Hubungan Filogenetik Hylarana Mocquardii (Anura : Ranidae) Di Sulawesi Berdasarkan Pengukuran Morfologi Dan Molekuler Gen 12s Rrna Dan 16s Rrna.

i

HUBUNGAN FILOGENETIK Hylarana mocquardii (ANURA : RANIDAE)
DI SULAWESI BERDASARKAN PENGUKURAN MORFOLOGI
DAN MOLEKULER GEN 12S rRNA DAN 16S rRNA

SISTER SIANTURI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

ii

iii

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Hubungan Filogenetik
Hylarana mocquardii (Anura : Ranidae) di Sulawesi Berdasarkan Pengukuran

Morfologi dan Molekuler Gen 12S rRNA dan 16S rRNA adalah benar karya saya
dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun
kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip
dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2015
Sister Sianturi
NIM G352130111

ii

RINGKASAN
SISTER SIANTURI. Hubungan Filogenetik Hylarana mocquardii (Anura :
Ranidae) di Sulawesi Berdasarkan Pengukuran Morfologi dan Molekuler Gen 12S
rRNA dan 16S rRNA. Dibimbing oleh ACHMAD FARAJALLAH dan MIRZA
DIKARI KUSRINI.
Hylarana mocquardii merupakan spesies yang awalnya merupakan

anggota spesies H.chalconota yang masih termasuk kompleks spesies karena
terdapat banyak variasi dalam spesies ini. H.mocquardii pada akhirnya ditetapkan
sebagai spesies yang hanya terdapat di Pulau Sulawesi. Pulau Sulawesi
merupakan salah satu pulau di Indonesia yang memiliki sejarah geologi yang
kompleks. Sejarah geologi yang kompleks dengan kombinasi reorganisasi habitat,
aktivitas pegunungan yang aktif, dan adanya fluktuasi permukaan laut menjadi
faktor pendukung terbentuknya fragmentasi habitat, migrasi, kolonisasi spesies,
hingga terjadinya spesiasi.
Konstruksi filogeni dihasilkan dengan membandingkan sekuen
H.mocquardii dari kawasan Sulawesi yang mewakili semua bagian Sulawesi,
yaitu Sulawesi Utara, Barat, Tengah, Tenggara, dan Selatan. Topologi filogeni
juga terdiri atas sekuen H.chalconota, H.megalonesa, H.erythraea, H.signata,
H.grandocula, H.similis, Sanguirana luzonensis, Limnonectes cf.kuhlii, dan
Occydozyga baluensis yang diunduh dari genebank. Konstruksi filogeni dengan
gen 12S rRNA dan 16S rRNA menghasilkan pola pengelompokan spesies
H.mocquardii yang monofiletik dan membentuk empat kelompok, yaitu kelompok
spesies di kawasan Sulawesi Utara, kelompok spesies di kawasan Sulawesi
Tengah dan Sulawesi Barat, kelompok spesies di kawasan Sulawesi Tenggara,
dan kelompok spesies di kawasan Sulawesi Selatan. Berdasarkan gen 12S rRNA
diperoleh pengelompokan spesies H.mocquardii dengan dua subclade yaitu

kelompok yang berasal dari kawasan Sulawesi Tengah dan Barat dan kelompok
yang berasal dari kawasan Sulawesi Utara, Sulawesi Tenggara, dan Sulawesi
Selatan. Berdasarkan gen 16S rRNA diperoleh pengelompokan spesies
H.mocquardii juga menghasilkan dua subclade yaitu dengan kelompok spesies
yang berasal dari kawasan Sulawesi Selatan memiliki pengelompokan sendiri.
Hasil analisis molekuler ini kemudian dibandingkan dengan hasil analisis
pengukuran morfologi. Dalam analisis morfometri ini dipisahkan antara analisis
individu betina dengan jantan. Penelitian ini melakukan perbandingan antara hasil
analisis morfometri dengan analisis molekuler. Pada hasil analisis morfometri
pada individu betina setelah dilakukan uji lanjut tidak terdapat perbedaan dan
pengelompokan. Pada hasil analisis morfometri individu jantan juga pada awalnya
tidak terlihat adanya pengelompokan, tetapi setelah dilakukan uji lanjut Duncan
terlihat adanya pengelompokan yang juga mendukung pada hasil analisis
molekuler gen 16S rRNA yang menunjukkan bahwa kelompok spesies
H.mocquardii di Sulawesi Selatan memiliki pengelompokan tersendiri.
Berdasarkan penelitian ini juga diketahui bahwa proses invasi spesies
H.mocquardii ke Pulau Sulawesi terjadi seiring dengan proses terbentuknya Pulau
Sulawesi dan nenek moyang spesies ini berasal dari daratan Asia.
Kata kunci: Filogenetik, Hylarana mocquardii, Morfometri, 12S rRNA dan 16S
rRNA

iii

SUMMARY
SISTER SIANTURI. Phylogenetic Relationships of Hylarana mocquardii in
Sulawesi based on Morphometrics and Molecular 12S rRNA with 16S rRNA
gene. Supervised by ACHMAD FARAJALLAH and MIRZA DIKARI KUSRINI.
Hylarana mocquardii was originally member of species Hylarana
chalconota complex because there are many variation in this species. The H.
mocquardii was then defined as species only found on Sulawesi island. Sulawesi
is an island in Indonesia with a complex geological history. Complex geological
history with a combination of reorganization habitat, the activity of the active
mountains, and the fluctuation of sea level are factors that support the formation
of habitat fragmentation, migraton,colonization of that species, and resulted in the
occurence of speciation.
A phylogeny construction was made by comparing the sequence of
H.mocquardii from all parts of Sulawesi: North Sulawesi, West Sulawesi, Central
Sulawesi, East Sulawesi, and South Sulawesi and added sequence of H.
chalconota, H. megalonesa, H. erythraea, H. signata, H. grandocula, H. similis,
Sanguirana luzonensis, Limnonectes cf. kuhlii, and Occydozyga baluensis from

genebank. The phylogeny construction of the 12S rRNA and 16S rRNA produce
monophyletic grouping patterns of H.mocquardii and consist of four groups:
North Sulawesi region, Central Sulawes and West Sulawesi region, Southeast
Sulawesi region, and South Sulawesi region. Based on12S rRNA gene this group
was divided in two subclade, the first group consist of species from West
Sulawesi and Central Sulawesi region and the second group consist of species
from North Sulawesi, Southeast Sulawesi, and South Sulawesi region. Based on
16S rRNA gene the grouping was divided in two subclade that separated species
from South Sulawesi region from other region.
Molecular analysis were then compared with morphometrics analysis of
females and males frog. Morphometric analysis results were unable to show
significant difference grouping of H.mocquardi because it produce only one
grouping. However, final morphometric analysis of males using Duncan Test
showed that H.mocquardii from South Sulawesi differed from other region. It
conclude that morphometric analysis of male frog showed the same pattern and
supported molecular analysis of 16S rRNA gene. This research was able to
analysis the spread of H.mocquardii to Sulawesi island. This process occured
during the formation of Sulawesi island and predicted occured during Miocene.
Based on this I concluded that ancestor of this species originated from Mainland
Asia.

