Karakterisasi Gen Ser2 pada Ulat Sutera Domestik (Bombyx mori)

FERY SANTOSA

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2013

ii

ABSTRAK

FERY SANTOSA. Karakterisasi Gen Ser2 pada Ulat Sutera Domestik (Bombyx mori). Di bawah bimbingan DEDY DURYADI SOLIHIN dan TARUNI SRI PRAWASTI.

Serangga dari famili Bombycidae merupakan serangga (ngengat) yang menguntungkan sebab serangga tersebut menghasilkan kokon sebagai sumber serat sutera alam. Serat sutera dari Bombyx mori mulai diproduksi di kelenjar sutera pada larva instar terakhir menjelang pembentukan kokon. Komponen utama dari serat sutera adalah fibroin dan serisin. Gen Ser2 mendominasi dalam proses pembentukan serat saat ulat berada dalam tahap pertumbuhan. Kajian mengenai karakteristik gen serisin 2 pada B. mori masih sangat minim. Penelitian ini bertujuan menganalisis karakterisasi gen Ser2 pada ulat B. mori asal Candiroto. Kelenjar ulat sutera bagian tengah pada ulat sutera B. mori diekstraksi untuk analisis RNA menggunakan Rneasy Mini Kit (Qiagen). Sintesis cDNA diubah dari RNA menggunakan RevertAid Transcriptase (Thermo Scientific Inc). Hasil cDNA ini diamplifikasi dengan tiga pasang primer yaitu dua pasang housekeeping gene dan satu psanag gen Ser2. Hasil amplifikaasi gen Ser2 dirunut komposisi basa-basa nukleotidanya. Dua sampel perunutan yaitu BC8 dan BC10 disejajarkan menggunakan software Molecular Evolutionary Genetic Analysis version 4 (MEGA 4.0). Hasil pensejajaran kedua sampel dibandingkan tingkat persentase kekerabatan dengan individu-individu lain pada gene bank melalui program Basic Local Alignment Search Tool- nucleotide (BLAST n). Hasilnya menunjukkan bahwa B. mori BC8 dan B. mori BC10 memiliki kesamaan dengan Bombyx mori serisin 2 (Ser2)transcript variant 2, mRNA (Genebank: NM001172817.1), Bombyx mori serisin 2 (Ser2) transcript variant 1, mRNA (Genebank: NM001172816.1) dan Bombyx mori serisin 2 precursor (Ser2) gene, complete cds alternatively spliced (Genebank: GQ381286.1) sebesar 100%.

Kata kunci : Ulat sutera, Bombyx mori, Ser2

ABSTRACT

FERY SANTOSA. Characterization of Genes Ser2 on Domestic Silkworm (Bombyx mori).

Supervised by DEDY DURYADI SOLIHIN and TARUNI SRI PRAWASTI.

Insect of the family Bombycidae is a beneficial insect because it produces cocoon as a source of natural silk fibers. Silk fibers from Bombyx mori is produced in the silk gland at the stage of last instar larvae before the formation of the cocoon. The main components of silk are fibroin and serisin. Ser2 gene dominates process of fiber formation when the caterpillar is on the growth stage. The study of genes characteristic serisin 2 in B. mori is still limited. The objective of this study was to analyze characteristic of Ser2 gene in silkworm B. mori originated from Candiroto. Middle silk gland (MSG) of the silkworm B. mori was extracted for the RNA analysis using the RNeasy Mini Kit (Qiagen). Complementary DNA (cDNA) was synthesized from RNA using Revertaid Transcriptase (Thermo Science Inc). It was then amplified using three pairs of the primers, i.e two pairs of housekeeping genes and one pair of Ser2 genes. The result of Ser2 gene amplification was sequenced to obtain composition of nucleotide bases. Sampels BC8 and BC10 were successfully sequenced and then aligned using Molecular Evolutionary Genetic Analysis software version 4 (MEGA 4.0). To obtain kindship percentage, those sequenced samples were compared with other individuals acquired from gene bank using Basic Local Alignment Search Tool-nucleotide ( BLAST n) program. The results was that B. mori BC8 and BC10 having similarity as high as 100% with Bombyx mori serisin 2 (Ser2) transcript variant 2, mRNA (Genebank: NM001172817.1), Bombyx mori serisin 2 (Ser2) transcript variant 1, mRNA (Genebank: NM001172816.1) dan Bombyx mori serisin 2 precursor (Ser2) gene, complete cds alternatively spliced (Genebank: GQ381286.1) .

KARAKTERISASI GEN Ser2 PADA ULAT SUTERA

DOMESTIK (Bombyx mori)

FERY SANTOSA

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains pada

Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2013

Judul Skripsi : Karakterisasi Gen

Ser2

pada Ulat Sutera Domestik (

Bombyx mori

)

Nama

NIM

Disetujui,

Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA

Pembimbing I

Dra.Taruni Sri Prawasti, M.Si.

Pembimbing II

Diketahui,

Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si.

