Gambaran Spermatogenesis dan Superoksida Dismutase pada Testis Tikus Model Diabetes yang Diberi Ekstrak Etanol Biji Mahoni (Swietenia mahagoni Jacq.).
GAMBARAN SPERMATOGENESIS DAN SUPEROKSIDA
DISMUTASE PADA TESTIS TIKUS MODEL DIABETES
YANG DIBERI EKSTRAK ETANOL BIJI MAHONI (Swietenia
mahagoni Jacq.)
RIFA RINALDI
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi Gambaran Spermatogenesis dan
Superoksida Dismutase pada Testis Tikus Model Diabetes yang Diberi Ekstrak
Etanol Biji Mahoni (Swietenia mahagoni Jacq.) adalah benar karya saya dengan
arahan dosen pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada
perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Mei 2015
Rifa Rinaldi
NIM B04110019
ABSTRAK
RIFA RINALDI. Gambaran Spermatogenesis dan Superoksida Dismutase pada
Testis Tikus Model Diabetes yang Diberi Ekstrak Etanol Biji Mahoni (Swietenia
mahagoni Jacq.). Dibimbing oleh TUTIK WRESDIYATI.
Diabetes melitus (DM) adalah suatu penyakit metabolik yang ditandai
dengan hiperglikemia. Tujuan penelitian ini adalah menganalisis jumlah sel-sel
spermatogenik, jumlah sel Leydig, dan kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada
jaringan testis tikus model DM yang diberi ekstrak etanol biji mahoni. Penelitian
ini menggunakan hewan coba sebanyak 25 ekor tikus Sprague Dawley dan dibagi
menjadi 5 kelompok; kelompok non DM (K-), kelompok DM (K+), kelompok
DM diberi ekstrak etanol biji mahoni (EM), kelompok DM diberi acarbose 2
mg/kg berat badan (KO), kelompok non DM diberi ekstrak etanol biji mahoni
(KE). Dosis ekstrak sebesar 500 mg/kg BB. Perlakuan diberikan selama 28 hari.
Jaringan testis dilakukan pemrosesan jaringan dan dilakukan pewarnaan
hematoksilin-eosin dan teknik imunohistokimia. Hasil penelitian ini menunjukkan
bahwa pemberian ekstrak etanol biji mahoni (Swietenia mahagoni Jacq.) dapat
meningkatkan jumlah sel-sel spermatogenik, jumlah sel Leydig, dan kandungan
antioksidan Cu,Zn-SOD pada jaringan testis tikus DM.
Kata kunci: antioksidan, superoksida dismutase; sel Leydig, spermatogenesis,
Swietenia mahagoni.
ABSTRACT
RIFA RINALDI. The Profile of Spermatogenesis and Superoxide Dismutase In
The Testis of Experimental Diabetic Rats Under Ethanolic Swietenia mahagoni
Jacq. Seed Extract Treatment. Supervised by TUTIK WRESDIYATI.
Diabetes mellitus (DM), a metabolic disease, is characterized by
hyperglycemia. The aim of this study was to analyze the number of spermatogenic
cells, the number of Leydig cells, and antioxidant Cu,Zn-SOD content in the
testical tissues of experimental diabetic rats treated with ethanolic Swietenia
mahagony seed extract. This study used 25 rats Sprague Dawley and the rats were
divided into 5 groups; non DM group (K-), DM group (K+), DM group that was
treated with ethanolic Swietenia mahagony seed extract (EM), DM group that was
treated with acarbose 2 mg/kg body weight (KO), and non DM group that was
treated with ethanolic Swietenia mahagony seed extract (KE). The dose of the
extract was 500 mg/kg body weight. The treatments were done for 28 days. The
testical tissues were subjected to tissue processing and stained using hematoxylin
eosine and immunohistochemical technique. The results showed that ethanolic
Swietenia mahagony Jacq. seed extract increased the number of spermatogenic
cells, the number of Leydig cells, and antioxidant Cu,Zn-SOD content in the
testical tissues of experimental DM rats.
Keywords: antioxidant, superoxide dismutase, Leydig cells, spermatogenesis,
Swietenia mahagony.
GAMBARAN SPERMATOGENESIS DAN SUPEROKSIDA
DISMUTASE PADA TESTIS TIKUS MODEL DIABETES
YANG DIBERI EKSTRAK ETANOL BIJI MAHONI (Swietenia
mahagoni Jacq.)
RIFA RINALDI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Kedokteran Hewan
pada
Fakultas Kedokteran Hewan
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Judul : Gambaran Spermatogenesis Dan Superoksida Dismutase Pada Testis
Tikus Model Diabetes Yang Diberi Ekstrak Etanol Biji Mahoni
(Swietenia mahagoni Jacq.)
Nama : Rifa Rinaldi
NIM : B04110019
Disetujui oleh
Prof Drh Tutik Wresdiyati, PhD, PAVet
Dosen Pembimbing
Diketahui oleh
Drh Agus Setiyono, MS, PhD, APVet
Wakil Dekan Bidang Akademik dan Kemahasiswaan
Tanggal lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat dan
hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul
Gambaran Spermatogenesis Dan Superoksida Dismutase Pada Testis Tikus Model
Diabetes Yang Diberi Ekstrak Etanol Biji Mahoni (Swietenia Mahagoni Jacq.).
Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat memperoleh gelar sarjana pada
Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof Drh Tutik Wresdiyati,
PhD, PAVet selaku pembimbing skripsi yang begitu sabar memberikan
pengarahan dan bimbingan bagi penulis. Terima kasih kepada Dirjen DIKTI,
Kemenristek dan Pendidikan Tinggi yang telah mendanai sebagian penelitian ini
melalui Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi Penelitian Dasar untuk Bagian
Tahun 2014 atas nama Prof Drh Tutik Wresdiyati, PhD, PAVet.
Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada keluarga tercinta
(Bapa, Mama, Teh Fika, dan seluruh keluarga besar). Kak Eka, Alam, Andi,
Rahajeng, Tyas, dan Miftahul Ilmi, sebagai teman satu penelitian, seluruh staf
pengajar dan pegawai Bagian Histologi FKH IPB, dan teman-teman yang lain atas
kerjasama dan bantuannya dalam penyelesaian skripsi.
Penulis menyadari ada kekurangan dalam karya ilmiah ini. Kritik dan
saran untuk perbaikan sangat diharapkan. Semoga karya ini bermanfaat bagi yang
memerlukan.
Bogor, Mei 2015
Rifa Rinaldi
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
viii
DAFTAR GAMBAR
viii
DAFTAR LAMPIRAN
viii
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
Manfaat Penelitian
2
TINJAUAN PUSTAKA
2
Diabetes Melitus
2
Mahoni (Swietenia mahagoni Jacq.)
