Isolasi Dan Karakterisasi Dengan Analisis 16s Rrna Bakteri Endofit Dari Tumbuhan Tembelekan (Lantana Camara L.) Sebagai Penghasil Senyawa Antibakteri

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER BAKTERI
ENDOFIT TUMBUHAN Lantana camara L. SERTA
IDENTIFIKASI SENYAWA ANTIBAKTERINYA

DINA DYAH SAPUTRI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Isolasi dan Karakterisasi
dengan Analisis 16S rRNA Bakteri Endofit dari Tumbuhan Tembelekan (Lantana
camara L.) sebagai Penghasil Senyawa Antibakteri adalah benar karya saya
dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun
kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip
dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
tesis ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2015
Dina Dyah Saputri
NRP G851130231

RINGKASAN
DINA DYAH SAPUTRI. Isolasi dan Karakterisasi dengan Analisis 16S rRNA
Bakteri Endofit dari Tumbuhan Tembelekan (Lantana camara L.) sebagai
Penghasil Senyawa Antibakteri. Dibimbing oleh MARIA BINTANG dan
FACHRIYAN HASMI PASARIBU.
Peningkatan kasus penyakit infeksi yang disebabkan oleh bakteri patogen,
berdampak pada meningkatnya kejadian resistensi bakteri patogen terhadap
antibiotik komersil yang saat ini banyak digunakan. Pemanfaatan tumbuhan akan
menjadi sumber terbaik untuk mendapatkan berbagai obat yang alami dan aman.
Salah satu tumbuhan yang telah diketahui khasiatnya sebagai obat adalah
tumbuhan tembelekan (Lantana camara L.). Lantana camara L. dapat mengobati
berbagai jenis penyakit. Bagian akar digunakan untuk mengobati penyakit
influenza disertai demam tinggi, TBC kelenjar (skrofulodeurm), rematik, dan
penyakit kulit. Bagian daunnya digunakan sebagai obat sakit batuk, kulit, bisul,

bengkak, gatal-gatal, panas tinggi, rematik, dan memar. Permasalahannya adalah
pengambilan senyawa bioaktif memerlukan biomassa yang cukup banyak.
Alternatif terbaru dari permasalahan tersebut adalah dengan pemanfaatan bakteri
endofit di dalam jaringan tumbuhan. Bakteri endofit merupakan mikroba yang
hidup di dalam jaringan internal tumbuhan hidup tanpa menyebabkan efek negatif
langsung yang nyata. Kemampuan bakteri endofit memproduksi senyawa
metabolit sekunder sesuai dengan tumbuhan inangnya merupakan peluang yang
sangat besar dan dapat diandalkan untuk memproduksi senyawa bioaktif yang
berpotensi sebagai antibiotik.
Isolasi bakteri dari tumbuhan Lantana camara L. menghasilkan sebanyak
21 isolat bakteri endofit. Semua isolat dilakukan uji aktivitas antibakteri terhadap
bakteri patogen Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Bacillus cereus,
Staphylococcus aureus. Isolat potensial BT22 mampu menghambat keempat
bakteri patogen. Selanjutnya dilakukan karakterisasi isolat BT22 dengan analisis
sekuen 16S rRNA. Hasil analisis sekuen 16S rRNA menunjukkan bahwa isolat
BT22 memiliki kemiripan sebanyak 99% dengan Bacillus amyloliquefaciens YB1402. Ekstraksi senyawa antibakteri isolat BT22 dengan menggunakan pelarut
kloroform. Identifikasi senyawa antibakteri dengan analisis GC-MS menunjukkan
beberapa senyawa antibakteri di antaranya : sikloheksanon, tetrakosan dan
oktadekan.
Kata kunci: antibakteri, bakteri endofit, Tembelekan (Lantana camara L.), 16S

rRNA

SUMMARY
DINA DYAH SAPUTRI. Isolation and Characterization of the 16S rRNA
Analysis Endophytic Bacteria from Tembelekan (Lantana camara L.) can
Produce Antibacterial Compounds. Supervised by MARIA BINTANG and
FACHRIYAN HASMI PASARIBU.
The cases of infection diseases which was caused by pathogenic bacteria
was increased, so the effect was increased incidence of pathogenic bacterial
resistance to antibiotics commercial. Utilization of the plant will be the best
source to get various drugs that are natural and safety. One of the plants that have
known as medicinal plants is tembelekan (Lantana camara L.). Lantana camara
L. can treat many diseases. The roots are used to treat influenza disease,
tuberculosis gland (skrofulodeurm), rheumatism, and skin diseases. The leaves are
used as a cough medicine, skin, boils, swelling, itching, fever, rheumatism, and
bruises. The problem is making bioactive compounds requires considerable
biomass. The latest alternative to these problems is the use of endophytic bacteria
in plant tissue. Endophytic bacteria are microbes that live in the internal tissues of
plant life without causing significant negative effect. Endophytic bacteria can
produce secondary metabolites which is same with the host plant is a huge

opportunity and can be relied upon to produce bioactive compounds that have the
potential as an antibiotic.
Isolation of endophytic bacteria from Lantana camara L. produce 21
isolates of endophytic bacteria. All isolates were tested antibacterial activity
against pathogenic bacteria Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Bacillus
cereus, Staphylococcus aureus. Potential isolates of BT22 could inhibit fourth
pathogenic bacteria. Characterization of isolates BT22 with 16S rRNA sequence
analysis. The results of 16S rRNA sequence analysis showed that BT22 isolate
have similarities as much as 99% by Bacillus amyloliquefaciens YB-1402.
Extraction of antibacterial compounds BT22 isolate using chloroform. The
identification of antibacterial compounds with GC-MS analysis showed some
antibacterial compounds include: Cyclohexanone, Tetracosane and Octadecane
Keywords: antibacterial, endophytic bacteria, Lantana camara L., 16S rRNA

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan

IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER BAKTERI
ENDOFIT TUMBUHAN Lantana camara L. SERTA
IDENTIFIKASI SENYAWA ANTIBAKTERINYA

DINA DYAH SAPUTRI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biokimia

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Syamsul Falah, S.Hut., M.Si

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat
dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis yang berjudul Isolasi
dan Karakterisasi dengan Analisis 16S rRNA Bakteri Endofit dari Tumbuhan
Tembelekan (Lantana camara L.) sebagai Penghasil Senyawa Antibakteri yang
telah dilaksanakan sejak bulan September 2014 sampai Februari 2015 di
Laboratorium Bakteriologi Bagian Mikrobiologi Medik Departemen Ilmu
Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner Fakultas Kedokteran
Hewan, Laboratorium Penelitian Departemen Biokimia Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor (IPB), dan Laboratorium
Pengujian Hasil Hutan P3KKPHH Bogor.
Terima kasih, penghargaan, dan apresiasi penulis ucapkan kepada Prof Dr
Drh Maria Bintang, MS dan Prof Dr Drh Fachriyan H. Pasaribu sebagai
pembimbing atas arahan, bimbingan, perhatian, nasihat, motivasi dan
masukkannya selama penelitian serta dalam penyusunan tesis ini. Penulis juga
mengucapkan terima kasih kepada Bapak Agus Somantri yang sudah banyak
membantu penulis untuk melakukan penelitian di Laboratorium Bakteriologi Bagian

Mikrobiologi Medik Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan
Masyarakat Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor
(IPB).
Penelitian ini didanai oleh Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (DIKTI)
melalui Beasiswa Pendidikan Pascasarjana Dalam Negeri (BPPDN). Tidak lupa
juga terima kasih penulis ucapkan kepada keluarga, teman-teman Bakteriologi
Bagian Mikrobiologi Medik Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan
Masyarakat Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor
(IPB), teman-teman SPs IPB program studi Biokimia 2013 yang selalu
mendukung penulis.
Penyusunan tesis ini tentunya tidak terlepas dari kekurangan. Oleh karena
itu, penulis mengharapkan adanya saran dan kritik yang bersifat membangun
untuk menyempurnakan penyusunan tesis ini. Semoga hasil penelitian ini dapat
bermanfaat bagi kemajuan ilmu pengetahuan.