Ketua Departemen Biologi

Tanggal lulus:

: Fery Santosa

: G34070050

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah Tuhan Yang Maha Esa atas segala karunia-Nya, sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Penelitian dengan judul “Karakterisasi Gen Ser2 pada Ulat Sutera Domestik (Bombyx mori)” ini dilakukan mulai Januari 2012 sampai dengan Januari 2013 di Laboratorium Biologi Molekuler, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) gedung PAU lantai 3.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA dan Dra. Taruni Sri Prawasti, M.Si. atas bimbingan dan arahan yang diberikan. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada keluarga tercinta yang senantiasa memberi cinta, doa, dan dukungan, Ucapan terima kasih pada teman-teman satu laboratorium (Gita Kusuma Rahayu, Dewi Murni P.S., Ratna Puspita, Dini Herlina dan Lydia Sari), teman Biologi angkatan 44 yang lainnya, dan teman-teman di Wisma Cemara yang selalu memberikan dukungan semangat untuk menyelesaikan karya ilmiah ini.

Penulis berharap semoga karya tulis ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.

Bogor, 19 Maret 2013

6

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 13 Februari 1989 dari pasangan Bapak Eka Prawira Raharja dan Ibu Supadmi. Penulis merupakan anak pertama dari tiga bersaudara. Penulis menyelesaikan pendidikan dasar dan menengah di SDN Cipedak 01 pagi pada tahun 2001, SMPN 253 Jakarta pada tahun 2004, dan SMA Yayasan Perguruan Rakyat 1 Jakarta pada tahun 2007. Setelah itu, penulis melanjutkan pendidikan tinggi pada Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui Undangan Seleksi Mahasiswa Institut Pertanian Bogor (USMI).

Penulis aktif berpartisipasi dalam berbagai aktivitas kepanitiaan seperti menjadi panitia anggota Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMABIO) divisi Biosains 2008/2009, panitia Logistik dan Transportasi dalam acara T’ n B’ going to Bandung 2009, panitia logstran Lomba Cepat Tepat Biologi (LCTB) dalam acara kompetisi sains tingkat SMA se-Indonesia, Pesta Sains Nasional 2009.

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR GAMBAR ...viii

DAFTAR LAMPIRAN ...viii

PENDAHULUAN Latar Belakang ... ...1

Tujuan Penelitian ... 1

BAHAN DAN METODE Pengambilan Sampel Penelitian ... 1

Ekstraksi RNA Ulat Sutera B. mori ... 1

Sintesis complementary DNA (cDNA) ... 2

Amplifikasi cDNA ... 2

Perunutan DNA ... 2

HASIL Ekstraksi RNA B.mori... 3

Amplifikasi cDNA ... 3

Perunutan DNA ... 3

PEMBAHASAN ... 4

SIMPULAN DAN SARAN Simpulan ... 5

Saran... 5

8

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Hasil elektroforesis RNA B. mori BC8 (a) dan B.mori BC10 (b) ... 3

2 Hasil amplifikasi gen β-aktin B. mori BC8 ... 3

3 Hasil amplifikasi gen GAPDH B.mori BC10 ... 3

4 Hasil amplifikasi gen Ser2B. mori BC8 dan B. mori BC10 ... 3

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman 1 Struktur anatomi dan bagian-bagian kelenjar sutera B. mori ... 8

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Benang sutera dihasilkan dari ulat sutera (Lepidoptera). Ulat sutera dikelompokkan menjadi ulat sutera domestik

(domestic silk worm) dari famili

Bombycidae (Bombyx mori) dan ulat sutera liar (wild silk worm ) dari famili Saturniidae (Attacus atlas, Cricula trifenestrata, Antheraea pernyi dan Philosamia ricini) (Solihin et al. 2010). Ulat B. mori telah lebih dulu dikenal oleh masyarakat karena merupakan ulat yang sudah didomestikasi (Atmosoedarjo et al. 2000). Jenis ulat sutera liar yang penyebarannya luas di Indonesia adalah A. atlas dan C. trifenestrata.

Ulat B. mori dan ulat sutera lainnya termasuk serangga holometabola yaitu serangga yang mengalami metamorfosis sempurna. Siklus hidupnya terbagi menjadi empat tahap yaitu telur, larva, pupa, dan imago atau ngengat dewasa (Gullan & Cranston 2000). Ulat B. mori bersifat monofagus yang berarti ulat yang hanya memakan satu jenis daun tertentu. Murbei (Morus sp.) merupakan satu-satunya pakan bagi ulat sutera jenis B. mori (Kusumaputra dan Samsijah 1976).

Ulat B. mori diklasifikasi galurnya berdasarkan tempat asal seperti Jepang, China, Eropa, dan Korea. Berdasarkan jumlah generasi per tahun (voltinisme), ulat

B. mori dapat dibedakan menjadi tiga

kelompok yaitu univoltin (satu generasi dalam satu tahun), bivoltin (dua generasi dalam satu tahun) dan polivoltin (tiga atau lebih generasi dalam satu tahun) (Atmosoedarjo et al. 2000). Di daerah tropik, polivoltin yang tahan terhadap suhu tinggi, dipelihara atau dijadikan induk untuk persilangan.

Serat sutera mulai diproduksi di kelenjar sutera pada tahap larva instar terakhir menjelang pembentukkan kokon. Komponen utama dari serat sutera adalah fibroin dan serisin (Mondal et al. 2007). Fibroin adalah protein serat dari sutera dan dihasilkan dari kelenjar sutera posterior. Serisin merupakan protein perekat yang menutupi permukaan fibroin dan dihasilkan di kelenjar sutera bagian tengah (Tazima 1964). Serisin telah dipelajari sebagai salah satu biomaterial untuk bahan non-tekstil seperti kosmetik, bahan makanan, dan farmasi karena mempunyai sifat antibakteri, antitumor, antioksidan, dan tahan terhadap sinar UV (Dash etal. 2008).

