal Calf Serum (FCS), 100 IU penisilin dan 100 µg
streptomisin dalam inkubator CO2 bersuhu 37 oC. Biakan sel lestari kemudian
disimpan dalam nitrogen cair hingga siap digunakan untuk pengujian aktivitas
antiproliferasi secara in vitro.
Temu Ireng (Curcuma aeruginosa Roxb.)
Temu ireng (Curcuma aeruginosa Roxb.) termasuk dalam famili
Zingiberaceae dan genus Curcuma. Tanaman ini memiliki nama daerah temu
erang (Sumatera), koneng hideung (Sunda), temu ireng (Melayu dan
Minangkabau), temu ereng (Madura), temu leteng (Makasar), temu lotong
(Bugis), dan temu ireng (Jawa dan Bali) (MTIC 2002).
Temu ireng dapat tumbuh pada kisaran iklim yang luas di daerah tropis dan
subtropis (Asia Selatan dan Tenggara). Tanaman ini merupakan tanaman
berbatang lunak tahunan yang biasa hidup di bawah naungan tanaman lain.
Habitat yang paling sesuai adalah daerah yang tidak terkena sinar matahari secara
langsung dan kelembapan tinggi (Gambar 1).
Gambar 1 Tanaman temu ireng (kiri) dan rimpang temu ireng yang berkhasiat
obat (kanan) (Dalimartha 2003)
4
Temu ireng mengandung minyak atsiri (turmerone, zingiberene),
kurkuminoid (kurkumin I, II, dan III), alkaloid, saponin, pati, damar atau getah,
dan lemak (Setiyono 2014). Zat warna kuning kurkuminoid terdiri dari 62%
kurkumin dan 38% desmetoksikurkumin (Sari 2008). Menurut Martha Tilaar
Innovation Center (MTIC), kadar minyak atsiri temu ireng sebanyak 2%.
Disamping itu, tanaman ini mengandung flavonoid dan polifenol
(Nugrahaningtyas et al. 2005).
Rimpang temu ireng (Curcuma aeruginosa Roxb.) merupakan salah satu
tanaman obat tradisional yang dapat dimanfaatkan sebagai obat cacing
(anthelmintik) (Putri 2009). Kurkuminoid diketahui memiliki efek antitoksin
(Setiyono 2014), dan flavonoid berkhasiat sebagai antihipertensi, merangsang
pembentukan estrogen, antifungal, dan insektisida (Nugrahaningtyas et al. 2005).
Doxorubicin
Doxorubicin merupakan agen kemoterapi yang sering digunakan dalam
pengobatan kanker payudara. Doxorubicin memiliki beberapa efek samping
diantaranya menyebabkan resistensi dan kardiotoksik sehingga akan beresiko
tinggi bila digunakan dalam konsentrasi yang tinggi (Meiyanto 2008).
Gambar 2 Mekanisme kerja doxorubicin pada sel kanker (Kim et al. 2009)
Doxorubicin bekerja dengan cara merusak DNA. DNA yang telah rusak
tersebut menginduksi mitokondria untuk melepaskan sitokrom c yang akan
mengaktifkan kaspase, sehingga berefek apoptosis. P-glycoprotein menghambat
kerja doxorubicin dengan cara drug efflux. BCL-2 dan BCL-XL adalah protein
yang menghambat pelepasan sitokrom C, sedangkan XIAP adalah protein yang
menghambat kaspase (Gambar 2).
5
Kematian Sel
Kematian sel dapat disebabkan oleh berbagai cara. Kematian sel
diklasifikasikan menjadi dua tipe, yakni nekrosis dan apoptosis. Nekrosis
merupakan salah satu pola dasar kematian sel yang bersifat irreversible
disebabkan hipoksia, iskemia, dan kerusakan membran sel (Zachary dan McGavin
2012). Apoptosis adalah suatu proses kematian sel yang terprogram, diatur secara
genetik, bersifat aktif, ditandai dengan adanya kondensasi kromatin, fragmentasi
sel, dan fagositosis sel tersebut oleh tetangganya.
Prinsip terjadinya inisiasi apoptosis berasal dari dua jalur, yakni ekstrinsik
dan intrinsik. Jalur ekstrinsik diinisiasi melalui stimulasi reseptor kematian,
sedangkan jalur intrinsik diinisiasi melalui pelepasan faktor signal dari
mitokondria dalam sel.
Gambar 3 Mekanisme apoptosis melalui jalur ekstrinsik (Zachary dan Mc Gavin
2012)
Apoptosis melalui jalur ekstrinsik dimulai dari pelepasan molekul signal
yang disebut ligan oleh sel lain, tapi bukan berasal dari sel yang akan mengalami
apoptosis. Ligan tersebut berikatan dengan Tumor Necrosis Factor (TNF) yang
merupakan death receptor yang terletak di permukaan sel dan menginduksi
apoptosis (CCRC 2012). Ligan yang berikatan dengan reseptor akan membentuk
trimer dengan adaptor Fas Associeted Death Domain (FADD) yang akan
membentuk pro kaspase 8. Kemudian menjadi kaspase aktif 8 yang akan menjadi
executioner kaspase sehingga menyebabkan apoptosis (Gambar 3).