Bogor, Agustus 2015
Dina Dyah Saputri

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vi

DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Hipotesis
Manfaat Penelitian

1
1

3
3
3
3

2 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Bahan
Alat
Prosedur Analisis Data

4
4
4
4
4

3 HASIL
Isolat Bakteri Endofit dari Tumbuhan Lantana camara L.
Aktivitas Antibakteri Isolat Bakteri Endofit terhadap Bakteri Patogen

Sekuen 16S rRNA dan Rekonstruksi Pohon Filogenetik
Aktivitas Senyawa Antibakteri Ekstrak Kloroform Isolat BT22
Senyawa Antibakteri Ekstrak Kloroform Isolat BT22 dengan GC-MS

6
6
8
9
10
11

4 PEMBAHASAN
Isolat Bakteri Endofit dari Tumbuhan Lantana camara L.
Aktivitas Antibakteri Isolat Bakteri Endofit terhadap Bakteri Patogen
Sekuen 16S rRNA dan Rekonstruksi Pohon Filogenetik
Aktivitas Senyawa Antibakteri Ekstrak Kloroform Isolat BT22
Senyawa Antibakteri Ekstrak Kloroform Isolat BT22 dengan GC-MS

13
13

14
14
15
16

5 KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Saran

13
18
18

DAFTAR PUSTAKA

18

LAMPIRAN

24

RIWAYAT HIDUP

33

DAFTAR GAMBAR
1 Tumbuhan Tembelekan (Lantana camara L.)
2 Persentase bakteri endofit yang diisolasi dari tumbuhan
Lantana camara L.
3 Zona hambat isolat BT22 yang terbentuk terhadap bakteri
patogen
4 Isolat BT22 bakteri endofit dari tumbuhan Lantana camara L
5 Sekuen 16S rRNA isolat potensial BT22 hasil pensejajaran
6 Zona hambat ekstrak kloroform isolat BT22 terhadap bakteri patogen

7
8
8
9
9
11

DAFTAR TABEL
1 Ciri morfologi koloni dan kecepatan pertumbuhan isolat bakteri endofit
dari tumbuhan Lantana camara L.
2 Diameter zona hambat yang terbentuk pada seleksi isolat
bakteri endofit
3 Diameter zona hambat ekstrak senyawa antibakteri isolat potensial BT22
dengan berbagai pelarut
4 Klasifikasi aktivitas antibakteri berdasarkan diameter zona
hambat
5 Senyawa yang diduga berperan sebagai senyawa antibakteri
yang terkandung di dalam isolat BT22

7
8
10
10
12

DAFTAR LAMPIRAN

1 Bagan alir penelitian
2 Determinasi tumbuhan Lantana camara L.
3 Diameter zona hambat yang terbentuk pada isolat bakteri
endofit terhadap bakteri patogen
4 Sekuen 16S rRNA isolat potensial BT22
5 Hasil BLAST sekuen 16S rRNA isolat potensial BT22 hasil pensejajaran
6 Rekonstruksi pohon filogenetik isolat potensial BT22
7 Kondisi operasional alat GC-MS
8 Kromatogram hasil analisis GC-MS ekstrak kloroform isolat BT22

25
26
27
28
29
30
31
32

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Peningkatan kasus penyakit infeksi yang disebabkan oleh bakteri patogen,
berdampak pada meningkatnya kejadian resistensi bakteri patogen terhadap
antibiotik komersil yang saat ini banyak digunakan. Bakteri patogen yang sudah
resisten terhadap antibiotik di antaranya, Staphylococcus aureus yang resisten
terhadap antibiotik penisilin, oksasilin, serta metisilin. Escherichia coli yang
resisten terhadap antibiotik beta laktam. Pseudomonas aeruginosa yang resisten
terhadap antibiotik trimetoprim/sulfametoksasol, tetrasiklin, dan sefalosporin
(Mardiastuti et al. 2007).
Menurut WHO pemanfaatan tumbuhan akan menjadi sumber terbaik untuk
mendapatkan berbagai obat, sehingga tumbuhan tersebut harus diteliti untuk lebih
memahami sifat-sifat tumbuhan terkait keamanan dan khasiatnya (Nascimento et
al. 2000). Sekitar 20% dari tumbuhan di dunia telah dilakukan tes farmakologis
atau biologis dan sejumlah besar antibiotik yang diperkenalkan di pasar diperoleh
dari sumber daya alam atau semi sintesis (Mothana & Lindequist 2005). Lebih
dari 50% dari semua obat klinis modern berasal dari alam dan produk alami
sangat berperan penting dalam pengembangan obat dalam industri farmasi (Baker
et al. 1995).
Indonesia dikenal sebagai salah satu dari 7 negara yang memiliki
keanekaragaman hayati terbesar di dunia setelah Brazil, sehingga sangat potensial
dalam pengembangan obat herbal (Radji 2005). Salah satu tumbuhan yang telah
diketahui khasiatnya sebagai obat adalah tumbuhan tembelekan (Lantana camara
L.). Menurut Deepak et al. (2009), Lantana camara L. memiliki potensi
terapeutik karena adanya senyawa bioaktif flavon, isoflavon, flavonoid,
anthosianidin, lignan, katesin, isokatesin, alkaloid, tanin, saponin dan terpenoid.
Barre et al. (1997) melaporkan bahwa triterpenoid pada Lantana camara
L. menunjukkan aktivitas yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri
Staphylococcus aureus dan Salmonella typhi. Kajian mengenai Lantana camara
L. dalam bidang kesehatan telah banyak dilakukan. Sebagai contoh, ekstrak daun
Lantana camara L. menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap strain
Mycobacterium tuberculosis (Claude et al. 2009).
Lantana camara L. telah diketahui khasiatnya untuk mengobati berbagai
jenis penyakit. Bagian akar digunakan untuk mengobati penyakit influenza
disertai demam tinggi, TBC kelenjar (skrofulodeurm), rematik, bengkak, memar,
keputihan, kencing nanah, gondongan, dan penyakit kulit. Bagian daunnya
digunakan sebagai obat sakit batuk, kulit, bisul, bengkak, gatal-gatal, panas tinggi,
rematik, dan memar (Dalimartha 2007). Di India, daun Lantana camara L.
direbus untuk diminum sebagai obat batuk dan ditumbuk untuk digunakan sebagai
obat luka, bisul, dan bengkak (Verma & Verma 2006).
Permasalahannya adalah pengambilan senyawa bioaktif memerlukan
biomassa yang cukup banyak, sehingga perlu solusi terbaru untuk menghadapi
permasalahan tersebut. Alternatif terbaru dari permasalahan tersebut adalah