Protein serisin disandi oleh tiga gen serisin, yaitu Ser1, Ser2, dan Ser3 yang terdapat pada kromosom ke-11 (Takasu et al. 2005). Gen Ser2 berperan penting dan mendominasi dalam proses pembentukan serat saat ulat berada dalam tahap pertumbuhan. Karakterisasi gen melalui jalur purifikasi RNA dan mRNA akan lebih cepat, walaupun sekuen bagian dari gen yang didapatkan hanya bagian yang ditranskripsikan (Cds) tanpa adanya bagian intronnya (Takasu etal. 2010).

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan mengkarak-teristisasi keragaman genetik gen Ser2 pada ulat sutera domestik B. mori

BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari 2012 hingga Januari 2013 di Laboratorium Biologi Molekuler, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) gedung PAU lantai 3 dan Laboratorium Terpadu Departemen Biologi.

Pengambilan Sampel Penelitian

Pengambilan sampel ulat B. mori dilakukan di Rumah Sutera Alam yang berlokasi di Jalan Ciapus Raya 100, Batu Gede, Kecamatan Taman Sari, Kabupaten Bogor, Provinsi Jawa Barat. Ulat B. mori yang didapatkan merupakan strain C301 (Candiroto-Indonesia) hasil persilangan B. mori strain Jepang dengan B. mori strain Cina. Ulat yang didapatkan sebanyak lima ekor asal Candiroto dan yang diekstraksi sebanyak dua ekor yaitu B. mori yang berkode BC 8 dan B. mori berkode BC 10.

Ekstrasi RNA Ulat Sutera B. mori

Kelenjar sutera bagian tengah pada ulat sutera B. mori (Lampiran 1) diekstraksi untuk analisis RNA, dengan menggunakan Rneasy Mini Kit (Qiagen).

Kelenjar sutera bagian tengah pada ulat B. mori dipotong dan ditimbang seberat 25 mg, selanjutnya digerus dengan bantuan nitrogen cair. Sampel yang telah digerus sampai halus, ditambah Reagent for Lysis of

the Tissue (RLT) sebanyak 400 µl dan

digerus kembali sampai homogen. Larutan hasil peggerusan dipindah ke dalam tabung mikro ukuran 1.5 ml dan diputar secara manual menggunakan tangan dengan

2

membentuk angka delapan selama 10 menit. Selanjutnya campuran diresuspensi dengan bantuan pipet mikro kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Setelah inkubasi, isi campuran dalam tabung mikro disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 1 menit. Supernatan yang terbentuk dipindahkan ke dalam tabung mikro yang baru, kemudian ditambahkan etanol 70% (1:1), dan diputar kembali secara manual selama 10 menit. Larutan tersebut dipindahkan ke dalam tabung spin coloumn yang dilengkapi dengan tabung penampung di bawahnya. Tabung spin coloumn beserta isinya disentrifugasi 10000 rpm selama 1 menit. Setelah disentrifugasi, cairan yang berada pada tabung penampung dibuang. Tabung spin coloumn ditambah Wash

Reagent (RW1) sebanyak 700 µl dan

disentrifugasi 10000 rpm selama 1 menit dan cairan yang berada pada tabung penampung dibuang. Tabung spin coloumn ditambahkan Elution Reagent (RPE) sebanyak 500 µl dan disentrifugasi 10000 rpm selama 1 menit dalam dua kali pengulangan. Tabung spin coloumn yang telah disentrifugasi, dipindahkan ke dalam tabung penampung yang baru, ditambahkan RNase- free water sebanyak 50 µl pada membran spin coloumn, diinkubasi 3 menit pada suhu kamar, kemudian disentrifugasi 10000 rpm selama 1 menit. Integritas RNA dievaluasi dengan memasukkan sampel ke dalam gel agarose 1.2% dan dijalankan pada mesin elektroforesis. Sampel RNA dilihat di bawah UV transluminator dan difoto menggunakan GEL DOC.

Sintesis complementary DNA (cDNA)

Transkripsi balik pembentukan cDNA dilakukan dengan menggunakan RevertAid Transcriptase (Thermo Scientific Inc).

Komposisi bahan-bahan dalam sintesis cDNA terdiri atas double distilled

water sebanyak 7 µl ditambah dengan

buffer sebanyak 4 µl, RNA sebanyak 4 µl, dNTP sebanyak 2 µl, Oligo dT sebanyak 1 µl, Riboloks sebanyak 1 µl, dan RevertAid sebanyak 1 µl. Setelah campuran cDNA dibentuk, selanjutnya diinkubasi ke dalam mesin thermal cycler verity dengan suhu 42ºC selama 60 menit dan dilanjutkan dengan suhu 70ºC selama 5 menit.

Amplifikasi cDNA

Sampel cDNA yang telah terbentuk, diamplifikasi dengan menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). Proses

amplifikasi cDNA menggunakan dua macam primer yaitu pasangan primer housekeeping gene dan gen target. Kedua pasangan primer housekeeping gene yang digunakan dalam amplifikasi adalah Sense-Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (S-GAPDH), Antisense Glyceraldehyde

3-phosphate dehydrogenase (A-GAPDH) dan

Sense-β-actin (S-β-act) dan

Antisense-β-actin (A-β-act). Housekeeping gene

digunakan sebagai kontrol internal untuk menormalisasi ekspresi gen target. Pasangan primer gen target Ser2 yang digunakan dalam proses amplifikasi cDNA adalah F-Ser2 dan R-Ser2 koleksi dari Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA.