6
Gambar 4 Mekanisme apoptosis melalui jalur intrinsik (CCRC 2012)
Stres mitokondria yang menginduksi apoptosis jalur intrinsik disebabkan
oleh senyawa kimia atau kehilangan faktor pertumbuhan, sehingga menyebabkan
gangguan pada mitokondria dan terjadi pelepasan sitokrom c dari intermembran
mitokondria. Protein kaspase 8 akan akan memotong BCL-2 kemudian akan
menginduksi insersi Bax dan Bad (CCRC 2012). Protein Bax dan Bad merupakan
protein yang dapat meningkatkan permeabilitas membran mitokondria terhadap
sitokrom c, yang selanjutnya berikatan dengan Apoptosis Protease Activating
Factor-1 (APAF-1), dan membentuk apoptosome yang akan mengaktifkan
kaspase 9. Kaspase 9 selanjutnya akan mengaktifkan kaspase 3 sehingga
terjadilah proses kematian sel (Gambar 4).
METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Agustus 2014 hingga Januari 2015 di
Laboratorium Kultur Jaringan, Divisi Patologi, Departemen Klinik, Reproduksi,
dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
7
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah tissue culture plate 24
well, mikroplate ELISA 96 well, pipet, mikropipet, tabung ependorf 1.5 ml,
inkubator 37 oC (5% CO2), bunsen, laminar air flow, vortex, hemositometer
Neubauer, cover slip, dan mikroskop cahaya.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sel lestari tumor
MCM/IPB-B3 dan K562, ekstrak etanol temu ireng yang diperoleh dari Pusat
Studi Biofarmaka, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Fetal Bovine
Serum (FBS), gentamisin, fungizon, doxorubicin, dimetilsulfoksida (DMSO), dan
trypan blue.
Metode Penelitian
Metode penelitian ini berdasarkan metode Priosoeryanto et al. (1995), yaitu:
1.
Persiapan media dan ekstrak
Media yang digunakan adalah 0.80 ml DMEM yang ditambahkan 50 µl
antibiotik (gentamisin) dan 30 µl FBS. Ekstrak etanol temu ireng diperoleh
dengan metode soxhletasi menggunakan pelarut etanol 70%. Sebanyak 0.1 g
ekstrak dilarutkan dalam 400 µl DMSO, kemudian diencerkan sebanyak 5
kali, sehingga konsentrasi ekstrak yang digunakan yaitu 12.5 ppm, 25 ppm,
37.5 ppm, dan 50 ppm.
2.
Penanaman sel
Suspensi sel lestari tumor MCM/IPB-B3 dan K562 dicairkan terlebih
dahulu (thawing). Setelah cair, suspensi sel dihomogenkan dengan vortex.
Penanaman sel dilakukan pada tissue culture plate 24 well yang berisi
medium penumbuh dengan empat konsentrasi ekstrak (12.5 ppm, 25 ppm,
37.5 ppm, dan 50 ppm), tidak ditambah ekstrak sebagai kontrol negatif, dan
ditambah 10 µl doxorubicin sebagai kontrol positif. Sebanyak 50 µl suspensi
sel lestari ditambahkan ke setiap lubang. Volume total cairan dalam satu
lubang adalah 1 ml. Pengulangan dilakukan sebanyak tiga kali. Suspensi sel
tumor ditumbuhkan dengan menginkubasikannya dalam inkubator 37 oC (5%
CO2).
3.
Pemanenan dan penghitungan sel
Pemanenan sel lestari tumor dilakukan apabila sel pada lubang kontrol
sudah tumbuh optimal menutupi sekitar 70% permukaan lubang (confluence)
atau, kira-kira setelah 3 hari. Suspensi sel dihomogenkan menggunakan
mikropipet dengan cara dihisap dan dikeluarkan. Sebanyak 100 µl suspensi
sel yang telah homogen diletakkan dalam mikroplate ELISA yang sudah
berisi 5 µl pewarna trypan blue, agar sel lestari tumor dapat tampak jelas di
bawah mikroskop, kemudian dihomogenkan. Sebanyak 10 µl suspensi sel
dengan kepadatan 5 x 103 sel/ml diteteskan pada hemositometer Neubauer,
dan dilakukan penghitungan jumlah sel di bawah mikroskop cahaya dengan
perbesaran 100x. Sel yang dihitung adalah sel yang berada pada kotak tengah
kamar hitung. Semua sel dihitung, baik sel hidup maupun sel yang sudah
8
mati. Garis kiri dan atas pada kotak dihitung untuk kotak yang bersangkutan,
sedangkan garis kanan dan bawah pada kotak dihitung untuk kotak
berikutnya, seperti ditunjukkan pada Gambar 5.
Gambar 5 Skema hemositometer Neubauer
Hasil penghitungan sel dikonversikan ke dalam jumlah sel per ml
suspensi dengan menggunakan rumus :
Jumlah sel/ml = jumlah sel yang dihitung x faktor volume x faktor pengencer
= jumlah sel yang dihitung x 104 x 5 x 10-2
Rumus yang digunakan untuk menghitung persentase aktivitas
pertumbuhan dan penghambatan sel tumor adalah sebagai berikut :
Jumlah rataan sel perlakuan
% aktivitas pertumbuhan =
Jumlah rataan sel kontrol negatif
x 100%
% aktivitas penghambatan = 100% - (% aktivitas pertumbuhan)
4.