2
Antioksidan
3
Testis Tikus
4
METODE PENELITIAN
4
Waktu dan Tempat Penelitian
4
Alat dan Bahan Penelitian
5
Metodologi Penelitian
5
Analisis Data
7
HASIL DAN PEMBAHASAN
8
Gambaran Histologis dan Jumlah Sel Spermatogenik
8
Jumlah Sel Leydig
9
Gambaran Histologis dan Profil Kandungan Cu,Zn-SOD
10
SIMPULAN DAN SARAN
13
DAFTAR PUSTAKA
13
LAMPIRAN
15
RIWAYAT HIDUP
23
DAFTAR TABEL
1 Pembagian kelompok perlakuan uji in vivo
2 Jumlah sel spermatogenik per tubuli seminiferi jaringan testis tikus
pada berbagai perlakuan
3 Jumlah sel Leydig pada masing-masing daerah interstitial tubuli
seminiferi
4 Profil kandungan Cu,Zn-SOD pada sel-sel spermatogenik per tubuli
seminiferi jaringan testis tikus pada berbagai perlakuan
5
8
9
12
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
Biji mahoni dengan kulit (A), biji mahoni tanpa kulit (B).
Gambaran histologis tubulus seminiferus dengan pewarnaan HE
Gambaran histologis tubuli seminiferi
Gambaran histologis terhadap kandungan Cu,Zn-SOD sel-sel
spermatogenik
3
4
8
10
DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil statistik jumlah sel spermatogenik per tubuli seminiferi jaringan
testis tikus pada berbagai perlakuan
2 Hasil statistik jumlah sel Leydig pada masing-masing daerah
interstitial tubuli seminiferi
3 Hasil statistik profil kandungan Cu,Zn-SOD pada sel-sel
spermatogenik per tubuli seminiferi jaringan testis tikus pada berbagai
perlakuan
15
17
18
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Diabetes melitus (DM) adalah suatu penyakit metabolik yang ditandai
dengan hiperglikemia sebagai akibat dari kurangnya sekresi insulin atau resistensi
insulin, ataupun keduanya. Hiperglikemia merupakan kondisi glukosa darah yang
tinggi. Kondisi ini disebabkan sedikitnya jumlah insulin dalam sirkulasi darah.
Sedikitnya jumlah insulin menyebabkan glukosa yang ditranspor dari sirkulasi
darah menuju sel jumlahnya juga sedikit, sehingga sel akan mencari sumber
energi lain melalui mekanisme pemecahan lemak, protein, dan gula otot. Proses
pemecahan tersebut dapat menghasilkan produk sampingan seperti radikal bebas.
Radikal bebas dalam jumlah normal memiliki fungsi bagi tubuh seperti dalam
ekspresi gen, pertumbuhan sel, pertahanan terhadap infeksi, dan transduksi signal
(Kunwar dan Priyadarsini 2011). Pada kondisi DM akan terjadi peningkatan
radikal bebas melalui mekanisme peningkatan pembentukan advanced glycation
end products (AGEs), peningkatan jalur poliol-sorbitol, peningkatan aktivasi
protein kinase C (PKC), peningkatan jalur hexosamine (Giacco dan Brownlee
2010). Peningkatan jumlah radikal bebas melalui mekanisme tersebut pada
kondisi DM dapat menyebabkan kondisi stres oksidatif, yaitu kondisi dimana
jumlah radikal bebas lebih tinggi dibandingkan jumlah antioksidan.
Telah dilaporkan bahwa terjadi penurunan kandungan antioksidan Copper,
Zinc-Superoxide Dismutase (Cu,Zn-SOD) pada jaringan hati Macaca fascicularis
DM (Wresdiyati et al. 2003), pada hati dan ginjal tikus DM (Wresdiyati et al.
2010), serta pada jaringan pankreas tikus DM (Wresdiyati et al. 2014), sebagai
akibat kondisi stres oksidatif. Namun status antioksidan SOD pada jaringan testis
tikus DM belum pernah dilaporkan.
Biji mahoni secara empiris digunakan untuk pengobatan tekanan darah
tinggi, diabetes, reumatik, demam, masuk angin, dan perangsang selera makan.
Ghosh et al. (2009) melaporkan bahwa ekstrak metanol biji mahoni memiliki
aktivitas antiinflamasi, analgesik, dan antipiretik. Hasan et al. (2011) melaporkan
bahwa ekstrak etanol biji mahoni bersifat hipoglikemik. Ekstrak metanol biji
mahoni memiliki potensi sebagai antidiabetes (Debasis et al. 2011). Suryani et al.
(2013) juga melaporkan bahwa ekstrak metanol biji mahoni dapat meningkatkan
kadar insulin, penurunan ekspresi TNF-α, dan perbaikan jaringan pankreas
(derajat insulitis) tikus DM. Ekstrak etanol biji mahoni (Swietenia mahagoni
Jacq.) telah dilaporkan mengandung senyawa fitokimia antioksidan flavonoid,
dapat menghambat enzim alfa-glukosidase secara in vitro dan menurunkan kadar
glukosa darah tikus hiperglikemia yang diinduksi sukrosa (Wresdiyati et al.
2015). Apakah ekstrak etanol biji mahoni mempunyai pengaruh terhadap kondisi
jaringan testis tikus DM, belum diketahui.
2
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah menganalisis jumlah sel-sel spermatogenik,
jumlah sel Leydig, dan kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada jaringan testis
tikus model DM yang diberi ekstrak etanol biji mahoni.
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini memberikan informasi bagi masyarakat dan instansi
terkait tentang khasiat biji mahoni sehingga dapat dikembangkan lebih lanjut
untuk perkembangan ilmu kesehatan.
TINJAUAN PUSTAKA
Diabetes Melitus
Diabetes melitus adalah suatu penyakit yang ditandai dengan hiperglikemia
akibat kurangnya sekresi insulin, aksi insulin, atau keduanya, serta terjadi
perubahan progresif terhadap struktur sel beta pankreas. Hiperglikemia
merupakan kondisi glukosa darah tinggi. Kondisi ini disebabkan rendahnya kadar
insulin dalam sirkulasi darah. Rendahnya kadar insulin menyebabkan jumlah
glukosa yang ditranspor dari sirkulasi darah menuju sel sedikit (ADA 2015). Pada
kondisi DM terjadi peningkatan jumlah radikal bebas yang dapat memicu
terjadinya apoptosis sel sperma dengan merusak membran mitokondria
(Darmawan 2007).
Diabetes melitus terbagi atas DM tipe 1 atau insulin-dependent diabetes
mellitus (IDDM) dan DM tipe 2 atau noninsulin-dependent diabetes mellitus
(NIDDM), serta gestational diabetes mellitus (GDM). DM tipe 1 terjadi akibat
kerusakan sel beta yang menyebabkan defisiensi insulin absolut. Sedangkan DM
tipe 2 terjadi akibat kegagalan transduksi signal atau reseptor insulin yang gagal
memberikan signal untuk transporter glukosa. Kegagalan transduksi tersebut
dapat mengakibatkan resistensi insulin. Gestational diabetes mellitus terjadi
akibat terhalangnya produksi dan atau kerja insulin yang dapat didiagnosis pada
trimester kedua atau ketiga kehamilan (ADA 2015).
Diabetes melitus memiliki efek komplikasi yang timbul oleh kelainan
vaskular mikroangiopati (retinopati, nefropati, dan neuropati) dan kelainan
vaskular makroangiopati (penyakit jantung iskemik, stroke, dan penyakit pada
pembuluh darah perifer), serta berkurangnya kualitas hidup (WHO 2006).
Mahoni (Swietenia mahagoni Jacq.)
Swietenia mahagoni merupakan tanaman yang berasal dari Hindia Barat dan
Afrika, dapat tumbuh subur bila tumbuh di pasir dekat pantai. Pada awalnya,
3
tanaman mahoni di Indonesia tumbuh secara liar di hutan-hutan. Namun sejak 20
tahun terakhir ini sudah dibudidayakan.