Keywords: Phylogenetics, Hylarana mocquardii, Morphometrics, 12S rRNA and
16S rRNA

iv

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

1

HUBUNGAN FILOGENETIK Hylarana mocquardii (ANURA : RANIDAE)
DI SULAWESI BERDASARKAN PENGUKURAN MORFOLOGI DAN
MOLEKULER GEN 12S rRNA dan 16S rRNA

SISTER SIANTURI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biosains Hewan

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

2

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr. Bambang Suryobroto, M.Si

PRAKATA
Puji dan Syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas

segala berkat dan karuniaNya sehingga penulisan tesis ini dapat diselesaikan.
Tesis ini disusun dalam rangka memenuhi persyaratan memperoleh gelar Magister
Sains pada Program Studi Biosains Hewan (BSH) Sekolah Pascasarjana Institut
Pertanian Bogor.
Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si. dan Dr. Ir. Mirza Dikari Kusrini, M.Si.
selaku komisi pembimbing yang telah memberikan arahan dan masukan
dalam penyusunan karya ini
2. Kepada Dr.Ir.R. R. Dyah Perwitasari, M.Sc.selaku ketua program studi
Biosains Hewan.
3. Museum Zoologicum Bogorienses (MZB) yang telah memberikan akses
terh adap penggunaan spesimen yang digunakan dalam penelitian.
4. Dr.Amir Hamidy M.Sc selaku kepala Laboratorium Herpetologi Lembaga
Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong, Dr. rer. nat. Evy Arida,
M.Sc. dan seluruh staff Laboratorium Herpetologi LIPI Cibinong
5. Dirjen Pendidikan Tinggi (DIKTI) Indonesia yang telah memberikan dana
melalui beasiswa Pendidikan Pasca Sarjana Dalam Negeri (BPPDN) 2013
6. Rekan-rekan BSH 2013 yang telah memberikan bantuan, dukungan dan
motivasi selama perkuliahan dan penelitian berlangsung
7. Bapak Adi Surahman dan Ibu Tini Wahyuni yang banyak membantu

dalam penyediaan alat dan bahan laboratorium
8. Kedua orang tua, saudara-saudara, dan teman-teman yang telah memberi
dukungan dan doa kepada penulis
Bogor, Agustus 2015
Sister Sianturi

5

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vi

DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian

1
1
3
4
4

2 METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian
Sampel Penelitian
Prosedur Penelitian
Pengukuran Morfologi
Analisis Pengukuran Morfologi
Analisis Molekuler

Ekstraksi DNA
Amplifikasi (Perbanyakan) Ruas DNA
Visualisasi Perbanyakan Ruas DNA
Perunutan (Sequencing) DNA Produk PCR
Analisis Data

4
4
5
5
5
5
8
8
8
8
9
9

3 HASIL
Analisis Pengukuran Morfologi
Analisis Molekuler
Karakteristik dan Komposisi Sekuens Hylarana
mocquardii Berdasarkan Gen 12S rRNA dan 16S rRNA
Analisis Filogenetik Berdasarkan Gen 12S rRNA
Analisis Filogenetik Berdasarkan Gen 16S rRNA
4 PEMBAHASAN
Kongruensi Analisis Morfometri dengan Analisis Molekuler Gen 16S rRNA
Rekonstruksi Filogeni dan Evolusi Pulau Sulawesi
Analisis Proses Invasi Spesies H.mocquardii
Berdasarkan Analisis Filogeni

10
10
14
14
14
14
15
15
15
17

5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

22
22
22

DAFTAR PUSTAKA

23

LAMPIRAN

26

RIWAYAT HIDUP

46

6

DAFTAR TABEL
1

Data Spesimen H.mocquardii yang digunakan dalam penelitian
untuk analisis molekuler
2 Daftar Spesies Hylarana dan akses Genebank yang digunakan
dalam analisis molekuler dan konstruksi filogeni
3 Hasil Pengukuran morfologi spesies H.mocquardii betina (n=79)
4 Hasil Pengukuran morfologi spesies H.mocquardii jantan (n=189)
5 Analisis komponen utama pengukuran morfologi spesies
H.mocquardii betina
6 Analisis komponen utama pengukuran morfologi spesies
H.mocquardii jantan
7 Hasil analisis uji lanjut Duncan spesies H.mocquardii betina pada
variabel HLL
8 Hasil analisis uji lanjut Duncan spesies H.mocquardii jantan pada
variabel HLL
9 Jumlah perbedaan nukleotida (bawah diagonal) dan jarak genetik
(atas diagonal) berdasarkan gen 12S rRNA
10 Jumlah perbedaan nukleotida (bawah diagonal) dan jarak genetik
(atas diagonal) berdasarkan gen 16S rRNA

6
9
10
11
12
12
13
14
20
21

DAFTAR GAMBAR
1
2
3

Spesimen H.mocquardii tampak dorsal dan tampak ventral
Karakter penting untuk identifikasi H.mocquardii
Kondisi Geologi dan Tektonik Pulau Sulawesi pada masingmasing pembagian kawasan
4 Titik pengukuran morfologi pada individu H.mocquardii
5 Karakter Nuptial pad pada H.mocquardii individu jantan
6 Hasil analisis biplot pengelompokan spesies H.mocquardii
betina
7 Hasil analisis biplot pengelompokan spesies H.mocquardii
jantan
8 Proses sejarah tektonik Pulau Sulawesi
9 Pembagian kawasan daratan yang terdiri dari kawasan daratan
Sunda, Wallacea, dan kawasan daratan Sahul
10 Konstruksi pohon filogeni dengan metode Neighbour-joining
11 Pola filogeografi H.mocquardii di Sulawesi berdasarkan gen
12S rRNA dan 16S rRNA

1
2
3
7
7
12
13
16
17
18
19

DAFTAR LAMPIRAN
1 Analisis kontribusi masing-masing variabel terhadap komponen
pada spesies H.mocquardii betina
2 Analisis kontribusi masing-masing variabel terhadap komponen
pada spesies H.mocquardii betina
3 Data spesimen H.mocquardii yang digunakan untuk analisis
pengukuran morfologi

26
27
28

1

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Penelitian terkait sistematika pada famili Ranidae masih perlu dilakukan
karena taksonomi pada taksa ini masih diperdebatkan. Pada anggota famili
Ranidae masih banyak spesies yang memiliki hubungan filogenetik yang belum
dapat dipecahkan. Penyebabnya adalah karena penyebaran spesies yang sangat
luas dan revisi sistematika terkait dengan sinonim antar lokasi geografis yang
masih terjadi pada anggota spesies famili Ranidae (Dubois 1992).
Hylarana mocquardii (Werner, 1901) merupakan salah satu anggota famili
Ranidae yang awalnya memiliki nama spesies Hylarana chalconota
(Schlegel, 1837). Spesies
H. chalconota memiliki penyebaran yang luas di
Indonesia, yaitu Jawa, Bali, Sumatera, Kalimantan, dan Sulawesi (Inger 1966). H.
chalconota yang berasal dari Sulawesi ditempatkan sebagai spesies yang sah
setelah ditemukan ciri morfologi pada bagian dorsal yang lebih mencolok
dibandingkan dengan H. chalconota yang berasal dari kawasan di luar Sulawesi
(Iskandar & Colijin 2000). Hal ini diperkuat dengan pernyataan Inger & Voris
(2001) yang menyatakan bahwa fauna Sulawesi, khususnya katak keturunan
Sundaland, menunjukkan hampir tidak ada kesamaan dengan fauna lain pada
tingkat spesies. Hasil penelitian yang dilakukan oleh Inger et al. (2009) dengan
menggunakan gen 16S rRNA dan beberapa karakter morfologi sebagai marker
menemukan bahwa spesies H. chalconota dipecah menjadi beberapa kelompok.
Kelompok H. chalconota yang hidup di Kalimantan terbagi menjadi dua jenis,
yaitu H. megalonesa dan H. raniceps, kelompok yang hidup di Sumatera dibagi
menjadi tiga jenis, yaitu H. chalconota, H. parvaccola, dan H. rufipes, kelompok
yang hidup di Jawa tetap sebagai jenis H. chalconota, dan kelompok yang hidup
di Sulawesi ditetapkan sebagai H. mocquardii. Inger et al. (2009) kemudian
menghapus H. mocquardii sebagai sinonim dari H. chalconota.