Analisis data
Data yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis sidik ragam
ANOVA dan dilanjutkan dengan uji wilayah berganda Duncan untuk melihat
perbedaan antar kelompok perlakuan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penurunan Jumlah Sel Lestari Tumor MCM/IPB-B3 dan K562
Pemberian ekstrak etanol temu ireng dengan konsentrasi bertingkat
menurunkan jumlah sel tumor, yang menandakan adanya aktivitas antiproliferasi
ekstrak terhadap pertumbuhan sel lestari tumor. Penurunan jumlah sel lestari
tumor MCM/IPB-B3 dan K562 disajikan pada Gambar 6.
9
Gambar 6 Penurunan jumlah sel lestari tumor MCM/IPB-B3 dan K562 pada
berbagai konsentrasi ekstrak temu ireng
Gambar 6 menunjukkan bahwa penurunan jumlah sel lestari tumor
berbanding lurus dengan peningkatan konsentrasi ekstrak etanol temu ireng.
Terlihat pula ekstrak etanol temu ireng memiliki aktivitas antiproliferasi yang
lebih baik terhadap sel lestari tumor K562 dibandingkan sel lestari tumor
MCM/IPB-B3. Hal ini diduga karena sel lestari tumor K562 memiliki sifat
establish sedangkan MCM/IPB-B3 memiliki sifat unestablish, sehingga sel lestari
tumor K562 lebih peka terhadap ekstrak etanol temu ireng dibandingkan sel
lestari tumor MCM/IPB-B3.
Aktivitas Penghambatan (Antiproliferasi) Ekstrak Etanol Temu Ireng
terhadap Sel Lestari Tumor MCM/IPB-B3 dengan K562
Ekstrak etanol temu ireng memiliki kemampuan untuk menghambat
pertumbuhan sel lestari tumor, baik sel lestari tumor MCM/IPB-B3 maupun
K562. Perbandingan aktivitas penghambatan pertumbuhan sel lestari tumor
MCM/IPB-B3 dan K562 dapat dilihat pada Tabel 1.
10
Tabel 1 Aktivitas antiproliferasi ekstrak etanol temu ireng terhadap pertumbuhan
sel lestari tumor MCM/IPB-B3 dan K562
Perlakuan
Aktivitas penghambatan (%)
MCM/IPB-B3
a
K562
0.00 ± 12.00a
K (-)
0.00 ± 23.45
P1
24.40 ± 13.06b
8.47 ± 10.06a
P2
29.13 ± 9.34b
30.81 ± 9.57b
P3
52.26 ± 10.94c
48.71 ± 5.99c
P4
63.33 ± 5.43c
74.59 ± 2.74d
K (+)
92.95 ± 1.72d
87.76 ± 1.64d
Keterangan: Huruf superscript yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan
nyata (p0.05) dengan 37.5 ppm. Seluruh
aktivitas antiproliferasi ekstrak berbeda nyata (p
(Curcuma aeruginosa Roxb.) SEBAGAI ANTIPROLIFERASI
PADA SEL LESTARI TUMOR MCM/IPB-B3 DAN K562
FITRI HARDIANI FATHONAH
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan skripsi berjudul Aktivitas Ekstrak Etanol Temu
Ireng (Curcuma aeruginosa Roxb.) sebagai Antiproliferasi pada Sel Lestari
Tumor MCM/IPB-B3 dan K562 adalah benar karya saya dengan arahan dari
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan
tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2015
Fitri Hardiani Fathonah
NIM B04100127
ABSTRAK
FITRI HARDIANI FATHONAH. Aktivitas Ekstrak Etanol Temu Ireng (Curcuma
aeruginosa Roxb.) sebagai Antiproliferasi pada Sel Lestari Tumor MCM/IPB-B3
dan K562. Dibimbing oleh EVA HARLINA dan BAMBANG PONTJO
PRIOSOERYANTO.
Pengobatan tumor secara konvensional menimbulkan imunosupresi dan efek
samping lainnya sehingga memberikan peluang bagi pertumbuhan tumor yang
progresif dan rekurens. Obat tradisional dapat menjadi alternatif dalam
pengobatan tumor. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas
antiproliferasi ekstrak etanol temu ireng terhadap sel lestari tumor MCM/IPB-B3
dan K562 secara in vitro. Konsentrasi ekstrak etanol temu ireng yang digunakan
adalah 0 ppm (kontrol negatif), 12.5 ppm (P1), 25 ppm (P2), 37.5 ppm (P3), dan 50
ppm (P4). Sebagai kontrol positif digunakan doxorubicin. Pemanenan sel
dilakukan setelah confluence, yaitu pada hari ke tiga dan dilakukan penghitungan
jumlah seluruh sel menggunakan hemositometer Neubauer. Data yang diperoleh
dianalisis menggunakan ANOVA dan Duncan. Hasil penelitian menunjukkan
bahwa ekstrak etanol temu ireng memiliki daya penghambatan tertinggi pada
konsentrasi 50 ppm sebesar 63.33% pada sel lestari tumor (MCM/IPB-B3) dan
74.59% pada sel lestari tumor (K562). Hasil tersebut menunjukkan bahwa ekstrak
etanol temu ireng berpotensi untuk dikembangkan menjadi senyawa antitumor.