Mahoni merupakan pohon tahunan dengan tinggi 5-25 m, batang bulat
bercabang, daun majemuk, menyirip genap bulat telur, ujung dan pangkal runcing,
tepi rata, panjang 3-15 cm, dan pertulangan menyirip. Buah bulat telur berlekuk
lima berwarna coklat. Biji pipih, warna hitam atau coklat. Akar tunggang warna
coklat (DepKes RI 2000).
A
B
Gambar 1 Biji mahoni dengan kulit (A), biji mahoni tanpa kulit (B).
Biji mahoni secara empiris digunakan untuk pengobatan tekanan darah
tinggi, diabetes, reumatik, demam, masuk angin, dan perangsang selera makan.
Suryani et al. (2013) melaporkan bahwa ekstrak metanol biji mahoni dapat
meningkatkan kadar insulin, penurunan ekspresi TNF-α dan perbaikan jaringan
pankreas tikus DM. Ekstrak etanol biji mahoni (Swietenia mahagoni Jacq.) telah
dilaporkan mengandung senyawa fitokimia antioksidan flavonoid (Wresdiyati et
al. 2015). Ekstrak etanol biji mahoni juga dilaporkan dapat menghambat enzim
alfa-glukosidase secara in vitro dan menurunkan kadar glukosa darah tikus
hiperglikemia yang diinduksi sukrosa (Wresdiyati et al. 2015).
Antioksidan
Di dalam sistem biokimia tubuh terjadi keseimbangan antara prooksidan dan
antioksidan sehingga tubuh terhindar dari kerusakan akibat radikal bebas.
Antioksidan adalah senyawa yang dapat mencegah atau menunda oksidasi.
Antioksidan dapat diperoleh secara endogen maupun eksogen. Antioksidan
endogen merupakan antioksidan yang terdapat dalam tubuh seperti katalase
(CAT), glutation peroksidase (GPx), dan superoksida dismutase (SOD).
Antioksidan eksogen merupakan antioksidan yang berasal dari luar tubuh seperti
vitamin C, vitamin E, polifenol (flavonoid), dan lain-lain.
Hewan memiliki bentuk SOD yaitu bentuk Cu,Zn-SOD yang berada di
dalam sitoplasma dan bentuk Mn-SOD yang berada di dalam matriks mitokondria
(Halliwell 2006). Hewan juga memiliki bentuk EC-SOD yang banyak ditemukan
pada cairan ekstraselular misalnya paru-paru. Sedangkan bentuk Fe-SOD
ditemukan pada tumbuhan. Garrat et al. (2014) melaporkan pada tikus yang
kekurangan SOD dapat terjadi kerusakan saraf, gangguan reproduksi, serta
gangguan fungsi vaskular.
4
Testis Tikus
Testis terdiri dari sepasang gonad berbentuk oval yang dibungkus oleh
skrotum. Skrotum dilapisi oleh lapis superficial kulit, lapis fibrosa dan jaringan
otot yaitu tunika dartos, dan tunika vaginalis yang menutupi dinding skrotum.
Testis merupakan organ genital primer hewan jantan yang berfungsi sebagai
kelenjar endokrin dan kelenjar eksokrin. Testis sebagai kelenjar endokrin
berfungsi memproduksi hormon testosteron, sedangkan fungsinya sebagai
kelenjar eksokrin adalah sebagai penghasil spermatozoa. Fungsi endokrin
dilakukan oleh sel Leydig atau sel interstitial sedangkan spermatozoa dihasilkan
oleh kelenjar tubulus seminiferus yang merupakan komponen penyusun testis
yang terbesar. Spermatozoa dihasilkan di dalam tubulus seminiferus melalui
proses spermatogenesis pada saat hewan mencapai usia pubertas mulai dari
spermatogonia, spermatosit primer, spermatosit sekunder, spermatid, dan
spermatozoa. Unitly et al. (2014) melaporkan bahwa spermatogenesis dipengaruhi
faktor endogen (hormonal, psikologi, dan genetika) dan eksogen (bahan kimia dan
obat-obatan).
Gambar 2 Gambaran Histologi Tubulus Seminiferus dengan Pewarnaan HE
(Bacha dan Bacha 2000)
Perubahan proses spermatogenesis secara mikroskopik dapat dilihat dari
jumlah sel-sel penyusun tubulus seminiferus. Perubahan ini akan mempengaruhi
tebal epitel dan diameter tubulus seminiferus.
METODE PENELITIAN
Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan September 2014 hingga Maret 2015
di Laboratorium Histologi, Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi,
Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
5
Alat dan Bahan Penelitian
Penelitian ini menggunakan hewan coba tikus jantan galur Sprague Dawley,
biji mahoni (Swietenia mahagoni Jacq.), aloksan, akuades, jarum sonde, ketamin,
silasin, botol sampel, larutan fisiologis NaCl 0.9%, larutan Bouin, alkohol (70%,
80%, 90%, 95%, dan alkohol absolut), larutan xylol, parafin, tissue embedding
console, mikrotom, gelas ukur, seperangkat alat pewarnaan, timbangan digital,
mikropipet, larutan phosphate buffer saline (PBS), larutan H2O2, normal serum
10%, Starr Trek Universal HRP Detection Kit Control Number: 901STUHRP700-052009 (background sniper, Trekkie Universal Link, Trekk AvidinHRP, diaminobenzidine (DAB)), antibodi Cu,Zn-SOD (Sigma S2147), object
glass, cover glass, mikroskop, kamera digital, program software McMaster
Biophotonics Image J, dan program software SPSS release 22.
Metodologi Penelitian
Pembuatan ekstrak etanol biji mahoni (Swietenia mahagoni Jacq.)
Penelitian ini menggunakan biji mahoni (Swietenia mahagoni Jacq.) yang
diambil dari daerah Leuwiliang, Kabupaten Bogor. Biji mahoni dikupas,
dibersihkan, dan dikeringkan, lalu dihaluskan menggunakan blender agar
menghasilkan bentuk serbuk. Kemudian dalam botol yang berisi pelarut etanol
96% dimasukkan serbuk biji mahoni, selanjutnya dimaserasi agar memperoleh
maserat. Agar diperoleh ekstrak etanol yang kental, maserat diuapkan pada suhu
±40oC menggunakan vakum evaporator.
Uji in vivo pada tikus model diabetes
Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL), sejumlah
25 ekor tikus galur Sprague Dawley dibagi secara random menjadi 5 kelompok
perlakuan (Tabel 1).
Tabel 1 Pembagian kelompok perlakuan uji in vivo
Kelompok
Perlakuan Uji In Vivo
Kontrol Negatif (K-)
Non DM + Akuades
Kontrol Positif (K+)
DM + Akuades
Perlakuan (EM)
DM + Ekstrak etanol biji mahoni 500 mg/kg BB
Kontrol Obat (KO)
DM + Acarbose 2 mg/kg BB
Kontrol Ekstrak (KE)
Non DM + Ekstrak etanol biji mahoni 500 mg/kg BB
DM = diabetes melitus; EM = ekstrak mahoni
Perlakuan hewan
Tikus yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rattus norvegicus galur
Sprague Dawley (SD) dengan umur 10-12 minggu dan berat badan 150-200 gram,
yang diperoleh dari Unit Pengelolaan Hewan Laboratorium (UPHL) Fakultas
Kedokteran Hewan IPB. Perlakuan tikus DM (kecuali K- dan KE) diperoleh
dengan induksi aloksan dosis 110 mg/kg BB secara intraperitoneal. Tikus
6
dianggap DM jika kadar glukosa darah melebihi 200 mg/dL pada saat pengukuran
kadar glukosa darah. Selanjutnya setiap kelompok (Tabel 1) diberi perlakuan
selama 28 hari.