Gambar 1

Spesimen H.mocquardii (a) : Tampak Ventral, (b) Tampak Dorsal. Sumber
Spesimen : Laboratorium Herpetologi, Museum Zoologicum Bogoriense
(MZB) LIPI Cibinong

2

Spesies H. mocquardii pada jantan memiliki kisaran ukuran 15.87 mm 55.73 mm sedangkan pada betina 35.74 mm - 83.87 mm, memiliki permukaan
dorsal yang berwarna kuning hingga coklat, sedangkan permukaan ventral
memiliki warna putih dengan bintik hitam, memiliki kaki panjang dan ramping
(Gambar 1) (Iskandar 1998). Karakter penting dalam identifikasi spesies ini
adalah memiliki bibir putih (white lipped) yang berada di sepanjang bawah mata
hingga timpanium, memiliki timpanium berwarna coklat tua, dan memiliki selaput
kaki (webbing) penuh (Gambar 2) (Iskandar 1998).
3

4

1
Gambar 2

2

Karakter Penting Untuk Identifikasi H.mocquardii (1) White Lipped, (2)
Timpanium, (3) Diameter Disc, (4) Selaput Kaki (Webbing)

Hylarana mocquardii ditetapkan sebagai jenis yang hanya ditemukan di
Pulau Sulawesi (Frost 2009). Inger et al. (2009) membuktikan bahwa
H.mocquardii merupakan spesies kriptik dalam grup H.chalconota yang ada di
Sulawesi.
Pulau Sulawesi merupakan salah satu pulau di Indonesia yang memiliki
sejarah geologi yang kompleks (Stelbrink et al. 2011). Sejarah geologi dan
topologi yang kompleks (Gambar 3) dengan kombinasi reorganisasi habitat
terestrial, aktivitas pegunungan yang aktif, dan adanya fluktuasi permukaan laut
menjadi faktor pendukung terbentuknya fragmentasi habitat, migrasi, kolonisasi
spesies pada habitat baru, hingga terbentuknya spesiasi allopatrik (Esselstyn et al.
2009). Pulau Sulawesi terbentuk dari beberapa proses tabrakan beberapa lempeng
yang berbeda (Hall 1996). Keadaan ini merupakan barier yang potensial untuk
menghasilkan pola distribusi hewan yang memiliki pola sesuai dengan
fragmentasi dan diversifikasi habitat (Evans et al. 2003). Selain itu adanya
topografi yang kompleks dan keragaman habitat iklim mikro memberi pengaruh
dalam diversifikasi, spesiasi, dan variasi spesies (Bridle et al. 2001). Studi
molekuler pada biota Sulawesi menemukan bukti bahwa sejarah vikarian dan
seleksi ekologi adalah sebagai faktor utama yang mendorong terjadinya
diversifikasi (Evans et al. 2001).

3

Gambar 3

Kondisi geologi dan tektonik Pulau Sulawesi pada masing-masing pembagian
kawasan (Moss & Wilson 1998)

Morfometri merupakan salah satu cara untuk mengetahui keanekaragaman
dari suatu spesies dengan menguji karakter morfologi. Data morfometri dapat
digunakan untuk menjelaskan perbedaan dan persamaan antar populasi dan
mendeskripsikan kekerabatan populasi secara morfologi (Hill & Wiens 2000).
Sebagai aplikasi lanjut, hasil analisis secara morfometri dapat memberikan
gambaran umum tentang tingkat variabilitas dari suatu taksa (Chernoff 1982).
Setiap karakter yang diamati umumnya merupakan akibat adanya interaksi gengen yang ekspresinya dipengaruhi oleh lingkungan (Munshi & Dutta 1996).
Keterbatasan dari penggunaan data morfometri adalah nilai konsistensi rendah
dalam menunjukkan hubungan filogenetik pada tingkat variasi spesies kriptik dan
subspesies sehingga perlu dikomparasi dengan data molekuler (Wiens 2004).
Studi dengan menggunakan kedua pendekatan ini dapat memberi informasi yang
lebih luas dan sangat membantu untuk informasi sistematika dan rekonstruksi
filogeni (Hillis 1987).
Penelitian sebelumnya dengan menggunakan gen marker 16S rRNA
membuktikan bahwa pembagian Pulau Sulawesi menghasilkan tujuh kawasan
endemik pada spesies Bufo celebensis. Berdasarkan hal itu perlu dilakukan uji
lanjut pada spesies H.mocquardii yang berada di kawasan Sulawesi untuk
mengetahui pola pengelompokan spesies (Evans et al. 2003). Banyak penelitian
pada amfibi yang telah dilakukan dengan menggunakan gen 16S rRNA sebagai
marker, misalnya pada spesies B. melanostictus dan B. asper (Tjandra 2011), pada
famili Dendrobatidae (Vences et al. 2000), bahkan untuk analisis hubungan
kekerabatan pada famili yang ada pada hewan amfibi (Hay et al. 1995). Selain itu,

4

gen yang digunakan sebagai marker adalah gen 12S rRNA. Hedges and Maxson
(1993) yang melakukan penelitian filogeni pada cecilia membuktikan bahwa gen
12S rRNA dan 16S rRNA dalam genom mitondria merupakan gen yang sangat
potensial dalam aspek filogeni amfibi.

Perumusan Masalah
Spesies H. mocquardii pada awalnya memiliki nama H. chalconota,
merupakan kompleks spesies. Inger et al. (2009) menemukan bahwa H.
mocquardii memiliki perbedaan dengan spesies lain dalam chalconota grup baik
secara morfologi maupun secara molekuler. H. mocquardii yang ada di Sulawesi
akhirnya ditetapkan sebagai spesies yang terpisah. Penegakan sebagai spesies
yang terpisah dari chalconota group pada
H. mocquardii di kawasan
Sulawesi dipengaruhi oleh kondisi geologis, habitat, dan batasan-batasan
ekologis. Penelitian ini ingin membuktikan bagaimana kontribusi dari batasan
tersebut terhadap kekerabatan spesies H. mocquardii di Sulawesi dan bagaimana
pola pengelompokan spesies berdasarkan sekuens gen 12S rRNA dan 16S rRNA
dalam genom mitokondria. Selain itu, penelitian ini juga menggunakan
pengukuran morfologi untuk memperkuat hasil pengelompokan tersebut.

Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk:
1. Untuk menganalisis kekerabatan intraspesies H. mocquardii
menggunakan gen 12S rRNA dan 16S rRNA genom mitokondria
2. Untuk menganalisis kekerabatan interspesies
H. mocquardii
berdasarkan pengukuran morfologi

Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan bermanfaat sebagai acuan untuk manajemen
konservasi spesies endemik di Sulawesi khususnya spesies H. mocquardii

2 METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Agustus 2014 – Maret 2015.
Pengukuran morfologi dan pengambilan sampel jaringan untuk analisis molekuler
dilakukan di Laboratorium Herpetologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia
(LIPI) Cibinong, sedangkan untuk proses analisis molekuler meliputi proses
Polymerase Chain Reaction (PCR) dan visualisasi hasil PCR dilakukan di
Laboratorium Molekuler, Departemen Biologi, Institut Pertanian Bogor.

5

Sampel Penelitian
Sampel katak H. mocquardii berasal dari kawasan Sulawesi yang diperoleh
dari hasil preservasi yang disimpan di Laboratorium Herpetologi LIPI Cibinong.
Analisis morfometri menggunakan 79 individu spesimen betina dan 189 individu
spesimen jantan pada semua sampel H. mocquardii yang ada di Museum
Zoologicum Bogoriense (MZB) (Lampiran 3). Analisis molekuler menggunakan
12 spesimen yang diambil dari organ hati (liver) yang berasal dari masing-masing
kawasan Sulawesi yang dapat mewakili masing-masing bagian pulau yaitu
Sulawesi Utara, Sulawesi Barat, Sulawesi Tengah, Sulawesi Tenggara, dan
Sulawesi Selatan (Tabel 1).
Prosedur Penelitian
Pengukuran Morfologi
Pengukuran menggunakan Calliper digital 0.1 mm. Titik-titik pengukuran
sesuai dengan Matsui (1984) dan Matsui (1994) ( Gambar 4). Selain itu, pada
katak jantan dilakukan juga pengukuran pada karakter tambahan, yaitu Nuptial
Pad (NP), diameter disc pada kaki depan jari ketiga (DFTD3) dan jari keempat
(DFTD4), dan diameter disc kaki belakang pada jari ketiga (DFTB3) dan jari
keempat (DFTB4) (Gambar 5).
Analisis Pengukuran Morfologi
Analisis untuk morfologi dilakukan dengan menggunakan program
statistik yaitu program R i386 versi 3.1.3 dan dan SPSS versi 16. Analisis pertama
dilakukan menggunakan Principal Component Anaysis (PCA) atau Analisis
Komponen Utama untuk melihat pola pengelompokan individu jantan dan betina.
Pemisahan analisis antara jantan dan betina dilakukan setelah dilakukan analisis ttest terlebih dahulu. Setelah itu, dlakukan analisis kontribusi variabel terhadap
variabel yang memiliki kontribusi paling tinggi untuk selanjutnya dilakukan Uji
Lanjut Duncan. Untuk mengetahui komponen yang memiliki pengaruh signifikan
terhadap pengelompokan juga dilakukan analisis Anova.