Kata kunci: antiproliferasi, ekstrak temu ireng, in vitro, K562, MCM/IPB-B3,
tumor
ABSTRACT
FITRI HARDIANI FATHONAH. Ethanol Extract of Temu Ireng (Curcuma
aerugnosa Roxb.) as Antiproliferation on MCM/IPB-B3 and K562 Cell Lines.
Supervised by EVA HARLINA and BAMBANG PONTJO PRIOSOERYANTO.
Conventional treatment on tumor cause immunosupression and other side
effect which provide opportunities for progressive tumor growth or recurrent.
Traditional medicine can be an alternative medicine for tumor treatment. The aim
of this research is to study the antiproliferation activities of ethanol extract of
temu ireng on MCM/IPB-B3 and K562 tumor cell lines by in vitro culture. The
concentration of ethanol extract of temu ireng were 0 ppm (negative control), 12.5
ppm (P1), 25 ppm (P2), 37.5 ppm (P3), and 50 ppm (P4) and as a positive control
was doxorubicin. The cells culture were harvested after three days or confluence
and all cells were counting by hemocytometer Neubauer. The data was analyzed
by ANOVA and Duncan. The result showed that ethanol extract of temu ireng had
the highest inhibitory effect on 50 ppm concentration both cell lines with
inhibitory activity were 63.33% (MCM/IPB-B3) cell line and 74.59% for (K562)
cell line. Based on those result concluded that ethanol extract temu ireng was
potentially develop as an antitumor.
Keywords: antiproliferation, in vitro, K562, MCM/IPB-B3, temu ireng extract,
tumor
AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL TEMU IRENG
(Curcuma aeruginosa Roxb.) SEBAGAI ANTIPROLIFERASI
PADA SEL LESTARI TUMOR MCM/IPB-B3 DAN K562
FITRI HARDIANI FATHONAH
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Kedokteran Hewan
pada
Fakultas Kedokteran Hewan
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Agustus 2014 ini ialah
tumor, dengan judul Aktivitas Ekstrak Etanol Temu Ireng (Curcuma aeruginosa
Roxb.) sebagai Antiproliferasi pada Sel Lestari Tumor MCM/IPB-B3 dan K562.
Terima kasih penulis ucapkan kepada ayahanda Lenur Komar, ibunda Titin
Kustinah, serta seluruh keluarga atas segala doa dan kasih sayangnya. Ungkapan
terima kasih juga disampaikan kepada Ibu Dr Drh Eva Harlina, MSi, APVet dan
Bapak Prof Drh Bambang Pontjo Priosoeryanto, MS, Ph.D, APVet selaku
pembimbing skripsi. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Dr Drh Elok
Budi Retnani, MS selaku dosen pembimbing akademik yang telah membimbing
dan memberi nasihat positif.
Penghargaan penulis sampaikan kepada teman satu penelitian Ansenora
Bekris dan Faizal Rafiq, teman-teman Ganglion, serta sahabat terbaik penulis
Sefi, Dwi, Asa, Nadia, Nova, Mayah, Sinta, Firman, Danu, Abel, Gerard, Sri,
Ulfah, Benli, dan Faisal.
Penulis menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini masih terdapat
kekurangan, namun penulis berharap semoga skripsi ini bermanfaat.
Bogor, September 2015
Fitri Hardiani Fathonah
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vii
DAFTAR GAMBAR
vii
DAFTAR LAMPIRAN
vii
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Perumusan Masalah
1
Tujuan Penelitian
2
Manfaat Penelitian
2
TINJAUAN PUSTAKA
2
Tumor
2
Biakan Sel Lestari Tumor
2
Temu Ireng
3
Doxorubicin
4
Kematian Sel
5
METODE
6
Tempat dan Waktu Penelitian
6
Alat dan Bahan
7
Metode Penelitian
7
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penurunan Jumlah Sel Lestari Tumor MCM/IPB-B3 dan K562
8
8
Aktivitas Penghambatan (Antiprolifersi) Ekstrak Etanol Temu Ireng terhadap
Sel Lestari Tumor MCM/IPB-B3 dan K562
9
SIMPULAN DAN SARAN
13
Simpulan
13
Saran
13
DAFTAR PUSTAKA
13
LAMPIRAN
16
RIWAYAT HIDUP
17
DAFTAR TABEL
1 Aktivitas antiproliferasi ekstrak etanol temu ireng
pertumbuhan sel lestari tumor MCM/IPB-B3 dan K562
terhadap
10
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
Tanaman temu ireng dan rimpang temu ireng yang berkhasiat obat
Mekanisme kerja doxorubicin pada sel kanker
Mekanisme apoptosis melalui jalur ekstrinsik
Mekanisme apoptosis melalui jalur intrinsik
Skema hemositometer Neubauer
Penurunan jumlah sel lestari tumor MCM/IPB-B3 dan K562
Mekanisme kerja kurkumin pada sel tumor
3
4
5
6
8
9
11
DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil uji statistik sidik ragam ANOVA terhadap
penghambatan pertumbuhan sel lestari tumor MCM/IPB-B3
2 Hasil uji statistik wilayah berganda Duncan terhadap
penghambatan pertumbuhan sel lestari tumor MCM/IPB-B3
3 Hasil uji statistik sidik ragam ANOVA terhadap
penghambatan pertumbuhan sel lestari tumor K562
4 Hasil uji statistik wilayah berganda Duncan terhadap
penghambatan pertumbuhan sel lestari tumor K562
aktivitas
16
aktivitas
16
aktivitas
16
aktivitas
16
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tumor merupakan salah satu penyakit yang sering menyerang hewan piara
khususnya anjing. Selain tingkat kejadian yang cukup tinggi (mencapai 22%),
jenis tumor yang menyerang sangat beragam dengan tingkat keparahan penyakit
yang berbeda-beda (Priosoeryanto et al. 2000). Penyakit tumor atau neoplasma
merupakan salah satu masalah dalam dunia medis yang sangat penting untuk
segera ditangani. Penyebab tumor sangat bervariasi dan sangat kompleks sehingga
dalam penanganannya sangat sulit, apalagi biasanya penyakit diketahui sudah
mencapai stadium lanjut (Priosoeryanto et al. 2008).