Sampling dan pemrosesan jaringan testis
Pengambilan sampel (sampling) dilakukan pada hari ke-29 dengan
mengorbankan tikus perlakuan. Tikus dibius menggunakan kombinasi ketamin 70
mg/kg BB dan silasin 20 mg/kg BB secara intraperitoneal, selanjutnya organ testis
diambil dan dicuci dengan larutan NaCl fisiologis 0,9%. Setelah organ dicuci
kemudian dimasukkan ke dalam larutan fiksatif Bouin selama 24 jam. Selanjutnya
jaringan didehidrasi dengan alkohol bertingkat (70%, 80%, 90%, 95%, alkohol
absolut I, II, dan III) kemudian dilanjutkan dengan tahap penjernihan (clearing)
jaringan dalam larutan xylol (xylol I, II, dan III). Kemudian dilakukan infiltrasi
dalam parafin cair (parafin cair I, II, dan III) yang dilakukan dalam oven, lalu
dilakukan penanaman (embedding) jaringan testis dalam cetakan parafin. Blok
jaringan dipotong (sectioning) dengan ketebalan 3 µm menggunakan mikrotom.
Hasil potongan jaringan testis kemudian ditempel pada object glass. Untuk
preparat yang akan dilakukan pewarnaan imunohistokimia, object glass dilem
menggunakan 0,2% neofren dalam toluen. Tahap selanjutnya adalah pewarnaan
hematoksilin-eosin (HE) dan pewarnaan imunohistokimia.
Pewarnaan hematoksilin eosin (Kiernan 1990)
Morfologi jaringan testis diamati dengan teknik pewarnaan hematoksilineosin (HE). Potongan jaringan testis pada object glass dideparafinisasi dengan
larutan xylol III, II, dan I, kemudian direhidrasi menggunakan alkohol absolut III,
II, dan I, serta alkohol 95%, 90%, 80%, dan 70% masing-masing selama 3 menit.
Selanjutnya direndam dalam air kran selama 10 menit dan akuades selama 5
menit. Kemudian preparat diwarnai menggunakan hematoksilin selama 4 menit,
lalu dimasukkan kembali dalam air kran selama 10 menit dan akuades selama 5
menit. Setelah itu, diwarnai menggunakan eosin selama 2 menit, lalu dilakukan
dehidrasi dengan alkohol bertingkat 70%, 80%, 90%, dan 95% selama 3 detik,
kemudian alkohol absolut I, II, dan III selama 1 menit. Selanjutnya dijernihkan
dengan xylol I, II, dan III selama 1 menit, kemudian di-mounting menggunakan
cover glass yang direkatkan dengan entellan®.
Pewarnaan imunohistokimia Cu,Zn-SOD
Profil antioksidan Cu,Zn-SOD jaringan testis dideteksi secara
imunohistokimia dengan menggunakan metode yang dilakukan oleh Wresdiyati et
al. (2006). Setiap tahap dilakukan pencucian dengan larutan PBS selama 5 menit
sebanyak 3 kali. Preparat jaringan testis pada object glass dideparafinasi dan
direhidrasi, lalu diinaktivasi peroksidase endogen dengan menggunakan 0,2 mL
H2O2 dalam 20 mL metanol selama 15 menit. Selanjutnya diinkubasi dalam
normal serum 10% selama 45 menit, kemudian diinkubasi kembali dalam
background sniper selama 15 menit. Kemudian preparat jaringan testis diinkubasi
dalam antibodi Cu,Zn-SOD (Sigma S2147) selama 48 jam pada suhu 4°C. Setelah
7
itu, preparat jaringan testis diinkubasi dalam Trekkie Universal Link selama 20
menit, lalu diinkubasi dalam Trekk Avidin-HRP selama 10 menit. Hasil reaksi
antara antigen dan antibodi divisualisasikan dengan diaminobenzidine (DAB)
selama 2 menit dan di-counterstain dengan hematoksilin selama 1 menit.
Kemudian preparat jaringan testis didehidrasi dalam alkohol bertingkat dan
dijernihkan dengan xylol. Selanjutnya, preparat jaringan testis yang telah diwarnai
di-mounting menggunakan cover glass yang direkatkan dengan entellan®.
Analisis Data
Kandungan Cu,Zn-SOD pada jaringan testis ditandai dengan adanya warna
coklat pada inti dan sitoplasma sel. Pengamatan dilakukan berdasarkan intensitas
warna coklat yang terbentuk pada inti dan sitoplasma sel, semakin tua warna
coklat yang ditunjukkan maka semakin banyak kandungan Cu,Zn-SOD di dalam
jaringannya. Sel yang tidak mengandung Cu,Zn-SOD akan bereaksi negatif
dengan munculnya warna biru (hematoksilin) pada inti sel dari counterstain.
Pengamatan dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif jaringan testis tikus
per tubuli seminiferi pada tahap delapan gelombang tubuli seminiferi (stage VIII
wave of the seminiferous tubule) (Wing dan Christensen 1982). Pengamatan
kualitatif dilakukan dengan mengamati morfologi sel-sel spermatogenik dan
kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada jaringan testis tikus. Sedangkan
pengamatan secara kuantitatif dilakukan dengan menghitung jumlah sel-sel
spermatogenik, sel Leydig, dan sel-sel spermatogenik yang bereaksi pada
berbagai tingkatan Cu,Zn-SOD pada jaringan testis yang diamati. Untuk melihat
perbedaan reaksi pada pewarnaan imunohistokimia Cu,Zn-SOD tersebut,
penghitungan dibagi menjadi tiga tingkatan intensitas warna untuk reaksi positif
dan satu warna untuk reaksi negatif. Reaksi positif pada berbagai tingkat
kandungan terhadap Cu,Zn-SOD pada jaringan testis ditunjukkan oleh warna
coklat tua yang menutupi keseluruhan inti sel atau positif kuat (+++), coklat
sedang yang menutupi sebagian inti sel atau positif sedang (++), dan coklat muda
yang menutupi sebagian kecil inti sel atau positif lemah (+). Sedangkan reaksi
negatif (-) ditunjukkan dengan warna biru pada inti sel akibat pemberian
counterstain (hematoksilin) yang berarti sel tidak mengandung Cu,Zn-SOD.
Penghitungan sel-sel dilakukan pada pembesaran 100x, yang dilakukan pada lima
lapang pandang berbeda secara acak pada setiap preparat jaringan (Wresdiyati et
al. 2006) menggunakan program software McMaster Biophotonics Image J
(http://rsb.info.nih.gov/ij/download. html).