Komposisi bahan-bahan dalam amplifikasi cDNA terdiri dari double distilled water sebanyak 13.8 µl, buffer sebanyak 2.5 µl, MgCl2 sebanyak 2.5 µl,

cDNA sebanyak 3 µl, Taq polymerase sebanyak 0.2 µl, serta dNTP dan kedua primer masing-masing 1 µl. Teknik PCR ini dilakukan dengan menggunakan mesin Esco. Tahap pertama dalam PCR adalah pra-denaturasi 94ºC (3 menit). Tahap kedua terdiri atas 35 siklus dengan proses denaturasi 94ºC (45 detik), penempelan primer GAPDH pada suhu 58ºC, penempelan primer β-aktin pada suhu 61ºC dan penempelan primer Ser2 pada suhu 62ºC dengan waktu penempelan masing-masing 1.5 menit, serta pemanjangan 72ºC (1 menit). Tahap ketiga adalah pemanjangan terakhir 72ºC (7 menit). Produk PCR dielektroforesis menggunakan 1.2% gel agarose dengan waktu 60 menit. Panjang produk PCR dengan primer GAPDH adalah 498 pasang basa, β-aktin menghasilkan 353 pasang basa dan primer serisin 2 menghasilkan 520 pasang basa.

Perunutan DNA

Perunutan nukleotida dilakukan melalui perusahaan penyedia jasa sekuen, yaitu PT. Genetika Sains Indonesia. Perunutan (sequencing) masing-masing sampel lengkap dua arah baik forward maupun reverse-nya. Pensejajaran dilakukan dengan menggunakan Clustal W pada software Molecular Evolutionary Genetic Analysis version 4.0 MEGA4 (Tamura et al. 2007). Hasil pensejajaran kemudian dilakukan analisis komposisi nukleotida dan membandingkan persentase kekerabatan spesies berdasarkan Basic Local Alignment Search Tool- nucleotide (BLAST n) pada situs Http://blast.ncbi.nlm.nih.gov.

HASIL Ekstraksi RNA B. mori

Hasil ekstraksi RNA dari kelenjar sutera bagian tengah ulat sutera B. mori dapat divisualisasikan di bawah UV transluminator. Hasil ekstraksi tersebut menghasilkan dua pita RNA, yaitu pita RNA ribosomal (rRNA) 28S dan rRNA18S (Gambar 1(a) dan (b) ).

(a) (b)

Gambar 1 Hasil elektroforesis RNA B. mori BC8 (a) RNA dari B. mori BC10 (b).

Kemurnian hasil ekstraksi RNA diukur menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 260A/280A didapatkan hasil rata-rata 1.6.

Amplifikasi cDNA

Amplifikasi cDNA dilakukan dengan primer housekeeping gene dan gen target divisualisasi di bawah UV transluminator dan difoto menggunakan GEL DOC. Amplifikasi gen β-aktin pada B. mori BC8 menghasilkan 353 pasang basa (Gambar 2) dan amplifikasi gen GAPDH pada B. mori BC10 menghasilkan 420 pasang basa (Gambar 3).

M 1

Gambar 2 Hasil amplifikasi gen β-aktin B. mori BC8. M= DNA ladder 100 bp, 1= amplifikasi gen β-aktin B. mori BC8.

M 1

Gambar 3 Hasil amplifikasi gen GAPDH B.mori BC10. M= DNA ladder 100 bp, 1= amplifikasi gen GAPDH B. mori BC10.

Panjang produk PCR dengan primer serisin 2 menghasilkan 520 pasang basa (Gambar 4).

M 1 2

Gambar 4 Hasil amplifikasi gen Ser2 B. mori BC8 dan B. mori BC10. M= DNA ladder 100 bp, 1= amplifikasi gen Ser2 B. mori BC 8 dan 2= gen serisin 2 B. mori BC10.

Perunutan Nukleotida

Sampel B. mori BC8 dan BC 10 disejajarkan dan diperoleh fragmen sepanjang 520 nukleotida dengan persentase runutan nukleotida sama 100 % atau bersifat

conserve. Komposisi nukleotida tersebut

terdiri atas adenin 228 basa (43.8%), timin 104 basa (20%), sitosin 69 basa (13.3%), dan guanin 119 basa (22.9%). Hasil tingkat persentase kekerabatan B. mori dengan individu lain melalui program BLAST n (Lampiran 2) menunjukkan bahwa B. mori BC8 dan B. mori BC10 memiliki kesamaan 28S 18 S

353bp 420 bp 500bp 520bp 500bp 500bp

4

100% dengan B. mori serisin 2 (Ser2) transcript variant 2, mRNA (Genebank: NM001172817.1), B. mori serisin 2 (Ser2) transcript variant 1, mRNA (Genebank: NM001172816.1) dan B. mori serisin 2 precursor (Ser2) gene, complete cds

alternatively spliced (Genebank:

GQ381286.1).

PEMBAHASAN

Purifikasi RNA pada kelenjar sutera bagian tengah B. mori BC8 dan BC10 (Gambar 1) didapatkan hasil masing-masing dua pita yaitu rRNA 28 S dan rRNA 18 S. Kemurnian RNA diukur menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 260A/280A didapatkan hasil rata-rata 1.6. Batas kemurnian RNA yang baik pada ratio A260/A280 adalah 1.8-2.0 (Sambrook et al. 1989). Hal ini menunjukan bahwa RNA BC8 dan BC10 mengandung kontaminasi DNA genom.