Pengobatan tumor yang telah dilakukan diantaranya pembedahan,
cryosurgery, radioterapi, kemoterapi, terapi hormonal, imunoterapi, inhibitor
angiogenesis, dan metode lainnya seperti hipertermia (terapi panas) serta
fototerapi (terapi cahaya) (Sari 2008). Cara pengobatan kemoterapi dan radiasi
menurut Priosoeryanto et al. (2000) memiliki beberapa kelemahan antara lain sifat
toksiknya dapat menurunkan fungsi organ-organ tubuh. Oleh karena itu obat
tradisional dapat menjadi pilihan yang baik dalam pengobatan tumor. Hal ini
dikarenakan obat tradisional kurang memiliki efek samping dibandingkan obatobatan kimia. Selain itu obat tradisional juga mudah diperoleh dan dapat diramu
sendiri (Nugrahaningtyas et al. 2005). Depkes RI (1981) mendefinisikan obat
tradisional merupakan bahan-bahan obat yang berasal dari tumbuhan, hewan,
maupun bahan-bahan mineral.
Indonesia merupakan salah satu negara yang memiliki kekayaan alam yang
sangat besar, termasuk didalamnya adalah berbagai tanaman obat. Depkes RI
(1981) mengindikasikan bahwa dari sekitar 326 perusahaan di Indonesia yang
bergerak dalam bidang farmasi, kosmetik dan makanan, menggunakan 180 jenis
tanaman. Jumlah total bahan baku yang digunakan kurang lebih sebanyak 6.223
ton. Depkes RI (1981) juga mencatat terdapat 45 jenis obat penting di Amerika
yang berasal dari tanaman, dan 18 jenis diantaranya berasal dari Indonesia. Temu
ireng (Curcuma aeruginosa Roxb.) merupakan salah satu dari sekian banyak
tanaman obat tradisional Indonesia. Temu ireng dipilih menjadi salah satu obat
tradisional untuk alternatif pengobatan tumor karena berkhasiat sebagai
antiradang, antibakteri, pembersih darah, antikoagulan, tonikum, pelindung hati
(hepatoprotektor), antibiotik, dan antineoplastik (antikanker).
Perumusan Masalah
Pengobatan tumor secara konvensional menyebabkan imunosupresi dan
efek samping lainnya, sehingga memberikan peluang bagi tumor untuk tumbuh
progresif dan rekurens.
2
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari aktivitas antiproliferasi ekstrak
etanol temu ireng terhadap sel lestari tumor MCM/IPB-B3 dan K562 secara in
vitro.
Manfaat Penelitian
Pengetahuan tentang aktivitas antiproliferasi ekstrak etanol temu ireng
terhadap sel lestari tumor MCM/IPB-B3 dan K562 akan bermanfaat sebagai dasar
untuk mempelajari khasiat temu ireng dalam mengatasi tumor.
TINJAUAN PUSTAKA
Tumor
Tumor atau neoplasma diartikan sebagai suatu gangguan pertumbuhan
dengan karakteristik proliferasi sel yang berlebihan, abnormal dan tidak terkontrol
dari sel yang mengalami transformasi atau perubahan pada satu atau lebih tempat
utama dalam tubuh inang, dan umumnya disertai dengan metastasis atau
penyebaran ke bagian lain dari tubuh inang (Priosoeryanto et al. 2008). Aliza et
al. (2011) mendefinisikan tumor sebagai penyakit yang disebabkan adanya
pertumbuhan sel-sel yang telah kehilangan daya aturnya dengan menyerang
berbagai macam sel, jaringan, ataupun organ.
Penyebab tumor sangat kompleks, hal ini berkaitan dengan paparan agen
karsinogen, kokarsinogen lingkungan, dan faktor predisposisi inang
(Priosoeryanto et al. 2002). Menurut Pinilih (2006), penyebab tumor dapat
dibedakan menjadi faktor intrinsik dan ekstrinsik. Faktor intrinsik meliputi usia,
diet, dan hormon. Faktor ekstrinsik dapat berasal dari lingkungan seperti agen
biologik, fisik, dan kimia.
Beberapa cara pengobatan kanker yaitu dengan operasi (pembedahan),
radiasi, chemotherapy, dan cancer immunotherapy (Pinilih 2006). Priosoeryanto
et al. (2000) menyatakan bahwa cara pengobatan dengan menggunakan
kemoterapi dan radiasi memiliki beberapa kelemahan antara lain karena sifat
toksiknya dapat menurunkan fungsi fisiologik organ-organ tubuh.
