Studi Metagenomik Aktinomiset Berdasarkan Gen 16S rRNA dan Deteksi Gen nifH Pada Tanah dan Akar Empat Varietas Tanaman Padi Asal Indonesia dengan Teknik DGGE
STUDI METAGENOMIK AKTINOMISET BERDASARKAN
GEN 16S rRNA DAN DETEKSI GEN nifH PADA TANAH DAN
AKAR EMPAT VARIETAS TANAMAN PADI DENGAN
TEKNIK DGGE
MAHYARUDIN
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Studi Metagenomik
Aktinomiset Berdasarkan Gen 16S rRNA dan Deteksi Gen nifH Pada Tanah dan
Akar Empat Varietas Tanaman Padi dengan Teknik DGGE adalah benar karya
saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Oktober 2014
Mahyarudin
NIM G351120131
RINGKASAN
MAHYARUDIN. Studi Metagenomik Aktinomiset Berdasarkan Gen 16S rRNA
dan Deteksi Gen nifH Pada Tanah dan Akar Empat Varietas Tanaman Padi
dengan Teknik DGGE. Dibimbing oleh YULIN LESTARI dan IMAN
RUSMANA.
Aktinomiset merupakan salah satu mikrob yang sangat penting
dikarenakan kemampuannya dalam menghasilkan senyawa metabolit seperti
pemacu tumbuh tanaman. Aktinomiset endofit telah dilaporkan mampu
memfiksasi nitrogen dan menghasilkan beberapa senyawa bioaktif seperti
fitohormon, enzim, dan antimikrob pada tanaman padi yang mampu tumbuh pada
berbagai tipe agroekosistem yang berbeda. Denaturing gradient gel
electrophoresis (DGGE) digunakan untuk menganalisis keragaman mikrob.
Analisis menggunakan DGGE mampu memisahkan gen yang memiliki ukuran
DNA hasil amplifikasi dengan PCR yang sama tetapi komposisi sekuen basa
DNA-nya berbeda. Deteksi keragaman aktinomiset dan bakteri yang memiliki
kemampuan untuk memfiksasi nitrogen menggunakan penanda genetik seperti
gen 16S rRNA dan nifH. Penelitian ini bertujuan mempelajari metagenom
aktinomiset berdasarkan gen 16S rRNA dan deteksi gen nifH pada bakteri yang
memiliki kemampuan memfiksasi nitrogen pada tanah dan akar empat varietas
tanaman padi asal Indonesia dengan teknik DGGE.
DNA genom dari tanah dan akar empat varietas tanaman padi diisolasi
menggunakan Soil DNA Isolation Kit dan Genomic DNA Mini Kit (Plant),
selanjutnya gen 16S rRNA aktinomiset diamplifikasi menggunakan primer
spesifik aktinomiset dengan teknik nested PCR. Amplifikasi PCR gen 16S rRNA
aktinomiset menghasilkan produk berukuran 1087 pb dan 180 pb. Deteksi
keragaman bakteri dianalisis menggunakan primer universal gen nifH untuk
mendeteksi gen nifH pada bakteri pemfiksasi nitrogen dengan teknik direct PCR.
Amplifikasi PCR gen nifH menghasilkan produk berukuran 360 pb. Analisis
keragaman aktinomiset dan bakteri pemfiksasi nitrogen dengan DGGE pada gel
poliakrilamida. Produk PCR hasil pemotongan pita pada gel poliakrilamida
disekuensing dan dianalisis kekerabatannya dengan menggunakan software
bioinformatika MEGA 5.05.
Hasil analisis karakter fisika dan kimia tanah menunjukkan bahwa tanah
sawah, tanah kering, dan tanah rawa (tiga tipe agroekosistem) merupakan tanah
asam dan memiliki kandungan total nitrogen organik yang tergolong sedang.
Profil DGGE berdasarkan gen 16S rRNA menunjukkan keragaman komunitas
aktinomiset pada sampel akar (20-23 pita) lebih beragam dibandingkan dengan
sampel tanah (12-18 pita). Keragaman komunitas aktinomiset memiliki kemiripan
pada empat varietas tanaman padi dan tiga tipe agroekosistem. Profil pita DGGE
dipotong dan di re-PCR menggunakan primer tanpa GC clamps untuk
disekuensing. Sekuen DNA dibandingkan dengan database pada Genbank yang
mengindikasikan hubungan kekerabatannya dengan mikrob lain. Hasil BLAST.N
menunjukkan 17 pita memiliki hubungan kekerabatan dengan identitas maksimum
berkisar 93-100% terhadap 5 genera dari aktinomiset seperti Geodermatophilus,
Actinokineospora, Actinoplanes, Streptomyces
and Kocuria. Genus
Actinokineospora dan Actinoplanes hanya ditemukan masing-masing satu spesies
yaitu Actinokineospora diospyrosa NRRL B-24047 dan Actinoplanes friuliensis
HAG 010964. Geodermatophilus terdiri atas dua spesies yaitu G. terrae PB261
dan G. normandii CF 5/3, sedangkan Kocuria terdiri atas tiga spesies yaitu K.
rhizophila DC2201, K. aegyptia YIM 70003 dan K. himachalensis K07-05.