Data jumlah sel-sel spermatogenik, sel Leydig, dan sel-sel spermatogenik
yang mengandung antioksidan Cu,Zn-SOD pada jaringan testis yang didapat
dianalisis dengan uji analysis of varian (ANOVA) menggunakan program
software SPSS release 22. Apabila hasil uji menunjukkan perbedaan yang nyata
(P
DISMUTASE PADA TESTIS TIKUS MODEL DIABETES
YANG DIBERI EKSTRAK ETANOL BIJI MAHONI (Swietenia
mahagoni Jacq.)
RIFA RINALDI
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi Gambaran Spermatogenesis dan
Superoksida Dismutase pada Testis Tikus Model Diabetes yang Diberi Ekstrak
Etanol Biji Mahoni (Swietenia mahagoni Jacq.) adalah benar karya saya dengan
arahan dosen pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada
perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Mei 2015
Rifa Rinaldi
NIM B04110019
ABSTRAK
RIFA RINALDI. Gambaran Spermatogenesis dan Superoksida Dismutase pada
Testis Tikus Model Diabetes yang Diberi Ekstrak Etanol Biji Mahoni (Swietenia
mahagoni Jacq.). Dibimbing oleh TUTIK WRESDIYATI.
Diabetes melitus (DM) adalah suatu penyakit metabolik yang ditandai
dengan hiperglikemia. Tujuan penelitian ini adalah menganalisis jumlah sel-sel
spermatogenik, jumlah sel Leydig, dan kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada
jaringan testis tikus model DM yang diberi ekstrak etanol biji mahoni. Penelitian
ini menggunakan hewan coba sebanyak 25 ekor tikus Sprague Dawley dan dibagi
menjadi 5 kelompok; kelompok non DM (K-), kelompok DM (K+), kelompok
DM diberi ekstrak etanol biji mahoni (EM), kelompok DM diberi acarbose 2
mg/kg berat badan (KO), kelompok non DM diberi ekstrak etanol biji mahoni
(KE). Dosis ekstrak sebesar 500 mg/kg BB. Perlakuan diberikan selama 28 hari.
Jaringan testis dilakukan pemrosesan jaringan dan dilakukan pewarnaan
hematoksilin-eosin dan teknik imunohistokimia. Hasil penelitian ini menunjukkan
bahwa pemberian ekstrak etanol biji mahoni (Swietenia mahagoni Jacq.) dapat
meningkatkan jumlah sel-sel spermatogenik, jumlah sel Leydig, dan kandungan
antioksidan Cu,Zn-SOD pada jaringan testis tikus DM.
Kata kunci: antioksidan, superoksida dismutase; sel Leydig, spermatogenesis,
Swietenia mahagoni.
ABSTRACT
RIFA RINALDI. The Profile of Spermatogenesis and Superoxide Dismutase In
The Testis of Experimental Diabetic Rats Under Ethanolic Swietenia mahagoni
Jacq. Seed Extract Treatment. Supervised by TUTIK WRESDIYATI.
Diabetes mellitus (DM), a metabolic disease, is characterized by
hyperglycemia. The aim of this study was to analyze the number of spermatogenic
cells, the number of Leydig cells, and antioxidant Cu,Zn-SOD content in the
testical tissues of experimental diabetic rats treated with ethanolic Swietenia
mahagony seed extract. This study used 25 rats Sprague Dawley and the rats were
divided into 5 groups; non DM group (K-), DM group (K+), DM group that was
treated with ethanolic Swietenia mahagony seed extract (EM), DM group that was
treated with acarbose 2 mg/kg body weight (KO), and non DM group that was
treated with ethanolic Swietenia mahagony seed extract (KE). The dose of the
extract was 500 mg/kg body weight. The treatments were done for 28 days. The
testical tissues were subjected to tissue processing and stained using hematoxylin
eosine and immunohistochemical technique. The results showed that ethanolic
Swietenia mahagony Jacq. seed extract increased the number of spermatogenic
cells, the number of Leydig cells, and antioxidant Cu,Zn-SOD content in the
testical tissues of experimental DM rats.
Keywords: antioxidant, superoxide dismutase, Leydig cells, spermatogenesis,
Swietenia mahagony.
GAMBARAN SPERMATOGENESIS DAN SUPEROKSIDA
DISMUTASE PADA TESTIS TIKUS MODEL DIABETES
YANG DIBERI EKSTRAK ETANOL BIJI MAHONI (Swietenia
mahagoni Jacq.)
RIFA RINALDI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Kedokteran Hewan
pada
Fakultas Kedokteran Hewan
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Judul : Gambaran Spermatogenesis Dan Superoksida Dismutase Pada Testis
Tikus Model Diabetes Yang Diberi Ekstrak Etanol Biji Mahoni
(Swietenia mahagoni Jacq.)
Nama : Rifa Rinaldi
NIM : B04110019
Disetujui oleh
Prof Drh Tutik Wresdiyati, PhD, PAVet
Dosen Pembimbing
Diketahui oleh
Drh Agus Setiyono, MS, PhD, APVet
Wakil Dekan Bidang Akademik dan Kemahasiswaan
Tanggal lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat dan
hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul
Gambaran Spermatogenesis Dan Superoksida Dismutase Pada Testis Tikus Model
Diabetes Yang Diberi Ekstrak Etanol Biji Mahoni (Swietenia Mahagoni Jacq.).
Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat memperoleh gelar sarjana pada
Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof Drh Tutik Wresdiyati,
PhD, PAVet selaku pembimbing skripsi yang begitu sabar memberikan
pengarahan dan bimbingan bagi penulis. Terima kasih kepada Dirjen DIKTI,
Kemenristek dan Pendidikan Tinggi yang telah mendanai sebagian penelitian ini
melalui Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi Penelitian Dasar untuk Bagian
Tahun 2014 atas nama Prof Drh Tutik Wresdiyati, PhD, PAVet.
Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada keluarga tercinta
(Bapa, Mama, Teh Fika, dan seluruh keluarga besar). Kak Eka, Alam, Andi,
Rahajeng, Tyas, dan Miftahul Ilmi, sebagai teman satu penelitian, seluruh staf
pengajar dan pegawai Bagian Histologi FKH IPB, dan teman-teman yang lain atas
kerjasama dan bantuannya dalam penyelesaian skripsi.
Penulis menyadari ada kekurangan dalam karya ilmiah ini. Kritik dan
saran untuk perbaikan sangat diharapkan. Semoga karya ini bermanfaat bagi yang
memerlukan.
Bogor, Mei 2015
Rifa Rinaldi
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
viii
DAFTAR GAMBAR
viii
DAFTAR LAMPIRAN
viii
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
Manfaat Penelitian
2
TINJAUAN PUSTAKA
2
Diabetes Melitus
2
Mahoni (Swietenia mahagoni Jacq.)
2
Antioksidan
3
Testis Tikus
4
METODE PENELITIAN
4
Waktu dan Tempat Penelitian
4
Alat dan Bahan Penelitian
5
Metodologi Penelitian
5
Analisis Data
7
HASIL DAN PEMBAHASAN
8
Gambaran Histologis dan Jumlah Sel Spermatogenik
8
Jumlah Sel Leydig
9
Gambaran Histologis dan Profil Kandungan Cu,Zn-SOD
10
SIMPULAN DAN SARAN
13
DAFTAR PUSTAKA
13
LAMPIRAN
15
RIWAYAT HIDUP
23
DAFTAR TABEL
1 Pembagian kelompok perlakuan uji in vivo
2 Jumlah sel spermatogenik per tubuli seminiferi jaringan testis tikus
pada berbagai perlakuan
3 Jumlah sel Leydig pada masing-masing daerah interstitial tubuli
seminiferi
4 Profil kandungan Cu,Zn-SOD pada sel-sel spermatogenik per tubuli
seminiferi jaringan testis tikus pada berbagai perlakuan
5
8
9
12
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
Biji mahoni dengan kulit (A), biji mahoni tanpa kulit (B).