2
dengan pemanfaatan bakteri endofit di dalam jaringan tumbuhan. Bakteri endofit
merupakan mikroba yang hidup di dalam jaringan internal tumbuhan hidup tanpa
menyebabkan efek negatif langsung yang nyata. Sifat bakteri endofit yang tidak
berdampak negatif pada jaringan tumbuhan menunjukkan kemungkinan adanya
hubungan simbiosis mutualisme antara bakteri endofit dan inangnya (Strobel &
Daisy 2003).
Tumbuhan tingkat tinggi dapat mengandung beberapa bakteri endofit yang
mampu menghasilkan senyawa biologi atau metabolit sekunder yang diduga
sebagai akibat koevolusi atau transfer genetik (genetic recombination) dari
tumbuhan inangnya ke dalam bakteri endofit (Radji 2005). Endofit di dalam
tumbuhan berada di ruang antarsel. Endofit pada awalnya ada di luar tubuh
tumbuhan, kemudian masuk jika terjadi luka pada tumbuhan. Jika sudah berada
dalam tumbuhan, endofit akan menetap. Tempat hidup bakteri sangat unik
sifatnya karena tumbuh dalam jaringan tumbuhan, dimana tumbuhan yang satu
tentunya berbeda dengan tumbuhan lainnya. Fisiologi tumbuhan tinggi yang
berasal dari spesies yang sama akan berbeda jika tumbuh di lingkungan yang
berbeda, sehingga dapat dikatakan bahwa keanekaragaman bakteri endofit
sangatlah tinggi. Berdasarkan pertimbangan tersebut endofit dapat menjadi
sumber berbagai metabolit sekunder baru yang berpotensi untuk dikembangkan
dalam bidang medis, pertanian, dan industri (Prasetyoputri & Ines 2006).
Bakteri endofit dapat menghasilkan senyawa-senyawa bioaktif yang
langka dan penting bagi tumbuhan inangnya, maka kebutuhan untuk
menumbuhkan tumbuhan yang masa hidupnya panjang dan mungkin termasuk
langka akan berkurang dan keanekaragaman hayati dunia juga terlindungi. Bakteri
digunakan sebagai sumber suatu produk hayati akan memudahkan proses dan
mengurangi biaya produksi, sehingga pada akhirnya menghasilkan produk dengan
harga lebih murah. Kemampuan bakteri endofit memproduksi senyawa metabolit
sekunder sesuai dengan tumbuhan inangnya merupakan peluang yang sangat besar
dan dapat diandalkan untuk memproduksi metabolit sekunder (Radji 2005).
Berbagai penelitian mengenai potensi senyawa bioaktif yang terkandung
dalam bakteri endofit telah banyak dilakukan. Beberapa bakteri endofit
menghasilkan hormon IAA yang terdapat pada tumbuhan tertentu dan
menghasilkan fitohormon yang bermanfaat bagi pertumbuhan tumbuhan tersebut
(Aryantha et al. 2005). Beberapa jenis bakteri endofit yang dapat menghasilkan
antibiotika berspektrum luas adalah bakteri endofit yang diisolasi dari tumbuhan
Grevillea pteridifolia menghasilkan metabolit kakadumycin yang berkhasiat
sebagai anti malaria (Castillo et al. 2003). Bakteri endofit Pestalotiopsis
microspora yang diisolasi dari tumbuhan Taxus mampu menghasilkan senyawa
metabolit paclitaxel yang berkhasiat sebagai antikanker (Strobel et al. 2002).
Endofit Pseudomassaria sp menghasilkan metabolit sekunder yang bekerja seperti
insulin dan telah terbukti dapat menurunkan glukosa darah tikus yang terkena
diabetes (Zhang et al. 1999).
Tumbuhan tembelekan (Lantana camara L.) telah terbukti memiliki khasiat
sebagai obat. Sejauh ini belum ada penelitian yang melaporkan mengenai
pemanfaatan dan kandungan senyawa aktif dari bakteri endofit yang diisolasi dari
tumbuhan tembelekan. Berdasarkan hal tersebut, sangat menarik dilakukan
penelitian mengenai bakteri endofit yang berada dalam tumbuhan tembelekan

3
yang diduga berpeluang besar mampu menghasilkan senyawa aktif yang memiliki
aktivitas yang sama dengan tumbuhan inangnya.
Perumusan Masalah
Tumbuhan tembelekan (Lantana camara L.) telah terbukti memiliki
khasiat sebagai obat, sehingga berpotensi untuk dijadikan sumber antibiotik alami.
Penelitian mengenai ekstrak tumbuhan tembelekan telah banyak dilakukan,
namun kajian mengenai pemanfaatan senyawa metabolit sekunder bakteri endofit
yang diisolasi dari tumbuhan tembelekan sebagai alternatif terbaru yang
berpotensi menghasilkan antibiotik alami sejauh ini belum dilaporkan.

Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri
endofit dan aktivitas antibakterinya dari tumbuhan tembelekan (Lantana camara
L.) serta menganalisis senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh isolat bakteri
endofit potensial dengan menggunakan Gass Chromatography-Mass
Spectrometer (GC-MS).

Hipotesis
Bakteri endofit dapat diisolasi dari tumbuhan tembelekan (Lantana
camara L.) dan memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri patogen (S. aureus,
E. coli, B. cereus dan S. enteritidis) serta isolat bakteri endofit potensial dapat
dikarakterisasi secara molekuler menggunakan analisis sekuen 16S rRNA.
Senyawa aktif dari isolat bakteri endofit potensial yang berperan dalam aktivitas
antibakteri dapat dianalisis menggunakan GC-MS.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai cara
isolasi, jenis bakteri endofit dan jenis senyawa antibakteri yang berasal dari
bakteri endofit tumbuhan tembelekan (Lantana camara L.).

4

2 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini telah dilaksanakan pada bulan September 2014 – Februari
2015 di Laboratorium Bakteriologi Bagian Mikrobiologi Medik Departemen Ilmu
Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner Fakultas Kedokteran
Hewan, Laboratorium Penelitian Departemen Biokimia Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor (IPB), dan Laboratorium
Pengujian Hasil Hutan P3KKPHH Bogor.

Bahan
Bahan yang digunakan antara lain : serabut akar (S), batang (B), dan daun
(D) tumbuhan tembelakan (Lantana camara L.) yang diperoleh dari area Kampus
IPB Darmaga, Bogor, dan telah dilakukan determinasi di Pusat Konservasi
Tumbuhan, Kebun Raya Bogor – LIPI, Bogor (Lampiran 2), media Nutrient Agar
(NA) produk Oxoid, media Nutrient Broth (NB) produk Difco, sodium hipoklorit
(NaOCl) 5.25%, nistatin, etanol 96%, pelarut kloroform, n-heksana, etil asetat dan
etanol 70%, kloramfenikol, akuades, larutan garam, aseton, primer 27F (5’ – AGA
GTT TGA TCM TGG GTC AG – 3’), 1492R (5’ – TAC GGY TAC CTT GTT
ACG ACT T – 3’), 518F ( 5’- CCA GCA GCC GCG GTA ATA CG -3’ ) dan
800R ( 5’- TAC CAG GGT ATC TAA TCC -3’), InstaGene Matrix (Bio-Rad,
USA), Montage PCR Clean up kit (Milipore), Big Dye terminator cycle
sequencing kit (Apllied BioSystem, USA). Kultur bakteri patogen meliputi:
Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus
berasal dari koleksi Laboratorium Bakteriologi Bagian Mikrobiologi Medik
Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor, Darmaga, Bogor, Jawa
Barat.