Streptomyces merupakan genus yang paling dominan yang terdiri atas empat
spesies yaitu S. alboniger DSM 40043, S. chiangmaiensis TA4-1, S. acidiscabies
RL-110, dan S. rapamycinicus ATCC 29253. Hasil penelitian ini menemukan
bahwa spesies dari genus Streptomyces pada sampel tanah dan akar tanaman padi
lebih bervariasi dibandingkan dengan genus dari aktinomiset lainnya, dengan
dominansi S. alboniger dan S. acidiscabies pada hampir seluruh sampel. Pita 1
dan 6 memiliki indikasi sebagai novel species karena kedua sekuens DNA ini
memiliki identitas maksimum kemiripan
GEN 16S rRNA DAN DETEKSI GEN nifH PADA TANAH DAN
AKAR EMPAT VARIETAS TANAMAN PADI DENGAN
TEKNIK DGGE
MAHYARUDIN
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Studi Metagenomik
Aktinomiset Berdasarkan Gen 16S rRNA dan Deteksi Gen nifH Pada Tanah dan
Akar Empat Varietas Tanaman Padi dengan Teknik DGGE adalah benar karya
saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Oktober 2014
Mahyarudin
NIM G351120131
RINGKASAN
MAHYARUDIN. Studi Metagenomik Aktinomiset Berdasarkan Gen 16S rRNA
dan Deteksi Gen nifH Pada Tanah dan Akar Empat Varietas Tanaman Padi
dengan Teknik DGGE. Dibimbing oleh YULIN LESTARI dan IMAN
RUSMANA.
Aktinomiset merupakan salah satu mikrob yang sangat penting
dikarenakan kemampuannya dalam menghasilkan senyawa metabolit seperti
pemacu tumbuh tanaman. Aktinomiset endofit telah dilaporkan mampu
memfiksasi nitrogen dan menghasilkan beberapa senyawa bioaktif seperti
fitohormon, enzim, dan antimikrob pada tanaman padi yang mampu tumbuh pada
berbagai tipe agroekosistem yang berbeda. Denaturing gradient gel
electrophoresis (DGGE) digunakan untuk menganalisis keragaman mikrob.
Analisis menggunakan DGGE mampu memisahkan gen yang memiliki ukuran
DNA hasil amplifikasi dengan PCR yang sama tetapi komposisi sekuen basa
DNA-nya berbeda. Deteksi keragaman aktinomiset dan bakteri yang memiliki
kemampuan untuk memfiksasi nitrogen menggunakan penanda genetik seperti
gen 16S rRNA dan nifH. Penelitian ini bertujuan mempelajari metagenom
aktinomiset berdasarkan gen 16S rRNA dan deteksi gen nifH pada bakteri yang
memiliki kemampuan memfiksasi nitrogen pada tanah dan akar empat varietas
tanaman padi asal Indonesia dengan teknik DGGE.
DNA genom dari tanah dan akar empat varietas tanaman padi diisolasi
menggunakan Soil DNA Isolation Kit dan Genomic DNA Mini Kit (Plant),
selanjutnya gen 16S rRNA aktinomiset diamplifikasi menggunakan primer
spesifik aktinomiset dengan teknik nested PCR. Amplifikasi PCR gen 16S rRNA
aktinomiset menghasilkan produk berukuran 1087 pb dan 180 pb. Deteksi
keragaman bakteri dianalisis menggunakan primer universal gen nifH untuk
mendeteksi gen nifH pada bakteri pemfiksasi nitrogen dengan teknik direct PCR.
Amplifikasi PCR gen nifH menghasilkan produk berukuran 360 pb. Analisis
keragaman aktinomiset dan bakteri pemfiksasi nitrogen dengan DGGE pada gel
poliakrilamida. Produk PCR hasil pemotongan pita pada gel poliakrilamida
disekuensing dan dianalisis kekerabatannya dengan menggunakan software
bioinformatika MEGA 5.05.
Hasil analisis karakter fisika dan kimia tanah menunjukkan bahwa tanah
sawah, tanah kering, dan tanah rawa (tiga tipe agroekosistem) merupakan tanah
asam dan memiliki kandungan total nitrogen organik yang tergolong sedang.
Profil DGGE berdasarkan gen 16S rRNA menunjukkan keragaman komunitas
aktinomiset pada sampel akar (20-23 pita) lebih beragam dibandingkan dengan
sampel tanah (12-18 pita). Keragaman komunitas aktinomiset memiliki kemiripan
pada empat varietas tanaman padi dan tiga tipe agroekosistem. Profil pita DGGE
dipotong dan di re-PCR menggunakan primer tanpa GC clamps untuk
disekuensing. Sekuen DNA dibandingkan dengan database pada Genbank yang
mengindikasikan hubungan kekerabatannya dengan mikrob lain. Hasil BLAST.N
menunjukkan 17 pita memiliki hubungan kekerabatan dengan identitas maksimum
berkisar 93-100% terhadap 5 genera dari aktinomiset seperti Geodermatophilus,
Actinokineospora, Actinoplanes, Streptomyces
and Kocuria. Genus
Actinokineospora dan Actinoplanes hanya ditemukan masing-masing satu spesies
yaitu Actinokineospora diospyrosa NRRL B-24047 dan Actinoplanes friuliensis
HAG 010964. Geodermatophilus terdiri atas dua spesies yaitu G. terrae PB261
dan G. normandii CF 5/3, sedangkan Kocuria terdiri atas tiga spesies yaitu K.
rhizophila DC2201, K. aegyptia YIM 70003 dan K. himachalensis K07-05.
Streptomyces merupakan genus yang paling dominan yang terdiri atas empat
spesies yaitu S. alboniger DSM 40043, S. chiangmaiensis TA4-1, S. acidiscabies
RL-110, dan S. rapamycinicus ATCC 29253. Hasil penelitian ini menemukan
bahwa spesies dari genus Streptomyces pada sampel tanah dan akar tanaman padi
lebih bervariasi dibandingkan dengan genus dari aktinomiset lainnya, dengan
dominansi S. alboniger dan S. acidiscabies pada hampir seluruh sampel. Pita 1
dan 6 memiliki indikasi sebagai novel species karena kedua sekuens DNA ini
memiliki identitas maksimum kemiripan