Biakan Sel Lestari Tumor
Sel lestari tumor adalah sel yang berasal dari tumor atau jaringan yang
sudah dibiakkan secara berkala, ditumbuhkembangkan dan dipelihara serta
disimpan dalam nitrogen cair. Keistimewaan dari sel lestari adalah sifatnya yang
immortal karena dapat hidup pada kondisi media yang minimal (Suindra 2005).
Sel MCM/IPB-B3 merupakan sel lestari tumor hasil rekayasa dari sel
MCM-B2 yang telah dihilangkan enzim thymidine kinasenya, yaitu enzim yang
berhubungan dengan regulasi, katalitik dan struktur gen, dan berfungsi sebagai
3
pasokan metabolik. Sel MCM-B2 diisolasi dari benign mixed tumor kelenjar
mamari anjing pemburu betina berumur 10 tahun, dengan cara pembedahan,
dengan massa tumor berukuran 3 cm x 5 cm. Beberapa penemuan menunjukkan
adanya kemungkinan bahwa sel lestari tumor ini berasal dari sel induk (stem cell)
atau sel atipikal. Sel lestari ini digunakan sebagai model untuk mempelajari
diferensiasi dan proliferasi sel pada tumor mamari anjing (Priosoeryanto et al.
1995). Secara mikroskopis kultur sel menunjukkan koloni monolayer. Di dalam
matriks gel kolagen, sel tumbuh membentuk koloni tiga dimensi berukuran besar
dengan pola bercabang. Nukleus besar, organel-organel intrasitoplasmik dan
filamen-filamen intermediet yang bervariasi diantara sel terlihat dengan
pemeriksaan sitoplasmik. Sel tumor ini memiliki jumlah kromosom abnormal.
Secara histologis, hasil transplantasi tumor dari sel kultur serupa dengan
karsinoma anaplastik.
Sel K562 adalah sel lestari yang berasal dari darah seorang wanita penderita
leukemia kronis, yang berusia 53 tahun pada tahun 1970, dan bersifat suspensi.
Leukemia (kanker darah) merupakan penyakit kanker yang ditandai oleh
pertambahan sel darah putih atau leukosit, dengan bentuk yang tidak normal,
proses berlangsung cepat dan tidak terkendali (Pinilih 2006).
Kedua jenis sel lestari dipelihara dan ditumbuhkembangkan dalam medium
BME/F-12 yang berisi 10% Fetal Calf Serum (FCS), 100 IU penisilin dan 100 µg
streptomisin dalam inkubator CO2 bersuhu 37 oC. Biakan sel lestari kemudian
disimpan dalam nitrogen cair hingga siap digunakan untuk pengujian aktivitas
antiproliferasi secara in vitro.
Temu Ireng (Curcuma aeruginosa Roxb.)
Temu ireng (Curcuma aeruginosa Roxb.) termasuk dalam famili
Zingiberaceae dan genus Curcuma. Tanaman ini memiliki nama daerah temu
erang (Sumatera), koneng hideung (Sunda), temu ireng (Melayu dan
Minangkabau), temu ereng (Madura), temu leteng (Makasar), temu lotong
(Bugis), dan temu ireng (Jawa dan Bali) (MTIC 2002).
Temu ireng dapat tumbuh pada kisaran iklim yang luas di daerah tropis dan
subtropis (Asia Selatan dan Tenggara). Tanaman ini merupakan tanaman
berbatang lunak tahunan yang biasa hidup di bawah naungan tanaman lain.
Habitat yang paling sesuai adalah daerah yang tidak terkena sinar matahari secara
langsung dan kelembapan tinggi (Gambar 1).
Gambar 1 Tanaman temu ireng (kiri) dan rimpang temu ireng yang berkhasiat
obat (kanan) (Dalimartha 2003)
4
Temu ireng mengandung minyak atsiri (turmerone, zingiberene),
kurkuminoid (kurkumin I, II, dan III), alkaloid, saponin, pati, damar atau getah,
dan lemak (Setiyono 2014). Zat warna kuning kurkuminoid terdiri dari 62%
kurkumin dan 38% desmetoksikurkumin (Sari 2008). Menurut Martha Tilaar
Innovation Center (MTIC), kadar minyak atsiri temu ireng sebanyak 2%.
Disamping itu, tanaman ini mengandung flavonoid dan polifenol
(Nugrahaningtyas et al. 2005).
Rimpang temu ireng (Curcuma aeruginosa Roxb.) merupakan salah satu
tanaman obat tradisional yang dapat dimanfaatkan sebagai obat cacing
(anthelmintik) (Putri 2009). Kurkuminoid diketahui memiliki efek antitoksin
(Setiyono 2014), dan flavonoid berkhasiat sebagai antihipertensi, merangsang
pembentukan estrogen, antifungal, dan insektisida (Nugrahaningtyas et al. 2005).
Doxorubicin
Doxorubicin merupakan agen kemoterapi yang sering digunakan dalam
pengobatan kanker payudara. Doxorubicin memiliki beberapa efek samping
diantaranya menyebabkan resistensi dan kardiotoksik sehingga akan beresiko
tinggi bila digunakan dalam konsentrasi yang tinggi (Meiyanto 2008).