Alat
Alat yang digunakan antara lain : pipet mikro, alat gelas, cawan Petri,
shaker incubator, mesin sentrifugasi, mesin Polymerase Chain Reaction (PCR),
Applied Biosystem model 3730XL automated DNA sequencing system (Apllied
BioSystem, USA), corong pisah, vakum evaporator, dan mesin GC-MS (Gas
Chromatography-Mass Spectrometer) tipe Shimadzu GCMS-QP2010.

Prosedur Analisis Data
Isolasi Bakteri Endofit (Modifikasi Desriani et al. 2013)
Sampel berupa serabut akar (S), batang (B), dan daun (D) tumbuhan
tembelekan (Lantana camara) dengan ukuran sekitar 1 cm. Sampel dicuci dengan
air mengalir hingga bersih lalu direndam etanol 96% selama 1 menit. Setelah itu,

5
cairan perendam dibuang dan diganti dengan sodium hipoklorit (NaOCl) lalu
didiamkan selama 5 menit. Cairan perendam dibuang kembali dan sampel dibilas
dengan etanol 96% sebanyak tiga kali. Sampel yang telah steril dipotong lagi
menjadi beberapa bagian lalu ditanam pada media NA yang telah ditambahkan
nistatin (200 μL/200mL) dan diinkubasi pada ruang gelap selama 48 jam.
Pemurnian dilakukan dengan memindahkan bakteri endofit yang tumbuh pada
media NA yang ditambahkan nistatin ke cawan Petri yang berisi NA steril.
Setelah diperoleh biakan murni, bakteri endofit disimpan ke agar miring NA.
Uji Aktivitas Antibakteri (Simarmata et al. 2007)
Isolat bakteri endofit dari agar miring diregenerasi ke media NA,
sedangkan bakteri patogen diregenerasikan ke dalam 5 mL media NB lalu
diinkubasi selama 24 jam pada suhu 28-30 ºC. Sebanyak 0.4 mL kultur cair
bakteri uji dimasukkan ke dalam 80 mL media NA yang bersuhu ± 40 ºC.
Selanjutnya sebanyak 20 mL dituangkan ke dalam cawan Petri steril dan ditunggu
hingga memadat. Isolat bakteri endofit yang akan diuji diinokulasikan ke media
berisi patogen menggunakan ose, lalu diinkubasi selama 24-48 jam. Zona hambat
yang terbentuk diamati kemudian diameter zona hambat diukur. Isolat bakteri
endofit yang positif menunjukkan zona hambat terhadap semua patogen dikatakan
sebagai isolat potensial.
Analisis Sekuen 16S rRNA (Kusumawati 2014) dan Rekonstruksi Pohon
Filogenetik (Singh et al. 2012)
Preparasi DNA cetakan dari isolat potensial. Koloni isolat potensial
disuspensikan ke dalam 0.5 mL larutan garam steril pada tabung sentrifugasi yang
berukuran 1.5 mL, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama
10 menit. Selanjutnya pelet diresuspensi dengan penambahan 0.5 mL InstaGene
Matrix (Bio-Rad, USA). Setelah itu, diinkubasi pada suhu 56 ºC selama 30 menit,
lalu dipanaskan 100 ºC selama 10 menit. Kemudian setelah proses pemanasan
selesai, supernatan yang berisi DNA cetakan siap digunakan untuk proses
amplifikasi.
Amplifikasi DNA dan penentuan urutan basa DNA untuk sekuen 16S
rRNA. Amplifikasi DNA dilakukan menggunakan mesin PCR (Polymerase
Chain Reaction). Primer yang digunakan pada proses PCR adalah 27F dan 1492R.
Volume DNA cetakan yang ditambahkan adalah 1 µL dari 20 µL total larutan
reaksi. Amplifikasi dilakukan sebanyak 35 siklus dengan kondisi denaturasi awal
94 °C selama 45 detik, anneling 55 ºC selama 60 detik dan elongasi pada suhu 72
ºC selama 60 detik. Kemudian purifikasi produk PCR dilakukan dengan
menggunakan Montage PCR Clean up kit (Milipore). Setelah itu, ditentukan
urutan basa DNA (sequencing) dari hasil PCR dengan menggunakan dua primer
(518F dan 800R) dan Big Dye terminator cycle sequencing kit (Apllied
BioSystem, USA), lalu dianalisis menggunakan Applied Biosystem model 3730XL
automated DNA sequencing system (Apllied BioSystem, USA).
Analisis hasil sequencing. Pensejajaran urutan basa DNA hasil
sequencing dilakukan dengan menggunakan proGram BioEdit Sequence
Alignment Editor ver.7.2.0. Selanjutnya hasil pensejajaran dianalisis
menggunakan proGram BLAST pada situs www.ncbi.nlm.nih.gov untuk
mengetahui spesies isolat bakteri endofit potensial tersebut.

6
Rekonstruksi pohon filogenetik (Singh et al. 2012). Pohon filogenetik
untuk mengetahui hubungan kekerabatan isolat bakteri endofit potensial dengan
spesies lain. Pembuatan pohon filogenetik dengan menggunakan software
ClustalX2 dan dilanjutkan dengan NJPlot.
Fermentasi dan Ekstraksi Senyawa Antibakteri Isolat BT22 (Ahamed 2012,
Garcia et al. 2012)
Fermentasi dilakukan dengan menumbuhkan isolat bakteri endofit
potensial ke dalam 50 mL media cair NB, kemudian diinkubasi dalam “shaker
incubator” selama 48 jam pada suhu 28-30 ºC dengan kecepatan 150 rpm. Kultur
bakteri hasil fermentasi dipindahkan ke dalam tabung sentrifugasi steril dan
disentrifugasi dengan kecepatan 3.600 rpm selama 10 menit untuk memisahkan
pelet dan supernatan. Supernatan yang telah terpisah dipindahkan ke corong
pemisah dan diekstrak menggunakan berbagai pelarut yaitu kloroform, n-heksana,
etil asetat dan etanol 70% dengan perbandingan 1:1 (v/v). Ekstrak dari kloroform,
n-heksana, etil asetat dan etanol 70% dilakukan uji aktivitas antibakteri terhadap
bakteri patogen dengan kloramfenikol sebagai kontrol positif. Selanjutnya, larutan
metabolit sekunder yang didapat dievaporasi pada vakum evaporator dengan suhu
40 ºC hingga terbentuk ekstrak kering.
Identifikasi Senyawa Antibakteri dengan Gas Chromatography – Mass
Spectrometer (GC-MS) (Kusumawati 2014)
Senyawa metabolit sekunder dari hasil ekstraksi dilarutkan dengan aseton,
kemudian diinjeksikan ke alat GC-MS. Proses GC-MS menggunakan kolom
kapiler tipe Phase Rtx-5MS dengan panjang 60 m dan diameter 0.25 mm. Kondisi
alat meliputi : suhu kolom 50 ºC, gas helium, SPL Temperature 280 ºC, MS
Interface 280 ºC, pyrolisis temperature 280 ºC, dan ion surface 200 ºC (Lampiran
8).