Gambaran histologis tubulus seminiferus dengan pewarnaan HE
Gambaran histologis tubuli seminiferi
Gambaran histologis terhadap kandungan Cu,Zn-SOD sel-sel
spermatogenik
3
4
8
10
DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil statistik jumlah sel spermatogenik per tubuli seminiferi jaringan
testis tikus pada berbagai perlakuan
2 Hasil statistik jumlah sel Leydig pada masing-masing daerah
interstitial tubuli seminiferi
3 Hasil statistik profil kandungan Cu,Zn-SOD pada sel-sel
spermatogenik per tubuli seminiferi jaringan testis tikus pada berbagai
perlakuan
15
17
18
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Diabetes melitus (DM) adalah suatu penyakit metabolik yang ditandai
dengan hiperglikemia sebagai akibat dari kurangnya sekresi insulin atau resistensi
insulin, ataupun keduanya. Hiperglikemia merupakan kondisi glukosa darah yang
tinggi. Kondisi ini disebabkan sedikitnya jumlah insulin dalam sirkulasi darah.
Sedikitnya jumlah insulin menyebabkan glukosa yang ditranspor dari sirkulasi
darah menuju sel jumlahnya juga sedikit, sehingga sel akan mencari sumber
energi lain melalui mekanisme pemecahan lemak, protein, dan gula otot. Proses
pemecahan tersebut dapat menghasilkan produk sampingan seperti radikal bebas.
Radikal bebas dalam jumlah normal memiliki fungsi bagi tubuh seperti dalam
ekspresi gen, pertumbuhan sel, pertahanan terhadap infeksi, dan transduksi signal
(Kunwar dan Priyadarsini 2011). Pada kondisi DM akan terjadi peningkatan
radikal bebas melalui mekanisme peningkatan pembentukan advanced glycation
end products (AGEs), peningkatan jalur poliol-sorbitol, peningkatan aktivasi
protein kinase C (PKC), peningkatan jalur hexosamine (Giacco dan Brownlee
2010). Peningkatan jumlah radikal bebas melalui mekanisme tersebut pada
kondisi DM dapat menyebabkan kondisi stres oksidatif, yaitu kondisi dimana
jumlah radikal bebas lebih tinggi dibandingkan jumlah antioksidan.
Telah dilaporkan bahwa terjadi penurunan kandungan antioksidan Copper,
Zinc-Superoxide Dismutase (Cu,Zn-SOD) pada jaringan hati Macaca fascicularis
DM (Wresdiyati et al. 2003), pada hati dan ginjal tikus DM (Wresdiyati et al.
2010), serta pada jaringan pankreas tikus DM (Wresdiyati et al. 2014), sebagai
akibat kondisi stres oksidatif. Namun status antioksidan SOD pada jaringan testis
tikus DM belum pernah dilaporkan.
Biji mahoni secara empiris digunakan untuk pengobatan tekanan darah
tinggi, diabetes, reumatik, demam, masuk angin, dan perangsang selera makan.
Ghosh et al. (2009) melaporkan bahwa ekstrak metanol biji mahoni memiliki
aktivitas antiinflamasi, analgesik, dan antipiretik. Hasan et al. (2011) melaporkan
bahwa ekstrak etanol biji mahoni bersifat hipoglikemik. Ekstrak metanol biji
mahoni memiliki potensi sebagai antidiabetes (Debasis et al. 2011). Suryani et al.
(2013) juga melaporkan bahwa ekstrak metanol biji mahoni dapat meningkatkan
kadar insulin, penurunan ekspresi TNF-α, dan perbaikan jaringan pankreas
(derajat insulitis) tikus DM. Ekstrak etanol biji mahoni (Swietenia mahagoni
Jacq.) telah dilaporkan mengandung senyawa fitokimia antioksidan flavonoid,
dapat menghambat enzim alfa-glukosidase secara in vitro dan menurunkan kadar
glukosa darah tikus hiperglikemia yang diinduksi sukrosa (Wresdiyati et al.
2015). Apakah ekstrak etanol biji mahoni mempunyai pengaruh terhadap kondisi
jaringan testis tikus DM, belum diketahui.
2
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah menganalisis jumlah sel-sel spermatogenik,
jumlah sel Leydig, dan kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada jaringan testis
tikus model DM yang diberi ekstrak etanol biji mahoni.
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini memberikan informasi bagi masyarakat dan instansi
terkait tentang khasiat biji mahoni sehingga dapat dikembangkan lebih lanjut
untuk perkembangan ilmu kesehatan.
TINJAUAN PUSTAKA
Diabetes Melitus
Diabetes melitus adalah suatu penyakit yang ditandai dengan hiperglikemia
akibat kurangnya sekresi insulin, aksi insulin, atau keduanya, serta terjadi
perubahan progresif terhadap struktur sel beta pankreas. Hiperglikemia
merupakan kondisi glukosa darah tinggi. Kondisi ini disebabkan rendahnya kadar
insulin dalam sirkulasi darah. Rendahnya kadar insulin menyebabkan jumlah
glukosa yang ditranspor dari sirkulasi darah menuju sel sedikit (ADA 2015). Pada
kondisi DM terjadi peningkatan jumlah radikal bebas yang dapat memicu
terjadinya apoptosis sel sperma dengan merusak membran mitokondria
(Darmawan 2007).
Diabetes melitus terbagi atas DM tipe 1 atau insulin-dependent diabetes
mellitus (IDDM) dan DM tipe 2 atau noninsulin-dependent diabetes mellitus
(NIDDM), serta gestational diabetes mellitus (GDM). DM tipe 1 terjadi akibat
kerusakan sel beta yang menyebabkan defisiensi insulin absolut. Sedangkan DM
tipe 2 terjadi akibat kegagalan transduksi signal atau reseptor insulin yang gagal
memberikan signal untuk transporter glukosa. Kegagalan transduksi tersebut
dapat mengakibatkan resistensi insulin. Gestational diabetes mellitus terjadi
akibat terhalangnya produksi dan atau kerja insulin yang dapat didiagnosis pada
trimester kedua atau ketiga kehamilan (ADA 2015).
Diabetes melitus memiliki efek komplikasi yang timbul oleh kelainan
vaskular mikroangiopati (retinopati, nefropati, dan neuropati) dan kelainan
vaskular makroangiopati (penyakit jantung iskemik, stroke, dan penyakit pada
pembuluh darah perifer), serta berkurangnya kualitas hidup (WHO 2006).
Mahoni (Swietenia mahagoni Jacq.)
Swietenia mahagoni merupakan tanaman yang berasal dari Hindia Barat dan
Afrika, dapat tumbuh subur bila tumbuh di pasir dekat pantai. Pada awalnya,
3
tanaman mahoni di Indonesia tumbuh secara liar di hutan-hutan. Namun sejak 20
tahun terakhir ini sudah dibudidayakan.