6

Tabel 1 Data Spesimen H. mocquardii yang digunakan dalam penelitian untuk
analisis molekuler
No MZB
No. Lapang
Lokasi
No Akses
Gen yang
Genebank
Digunakan
MZB13964 BSI 1450
Desa Mataue,
KR082128
12S rRNA
Sulawesi Tengah
KR153317
16S rRNA
MZB13989 BSI 1272
Desa Balapu, Kec.Kulawi, KR082127
12S rRNA
Kab.Donggala,
Sulawesi Tengah
MZB11450 AK203
Lantai Hutan Salodik, Kab KR082129
12S rRNA
.Banggai,Sulawesi Tengah KR153318
16S rRNA
MZB12404 JAM 6284
Desa Kabinan, Kab.Maje KR082132
12S rRNA
ne, Sulawesi Barat
KR153321
16S rRNA
MZB12400 JAM 5942
Desa Polewali, Massawa R KR082133
12S rRNA
oad River 1, Sulawesi KR153322
16S rRNA
Barat
MZB12418 JAM 5996
Desa Makuang,
KR082134
12S rRNA
Kec.Massawa
KR153323
16S rRNA
Sulawesi Barat
MZB17486 ATH 2082
Pegunungan Mekongga, D KR082130
12S rRNA
esa Tinukari, Kec.Wawo, KR153319
16S rRNA
Kolaka,Sulawesi Tenggara
MZB17484 ATH 1760
Pegunungan Mekongga,
KR082131
12S rRNA
Desa Tinukari, Kec.Wawo, KR153320
16S rRNA
Kolaka
Sulawesi Tenggara
MZB23288 KBAA12
Kaki Gunung Boliyuhuto, KR082137
12S rRNA
Marga Satwa Nantu,
KR153324
16S rRNA
Sulawesi Utara
MZB23289 KBAA14
Kaki Gunung Boliyuhuto, KR082138
12S rRNA
Marga Satwa Nantu,
Sulawesi Utara
MZB12413 JAM 5504
Desa Bonto Maranu (Near KR082135
12S rRNA
Loka), Sulawesi Selatan
MZB12401 JAM 5740
Kelurahan Lewaja,
KR082136
12S rRNA
Kab.Enrekang,
KR153316
16S rRNA
Sulawesi Selatan

7

Gambar 4

Titik Pengukuran Morfologi pada Individu H. mocquardiii (Matsui 1984) (1):
Snout Vent Length (SVL), (2) Head Length (HL), (3) Snout-Nostril Length
(SNL), (4) Nostril-Eyelid Length (NEL), (5) Snout-Length (SL), (6) Eye
Length (EL), (7) Tympanium-Eye Length (TEL), (8) Tympanium Diameter
(TD), (9) Head Width (HW), (10) Internarial Distance (IND), (11)Intercanthal
Distance (ICD), (12) Interorbital Distance (IOD), (13)Upper Eyelid Width
(UEW), (14) Upper Eyelid Margin Distance (UEMD), (18) Forelimb Length
(FLL), (19) Lower Arm Length (LAL), (20) Third Finger Length (TFL), (21)
First Finger Length (FFL), (22) Outer Palmar Tubercle Length (OPTL), (23)
Inner Palmar Tubercle Length (IPTL), (24) Hand Length (HAL), (25)
ForearmWidth (FAW), (26) Hindlimb Length (HLL), (27) Tibia Length (TL),
(28) Foot Length (FL), (29) Fourth Toe Length (FTL), (30) Outer Metatarsal
Tubercle Length (OMTL), (31) Inner Metatarsal Tubercle Length (IMTL)

Nuptial pad

Gambar 5. Karakter Nuptial pad pada H.mocquardii individu jantan

8

Analisis Molekuler
Ekstraksi DNA
Isolasi DNA total dilakukan dengan mengikuti metode Farajallah (2002).
Potongan otot katak sekitar 2 mm dalam alkohol 70 % dicuci dengan 500 µl
buffer TE sebanyak 2 kali. Sampel otot yang telah dicuci kemudian dipotong
kecil-kecil menggunakan gunting dalam bufer 1x STE. Sel-sel otot dilisis dengan
menambahkan SDS sampai 10 % dan enzim Proteinase-K sebanyak 0.3 mg/ml.
Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 55oC selama 1 jam sambil
dikocok perlahan.
Material DNA dipisahkan dari material organik lainnya dengan metode
ekstraksi fenol, yaitu dengan menambahkan larutan NaCl 5 M sebanyak 1/10
volume, fenol sebanyak 1x volume, dan Kloroform-isoamil alkohol (CIAA:24:1)
sebanyak 1x volume. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu ruang
sambil dikocok pelan selama 1 jam. Bahan organik yang masuk ke fase fenol
dipisahkan dari fase air dengan sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 5
menit. Fase air kemudian dipindahkan ke dalam tabung baru. Molekul DNA
dimurnikan dengan teknik pengendapan alkohol yaitu dengan menambahkan
alkohol absolut sebanyak 2x volume dan NaCl 5 M sebanyak 1/10 x volume.
Campuran diinkubasi pada suhu 4o C selama 24 jam. Molekul DNA diendapkan
dengan sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 5 menit. Endapan DNA
yang diperoleh kemudian dicuci dengan alkohol 70 %. Molekul DNA diendapkan
kembali kemudian disuspensikan dalam bufer TE 80 % dan disimpan dalam
freezer untuk digunakan lebih lanjut.
Amplifikasi (Perbanyakan) Ruas DNA
Ruas DNA diamplifikasi dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR)
menggunakan mesin Thermo Cycler TaKaRa MP4. Primer yang digunakan adalah
AF559 (5’ACTGGGATTAGATACCCCACTAT 3’) yang menempel pada bagian
tengah gen 16S rRNA dan AF560 (5’ATGTTTTTGGTAAACAGGCG-3’) yang
menempel pada akhir gen 12S rRNA. Total pereaksi PCR adalah 25µl yang terdiri
atas 0.625 mg/ml Gotag Green Master Mix, 0.0026 mg/ml Primer Forward,
0.0028 mg/ml Primer Reverse, 10.5 µl Nuclease Water, dan 0.8 ƞ g/ml Template
DNA.
Amplifikasi dilakukan dengan kondisi predenaturasi 94o C selama 4 menit,
dilanjutkan dengan 30 siklus yang terdiri dari denaturasi 94o C selama 1 menit,
annealing (penempelan) 55o C selama 1 menit 30 detik, pemanjangan 72o C
selama 1 menit, dan pemanjangan akhir 72o C selama 7 menit.
Visualisasi Perbanyakan Ruas DNA
Amplikon diuji dengan menggunakan metode elektroforesis gel
poliakrilamid (PAGE) 6% dan dijalankan pada tegangan 200 V selama 40 menit
atau sampai bromthymol blue mencapai bagian bawah gel. Setelah pemisahan
elektroforesis, pita-pita DNA divisualisasi dengan pewarnaan perak (silver
staining) (Tegelstrom 1986).