Gambar 2 Mekanisme kerja doxorubicin pada sel kanker (Kim et al. 2009)
Doxorubicin bekerja dengan cara merusak DNA. DNA yang telah rusak
tersebut menginduksi mitokondria untuk melepaskan sitokrom c yang akan
mengaktifkan kaspase, sehingga berefek apoptosis. P-glycoprotein menghambat
kerja doxorubicin dengan cara drug efflux. BCL-2 dan BCL-XL adalah protein
yang menghambat pelepasan sitokrom C, sedangkan XIAP adalah protein yang
menghambat kaspase (Gambar 2).
5
Kematian Sel
Kematian sel dapat disebabkan oleh berbagai cara. Kematian sel
diklasifikasikan menjadi dua tipe, yakni nekrosis dan apoptosis. Nekrosis
merupakan salah satu pola dasar kematian sel yang bersifat irreversible
disebabkan hipoksia, iskemia, dan kerusakan membran sel (Zachary dan McGavin
2012). Apoptosis adalah suatu proses kematian sel yang terprogram, diatur secara
genetik, bersifat aktif, ditandai dengan adanya kondensasi kromatin, fragmentasi
sel, dan fagositosis sel tersebut oleh tetangganya.
Prinsip terjadinya inisiasi apoptosis berasal dari dua jalur, yakni ekstrinsik
dan intrinsik. Jalur ekstrinsik diinisiasi melalui stimulasi reseptor kematian,
sedangkan jalur intrinsik diinisiasi melalui pelepasan faktor signal dari
mitokondria dalam sel.
Gambar 3 Mekanisme apoptosis melalui jalur ekstrinsik (Zachary dan Mc Gavin
2012)
Apoptosis melalui jalur ekstrinsik dimulai dari pelepasan molekul signal
yang disebut ligan oleh sel lain, tapi bukan berasal dari sel yang akan mengalami
apoptosis. Ligan tersebut berikatan dengan Tumor Necrosis Factor (TNF) yang
merupakan death receptor yang terletak di permukaan sel dan menginduksi
apoptosis (CCRC 2012). Ligan yang berikatan dengan reseptor akan membentuk
trimer dengan adaptor Fas Associeted Death Domain (FADD) yang akan
membentuk pro kaspase 8. Kemudian menjadi kaspase aktif 8 yang akan menjadi
executioner kaspase sehingga menyebabkan apoptosis (Gambar 3).
6
Gambar 4 Mekanisme apoptosis melalui jalur intrinsik (CCRC 2012)
Stres mitokondria yang menginduksi apoptosis jalur intrinsik disebabkan
oleh senyawa kimia atau kehilangan faktor pertumbuhan, sehingga menyebabkan
gangguan pada mitokondria dan terjadi pelepasan sitokrom c dari intermembran
mitokondria. Protein kaspase 8 akan akan memotong BCL-2 kemudian akan
menginduksi insersi Bax dan Bad (CCRC 2012). Protein Bax dan Bad merupakan
protein yang dapat meningkatkan permeabilitas membran mitokondria terhadap
sitokrom c, yang selanjutnya berikatan dengan Apoptosis Protease Activating
Factor-1 (APAF-1), dan membentuk apoptosome yang akan mengaktifkan
kaspase 9. Kaspase 9 selanjutnya akan mengaktifkan kaspase 3 sehingga
terjadilah proses kematian sel (Gambar 4).
METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Agustus 2014 hingga Januari 2015 di
Laboratorium Kultur Jaringan, Divisi Patologi, Departemen Klinik, Reproduksi,
dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
7
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah tissue culture plate 24
well, mikroplate ELISA 96 well, pipet, mikropipet, tabung ependorf 1.5 ml,
inkubator 37 oC (5% CO2), bunsen, laminar air flow, vortex, hemositometer
Neubauer, cover slip, dan mikroskop cahaya.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sel lestari tumor
MCM/IPB-B3 dan K562, ekstrak etanol temu ireng yang diperoleh dari Pusat
Studi Biofarmaka, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Fetal Bovine
Serum (FBS), gentamisin, fungizon, doxorubicin, dimetilsulfoksida (DMSO), dan
trypan blue.
Metode Penelitian
Metode penelitian ini berdasarkan metode Priosoeryanto et al. (1995), yaitu:
1.
Persiapan media dan ekstrak
Media yang digunakan adalah 0.80 ml DMEM yang ditambahkan 50 µl
antibiotik (gentamisin) dan 30 µl FBS. Ekstrak etanol temu ireng diperoleh
dengan metode soxhletasi menggunakan pelarut etanol 70%. Sebanyak 0.1 g
ekstrak dilarutkan dalam 400 µl DMSO, kemudian diencerkan sebanyak 5
kali, sehingga konsentrasi ekstrak yang digunakan yaitu 12.5 ppm, 25 ppm,
37.5 ppm, dan 50 ppm.
2.
Penanaman sel
Suspensi sel lestari tumor MCM/IPB-B3 dan K562 dicairkan terlebih
dahulu (thawing). Setelah cair, suspensi sel dihomogenkan dengan vortex.