Mahoni merupakan pohon tahunan dengan tinggi 5-25 m, batang bulat
bercabang, daun majemuk, menyirip genap bulat telur, ujung dan pangkal runcing,
tepi rata, panjang 3-15 cm, dan pertulangan menyirip. Buah bulat telur berlekuk
lima berwarna coklat. Biji pipih, warna hitam atau coklat. Akar tunggang warna
coklat (DepKes RI 2000).
A
B
Gambar 1 Biji mahoni dengan kulit (A), biji mahoni tanpa kulit (B).
Biji mahoni secara empiris digunakan untuk pengobatan tekanan darah
tinggi, diabetes, reumatik, demam, masuk angin, dan perangsang selera makan.
Suryani et al. (2013) melaporkan bahwa ekstrak metanol biji mahoni dapat
meningkatkan kadar insulin, penurunan ekspresi TNF-α dan perbaikan jaringan
pankreas tikus DM. Ekstrak etanol biji mahoni (Swietenia mahagoni Jacq.) telah
dilaporkan mengandung senyawa fitokimia antioksidan flavonoid (Wresdiyati et
al. 2015). Ekstrak etanol biji mahoni juga dilaporkan dapat menghambat enzim
alfa-glukosidase secara in vitro dan menurunkan kadar glukosa darah tikus
hiperglikemia yang diinduksi sukrosa (Wresdiyati et al. 2015).
Antioksidan
Di dalam sistem biokimia tubuh terjadi keseimbangan antara prooksidan dan
antioksidan sehingga tubuh terhindar dari kerusakan akibat radikal bebas.
Antioksidan adalah senyawa yang dapat mencegah atau menunda oksidasi.
Antioksidan dapat diperoleh secara endogen maupun eksogen. Antioksidan
endogen merupakan antioksidan yang terdapat dalam tubuh seperti katalase
(CAT), glutation peroksidase (GPx), dan superoksida dismutase (SOD).
Antioksidan eksogen merupakan antioksidan yang berasal dari luar tubuh seperti
vitamin C, vitamin E, polifenol (flavonoid), dan lain-lain.
Hewan memiliki bentuk SOD yaitu bentuk Cu,Zn-SOD yang berada di
dalam sitoplasma dan bentuk Mn-SOD yang berada di dalam matriks mitokondria
(Halliwell 2006). Hewan juga memiliki bentuk EC-SOD yang banyak ditemukan
pada cairan ekstraselular misalnya paru-paru. Sedangkan bentuk Fe-SOD
ditemukan pada tumbuhan. Garrat et al. (2014) melaporkan pada tikus yang
kekurangan SOD dapat terjadi kerusakan saraf, gangguan reproduksi, serta
gangguan fungsi vaskular.
4
Testis Tikus
Testis terdiri dari sepasang gonad berbentuk oval yang dibungkus oleh
skrotum. Skrotum dilapisi oleh lapis superficial kulit, lapis fibrosa dan jaringan
otot yaitu tunika dartos, dan tunika vaginalis yang menutupi dinding skrotum.
Testis merupakan organ genital primer hewan jantan yang berfungsi sebagai
kelenjar endokrin dan kelenjar eksokrin. Testis sebagai kelenjar endokrin
berfungsi memproduksi hormon testosteron, sedangkan fungsinya sebagai
kelenjar eksokrin adalah sebagai penghasil spermatozoa. Fungsi endokrin
dilakukan oleh sel Leydig atau sel interstitial sedangkan spermatozoa dihasilkan
oleh kelenjar tubulus seminiferus yang merupakan komponen penyusun testis
yang terbesar. Spermatozoa dihasilkan di dalam tubulus seminiferus melalui
proses spermatogenesis pada saat hewan mencapai usia pubertas mulai dari
spermatogonia, spermatosit primer, spermatosit sekunder, spermatid, dan
spermatozoa. Unitly et al. (2014) melaporkan bahwa spermatogenesis dipengaruhi
faktor endogen (hormonal, psikologi, dan genetika) dan eksogen (bahan kimia dan
obat-obatan).
Gambar 2 Gambaran Histologi Tubulus Seminiferus dengan Pewarnaan HE
(Bacha dan Bacha 2000)
Perubahan proses spermatogenesis secara mikroskopik dapat dilihat dari
jumlah sel-sel penyusun tubulus seminiferus. Perubahan ini akan mempengaruhi
tebal epitel dan diameter tubulus seminiferus.
METODE PENELITIAN
Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan September 2014 hingga Maret 2015
di Laboratorium Histologi, Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi,
Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
5
Alat dan Bahan Penelitian
Penelitian ini menggunakan hewan coba tikus jantan galur Sprague Dawley,
biji mahoni (Swietenia mahagoni Jacq.), aloksan, akuades, jarum sonde, ketamin,
silasin, botol sampel, larutan fisiologis NaCl 0.9%, larutan Bouin, alkohol (70%,
80%, 90%, 95%, dan alkohol absolut), larutan xylol, parafin, tissue embedding
console, mikrotom, gelas ukur, seperangkat alat pewarnaan, timbangan digital,
mikropipet, larutan phosphate buffer saline (PBS), larutan H2O2, normal serum
10%, Starr Trek Universal HRP Detection Kit Control Number: 901STUHRP700-052009 (background sniper, Trekkie Universal Link, Trekk AvidinHRP, diaminobenzidine (DAB)), antibodi Cu,Zn-SOD (Sigma S2147), object
glass, cover glass, mikroskop, kamera digital, program software McMaster
Biophotonics Image J, dan program software SPSS release 22.
Metodologi Penelitian
Pembuatan ekstrak etanol biji mahoni (Swietenia mahagoni Jacq.)
Penelitian ini menggunakan biji mahoni (Swietenia mahagoni Jacq.) yang
diambil dari daerah Leuwiliang, Kabupaten Bogor. Biji mahoni dikupas,
dibersihkan, dan dikeringkan, lalu dihaluskan menggunakan blender agar
menghasilkan bentuk serbuk. Kemudian dalam botol yang berisi pelarut etanol
96% dimasukkan serbuk biji mahoni, selanjutnya dimaserasi agar memperoleh
maserat. Agar diperoleh ekstrak etanol yang kental, maserat diuapkan pada suhu
±40oC menggunakan vakum evaporator.
Uji in vivo pada tikus model diabetes
Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL), sejumlah
25 ekor tikus galur Sprague Dawley dibagi secara random menjadi 5 kelompok
perlakuan (Tabel 1).
Tabel 1 Pembagian kelompok perlakuan uji in vivo
Kelompok
Perlakuan Uji In Vivo
Kontrol Negatif (K-)
Non DM + Akuades
Kontrol Positif (K+)
DM + Akuades
Perlakuan (EM)
DM + Ekstrak etanol biji mahoni 500 mg/kg BB
Kontrol Obat (KO)
DM + Acarbose 2 mg/kg BB
Kontrol Ekstrak (KE)
Non DM + Ekstrak etanol biji mahoni 500 mg/kg BB
DM = diabetes melitus; EM = ekstrak mahoni
Perlakuan hewan
Tikus yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rattus norvegicus galur
Sprague Dawley (SD) dengan umur 10-12 minggu dan berat badan 150-200 gram,
yang diperoleh dari Unit Pengelolaan Hewan Laboratorium (UPHL) Fakultas
Kedokteran Hewan IPB. Perlakuan tikus DM (kecuali K- dan KE) diperoleh
dengan induksi aloksan dosis 110 mg/kg BB secara intraperitoneal. Tikus
6
dianggap DM jika kadar glukosa darah melebihi 200 mg/dL pada saat pengukuran
kadar glukosa darah. Selanjutnya setiap kelompok (Tabel 1) diberi perlakuan
selama 28 hari.