3 HASIL
Isolat Bakteri Endofit dari Tumbuhan Lantana camara L.
Tumbuhan tembelekan (Lantana camara L.) yang digunakan sebagai
sumber bakteri endofit dalam penelitian ini dengan daun berwarna hijau dan
tepian bergerigi serta batang berduri (Gambar 1). Sebanyak 21 isolat murni
bakteri endofit telah diperoleh dari hasil isolasi tumbuhan tembelekan (Lantana
camara L.), yaitu: 13 isolat dari akar (AT), 5 isolat dari batang (BT), dan 3 isolat
dari daun (DT). Persentase isolat bakteri endofit disajikan pada Gambar 2.
Keragaman isolat bakteri endofit berdasarkan ciri morfologi koloni seperti
yang tertera pada Tabel 1, terlihat bahwa kecepatan pertumbuhan dari 8 isolat
tergolong lambat (> 48 jam), 10 isolat tergolong sedang (24-48 jam) dan 3 isolat
yang tergolong cepat (< 24 jam). Berdasarkan permukaan bakteri, terdapat 13
isolat dengan permukaan berlendir (B), 6 isolat dengan permukaan kurang
berlendir (KB), 2 isolat dengan permukaan tidak berlendir (TB) dan cenderung
kering.

7

Gambar 1 Tumbuhan Lantana camara L. (sumber : dokumentasi pribadi, 2015)
Tabel 1 Ciri morfologi koloni dan kecepatan pertumbuhan isolat bakteri endofit
dari tumbuhan Lantana camara L.
Kode
isolat
AT11
AT12
AT13
AT21
AT22
AT23
AT24
AT3
AT4
AT5
AT6
AT7
AT8
BT11
BT12
BT21
BT22
BT3
DT1
DT11
DT2

Warna
putih susu
Kuning
Putih
Kekuningan
Kuning
Putih
Kekuningan
Krem
putih susu
Kuning
Kuning
putih susu
Kuning
putih susu
Kuning
putih
kekuningan
Putih
kekuningan
Kuning
Putih
kekuningan
Putih susu
Putih susu
Putih tulang
Putih susu

Ciri morfologi koloni
Permukaan
Tepian
B
bergerigi
B
bergerigi
KB
bergerigi

Elevasi
cembung
cembung
cembung

Kecepatan
pertumbuhan
+++
+++
++

B
B

rata
bergerigi

cembung
cembung

++
++

B
B
KB
B
KB
B
TB
B
KB

bergerigi
bergerigi
rata
bergerigi
bergerigi
rata
bergerigi
bergerigi
rata

cembung
cembung
cembung
cembung
datar
datar
datar
cembung
datar

+++
+
++
++
+
+
+
++
+

KB

rata

datar

+

B

bergerigi

cembung

++

TB
B
B
KB
B

bergerigi
bergerigi
bergerigi
bergerigi
bergerigi

datar
cembung
cembung
cembung
cembung

++
++
++
+
+

Ket : B = berlendir
KB = kurang berlendir
+++ = cepat (24 jam) ++ = sedang (48 jam)

TB = tidak berlendir
+ = lambat (> 48 jam)

8

Gambar 2 Persentase bakteri endofit yang diisolasi dari tumbuhan Tembelekan
Aktivitas Antibakteri Isolat Bakteri Endofit terhadap Bakteri Patogen
Uji aktivitas antibakteri dari isolat bakteri endofit dilakukan dengan
metode inokulasi titik terhadap bakteri patogen Bacillus cereus, Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, dan Salmonella enteritidis. Berdasarkan hasil uji aktivitas
antibakteri, beberapa isolat yang mampu menghasilkan zona hambat di antaranya
AT22, AT3, BT21, BT22, dan DT11 (Tabel 2). Hal ini menandakan bahwa isolat
tersebut berpotensi sebagai antibakteri. Isolat BT22 merupakan isolat paling
potensial karena memiliki aktivitas antibakteri dengan menghambat keempat
bakteri patogen (Gambar 3). Isolat BT22 berwarna putih kekuningan dengan
tepian bergerigi, permukaan tidak berlendir dan elevasi datar (Gambar 4).
Tabel 2 Diameter zona hambat yang terbentuk pada seleksi isolat bakteri endofit
No
1
2
3
4
5

Kode
Isolat
AT22
AT3
BT21
BT22
DT11

B. cereus
2
3
-

Diameter zona hambat (mm)
E. coli
S. aureus S.enteritidis
V
V
V
3
V
V
8
5
1
3
1

Keterangan : V = terdapat zona hambat namun sangat kecil dan sulit terukur

Gambar 3 Zona hambat isolat BT22 yang terbentuk terhadap bakteri patogen

9

Gambar 4 Isolat BT22 bakteri endofit dari tumbuhan Lantana camara L.
Sekuen 16S rRNA dan Rekonstruksi Pohon Filogenetik
Identifikasi isolat potensial BT22 dengan menggunakan analisis 16S
rRNA. Urutan sekuen basa 16S rRNA dibandingkan dengan urutan basa yang
telah tersimpan dalam NCBI-GenBank database. Hasil sekuensing isolat BT22
yang telah disejajarkan menunjukkan bahwa gen 16S rRNA pada isolat tersebut
berukuran 1477 pb (pasang basa) (Gambar 5). Berdasarkan hasil analisis sekuen
16S rRNA menggunakan program BLAST, isolat BT22 memiliki persentase
kemiripan dengan Bacillus amyloliquefaciens YB-1402 sebesar 99% (Lampiran
5). Hal ini didukung dengan rekonstruksi pohon filogenetik untuk mengetahui
hubungan kekerabatan antar spesies bakteri. Pensejajaran sekuen hasil penelitian
dan beberapa sekuen bakteri lain yang diambil dari NCBI-GenBank database
dengan menggunakan clustalX2. Kemudian hasil pensejajaran dimasukkan ke
dalam NJPlot untuk merekonstruksi pohon filogenetik. Hasil rekonstruksi pohon
filogenetik menunjukkan bahwa isolat BT22 memiliki hubungan kekerabatan
yang paling dekat dengan Bacillus amyloliquefaciens (Lampiran 6).
>BT22_Consensus (1477 pb)

Gambar 5 Sekuen 16S rRNA isolat potensial BT22 hasil pensejajaran

10
Aktivitas Senyawa Antibakteri Ekstrak Kloroform Isolat Potensial BT22
Ekstraksi senyawa antibakteri isolat potensial BT22 dilakukan dengan
menggunakan pelarut kloroform, n-heksana, etil asetat, dan etanol 70%.
Selanjutnya ekstrak dari kloroform, n-heksana, etil asetat, dan etanol 70% isolat
potensial BT22 diujikan kembali dengan bakteri patogen Bacillus cereus,
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, dan Salmonella enteritidis.
Kloramfenikol 60µg/mL digunakan sebagai kontrol positif. Berdasarkan hasil uji,
ekstrak kloroform isolat BT22 memiliki aktivitas antibakteri yang paling baik
karena mampu menghambat pertumbuhan Bacillus cereus, Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, dan Salmonella enteritidis. Hal ini terlihat dengan
terbentuknya zona bening di sekitar lubang sumur masing-masing sebesar 3 mm,
7 mm, 2 mm, dan 1 mm (Tabel 3). Diameter zona hambat ekstrak kloroform isolat
BT22 terhadap Bacillus cereus, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, dan
Salmonella enteritidis ditunjukkan pada Gambar 6. Menurut Zahro & Agustini
(2013), aktivitas antibakteri dapat digolongkan berdasarkan besarnya zona hambat
yang terbentuk dapat diklasifikasikan dalam Tabel 4.
Tabel 3 Diameter zona hambat ekstrak senyawa antibakteri isolat potensial BT22
dengan berbagai pelarut
Jenis
Diameter zona hambat (mm)
Pelarut
B. cereus
E. coli
S. aureus
S. enteritidis
Kloroform
3
7
2
1
n-heksana
3
Etil asetat
1
Etanol 70%