Hasil RNA yang terbentuk kemudian dijadikan cetakan dalam pembentukan cDNA. Penggunaan cDNA dalam kegiatan molekular lebih baik dibanding RNA (mRNA) secara langsung. Hal ini dikarenakan RNA memiliki sifat yang tidak stabil terhadap suhu tinggi dan mudah terdegradasi RNase. Larutan-larutan yang penting dalam proses sintesis cDNA yaitu dNTP, oligo- dT, riboloks, enzim transkriptase. Larutan dNTP atau kependekan dari deoksi nucleotida

triphosphate merupakan larutan yang

mengandung monomer penyusun DNA (Guanin, Adenin, Sitosin, dan Timin). Tanpa adanya dNTP maka proses penyusunan komplemen dari mRNA yang akan ditranskrip balik dengan bantuan enzim reverse transcriptase tidak akan berjalan karena tidak ada monomer yang bisa dipolimerasi menjadi utas cDNA. Oligo-dT dapat digunakan sebagai primer untuk semua mRNA yang memiliki poly A pada ujung 3’ secara simultan. Umumnya primer jenis ini digunakan apabila mRNA yang digunakan berasal dari sel eukariot, sebab pada sel eukarot sel akan menambahkan poly-A (melakukan adenilasi) pada ujung 3’ setelah proses splicing untuk menghilangkan intron (Feron et al. 2004). Riboloks digunakan untuk menghilangkan RNase pada saat sintesis cDNA berlangsung. Enzim

reverse transcriptase merupakan enzim yang

digunakan untuk mensintesis mRNA menjadi untai DNA. Pada penelitian ini,

enzim yang digunakan adalah Revertaid™ reverse transcriptation.

Sintesis cDNA telah berhasil diamplifikasi menggunakan primer gen β-aktin dan primer gen GAPDH. Hal ini menunjukkan bahwa kualitas cDNA yang didapatkan cukup baik untuk dapat diteruskan pada tahap pencarian gen targetnya (Butet 2013). Gen target atau gen Ser2 didapatkan sebesar 520 bp. Keberhasilan DNA template menempel pada primer itu bergantung pada kualitas dan integritas RNA dan cara memasukkan bahan-bahan baku dalam pembuatan cDNA serta sampel amplifikasi gen target. Modifikasi yang dilakukan antara lain menambahkan volume MgCl2 dan volume

DNA cetakan. Dengan adanya MgCl2 ini

akan meningkatkan interaksi primer dengan DNA cetakan yang membentuk kompleks larut dengan dNTP (Handoyo & Rudiretna 2001). Selain itu pengaturan suhu optimasi dalam proses annealing turut menjadi faktor keberhasilan penempelan primer terhadap cDNA. Jika suhu terlalu tinggi dari suhu optimum, hal ini akan menyebabkan primer tidak menempel dengan cDNA. Jika suhu terlalu rendah dari suhu optimum menyebabkan misspriming yaitu penempelan primer pada tempat yang salah pada DNA cetakan sehingga dihasilkan produk non spesifik (Newton & Graham 1997).

Penggunaan gen Ser2 dalam penelitian ini memiliki beberapa karakteristik sifat kimia. Beberapa sifat kimia dari serisin adalah komposisi utama serisin B. mori adalah protein (91.6%), abu (4.2%), dan gula (0.93%) (Wu et al. 2007). Selain itu, protein serisin mempunyai berat molekul antara 10-310kb (Wei et al. 2005) Program bioinformatika BLAST n menggunakan analisis statistik untuk menghasilkan nila identitas maksimum dan E-value. Nilai yang tertera pada BLAST n menunjukkan tingkat keakuratan nilai pensejajaran sekuens berupa nukleotida yang tidak diketahui dengan sekuens nukleotida yang terdapat dalam basis data. Semakin tinggi nilai identitas maksimum yang diperoleh semakin tinggi tingkat homologi antar sekuens. Nilai E-value merupakan nilai dugaan yang memberikan ukuran statistik yang signifikan terhadap sekuens. Nilai E-value yang semakin tinggi menunjukkan tingkat homologi antar sekuens semakin rendah. Nilai E-value bernilai 0 (nol) menunjukkan bahwa kedua

atau lebih sekuens memiliki keidentikan. (Claverie & Notredame 2003). Sekuens nukleotida gen serisin pada spesies B. mori SBC8 dan SBC10 serta sekuens hasil BLAST n Bombyx mori serisin 2 (Ser2) transcript

variant 2, mRNA (Genebank:

NM001172817.1), Bombyx mori serisin 2

(Ser2) transcript variant 1, mRNA

(Genebank: NM001172816.1) dan Bombyx

mori serisin 2 precursor (Ser2) gene,

complete cds alternatively spliced

(Genebank: GQ381286.1) memiliki

kesamaan 100%, tidak ada variasi pada semua individu. Hal ini berarti bahwa nukleotida tersebut bersifat conserve pada level spesies. Gen yang bersifat conserve menunjukkan signifikansi fungsional yang artinya keberadaan produk gen sangat fital bagi protein yang dikodenya (Sezutsu et al. 2008).