Sampling dan pemrosesan jaringan testis
Pengambilan sampel (sampling) dilakukan pada hari ke-29 dengan
mengorbankan tikus perlakuan. Tikus dibius menggunakan kombinasi ketamin 70
mg/kg BB dan silasin 20 mg/kg BB secara intraperitoneal, selanjutnya organ testis
diambil dan dicuci dengan larutan NaCl fisiologis 0,9%. Setelah organ dicuci
kemudian dimasukkan ke dalam larutan fiksatif Bouin selama 24 jam. Selanjutnya
jaringan didehidrasi dengan alkohol bertingkat (70%, 80%, 90%, 95%, alkohol
absolut I, II, dan III) kemudian dilanjutkan dengan tahap penjernihan (clearing)
jaringan dalam larutan xylol (xylol I, II, dan III). Kemudian dilakukan infiltrasi
dalam parafin cair (parafin cair I, II, dan III) yang dilakukan dalam oven, lalu
dilakukan penanaman (embedding) jaringan testis dalam cetakan parafin. Blok
jaringan dipotong (sectioning) dengan ketebalan 3 µm menggunakan mikrotom.
Hasil potongan jaringan testis kemudian ditempel pada object glass. Untuk
preparat yang akan dilakukan pewarnaan imunohistokimia, object glass dilem
menggunakan 0,2% neofren dalam toluen. Tahap selanjutnya adalah pewarnaan
hematoksilin-eosin (HE) dan pewarnaan imunohistokimia.
Pewarnaan hematoksilin eosin (Kiernan 1990)
Morfologi jaringan testis diamati dengan teknik pewarnaan hematoksilineosin (HE). Potongan jaringan testis pada object glass dideparafinisasi dengan
larutan xylol III, II, dan I, kemudian direhidrasi menggunakan alkohol absolut III,
II, dan I, serta alkohol 95%, 90%, 80%, dan 70% masing-masing selama 3 menit.
Selanjutnya direndam dalam air kran selama 10 menit dan akuades selama 5
menit. Kemudian preparat diwarnai menggunakan hematoksilin selama 4 menit,
lalu dimasukkan kembali dalam air kran selama 10 menit dan akuades selama 5
menit. Setelah itu, diwarnai menggunakan eosin selama 2 menit, lalu dilakukan
dehidrasi dengan alkohol bertingkat 70%, 80%, 90%, dan 95% selama 3 detik,
kemudian alkohol absolut I, II, dan III selama 1 menit. Selanjutnya dijernihkan
dengan xylol I, II, dan III selama 1 menit, kemudian di-mounting menggunakan
cover glass yang direkatkan dengan entellan®.
Pewarnaan imunohistokimia Cu,Zn-SOD
Profil antioksidan Cu,Zn-SOD jaringan testis dideteksi secara
imunohistokimia dengan menggunakan metode yang dilakukan oleh Wresdiyati et
al. (2006). Setiap tahap dilakukan pencucian dengan larutan PBS selama 5 menit
sebanyak 3 kali. Preparat jaringan testis pada object glass dideparafinasi dan
direhidrasi, lalu diinaktivasi peroksidase endogen dengan menggunakan 0,2 mL
H2O2 dalam 20 mL metanol selama 15 menit. Selanjutnya diinkubasi dalam
normal serum 10% selama 45 menit, kemudian diinkubasi kembali dalam
background sniper selama 15 menit. Kemudian preparat jaringan testis diinkubasi
dalam antibodi Cu,Zn-SOD (Sigma S2147) selama 48 jam pada suhu 4°C. Setelah
7
itu, preparat jaringan testis diinkubasi dalam Trekkie Universal Link selama 20
menit, lalu diinkubasi dalam Trekk Avidin-HRP selama 10 menit. Hasil reaksi
antara antigen dan antibodi divisualisasikan dengan diaminobenzidine (DAB)
selama 2 menit dan di-counterstain dengan hematoksilin selama 1 menit.
Kemudian preparat jaringan testis didehidrasi dalam alkohol bertingkat dan
dijernihkan dengan xylol. Selanjutnya, preparat jaringan testis yang telah diwarnai
di-mounting menggunakan cover glass yang direkatkan dengan entellan®.
Analisis Data
Kandungan Cu,Zn-SOD pada jaringan testis ditandai dengan adanya warna
coklat pada inti dan sitoplasma sel. Pengamatan dilakukan berdasarkan intensitas
warna coklat yang terbentuk pada inti dan sitoplasma sel, semakin tua warna
coklat yang ditunjukkan maka semakin banyak kandungan Cu,Zn-SOD di dalam
jaringannya. Sel yang tidak mengandung Cu,Zn-SOD akan bereaksi negatif
dengan munculnya warna biru (hematoksilin) pada inti sel dari counterstain.
Pengamatan dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif jaringan testis tikus
per tubuli seminiferi pada tahap delapan gelombang tubuli seminiferi (stage VIII
wave of the seminiferous tubule) (Wing dan Christensen 1982). Pengamatan
kualitatif dilakukan dengan mengamati morfologi sel-sel spermatogenik dan
kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada jaringan testis tikus. Sedangkan
pengamatan secara kuantitatif dilakukan dengan menghitung jumlah sel-sel
spermatogenik, sel Leydig, dan sel-sel spermatogenik yang bereaksi pada
berbagai tingkatan Cu,Zn-SOD pada jaringan testis yang diamati. Untuk melihat
perbedaan reaksi pada pewarnaan imunohistokimia Cu,Zn-SOD tersebut,
penghitungan dibagi menjadi tiga tingkatan intensitas warna untuk reaksi positif
dan satu warna untuk reaksi negatif. Reaksi positif pada berbagai tingkat
kandungan terhadap Cu,Zn-SOD pada jaringan testis ditunjukkan oleh warna
coklat tua yang menutupi keseluruhan inti sel atau positif kuat (+++), coklat
sedang yang menutupi sebagian inti sel atau positif sedang (++), dan coklat muda
yang menutupi sebagian kecil inti sel atau positif lemah (+). Sedangkan reaksi
negatif (-) ditunjukkan dengan warna biru pada inti sel akibat pemberian
counterstain (hematoksilin) yang berarti sel tidak mengandung Cu,Zn-SOD.
Penghitungan sel-sel dilakukan pada pembesaran 100x, yang dilakukan pada lima
lapang pandang berbeda secara acak pada setiap preparat jaringan (Wresdiyati et
al. 2006) menggunakan program software McMaster Biophotonics Image J
(http://rsb.info.nih.gov/ij/download. html).
Data jumlah sel-sel spermatogenik, sel Leydig, dan sel-sel spermatogenik
yang mengandung antioksidan Cu,Zn-SOD pada jaringan testis yang didapat
dianalisis dengan uji analysis of varian (ANOVA) menggunakan program
software SPSS release 22. Apabila hasil uji menunjukkan perbedaan yang nyata
(P