Penanaman sel dilakukan pada tissue culture plate 24 well yang berisi
medium penumbuh dengan empat konsentrasi ekstrak (12.5 ppm, 25 ppm,
37.5 ppm, dan 50 ppm), tidak ditambah ekstrak sebagai kontrol negatif, dan
ditambah 10 µl doxorubicin sebagai kontrol positif. Sebanyak 50 µl suspensi
sel lestari ditambahkan ke setiap lubang. Volume total cairan dalam satu
lubang adalah 1 ml. Pengulangan dilakukan sebanyak tiga kali. Suspensi sel
tumor ditumbuhkan dengan menginkubasikannya dalam inkubator 37 oC (5%
CO2).
3.
Pemanenan dan penghitungan sel
Pemanenan sel lestari tumor dilakukan apabila sel pada lubang kontrol
sudah tumbuh optimal menutupi sekitar 70% permukaan lubang (confluence)
atau, kira-kira setelah 3 hari. Suspensi sel dihomogenkan menggunakan
mikropipet dengan cara dihisap dan dikeluarkan. Sebanyak 100 µl suspensi
sel yang telah homogen diletakkan dalam mikroplate ELISA yang sudah
berisi 5 µl pewarna trypan blue, agar sel lestari tumor dapat tampak jelas di
bawah mikroskop, kemudian dihomogenkan. Sebanyak 10 µl suspensi sel
dengan kepadatan 5 x 103 sel/ml diteteskan pada hemositometer Neubauer,
dan dilakukan penghitungan jumlah sel di bawah mikroskop cahaya dengan
perbesaran 100x. Sel yang dihitung adalah sel yang berada pada kotak tengah
kamar hitung. Semua sel dihitung, baik sel hidup maupun sel yang sudah
8
mati. Garis kiri dan atas pada kotak dihitung untuk kotak yang bersangkutan,
sedangkan garis kanan dan bawah pada kotak dihitung untuk kotak
berikutnya, seperti ditunjukkan pada Gambar 5.
Gambar 5 Skema hemositometer Neubauer
Hasil penghitungan sel dikonversikan ke dalam jumlah sel per ml
suspensi dengan menggunakan rumus :
Jumlah sel/ml = jumlah sel yang dihitung x faktor volume x faktor pengencer
= jumlah sel yang dihitung x 104 x 5 x 10-2
Rumus yang digunakan untuk menghitung persentase aktivitas
pertumbuhan dan penghambatan sel tumor adalah sebagai berikut :
Jumlah rataan sel perlakuan
% aktivitas pertumbuhan =
Jumlah rataan sel kontrol negatif
x 100%
% aktivitas penghambatan = 100% - (% aktivitas pertumbuhan)
4.
Analisis data
Data yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis sidik ragam
ANOVA dan dilanjutkan dengan uji wilayah berganda Duncan untuk melihat
perbedaan antar kelompok perlakuan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penurunan Jumlah Sel Lestari Tumor MCM/IPB-B3 dan K562
Pemberian ekstrak etanol temu ireng dengan konsentrasi bertingkat
menurunkan jumlah sel tumor, yang menandakan adanya aktivitas antiproliferasi
ekstrak terhadap pertumbuhan sel lestari tumor. Penurunan jumlah sel lestari
tumor MCM/IPB-B3 dan K562 disajikan pada Gambar 6.
9
Gambar 6 Penurunan jumlah sel lestari tumor MCM/IPB-B3 dan K562 pada
berbagai konsentrasi ekstrak temu ireng
Gambar 6 menunjukkan bahwa penurunan jumlah sel lestari tumor
berbanding lurus dengan peningkatan konsentrasi ekstrak etanol temu ireng.
Terlihat pula ekstrak etanol temu ireng memiliki aktivitas antiproliferasi yang
lebih baik terhadap sel lestari tumor K562 dibandingkan sel lestari tumor
MCM/IPB-B3. Hal ini diduga karena sel lestari tumor K562 memiliki sifat
establish sedangkan MCM/IPB-B3 memiliki sifat unestablish, sehingga sel lestari
tumor K562 lebih peka terhadap ekstrak etanol temu ireng dibandingkan sel
lestari tumor MCM/IPB-B3.
Aktivitas Penghambatan (Antiproliferasi) Ekstrak Etanol Temu Ireng
terhadap Sel Lestari Tumor MCM/IPB-B3 dengan K562
Ekstrak etanol temu ireng memiliki kemampuan untuk menghambat
pertumbuhan sel lestari tumor, baik sel lestari tumor MCM/IPB-B3 maupun
K562. Perbandingan aktivitas penghambatan pertumbuhan sel lestari tumor
MCM/IPB-B3 dan K562 dapat dilihat pada Tabel 1.
10
Tabel 1 Aktivitas antiproliferasi ekstrak etanol temu ireng terhadap pertumbuhan
sel lestari tumor MCM/IPB-B3 dan K562
Perlakuan
Aktivitas penghambatan (%)
MCM/IPB-B3
a
K562
0.00 ± 12.00a
K (-)
0.00 ± 23.45
P1
24.40 ± 13.06b
8.47 ± 10.06a
P2
29.13 ± 9.34b
30.81 ± 9.57b
P3
52.26 ± 10.94c
48.71 ± 5.99c
P4
63.33 ± 5.43c
74.59 ± 2.74d
K (+)
92.95 ± 1.72d
87.76 ± 1.64d
Keterangan: Huruf superscript yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan
nyata (p0.05) dengan 37.5 ppm. Seluruh
aktivitas antiproliferasi ekstrak berbeda nyata (p