9

Perunutan (Sequencing) DNA Produk PCR
Perunutan DNA dilakukan dengan menggunakan jasa pelayanan sekuensing.
Perunutan tersebut dilakukan dengan menggunakan pasangan primer yang
digunakan pada saat PCR.
Analisis Data
Urutan nukleotida yang diperoleh dari proses perunutan diedit secara
manual dibantu dengan program Bioedit. Runutan nukleotida kemudian
disejajarkan bersama spesies lain yang masih dalam satu famili yang diunduh dari
genebank (www.ncbi.nlm.nih.gov) (Tabel 2). Analisis jumlah perbedaan
nukleotida, jarak genetik dilakukan dengan model Kimura 2 Parameter (K2P) dan
rekonstruksi filogeni dilakukan dengan menggunakan program MEGA version 4
(Tamura et al. 2007).
Tabel 2. Daftar spesies Hylarana dan akses GeneBank yang digunakan dalam
analisis molekuler dan konstruksi filogeni
No
4
5
6
7
8
9
1
2
3

Spesies
Ingroup
Hylarana chalconota
Hylarana megalonesa
Hylarana erythraea
Hylarana signata
Hylarana grandocula
Hylarana similis
Outgroup
Sanguirana luzonensis
Limnonectes cf.kuhlii
Occidozyga baluensis

No. Akses

Sumber

Tahun

KF477630.1
KF477629.1
KF477637.1
KF477746.1
KF477654.1
KF477783.1

Brown R.M. dan Siler C.D.
Brown R.M. dan Siler C.D.
Brown R.M. dan Siler C.D.
Brown R.M. dan Siler C.D.
Brown R.M. dan Siler C.D.
Brown R.M. dan Siler C.D.

2014
2014
2014
2014
2014
2014

KF477636.1
HM067130.1
DQ283143.1

Brown R.M. dan Siler C.D.
McLeod D.S.
Frost DR., Grant T., Faivovich
J., Bain R., Haas A. Haddad
CFB., De Sa RO., Channing
A., Wilkinson M, Donnelan
SC, Raxworthy C., Campbell
JA, Blotto BL, Moler P,
Drewes RC, Nussbaum RA,
Lynch JD, Green DM, dan
heeler WC.

2014
2010
2010

10

3 HASIL
Analisis Pengukuran Morfologi
Pengukuran morfologi pada spesies H. mocquardii dilakukan berdasarkan
teknik pengukuran sesuai dengan Matsui 1984. Untuk analisis pengukuran,
dipisahkan analisis individu jantan dengan individu betina setelah terlebih dahulu
dilakukan uji t-test yang menunjukkan adanya perbedaan siginifikan (t268 = 1.69;
P < 0.05) antara jantan dan betina. Spesies H. mocquardii betina memiliki nilai
Snout Vent Length (SVL) kisaran 35.74 mm hingga 83.87 mm dengan nilai ratarata sebesar 65.50 mm (Tabel 3).
Tabel 3 Hasil Pengukuran Morfologi spesies H. mocquardii betina (n = 79)
Variabel*
Rata-rata
Minimum
Maksimum
Std.deviasi
SVL
65.50
35.74
83.87
11.12
HL1
19.82
10.86
26.75
3.57
HL2
25.22
13.59
31.97
4.43
SNL
3.11
1.47
4.98
0.74
NEL
6.98
3.70
9.28
1.22
SL
10.64
6.01
14.85
1.93
EL
7.39
4.67
9.68
1.14
TEL
2.08
1.02
3.57
0.59
TD
4.66
2.18
6.77
0.99
HW
21.41
11.60
29.81
3.91
IND
5.22
2.61
7.46
1.03
ICD
11.90
6.37
16.09
2.21
IOD
7.46
3.75
10.97
1.66
UEW
5.34
2.80
7.86
0.99
UEMD
16.51
2.52
23.85
3.52
FLL
44.68
25.92
58.97
7.70
LAL
32.96
19.06
44.17
6.09
TFL
15.87
9.30
21.42
3.02
FFL
10.78
5.65
15.21
2.27
OPTL
2.52
1.38
4.27
0.63
IPTL
3.59
1.64
5.29
0.68
HAL
19.33
11.40
25.89
3.59
FAW
4.56
2.15
7.32
0.96
HLL
123.48
68.94
155.30
20.47
TL
39.03
22.09
49.57
6.33
FL
85.54
47.63
112.31
14.71
FTL1
30.15
16.16
39.20
5.30
FTL2
19.22
8.76
32.70
3.83
OMTL
2.46
1.33
4.20
0.61
IMTL
2.82
1.40
5.04
0.68
DFTD3
2.95
1.18
4.74
0.86
DFTD4
2.91
1.03
4.60
0.86
DFTB3
1.92
0.86
3.14
0.56
DFTB4
1.54
0.63
2.62
0.44
Keterangan: * Singkatan variabel pengukuran mengacu pada keterangan Gambar 4

11

Tabel 4. Hasil Pengukuran Morfologi spesies H. mocquardii jantan (n = 189)
Variabel*
NP
SVL
HL1
HL2
SNL
NEL
SL
EL
TEL
TD
HW
IND
ICD
IOD
UEW
UEMD
FLL
LAL
TFL
FFL
OPTL
IPTL
HAL
FAW
HLL
TL
FL
FTL1
FTL2
OMTL
IMTL
DFTD3
DFTD4
DFTB3
DFTB4

Rata-rata
1.88
42.42
12.86
16.78
2.11
4.53
6.91
5.45
1.15
3.25
12.89
3.42
7.78
4.29
3.80
11.08
29.39
21.61
10.22
6.71
1.74
4.12
12.46
3.34
79.47
25.03
54.75
18.93
11.85
1.65
1.96
1.63
1.59
1.07
0.91

Minimum
0.18
15.87
3.95
6.30
0.95
1.01
1.49
1.89
0.41
0.72
4.84
1.49
3.03
1.95
0.77
4.16
10.59
8.35
3.35
1.88
0.52
0.82
4.35
1.01
28.01
8.58
19.42
6.03
3.87
0.54
0.80
0.40
0.43
0.31
0.30

Maksimum
2.84
55.73
16.87
21.36
3.46
6.00
9.04
8.01
2.00
4.99
16.56
4.98
10.41
5.92
5.52
15.53
38.72
28.55
14.82
11.65
3.19
6.31
17.52
7.24
105.58
32.79
73.74
25.70
17.04
2.48
3.07
3.06
2.78
1.90
1.70

Std.deviasi
0.52
7.25
2.39
3.20
0.41
0.90
1.34
1.12
0.32
0.76
2.37
0.63
1.51
0.80
0.98
2.28
5.76
4.09
2.18
1.58
0.41
0.95
2.40
0.89
14.82
4.71
10.60
3.77
2.47
0.38
0.43
0.50
0.50
0.34
0.23

Keterangan : * Singkatan variabel mengacu pada keterangan Gambar 4

Spesies H. mocquardii untuk individu jantan memiliki SVL dengan kisaran
15.87 mm hingga 55.73 mm dan nilai rata-rata SVL adalah 42.42 mm (Tabel 4).

12

Tabel 5 Analisis komponen utama pengukuran morfologi spesies H. mocquardii
betina
F1
F2
F3
F4
F5
F6
Eigenvalue
27.69
0.89
0.86
0.61
0.47
0.44
Variability (%)
81.44
2.62
2.54
1.80
1.40
1.30
Cumulative (%)
81.44
84.10
86.60
88.40
89.79
91.09
Nilai eigenvalue menunjukkan pada F1 sudah >1 dan nilai cumulative nya
adalah >70 % (Tabel 5). Hal ini menunjukkan bahwa hanya dengan satu
komponen saja sudah mewakili 35 komponen.