Tabel 4 Klasifikasi aktivitas antibakteri berdasarkan diameter zona hambat
Aktivitas antibakteri
Diameter zona hambat (mm)
Lemah
20

11

Gambar 6 Zona hambat ekstrak kloroform terhadap bakteri patogen

Senyawa Antibakteri Ekstrak Kloroform Isolat BT22 dengan GC-MS
Senyawa-senyawa yang teridentifikasi tidak semuanya termasuk dalam
senyawa golongan antibakteri. Senyawa dengan konsentrasi tertinggi adalah
sikloheksanon menunjukkan peak tertinggi dengan konsentrasi 42.74% pada
waktu retensi 4.421. Senyawa dominan yang terdeteksi dalam analisis GC-MS
adalah tetrakosan pada waktu retensi 23.566 (2.23%), 23.625 (0.58%), 24.839
(0.49%), 25.649 (1.21%), 25.748 (1.71%), 26.249 (0.79%), 28.735 (0.95%),
28.902 (1.27%) dan 33.434 (1.16%). Selain itu, oktadekan juga merupakan
senyawa dominan yang terdeteksi dalam analisis GC-MS pada waktu retensi
19.239 (0.62%), 19.554 (1.24%), 20.429 (1.65%), 21.729 (2.28%), 21.897
(4.29%), 23.410 (0.93%), 23.492 (1.25%) dan 23.926 (3.09%) (Lampiran 8).
Hasil analisis GC-MS ekstrak kloroform isolat BT22 menunjukkan beberapa
senyawa yang diduga berpotensi sebagai senyawa antibakteri (Tabel 5).

12
Tabel 5 Senyawa yang diduga berperan sebagai senyawa antibakteri yang
terkandung di dalam ekstrak kloroform isolat BT22
No

Nama Senyawa

Rumus
Molekul
C6H10O

Berat
Molekul
98.15

1

Sikloheksanon

2

Tetrakosan

C24H50

338

3

Oktadekan

C18H38

254

4

Dokosan

C22H46

310

5

Eikosan

C20H42

282

6

Tetratetrakontan

C44H90

619

7

Nonakosan

C29H60

408

8

Metil eugenol (ME)

C11H14O2

178

9

Fenol

C6H5OH

206

10

C16H22O4

278

11

1,2benzendikarboksilat,
phtlat
Asam heksadekanoat

C17H34O2

270

12

Asam heksanedioat

C22H42O4

370

Asam
Butil

Aktivitas Biologi
Antibakteri
dan
antifungi (Jha et al.
2013)
Sitotoksik terhadap sel
kanker usus besar HT29 dengan menginduksi
apoptosis (Uddin et al.
2012)
Antimikrob terhadap S.
aureus dan E. coli
(Shkiri et al. 2014).
Antibakteri
terhadap
bakteri
Gram-positif
maupun Gram-negatif
(Uma
&
Parvathavarthini 2010)
Antibakteri, antifungi,
serta efek sitotoksik
terhadap sel kanker
HeLa
dan
MCF-7
(Hsouna et al. 2011)
Antibakteri dan anti
inflamasi (Kumar et al
2011)
Antibakteri (Saracoglu
et al. 2012)
Antibakteri
terhadap
Campylobacter jejuni
(Rossi et al. 2007)
Antimikrob
pada
Sesame
radiatum
(Shittu et al. 2007)
Antifungi, antibakteri,
dan anti malaria (Elija
et al. 2012)
Antibakteri
terhadap
Salmonella
typhi,
Shigella
sp.,
dan
Enterococcus faecalis
(Manilal et al. 2009)
Antibakteri terhadap S.
aureus, K. pneumoniae,
dan Shigella dysentriae
(Chu et al. 2014)

13

4 PEMBAHASAN
Isolat Bakteri Endofit dari Tumbuhan Lantana camara L.
Isolasi tumbuhan tembelekan (Lantana camara L.) untuk menghasilkan
bakteri endofit yang berpotensi sebagai penghasil senyawa antibakteri merupakan
alternatif terbaru tanpa memerlukan ekstraksi tumbuhan obat dalam jumlah yang
banyak dan waktu yang cukup lama. Bakteri endofit tidak berdampak negatif bagi
tumbuhan inang, namun terbentuk simbiosis mutualisme antara bakteri endofit
dan tumbuhan inangnya (Strobel & Daisy 2003). Bakteri endofit bermanfaat bagi
tumbuhan inangnya karena mampu menghasilkan produk alami yang dapat
digunakan sebagai obat, bidang pertanian, dan industri (Ryan et al. 2008).
Pemilihan tumbuhan tembelekan dikarenakan tumbuhan ini telah terbukti
memiliki khasiat sebagai obat karena mengandung senyawa bioaktif flavon,
isoflavon, flavonoid, anthosianidin, lignan, katesin, isokatesin, alkaloid, tanin,
saponin dan terpenoid (Deepak et al. 2009) dan ekstraknya banyak digunakan
untuk mengobati penyakit influenza disertai demam tinggi, rematik, bengkak,
memar, serta penyakit kulit (Dalimartha 2007).
Hasil isolasi bakteri endofit dari tanaman Lantana camara L. didapatkan
sebanyak 21 isolat di antaranya 13 isolat dari akar (AT), 5 isolat dari batang (BT),
dan 3 isolat dari daun (DT). Hal ini sesuai dengan pernyataan Lodewyckx et al.
(2002) yang menyatakan bahwa bakteri endofit dapat diisolasi dari bagian akar,
daun, batang, bunga, buah, dan biji. Bakteri endofit banyak terdapat di akar dan
semakin menurun jumlahnya pada batang dan daun (Lamb et al. 1996). Jumlah
bakteri endofit yang dihasilkan banyak terdapat di bagian akar. Hal ini disebabkan
karena bakteri endofit masuk ke jaringan tumbuhan pertama kali melalui akar
(Zinniel et al. 2002). Perakaran tanaman (rhizosfer) banyak mengandung asam
amino dan gula yang digunakan sebagai sumber nutrisi bagi bakteri endofit
(Sylvia 2005), sehingga jaringan internal bagian perakaran memiliki kerapatan
populasi bakteri paling tinggi dibandingkan bagian tanaman lain (Hallman 1997).
Isolasi bakteri endofit dari sampel tumbuhan dilakukan dengan metode
sterilisasi permukaan (Hallman et al. 1997). Sodium hipoklorit (NaOCl)
digunakan untuk sterilisasi permukaan yang bersifat bakterisidal dan virusidal
(Bolfoni et al. 2014). Metode surface sterilization digunakan untuk
menghilangkan mikroorganisme epifit pada sampel tumbuhan (Larran et al.
2001). Penambahan nistatin ke dalam media isolasi NA berfungsi sebagai
antifungi (Silva et al. 2008).
Keragaman bakteri endofit ditunjukkan pada Tabel 1 dilihat dari segi
morfologi koloni isolat. Keanekaragaman bakteri endofit ditentukan dari kondisi
tumbuhan sebagai tumbuhan inang bagi bakteri endofit (Seo et al. 2010). Hal ini
menjelaskan bahwa faktor-faktor fisiologis yang mempengaruhi pertumbuhan
tumbuhan inang juga berpengaruh terhadap keragaman bakteri endofit. Faktorfaktor fisiologis tersebut antara lain struktur tanah, umur tumbuhan, sebaran
geografis, waktu pengambilan sampel (Mano et al. 2007; Helander et al. 2007)
dan jenis jaringan tumbuhan (Zinniel et al. 2002).