SIMPULAN

Kelenjar sutera bagian tengah telah berhasil diekstraksi dan diamplifikasi gen Ser2 dari ulat B. mori asal candiroto-Indonesia. Runutan nukleotida yang berhasil disekuensing sepanjang 520 nukleotida yang memiliki kesamaan 100% dengan B. mori serisin 2 (Ser2)transcript variant 2, mRNA

(Genebank: NM001172817.1), B. mori

serisin 2 (Ser2)transcript variant 1, mRNA

(Genebank: NM001172816.1) dan B. mori

serisin 2 precursor (Ser2) gene, complete cds

alternatively spliced (Genebank:

GQ381286.1).

SARAN

Penelitian selanjutnya disarankan untuk mengkarakterisasi gen Ser2 kelenjar sutera bagian tengah pada ulat sutera famili Saturniidae sehingga tereksplorasi perbandingan keragaman gen antara spesies dari famili Bombycidae dan famili Saturniidae.

DAFTAR PUSTAKA

Atmosoedarjo S, Moerdoko W, Kaomini M, Kartasubrata J. 2000. Sutera Alam

Indonesia. Yogyakarta: Yayasan Sarana

Wana Jaya.

Butet NA. 2013. Ekspresi gen Hsp70 pada kerang darah Anadara granosa dalam merespon logam berat merkuri yang bersifat genotoksik [disertasi]. Bogor:

Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Claverie JM, Notredame C. 2003.

Bioinformatics for Dummies.

Indianapolis: Willey Publishing. Dash R, Acharya C, Bindu PC, Kundu SC.

2008. Antioxidant potential of silk protein sericin against hydrogen peroxide-induced oxidative stressin skin fibroblast. BMB Reports 41:236-241. Feron R, Mariani C, Vriezen HW. 2004.

Application of the mRNA capture kit in cDNA-AFLP. Biochemica 3:23-24. Gullan PJ, Cranston PS. 2000. The Insects

An Outline of Entomology. London:

Blackwell Science Ltd.

Handoyo D, Rudiretna A. 2001. Prinsip umum dan pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR). Unitas 9:17-29. Kusumaputra SA dan Samsijah. 1976.

Pengaruh Pemberian Makan Ulat Kecil dan Ulat Besar dengan Daun Murbei

yang Berbeda Jenisnya Terhadap

Rendemen Pemeliharaan dan Mutu Kokon. Lembaga Penelitian Kehutanan. Bogor.

Mondal M, Kumar SN, Trivedy K. 2007. The silk protein, sericin, fibroin in silkworm, Bombyx mori Linn: A review. J Env Sci 5:63-67.

Newton CR, Graham A. 1997. PCR introduction to Biotechnique. Second

Edition. Oxford: Bios Scientific

Publisher Ltd.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniati T. 1989.

Molecular Cloning A Laboratory

Manual. USA: Cold Spring Harbor Lab

Press.

Solihin DD et al. 2010. Budidaya ulat sutera alam Attacus atlas. Jakarta: Penebar Swadaya.

Sezutsu H, Tamura T, Yukuhiro K.. 2008. Leucine-rich fibroin gene of the Japanese wild silkmoth, Rhodinia fugax (Leptidoptera: Saturniidae). Europ J of

Entomol 105:561-566

Takasu Y, Yamada H, Saito H, Tsubouchi. 2005. Characterization of Bombyx mori sericin by the partial amino acid sequence. J of Insect Biotec and Sericol 74: 103-109

Takasu Hata T, Uchino K, Zhang Q. 2010. Identification of Ser2 proteins as major sericin components in the non-cocoon silk of Bombyx mori. Insect Biochem Mol Biol 40:339-344

Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. 2007. Mega 4: Molecular evolutionary

6

genetics analysis. Software Version 4. J Mol Biol Evol 24: 1596-1599

Tazima Y. 1964. The Genetics of The

Silkworm. London: Logos Press

Wei T, Li MZ, Xie RJ. 2005. Preparation and structure of porous silk sericin materials. Macromolecular Material

and Engineering 290:188-194.

Wu JH, Wang Z, Xu SY. 2007. Preparation and characterization of sericin powder extracted from silk industry wate water.

8

Lampiran 1 Struktur anatomi dan bagian-bagian kelenjar sutera B, mori

Struktur anatomi Bombyx mori a = kepala, b = kelenjar sutera, dan c = bagian anal

Bagian-bagian kelenjar sutera B. mori a= kelenjar sutera bagian depan, b= kelenjar sutera bagian tengah, dan c= kelenjar sutera bagian belakang

a

c

b

Lampiran 2 Tingkat persentase kekerabatan B. mori pada gene bank melalui program BLAST n

Description Max Score

Total Score

Query Cover

E-Value

Max-Ident

Accecsion Bombyx mori Serisin 2 (Ser2),

Transcript variant 2, mRNA

933 1375 97% 0.0 100% NM

001172817.1 Bombyx mori Serisin 2 (Ser2),

Transcript variant 1, mRNA

933 1375 97% 0.0 100% NM

001172816.1 Bombyx mori Serisin 2 precursor

(Ser2) gene complete cds alternatively spliced

843 1378 97% 0.0 100% GQ 381286.1

100% dengan B. mori serisin 2 (Ser2) transcript variant 2, mRNA (Genebank: NM001172817.1), B. mori serisin 2 (Ser2) transcript variant 1, mRNA (Genebank: NM001172816.1) dan B. mori serisin 2 precursor (Ser2) gene, complete cds alternatively spliced (Genebank: GQ381286.1).