Gambar 6 Hasil analisis biplot pengelompokan spesies H.mocquardii betina

Pengelompokan H.mocquardii betina menunjukkan bahwa semua variabel
pengukuran berada pada satu kelompok dan sudut yang dibentuk adalah < 90o
yang menunjukkan bahwa semua variabel memiliki korelasi yang kuat dan positif
(Gambar 6).
Tabel

6 Analisis Komponen Utama Pengukuran Morfologi
H. mocquardii jantan

Eigenvalue

F1
27.50

F2
1.23

F3
0.76

F4 F5
0.73
0.52

F6
0.46

Variability (%)

78.58

3.50

2.18

2.07

1.49

1.31

Cumulative (%)

78.58

82.09

84.27

86.34

87.83

89.14

spesies

F7
0.37
0.09
92.18

13

Nilai eigenvalue >1 dan nilai cumulative juga >70 % menunjukkan bahwa
satu komponen saja sudah dapat mewakili 35 komponen yang dianalisis dan tidak
ada pengelompokan dalam variabel pengukuran yang dianalisis (Tabel 6)
Pengelompokan spesies H.mocquardii jantan menunjukkan bahwa semua
variabel pengukuran berkumpul cenderung memiliki dua kelompok dan sudut
yang dibentuk adalah < 90o yang menunjukkan bahwa semua variabel memiliki
korelasi yang kuat dan positif (Gambar 7) .

Gambar 7 Hasil Analisis Biplot pengelompokan spesies H.mocquardii jantan

Variabel pengukuran yang memiliki nilai kontribusi paling besar pada
betina adalah variabel HLL dengan nilai 3.51 (Lampiran 1). Uji Lanjut Duncan
menunjukkan bahwa tidak ada pengelompokan berdasarkan variabel HLL
sehingga tidak ada perbedaan karakteristik yang signifikan pada spesies
H.mocquardii betina di Sulawesi (Tabel 7).
Tabel 7 Hasil analisis Uji Lanjut Duncan spesies H.mocquardii betina pada
variabel HLL
Wil
3.00
5.00
1.00
4.00
2.00
Sig.

N
2
8
7
32
30

Subset for alpha = 0.05
1
101.20
112.18
116.69
126.13
126.73
0.05

Variabel pengukuran yang memiliki kontribusi paling besar pada jantan
adalah variabel HLL. Uji Lanjut Duncan menunjukkan bahwa terdapat dua
pengelompokan yang dibentuk , yaitu kawasan Sulawesi Selatan dan kawasan
Sulawesi Utara, Tengah, Barat, dan Tenggara (Tabel 8).

14

Tabel 8 Hasil analisis Uji Lanjut Duncan spesies H. mocquardii jantan pada
variabel HLL
Wil
5.00
1.00
2.00
4.00
3.00
Sig.

N
25
24
57
66
17

Subset for alpha = 0.05
1
2
60.86
77.56
82.77
83.04
84.55
1.00
0.06

Analisis Molekuler
Karakteristik dan Komposisi Sekuens H. mocquardii Berdasarkan Gen 12S
rRNA dan 16S rRNA
Analisis gen 12S rRNA yang dianalisis terdiri dari 12 sekuens dengan
pensejajaran sebesar 596 bp, yaitu 492 bp conserve sites, 103 variable sites, dan
80 parsimony informative dengan komposisi rata-rata nukleotida adalah T (U) =
24.1 %; C =28.0 %; A=30.3 %; dan G=17.6 % sedangkan analisis gen 16S
rRNA terdiri dari 9 sekuens dengan pensejajaran nukleotida sebesar 665 bp, yaitu
584 conserve sites, 79 variable sites, dan 43 parsimony informative dengan
komposisi rata-rata adalah T (U) = 24.3 %; C = 23.4 %; A = 37.4 %; dan G =
15.0 %.
Analisis Filogenetik Berdasarkan Gen 12S rRNA
Konstruksi filogenetik berdasarkan gen 12S rRNA membentuk dua
kelompok, yaitu kelompok [Sulawesi Barat dan Sulawesi Tengah] dan [Sulawesi
Utara, Sulawesi Tenggara, Sulawesi Selatan]. Untuk lebih lanjut lagi, kelompok
tersebut terbagi menjadi empat kelompok, yaitu kelompok [Sulawesi Utara],
[Sulawesi Barat dan Sulawesi Tengah], [Sulawesi Tenggara], dan [Sulawesi
Selatan] (Gambar 10a). Jarak genetik (genetic distance) paling dekat berasal dari
Sulawesi Tengah dan Sulawesi Barat sedangkan jarak genetik yang paling jauh
yaitu sebesar 0.111 ditemukan pada sekuens yang berasal dari Sulawesi Selatan
dan Sulawesi Tengah (Tabel 9). Spesies H. chalconota dan
H.
megalonesa merupakan sister clade dari kelompok spesies H. mocquardii yang
didukung kuat dengan nilai bootstrap = 100. Hal ini menunjukkan kekerabatan
yang sangat dekat antara H. mocquardii dengan kelompok H. chalconota yang
merupakan salah satu jenis spesies kompleks.
Analisis Filogenetik Berdasarkan Gen 16S rRNA
Konstruksi filogenetik berdasarkan gen 16S rRNA menghasilkan dua
kelompok yaitu kelompok [Sulawesi Utara, Sulawesi Barat, Sulawesi Tengah,
Sulawesi Tenggara] dan [Sulawesi Selatan]. Untuk lebih lanjut, kelompok
tersebut terbagi atas empat kelompok, yaitu kelompok [Sulawesi Utara],
[Sulawesi Tengah dan Sulawesi Barat], [Sulawesi Tenggara], dan [Sulawesi
Selatan] (Gambar 10b). Jarak genetik yang paling dekat ditemukan pada sekuens
H. mocquardii yang berasal dari Barat dan Tengah dan jarak genetik yang paling
jauh dengan nilai 0.78 ditemukan pada sekuens spesies H.mocquardii yang

15

berasal dari Sulawesi Selatan (Tabel 10). H. chalconota dan H. megalonesa
merupakan sister clade dari kelompok spesies H.mocquardii yang didukung
dengan nilai bootstrap = 100.

4 PEMBAHASAN
Kongruensi Analisis Morfometri dengan Analisis Molekuler Gen 16S rRNA
Analisis molekuler spesies H. mocquardii di Sulawesi membentuk
pengelompokan sesuai dengan pola pembentukan Pulau Sulawesi (Gambar 11).
Hasil rekonstruksi filogeni secara konsisten menunjukkan bahwa spesies H.
mocquardii di Sulawesi memiliki posisi monofiletik dibandingkan dengan
anggota famili Ranidae. Berdasarkan gen 16S rRNA spesies H. mocquardii
membentuk dua kelompok, yaitu kelompok [Sulawesi Utara, Sulawesi Tenggara,
Sulawesi Barat, Sulawesi Tengah] dan kelompok [Sulawesi Selatan]. Untuk lebih
lanjut lagi, kelompok [Sulawesi Utara], [Sulawesi Barat dan Tengah], [Sulawesi
Tenggara], dan [Sulawesi Selatan] membentuk empat kelompok yang terpisah.
Hasil analisis molekuler 16S rRNA menunjukkan hasil yang kongruen
dengan hasil pengukuran morfologi pada individu jantan yang menempatkan
Sulawesi Selatan sebagai kelompok yang terpisah. Kesesuaian hasil ini
membuktikan bahwa kedua metode mampu menunjukkan adanya variasi atau
diferensiasi spesies (Wien 2000). Menurut Schuh (2000) bahwa adanya variasi
ekologis dan adanya barier geografis dapat memunculkan karakter yang berbeda
pada individu dalam satu spesies dan akan meningkatkan diferensiasi genetik. Hal
ini menunjukkan bahwa adanya tingkat efisiensi dan konsistensi yang lebih tinggi
pada gen 16S rRNA dibanding gen 12S rRNA. Vences et al. (2005) membuktikan
bahwa gen 16S rRNA lebih efektif sebagai marker pada amfibi (Xia et al. 2011).
Selain itu, gen 16S rRNA memiliki laju evolusi (evolution rate) yang lebih rendah.
Penggunaan gen 16S rRNA juga ditinjau dari segi ketersediaan database di
genebank.
Rekonstruksi Filogeni dan Evolusi Pulau Sulawesi
Hylarana mocquardii memiliki distribusi yang luas dan populasi yang
besar di Sulawesi. Spesies H. mocquardii membentuk kelompok sendiri satu clade
pada posisi basal pohon filogeni (Inger et al. 2009). Adanya pengaruh faktor
ekologi atau geologi dapat memberi batasan pada diversifikasi geografis yang
menyebabkan adanya pola biogeografis pada taksa terkait (Evans et al. 2002).
Adanya pola distribusi spesies
H. mocquardii yang ada di Pulau Sulawesi
merupakan hasil sejarah geografi yang kompleks yang terstruktur. Biogeografi
dapat membatasi jangkauan kekuatan evolusi yang relevan. Sejarah geologi yang
kompleks dengan kombinasi reorganisasi habitat terestrial dengan adanya
tabrakan antara dataran Sunda dan Sahul, aktivitas pegunungan yang aktif, dan
fluktuasi permukaan laut yang berulang menjadi faktor pendukung terbentuknya
fragmentasi habitat, migrasi, kolonisasi spesis pada habitat baru, hingga
terbentuknya spesiasi allopatrik (Esselstyn et al. 2009). Pulau ini terbentuk dari
beberapa proses tabrakan beberapa lempeng yang berbeda berbeda dan memiliki
barier pada empat lengan berbeda pada pulau (Hall 1996). Keadaan ini merupakan
barrier yang potensial untuk menghasilkan pola distribusi taksa yang memiliki