14
Aktivitas Antibakteri Isolat Bakteri Endofit terhadap Bakteri Patogen
Hal ini sesuai dengan pernyataan Simarmata et al. (2007) yang
menyatakan bahwa isolat mikroba endofit dikatakan mempunyai aktivitas
antimikroba jika terbentuk zona jernih di sekeliling isolat mikroba endofit yang
ditumbuhkan pada media yang telah diinokulasi oleh mikroba patogen.
Perbedaan diameter zona hambat kemungkinan disebabkan oleh
kandungan senyawa antibakteri yang berbeda (Kusumawati 2014) dan diameter
dinding sel bakteri patogen (Junanto et al. 2008). Beberapa isolat bakteri endofit
tidak menunjukkan aktivitas antibakteri. Hal ini terjadi karena adanya
kemungkinan bakteri endofit memiliki kandungan senyawa aktif namun
jumlahnya sangat kecil atau mungkin juga mengandung senyawa aktif potensial
lain (Son & Cheah 2002) seperti asam indol asetat (IAA) (Dudeja & Giri 2014)
dan enzim (Kannan et al. 2015).
Hasil uji aktivitas antibakteri menunjukkan bahwa bakteri endofit dari
tumbuhan tembelekan (Lantana camara L.) memiliki kemampuan untuk
menghasilkan senyawa antibakteri (Tabel 2). Penelitian sebelumnya melaporkan
bahwa ekstrak dari bunga, daun, batang, dan akar Lantana camara L.
menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa, Staphylococcus aureus, dan Staphylococcus saprohiticus (Mary
2011). Hal ini menandakan bahwa bakteri endofit yang diisolasi dari tumbuhan
Tembelekan (Lantana camara L.) mampu mensintesis senyawa antibakteri seperti
tumbuhan inangnya.
Berdasarkan hasil penelitian, isolat BT22 merupakan isolat paling
potensial karena memiliki kemampuan menghambat keempat bakteri patogen
yang diujikan. Selanjutnya, isolat potensial BT22 dilakukan uji lanjut untuk
karakterisasi molekuler analisis sekuen 16S rRNA.

Analisis Sekuen 16S rRNA dan Rekonstruksi Pohon Filogenetik
Identifikasi bakteri endofit isolat BT22 dilakukan dengan analisis sekuen
16S rRNA. Analisis sekuen 16S rRNA merupakan tahap penting identifikasi
tingkat molekuler (Singh et al. 2012). Analisis ini dapat digunakan untuk
klasifikasi dan identifikasi berbasis filogenetik dengan menggunakan parameter
yang tidak bergantung pada kondisi pertumbuhan dan media yang digunakan
(Case et al. 2007). Menurut Singh et al. (2012), operon ribosom terutama 16S
rRNA telah terbukti menjadi penanda molekuler yang stabil dan spesifik untuk
identifikasi bakteri. Alasan menggunakan rRNA adalah dapat mengakses
database dengan mudah. Sifat rRNA yang sangat konservatif dapat mensintesis
primer universal untuk proses PCR yang mampu melekat pada sekuen
terkonservasi dari gen rRNA ketiga domain filogenetik : Archaea, Bacteria, dan
Eukarya. Daerah terkonservasi tersebut menjadi tempat perlekatan primer untuk
mengamplifikasi gen 16S rRNA secara in vitro yang diisolasi dari lingkungan
(Drancourt et al. 2000).
Analisis sekuen 16S rRNA menunjukkan bahwa isolat BT22 memiliki
persentase kemiripan dengan Bacillus amyloliquefaciens YB-1402 sebesar 99%
(Lampiran 5). Bacillus merupakan genus bakteri Gram positif yang memiliki ciri

15
morfologi berbentuk batang dan banyak terdapat di dalam tanah (Niazi 2014).
Bacillus amyloliquefaciens termasuk bakteri Gram positif yang dapat
menghasilkan senyawa metabolit sekunder dan berperan sebagai antimikroba.
Jenis senyawa antimikroba yang mampu disintesis di antaranya senyawa
antibakteri berupa poliketida (basilaen, diffisidin, dan makrolaktin), senyawa
antifungi berupa lipopeptida (surfaktin, fengysin, dan basilomisin D) (He et al.
2013), siderophora (basilibaktin) (Scholz et al. 2011), dan antibiotik iturin A (Lin
et al. 2007).
Bacillus amyloliquefaciens memiliki kemampuan untuk mempercepat
pertumbuhan tumbuhan dan menekan pertumbuhan fungi serta bakteri
fitopatogenik (Qiao et al. 2014). Nasrin et al. (2015) dalam penelitiannya
mengungkapkan bahwa senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan oleh
Bacillus amyloliquefaciens mampu menghambat pertumbuhan Methicilinresistant Staphylococcus aureus (MRSA). Filho et al. (2013) melaporkan bahwa
Bacillus amyloliquefaciens mampu mensintesis makromolekul protein dari alam
yang dapat menginduksi daya resistensi tumbuhan tomat (Solanum lycopersicum)
terhadap bercak bakteri yang disebabkan oleh Xanthomonas vesicatoria.
Aktivitas Senyawa Antibakteri Ekstrak Kloroform Isolat Potensial BT22
Fermentasi dilakukan untuk mengisolasi senyawa metabolit sekunder pada
isolat potensial BT22. Pemilihan supernatan pada hasil sentrifugasi dikarenakan
senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh isolat potensial BT22 bersifat
ekstraseluler. Hal ini diperkuat dengan pernyataan Seo et al. (2010) yang
menyatakan bahwa metabolit sekunder dihasilkan secara ekstraseluler sehingga
dilakukan pemisahan sel bakteri dalam supernatan untuk mengekstrak metabolit
sekunder. Supernatan diperoleh melalui proses sentrifugasi untuk mengendapkan
sel bakteri, sehingga supernatan hanya mengandung hasil metabolisme bakteri
(Savadogo et al. 2004).
Ekstraksi senyawa antibakteri isolat potensial BT22 dilakukan dengan
menggunakan pelarut kloroform, n-heksana, etil asetat, dan etanol 70%.
Selanjutnya ekstrak dari kloroform, n-heksana, etil asetat, dan etanol 70% isolat
potensial BT22 diujikan kembali dengan bakteri patogen Bacillus cereus,
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, dan Salmonella enteritidis. Hasil uji
aktivitas senyawa antibakteri dari berbagai pelarut menunjukkan bahwa ekstrak
kloroform memiliki aktivitas paling baik karena mampu menghambat keempat
bakteri patogen (Tabel 3). Hal ini dikarenakan kloroform bersifat non-polar
sehingga dapat melarutkan senyawa-senyawa organik, diantaranya senyawa
golongan lipid. Kloramfenikol 60µg/mL digunakan sebagai kontrol positif karena
merupakan antibiotika bakteriostatik berspektrum luas yang aktif terhadap
organisme-organisme aerobik dan anaerobik Gram positif maupun Gram negatif
(Katzung 2004). Klasifikasi aktivitas antibakteri berdasarkan diameter zona
hambat (Tabel 4), menunjukkan bahwa aktivitas antibakteri ekstrak kloroform
tergolong sedang terhadap E. coli dan tergolong lemah terhadap Bacillus cereus,
Staphylococcus aureus, dan Salmonella enteritidis. Hal ini menandakan bahwa
senyawa antibakteri yang terkandung di dalam ekstrak kloroform memiliki
aktivitas penghambatan yg lebih besar terhadap E. coli.