PEMBAHASAN

Purifikasi RNA pada kelenjar sutera bagian tengah B. mori BC8 dan BC10 (Gambar 1) didapatkan hasil masing-masing dua pita yaitu rRNA 28 S dan rRNA 18 S. Kemurnian RNA diukur menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 260A/280A didapatkan hasil rata-rata 1.6. Batas kemurnian RNA yang baik pada ratio A260/A280 adalah 1.8-2.0 (Sambrook et al. 1989). Hal ini menunjukan bahwa RNA BC8 dan BC10 mengandung kontaminasi DNA genom.

Hasil RNA yang terbentuk kemudian dijadikan cetakan dalam pembentukan cDNA. Penggunaan cDNA dalam kegiatan molekular lebih baik dibanding RNA (mRNA) secara langsung. Hal ini dikarenakan RNA memiliki sifat yang tidak stabil terhadap suhu tinggi dan mudah terdegradasi RNase. Larutan-larutan yang penting dalam proses sintesis cDNA yaitu dNTP, oligo- dT, riboloks, enzim transkriptase. Larutan dNTP atau kependekan dari deoksi nucleotida triphosphate merupakan larutan yang mengandung monomer penyusun DNA (Guanin, Adenin, Sitosin, dan Timin). Tanpa adanya dNTP maka proses penyusunan komplemen dari mRNA yang akan ditranskrip balik dengan bantuan enzim reverse transcriptase tidak akan berjalan karena tidak ada monomer yang bisa dipolimerasi menjadi utas cDNA. Oligo-dT dapat digunakan sebagai primer untuk semua mRNA yang memiliki poly A pada ujung 3’ secara simultan. Umumnya primer jenis ini digunakan apabila mRNA yang digunakan berasal dari sel eukariot, sebab pada sel eukarot sel akan menambahkan poly-A (melakukan adenilasi) pada ujung 3’ setelah proses splicing untuk menghilangkan intron (Feron et al. 2004). Riboloks digunakan untuk menghilangkan RNase pada saat sintesis cDNA berlangsung. Enzim reverse transcriptase merupakan enzim yang digunakan untuk mensintesis mRNA menjadi untai DNA. Pada penelitian ini,

enzim yang digunakan adalah Revertaid™ reverse transcriptation.

Sintesis cDNA telah berhasil diamplifikasi menggunakan primer gen β-aktin dan primer gen GAPDH. Hal ini menunjukkan bahwa kualitas cDNA yang didapatkan cukup baik untuk dapat diteruskan pada tahap pencarian gen targetnya (Butet 2013). Gen target atau gen Ser2 didapatkan sebesar 520 bp. Keberhasilan DNA template menempel pada primer itu bergantung pada kualitas dan integritas RNA dan cara memasukkan bahan-bahan baku dalam pembuatan cDNA serta sampel amplifikasi gen target. Modifikasi yang dilakukan antara lain menambahkan volume MgCl2 dan volume DNA cetakan. Dengan adanya MgCl2 ini akan meningkatkan interaksi primer dengan DNA cetakan yang membentuk kompleks larut dengan dNTP (Handoyo & Rudiretna 2001). Selain itu pengaturan suhu optimasi dalam proses annealing turut menjadi faktor keberhasilan penempelan primer terhadap cDNA. Jika suhu terlalu tinggi dari suhu optimum, hal ini akan menyebabkan primer tidak menempel dengan cDNA. Jika suhu terlalu rendah dari suhu optimum menyebabkan misspriming yaitu penempelan primer pada tempat yang salah pada DNA cetakan sehingga dihasilkan produk non spesifik (Newton & Graham 1997).

Penggunaan gen Ser2 dalam penelitian ini memiliki beberapa karakteristik sifat kimia. Beberapa sifat kimia dari serisin adalah komposisi utama serisin B. mori adalah protein (91.6%), abu (4.2%), dan gula (0.93%) (Wu et al. 2007). Selain itu, protein serisin mempunyai berat molekul antara 10-310kb (Wei et al. 2005) Program bioinformatika BLAST n menggunakan analisis statistik untuk menghasilkan nila identitas maksimum dan E-value. Nilai yang tertera pada BLAST n menunjukkan tingkat keakuratan nilai pensejajaran sekuens berupa nukleotida yang tidak diketahui dengan sekuens nukleotida yang terdapat dalam basis data. Semakin tinggi nilai identitas maksimum yang diperoleh semakin tinggi tingkat homologi antar sekuens. Nilai E-value merupakan nilai dugaan yang memberikan ukuran statistik yang signifikan terhadap sekuens. Nilai E-value yang semakin tinggi menunjukkan tingkat homologi antar sekuens semakin rendah. Nilai E-value bernilai 0 (nol) menunjukkan bahwa kedua

atau lebih sekuens memiliki keidentikan. (Claverie & Notredame 2003). Sekuens nukleotida gen serisin pada spesies B. mori SBC8 dan SBC10 serta sekuens hasil BLAST n Bombyx mori serisin 2 (Ser2) transcript variant 2, mRNA (Genebank: NM001172817.1), Bombyx mori serisin 2 (Ser2) transcript variant 1, mRNA (Genebank: NM001172816.1) dan Bombyx mori serisin 2 precursor (Ser2) gene, complete cds alternatively spliced (Genebank: GQ381286.1) memiliki kesamaan 100%, tidak ada variasi pada semua individu. Hal ini berarti bahwa nukleotida tersebut bersifat conserve pada level spesies. Gen yang bersifat conserve menunjukkan signifikansi fungsional yang artinya keberadaan produk gen sangat fital bagi protein yang dikodenya (Sezutsu et al. 2008).