16

pola sesuai dengan fragmentasi dan diversifikasi habitat (Evans et al. 2003).
Selain itu, adanya topografi yang kompleks dan keragaman iklim mikro dan
habitat memberi pengaruh dalam diversifikasi, spesiasi, dan variasi spesies (Bridle
et al. 2001). Adanya barrier dalam penyebaran dapat menghasilkan pola variasi
pada taksa terkait yang berkerabat (Avise 2000). Kondisi ini menyebabkan Pulau
Sulawesi memiliki tingkat variasi yang beragam pada tiap taksa hingga pada
tingkat spesies.
Pola pengelompokan menghasilkan satu kelompok spesies Sulawesi Barat
dan Tengah (Gambar 10). Adanya satu pengelompokan antara spesies yang berada
di kawasan Sulawesi Barat dan Tengah disebabkan karena kurangnya konkordansi
geografis spesies yang berada di zona kontak Sulawesi Barat dan Sulawesi
Tengah. Perpindahan spesies pada kedua kawasan ini salah satu faktor
pendukungnya adalah adanya kesamaan tipe vegetasi, tipe tanah, dan fluktuasi
iklim antara Sulawesi Tengah dan Sulawesi Barat (Whitten et al. 2002). Proses
pengelompokan spesies di Sulawesi Tengah dan Sulawesi Barat kemungkinan
juga disebabkan karena proses stratifikasi geologi yang menyebabkan sulawesi
bagian tengah pernah menyatu (Gambar 8). Villeneuve et al. (2000) menyatakan
bahwa pada masa Miocene adanya pergerakan lempeng menuju ke barat
menyebabkan adanya benturan besar yang menjadikan bagian tengah Sulawesi
bertekuk yang menyebabkan percampuran jenis batuan yang berasal dari
lingkungan pengendapan yang berbeda.

Gambar 8 Proses Sejarah Tektonik Pulau Sulawesi (a) Eocene, (b) Middle Eocene, (c) Early
Oligocene, (d) Early Miocene, (e) Late Miocene, (f) Early Pliocene (Moss & Wilson
1998)

Analisis jarak genetik gen 16S rRNA menunjukkan bahwa spesies Sulawesi
Selatan memiliki jarak genetik yang paling jauh. Hal ini dihubungkan dengan
proses evolusi tektonik pulau Sulawesi yang menyebabkan adanya perbedaan
stratigrafi khususnya pada kawasan Sulawesi Selatan berupa perbedaan sedimen
dan vulkanik (Suyono & Kusnama 2010). Aktivitas vukanik pada masa Paleocene
hingga Eocene ditelusuri dari kawasan Sulawesi Selatan yang juga berpengaruh
terhadap kondisi stratigrafi Sulawesi Selatan (Yuwono et al. 1988). Selain itu,

17

pada saat penurunan permukaan laut 100 m menunjukkan terjadinya pelebaran
permukaan antara kawasan Kalimantan Selatan dan Sulawesi Selatan yang
memungkinkan terjadinya kontak antara kedua kawasan tersebut yang kemudian
terpisah kembali oleh Selat Makassar pada saat naiknya permukaan laut (Katili
1978). Proses penurunan suhu global juga terjadi di kawasan Sulawesi Selatan
pada masa pertengahan Eocene (Gower et al. 2012). Hal ini memberi dampak
terhadap kondisi ekologis dari spesies H. mocquardii yang rentan terhadap
perubahan habitat dan kemungkinan menjadi faktor yang menjadi penyebab
spesies di kawasan ini memiliki pengelompokan sendiri dibandingkan dengan
spesies di kawasan yang lainnya.
Analisis Proses Invasi Spesies H.mocquardii berdasarkan analisis Filogeni
Berdasarkan hasil ini diasumsikan bahwa nenek moyang dari spesies ini
berasal dari daratan Sunda (Gambar 9). Proses masuknya (invasi) spesies ini
menuju Pulau Sulawesi yang termasuk kawasan Wallacea diduga memiliki
hubungan dengan proses terbentuknya Pulau Sulawesi.

Gambar 9 Pembagian kawasan daratan yang terdiri dari kawasan Daratan Sunda, Wallacea, dan
kawasan Daratan Sahul (Bacon et al. 2013).

Proses invasi ini merupakan hasil kontribusi evolusi pulau yang
mempengaruhi distribusi spesies di Sulawesi. Pada masa Eocene, proses
pembentukan Pulau Sulawesi menunjukkan bahwa Pulau Sulawesi pada lengan
Timur dan Selatan menyatu dengan Pulau Kalimantan. Diduga proses ini
merupakan awal masuknya spesies H. mocquardii di Sulawesi. Hal tersebut dapat
dibuktikan dengan hasil konstruksi filogeni yang monofiletik yang juga
mendukung sister clade dari spesies H. mocquardii adalah kelompok Chalconota
group yaitu H. chalconota dan H. megalonesa yang merupakan anggota spesies
dari Sundaland.

18

18

(a)

(b)

Gambar 10 Konstruksi pohon filogeni dengan metode Neighbour-joining: (a) Pohon filogeni dengan sekuens DNA mitokondria gen 12S rRNA dengan nilai
bootstrap 1000 pengulangan, (b) Pohon filogeni dengan sekuens DNA mitokondria gen 16S rRNA dengan nilai bootstrap 1000 pengulangan

19

Gambar 11 Pola Filogeografi H. mocquardii di Sulawesi berdasarkan gen 12S rRNA dan 16S rRNA

19
19

20
20

Tabel 9 Jumlah perbedaan nukleotida (bawah diagonal) dan jarak genetik (atas diagonal) berdasarkan gen 12S rRNA
1
1 Hylarana_mocquardii_KR082129_S.Tengah