16
Senyawa Antibakteri Ekstrak Kloroform Isolat BT22 dengan GC-MS
Hasil analisis GC-MS menunjukkan bahwa di dalam ektrak kloroform
isolat BT22 terdapat beberapa senyawa yang berpotensi sebagai antibakteri (Tabel
5). Senyawa yang terdeteksi dalam analisis GC-MS dengan konsentrasi tertinggi
adalah sikloheksanon. Jha et al. (2013) melaporkan bahwa reaksi asam
aminobenzoat / aminopiridin dengan keton (asetil aseton / sikloheksanon) dan
benzaldehid menghasilkan senyawa asam benzoat / piridin yang menunjukkan
aktivitas antibakteri dan antifungi.
Senyawa dominan yang paling sering terdeteksi dalam analisis GC-MS
adalah tetrakosan. Tetrakosan merupakan senyawa hidrokarbon alifatik (Kalegari
et al. 2011) golongan alkana (Sonibare et al. 2007). Senyawa ini belum ada
laporan ilmiah terkait perannya sebagai antibakteri, namun penelitian sebelumnya
telah melaporkan bahwa senyawa tetrakosan memiliki aktivitas sitotoksik
terhadap sel kanker usus besar HT-29 dengan menginduksi apoptosis (Uddin et al.
2012). Hal ini menandakan bahwa meskipun belum diketahui perannya sebagai
antibakteri, namun tetrakosan telah diketahui berperan dalam bidang medis. Selain
itu, oktadekan juga merupakan senyawa dominan yang sering terdeteksi dalam
analisis GC-MS. Oktadekan merupakan senyawa golongan alkana yang memiliki
efek antimikroba, terutama terhadap S. aureus dan E. coli (Shkiri et al. 2014).
Dokosan terdeteksi sebanyak 1.76%, 3.50%, dan 1.51% pada hasil analisis
GC-MS. Ekstrak T. alexandri dengan salah satu komponen senyawa utamanya
dokosan bersifat antibakteri terhadap bakteri Gram-positif maupun Gram-negatif
(Uma & Parvathavarthini 2010). Eikosan merupakan senyawa yang muncul pada
waktu retensi 20.240 dan 20.910 (0.51% dan 3.07%). Senyawa eikosan dari
ekstrak tumbuhan Ceratonia siliqua menunjukkan aktivitas antibakteri, antifungi,
serta efek sitotoksik terhadap sel kanker HeLa dan MCF-7 (Hsouna et al. 2011).
Tetratetrakontan merupakan senyawa yang terdeteksi pada waktu retensi
21.111 (1.60%) merupakan senyawa golongan alkana (Kanimozhi & Bai 2012).
Senyawa ini diketahui sebagai komponen dari daun dan biji Syzygium cumini,
tumbuhan obat yang digunakan sebagai antibakteri dan antiinflamasi (Kumar et al
2011). Nonakosan terdeteksi pada waktu retensi 26.127 (1.69%) adalah senyawa
golongan alkana (Kanimozhi & Bai 2012). Senyawa ini terdapat pada akar B.
lancifolium dan memiliki aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus
ATCC 6538, Staphylococcus aureus ATCC 29213, E. coli ATCC 25923, E. coli
ATCC 29988, Proteus mirabilis ATCC 43071 (Saracoglu et al. 2012).
Metil eugenol terdeteksi pada waktu retensi 16.748 (2.63%), biasa dikenal
dengan nama Methyl Eugenol (ME). ME merupakan senyawa phenylpropanoid,
turunan dari phenylalanin yang banyak terkandung dalam tumbuhan obat (Tan &
Nishida 2012). Pertumbuhan Campylobacter jejuni, bakteri penyebab penyakit
gastroenteritis pada manusia dapat dihambat oleh tumbuhan wortel dengan
kandungan minyak esensial berupa ME dan elemisin (Rossi et al. 2007).
Fenol terdeteksi sebanyak 0.37% merupakan senyawa aromatik yang
terdiri dari fenol, asam karboksilat aromatik dan ester (Roy et al. 2010). Fenol dan
asam fenolat merupakan senyawa bioaktif yang berperan sebagai antibakteri pada
tumbuhan obat (Proestos et al. 2005). Fenol dan asam karboksilat memiliki
aktivitas antimikroba pada Sesame radiatum (Shittu et al. 2007).

17
Mekanisme kerja senyawa fenol sebagai zat antibakteri dengan cara
meracuni protoplasma, merusak dan menembus dinding sel, serta mengendapkan
protein sel bakteri. Komponen fenol juga dapat mendenaturasi enzim yang
bertanggung jawab dalam germinasi spora atau berpengaruh terhadap asam amino
yang terlibat dalam proses germinasi. Senyawa fenolik bermolekul besar mampu
menginaktifkan enzim esensial di dalam sel bakteri meskipun dalam konsentrasi
yang sangat rendah. Senyawa fenol mampu memutus senyawa peptidoglikan saat
menerobos dinding sel. Ikatan peptidoglikan ini secara mekanis memberi
kekuatan pada sel bakteri. Bakteri Gram negatif dengan dinding sel terdapat
peptidoglikan yang sedikit sekali berada di antara selaput luar dan selaput dalam
dinding sel. Dinding sel Gram negatif mengandung fosfolipid, lipopolisakarida
dan lipoprotein. Setelah menerobos dinding sel, senyawa fenol akan menyebabkan
kebocoran isi sel dengan cara merusak ikatan hidrofobik komponen membran sel
(seperti protein dan fosfolipid) serta larutnya komponen-komponen yang
berikatan secara hidrofobik yang berakibat meningkatnya permeabilitas membran.
Terjadinya kerusakan pada membran sel mengakibatkan terhambatnya aktivitas
dan biosintesis enzim-enzim spesifik yang diperlukan dalam reaksi metabolisme
pada bakteri patogen segingga mampu menghambat pertumbuhan sel atau bahkan
mematikan sel bakteri patogen tersebut (Darsana et al. 2012).
1,2- Asam benzendikarboksilat, Butil pthlat terdeteksi sebanyak 0.84%
dan 2.08% merupakan senyawa golongan triterpenoid berstruktur siklik,
kebanyakan berupa alkohol, aldehid, dan asam karboksilat (Suhada 2013).
Senyawa ini biasa dikenal dengan nama Dibuthyl phthalate (DBP). Senyawa ini
memiliki aktivitas antifungi, antibakteri, dan antimalaria (Elija et al. 2012).
Triterpenoid mempunyai potensi sebagai antibakteri terhadap Escherichia coli dan
Staphylococcus aureus pada konsentrasi 1000 ppm (Sukadana et al. 2008).
Kandungan triterpenoid membuktikan perannya sebagai senyawa antibakteri.
Mekanisme kerja senyawa triterpenoid dengan cara merusak membran sel
bakteri karena senyawa triterpenoid bersifat lipofilik. Hal ini mengakibatkan
lisisnya membran sel dan koagulasi sitoplasma dari sel bakteri (Darsana et al.
2012).
Asam heksadekanoat termasuk senyawa golongan asam palmitat terdeteksi
pada waktu retensi 20.490 dengan konsentrasi 1.10%. Asam heksadekanoat
merupakan komponen utama dari alga merah F. hillebrandii yang memiliki
potensi sebagai antibiotik karena bersifat antibakteri terhadap Salmonella typhi,
Shigella sp., dan Enterococcus faecalis (Manilal et al. 2009). Asam heksanedioat,
senyawa organik yang biasa dikenal dengan asam adipat. Asam heksanedio