SIMPULAN

Kelenjar sutera bagian tengah telah berhasil diekstraksi dan diamplifikasi gen Ser2 dari ulat B. mori asal candiroto-Indonesia. Runutan nukleotida yang berhasil disekuensing sepanjang 520 nukleotida yang memiliki kesamaan 100% dengan B. mori serisin 2 (Ser2) transcript variant 2, mRNA (Genebank: NM001172817.1), B. mori serisin 2 (Ser2) transcript variant 1, mRNA (Genebank: NM001172816.1) dan B. mori serisin 2 precursor (Ser2) gene, complete cds alternatively spliced (Genebank: GQ381286.1).

SARAN

Penelitian selanjutnya disarankan untuk mengkarakterisasi gen Ser2 kelenjar sutera bagian tengah pada ulat sutera famili Saturniidae sehingga tereksplorasi perbandingan keragaman gen antara spesies dari famili Bombycidae dan famili Saturniidae.

DAFTAR PUSTAKA

Atmosoedarjo S, Moerdoko W, Kaomini M, Kartasubrata J. 2000. Sutera Alam Indonesia. Yogyakarta: Yayasan Sarana Wana Jaya.

Butet NA. 2013. Ekspresi gen Hsp70 pada kerang darah Anadara granosa dalam merespon logam berat merkuri yang bersifat genotoksik [disertasi]. Bogor:

Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Claverie JM, Notredame C. 2003. Bioinformatics for Dummies. Indianapolis: Willey Publishing. Dash R, Acharya C, Bindu PC, Kundu SC.

2008. Antioxidant potential of silk protein sericin against hydrogen peroxide-induced oxidative stressin skin fibroblast. BMB Reports 41:236-241. Feron R, Mariani C, Vriezen HW. 2004.

Application of the mRNA capture kit in cDNA-AFLP. Biochemica 3:23-24. Gullan PJ, Cranston PS. 2000. The Insects

An Outline of Entomology. London: Blackwell Science Ltd.

Handoyo D, Rudiretna A. 2001. Prinsip umum dan pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR). Unitas 9:17-29. Kusumaputra SA dan Samsijah. 1976.

Pengaruh Pemberian Makan Ulat Kecil dan Ulat Besar dengan Daun Murbei yang Berbeda Jenisnya Terhadap Rendemen Pemeliharaan dan Mutu Kokon. Lembaga Penelitian Kehutanan. Bogor.

Mondal M, Kumar SN, Trivedy K. 2007. The silk protein, sericin, fibroin in silkworm, Bombyx mori Linn: A review. J Env Sci 5:63-67.

Newton CR, Graham A. 1997. PCR introduction to Biotechnique. Second Edition. Oxford: Bios Scientific Publisher Ltd.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniati T. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual. USA: Cold Spring Harbor Lab Press.

Solihin DD et al. 2010. Budidaya ulat sutera alam Attacus atlas. Jakarta: Penebar Swadaya.

Sezutsu H, Tamura T, Yukuhiro K.. 2008. Leucine-rich fibroin gene of the Japanese wild silkmoth, Rhodinia fugax (Leptidoptera: Saturniidae). Europ J of Entomol 105:561-566

Takasu Y, Yamada H, Saito H, Tsubouchi. 2005. Characterization of Bombyx mori sericin by the partial amino acid sequence. J of Insect Biotec and Sericol 74: 103-109

Takasu Hata T, Uchino K, Zhang Q. 2010. Identification of Ser2 proteins as major sericin components in the non-cocoon silk of Bombyx mori. Insect Biochem Mol Biol 40:339-344

Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. 2007. Mega 4: Molecular evolutionary

genetics analysis. Software Version 4. J Mol Biol Evol 24: 1596-1599

Tazima Y. 1964. The Genetics of The Silkworm. London: Logos Press

Wei T, Li MZ, Xie RJ. 2005. Preparation and structure of porous silk sericin materials. Macromolecular Material and Engineering 290:188-194.

Wu JH, Wang Z, Xu SY. 2007. Preparation and characterization of sericin powder extracted from silk industry wate water. Food Chem 103:1255-1262

Lampiran 1 Struktur anatomi dan bagian-bagian kelenjar sutera B, mori

Struktur anatomi Bombyx mori a = kepala, b = kelenjar sutera, dan c = bagian anal

Bagian-bagian kelenjar sutera B. mori a= kelenjar sutera bagian depan, b= kelenjar sutera bagian tengah, dan c= kelenjar sutera bagian belakang

a

c

b

Lampiran 2 Tingkat persentase kekerabatan B. mori pada gene bank melalui program BLAST n

Description Max

Score

Total Score

Query Cover

E-Value

Max-Ident

Accecsion Bombyx mori Serisin 2 (Ser2),

Transcript variant 2, mRNA

933 1375 97% 0.0 100% NM

001172817.1 Bombyx mori Serisin 2 (Ser2),

Transcript variant 1, mRNA

933 1375 97% 0.0 100% NM

001172816.1 Bombyx mori Serisin 2 precursor

(Ser2) gene complete cds alternatively spliced

843 1378 97% 0.0 100% GQ 381286.1