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

0.008

0.008

0.008

0.008

0.008

0.014

0.014

0.014

0.014

0.014

0.013

0.019

0.023

0.022

0.018

0.022

0.023

0.025

0.029

0.023

0.000

0.000

0.004

0.000

0.012

0.012

0.012

0.014

0.012

0.011

0.017

0.020

0.021

0.016

0.021

0.021

0.023

0.026

0.022

0.000

0.004

0.000

0.012

0.012

0.012

0.014

0.012

0.011

0.017

0.020

0.021

0.016

0.021

0.021

0.023

0.026

0.022

0.004

0.000

0.012

0.012

0.012

0.014

0.012

0.011

0.017

0.020

0.021

0.016

0.021

0.021

0.023

0.026

0.022

0.004

0.013

0.013

0.012

0.014

0.013

0.011

0.017

0.020

0.021

0.017

0.021

0.022

0.024

0.027

0.022

0.012

0.012

0.012

0.014

0.012

0.011

0.017

0.020

0.021

0.016

0.021

0.021

0.023

0.026

0.022

0.000

0.011

0.013

0.011

0.011

0.016

0.021

0.020

0.016

0.022

0.020

0.024

0.026

0.021

0.011

0.013

0.011

0.011

0.016

0.021

0.020

0.016

0.022

0.020

0.024

0.026

0.021

0.006

0.012

0.011

0.017

0.021

0.021

0.018

0.023

0.021

0.026

0.028

0.022

0.013

0.013

0.019

0.023

0.023

0.019

0.024

0.022

0.027

0.028

0.023

0.006

0.018

0.021

0.020

0.018

0.022

0.020

0.026

0.029

0.021

0.017

0.021

0.020

0.017

0.021

0.020

0.025

0.027

0.022

0.020

0.021

0.011

0.022

0.020

0.026

0.028

0.020

0.022

0.019

0.022

0.022

0.027

0.026

0.023

0.021

0.015

0.005

0.028

0.028

0.024

0.022

0.020

0.026

0.027

0.022

0.015

0.027

0.026

0.024

0.028

0.028

0.024

0.025

0.023

2 Hylarana_mocquardii_KR082128_S.Tengah

0.035

3 Hylarana_mocquardii_KR082133_S.Barat

0.035

0.000

4 Hylarana_mocquardii_KR082132_S.Barat

0.035

0.000

0.000

5 Hylarana_mocquardii_KR082134_S.Barat

0.039

0.007

0.007

0.007

6 Hylarana_mocquardii_KR082127_S.Tengah

0.035

0.000

0.000

0.000

0.007

7 Hylarana_mocquardii_KR082130_S.Tenggara

0.107

0.078

0.078

0.078

0.086

0.078

8 Hylarana_mocquardii_KR082131_S.Tenggara

0.107

0.078

0.078

0.078

0.086

0.078

0.000

9 Hylarana_mocquardii_KR082137_S.Utara

0.105

0.086

0.086

0.086

0.082

0.086

0.074

0.074

10 Hylarana_mocquardii_KR082138_S.Utara

0.107

0.107

0.107

0.107

0.099

0.107

0.094

0.094

0.020

11 Hylarana_mocquardii_KR082135_S.Selatan

0.111

0.086

0.086

0.086

0.090

0.086

0.070

0.070

0.078

0.099

12 Hylarana_mocquardii_KR082136_S.Selatan

0.098

0.070

0.070

0.070

0.074

0.070

0.062

0.062

0.068

0.088

0.018

13 Hylarana_chalconota_KF477630.1

0.171

0.145

0.145

0.145

0.154

0.145

0.147

0.147

0.158

0.174

0.161

0.152

14 Hylarana_erythraea_KF477637.1

0.231

0.192

0.192

0.192

0.199

0.192

0.208

0.208

0.200

0.224

0.212

0.203

0.197

15 Hylarana_grandocula_KF477654.1

0.235

0.207

0.207

0.207

0.214

0.207

0.195

0.195

0.216

0.231

0.204

0.201

0.201

0.222

16 Hylarana_megalonesa_KF477629.1

0,168

0.142

0.142

0.142

0.146

0.142

0.138

0.138

0.159

0.169

0.158

0.147

0.063

0.196

0.204

17 Hylarana_signata_KF477746.1

0,248

0.210

0.210

0.210

0.217

0.210

0.214

0.214

0.242

0.258

0.226

0.219

0.218

0.226

0.106

0.221

18 Hylarana_similis_KF477783.1

0,245

0.217

0.217

0.217

0.224

0.217

0.196

0.196

0.219

0.231

0.206

0.204

0.196

0.219

0.016

0.193

0.111

19 Limnonectes_cf._kuhlii_HM067130.1

0,289

0.243

0.243

0.243

0.250

0.243

0.257

0.257

0.282

0.300

0.287

0.274

0.275

0.299

0.305

0.271

0.308

0.309

20 Occidozyga_baluensis_DQ283143.1

0,321

0.275

0.275

0.275

0.284

0.275

0.289

0.289

0.317

0.328

0.326

0.303

0.315

0.297

0.320

0.298

0.298

0.320

0.260

21 Sanguirana_luzonensis__KF477636.1

0,248

0.219

0.219

0.219

0.226

0.219

0.194

0.194

0.215

0.226

0.206

0.209

0.191

0.228

0.229

0.206

0.237

0.229

0.246

0.028
0.304

21

Tabel 10 Jumlah perbedaan nukleotida (bawah diagonal) dan jarak genetik (atas diagonal) berdasarkan gen 16S rRNA

1
1 Hylarana_mocquardii_KR153316_S.Selatan
2 Hylarana_mocquardii_KR153317_S.Tengah
3 Hylarana_mocquardii_KR153318_S.Tengah
4 Hylarana_mocquardii_KR153319_S.Tenggara
5 Hylarana_mocquardii_KR153320_S.Tenggara
6 Hylarana_mocquardii_KR153321_S.Barat
7 Hylarana_mocquardii_KR153322_S.Barat
8 Hylarana_mocquardii_KR153323_S.Barat
9 Hylarana_mocquardii_KR153324_S.Utara
10 Hylarana_chalconota_KF477630.1
11 Hylarana_megalonesa_KF477629.1
12 Hylarana_erythraea_KF477637.1
13 Hylarana_signata_KF477746.1
14 Hylarana_grandocula_KF477654.1
15 Hylarana_similis_KF477783.1
16 Sanguirana_luzonensis__KF477636.1
17 Limnonectes_cf._kuhlii_HM067130.1
18 Occidozyga_baluensis_DQ283143.1

0.077
0.078
0.061
0.061
0.080
0.078
0.080
0.077
0.156
0.143
0.273
0.195
0.202
0.190
0.240
0.283
0.301

2
0.011
0.006
0.049
0.049
0.006
0.006
0.005
0.059
0.150
0.145
0.282
0.204
0.207
0.198
0.248
0.265
0.299

3
0.011
0.003
0.056
0.056
0.002
0.000
0.002
0.063
0.148
0.143
0.280
0.204
0.207
0.198
0.248
0.256
0.294

4
0.010
0.009
0.009
0.000
0.056
0.056
0.054
0.061
0.150
0.133
0.273
0.193
0.207
0.188
0.231
0.284
0.298

5
0.010
0.009
0.009
0.000
0.056
0.056
0.054
0.061
0.150
0.133
0.273
0.193
0.207
0.188
0.231
0.284
0.298

6
0.011
0.003
0.002
0.009
0.009
0.002
0.002
0.065
0.150
0.145
0.282
0.206
0.209
0.200
0.250
0.258
0.296

7
0.011
0.003
0.000
0.009
0.009
0.002
0.002
0.063
0.148
0.143
0.280
0.204
0.207
0.198
0.248
0.256
0.294

8
0.011
0.003
0.002
0.009
0.009
0.002
0.002
0.065
0.150
0.145
0.282
0.206
0.209
0.200
0.250
0.258
0.296

9
0.012
0.010
0.010
0.010
0.010
0.010
0.010
0.010
0.148
0.149
0.252
0.195
0.203
0.192
0.225
0.281
0.284

10
0.018
0.017
0.017
0.017
0.017
0.017
0.017
0.017
0.017
0.046
0.283
0.194
0.228
0.222
0.261
0.306
0.306

11
0.017
0.017
0.017
0.016
0.016
0.017
0.017
0.017
0.018
0.009
0.277
0.199
0.222
0.202
0.242
0.299
0.301

12
0.024
0.024
0.024
0.024
0.024
0.024
0.024
0.024
0.023
0.026
0.025
0.271
0.276
0.276
0.260
0.298
0.325

13
0.019
0.019
0.019
0.019
0.019
0.019
0.019
0.019
0.019
0.021
0.021
0.024
0.121
0.111
0.214
0.298
0.304

14
0.020
0.020
0.020
0.020
0.020
0.020
0.020
0.020
0.020
0.023
0.022
0.023
0.014
0.034
0.219
0.293
0.293

15
0.019
0.020
0.020
0.019
0.019
0.020
0.020
0.020
0.019
0.022
0.021
0