Konstiuksi Pustaka cDNA Sengon (Paraserianthes falmtaria L. Nielsen ) Yang Terinduksi Oleh Serangan Hama Boktor (Xystrosera festiva)

a

KONSTRUKSI PUSTAKA cDNA SENGON
(Parmerianthesfalcataria L. Nielsen) YANG
TERINDUKSI OLEH SERANGAN HAMA BOKTOR
(Xystroserafestiva)

OLEH
N. SRI HARTATI

PROGRAM PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2002

N. SRI HARTATI. Konstruksi Pwtaka cDNA Sengon (Parczserimthes
faleafaria L. Niefsen) Yang Terinduksi Oleh Semngan Hamrt B Q ~ (Xystrmra
X
festiva)). Dibrrwah bimbingan SUHARSONO sebagai ketua dm ENNY
SUDARMONOWATI sebagai anggota.
Penelitian ini bertujuan untuk mengklon gen-gen sengon yang terinduksi
oleh swangim hama boktor melalui konstnrksi pustaka GDNA Vektor yang

digunakan gdalah pSPORTl yang membawa gen penanda resistensi terhadap
ampisilin (A& dan lacOPZ' penyandi P-galaktosidase. RNA total diisolasi dari
kambium batang mngon yang terideksi dan yang tidak terideksi oleh hama
boktor secara terpsah. Isolasi mRNA dari RNA total dilakukan Bengan metda
fiaksinasi pada kolom oligo-dT seblosa. DNA komplementer @DNA) yang
disintesis &%an menggunakan mRNA sebagai cetkan disisipkan pada situs
Notl- EcoRl yang terletak pada daerah 1acOPZ'. Plasmid rekombinan
diintroduks'lkan ke daiaxn sel ~ c h e r i c h i acoli DH5a. Frelcuensi rekombinan
yang diperdeh adalah 31,91% dan 67,58% masing-masing untuk E wli yang
ditransformasi dengan plasmid rekombinan yang mengandung cDNA sengon
yang terinfeksi dengan hama boktor dan yang tidak terinfeksi. A d i s i s pustaka
cDNA dilakukan dengan mengamplifikasi sisipan cDNA pada mesin PCR
menggunakan primer M13 (reverse dan forward) serta restriksi dengan Not1 dan
EcoRl . Hasil analisis terhadap pustaka cDNA baik melalui d i s i s PCR maupun
pernotongan dengan enzim restriksi menunjukkan adanya sisipan pada plasmid
rekombinaa hstaka cDNA yang dihasilkan dapat digunakan sebagai bahb
untuk mengidenwikasi gen-gen yang berkaitan dengan ketahanan tanaman
t e r W p hamo pada penelitian lebih lanjut, yang berguna @am program
perbaikan genetik tanaman di masa yang akan datang.

SURAT PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa t i i s yang bejudul
KONSTRUKSI PUSTAKA eDNA SENGON ( P ~ v ~ a n t hfalcataria
c~
L. NSdscn) YANG TERIlWW#SI O m H SERANGAN HAMA BOK~@R
(Xystmsetrzfdm)
Adalah be= merupakan hasil karya sendiri dan belum pentah dipubiikaikan.
Semua sumbe?. data dan infonnasi yang digunakan telah dinyatakm
jelas
dan dapat diperiksa kebenarannya.

N.Sri Hartati
NRP.99637

Judul Tesis

:

Nama

Nomor Pokok
Program Studi

:
:
:

Konstiuksi Pustaka cDNA Sengon (Paraserianthes
falmtaria L. Nielsen ) Yang Terinduksi Oleh
Serangan Hama Boktor (Xystroserafestiva)
N. Sri Hartati
99637
Bioteknologi

Menyetujui

C

Ketua

Dr. Ir. Ennv Sudarmonowati
Anggota

Mengetahui
2. Ketua Program Studi

ur Program Pasca. Sarjana

u.Muhammad Jusuf

~ i ~ Manuw
d a ,oto. MSc.

Tanggal lulus : 12 Maret 2002

KONSTRUKSI PUSTAKA cDNA SENGON
( P a r d a n t h afalcataria L. Nielsen) YANG
TERINDUKSI OLEH SERANGAN HAMA BOKTOR
(Xystrweraf&a)

N. SRI HARTATI

Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk rnernperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Bioteknologi

PROGRAM PASCASARJANA
INSTITUT PERTANLAN BOGOR
2002

RIWAYAT EUDUP

Penulis dilahirkan di Tasikmalaya, Jawa Barat pada fanggal 26 Desember
1969 sebagai anak pertma dari pasangan Bapak Maryoto (ah) dan Ibu Ati
Susilawati. Penulis rnenyelesaikan jenjang pendidikan formal di SD Negeri

Arjasari 1 pada tahun 1981, SMP Negeri 1 Singaparna pada tahun 1984 dm
SMA Negeri 1 Tasikmalaya pada tahun 1987. Pada tahun yang sama penulis

rnelanjutkan pendidikan di Institut Teknologi Sepuluh Nopember, Surabaya dan
memperoleh gelar Sarjana Kimia pada bufan Februari 1992.
Pada tahun 1999 penu1is diterima di Program studi Bioteknologi,
Program Pasmsarjana Institut Pertanian Bogor. Penulis bekeja sebagai staf
peneliti pada Pusat Penelitian Bioteknologi-Lembaga Ilmu Pengetahuan
Indonesia sejak Februari 1993 hingga sekarang.

PRAKATA
Puji syukur penulis p 8 t l . h ke hadirat Allah swt atas selesainya karya
tulis i h i a h ini. Top& yang dipiff aeSalah Konstruksi Pustaka cDNA Sengon
(Panwaianthes falcafmk L. Nielson ) Yang Tcriiaduksi 0 1 ~ BSerangan
Hama Boktor (xystrosmf k s t h ).
T g r i m m diucapkan lrepada Dr. Ir. Suharsono dm Dr. Ir: Emy
Sudarmonmti selaku pembimbing, atas gagasan dan dorongan yang sangat
berguna dalam memyelesaikan penelitian serta penulisan tesis; Ketua Program
Studi bestaf atas kqemayaan dan kasediaannya mendidik penulis
khususnya ddam bidang biologi nroleh1er; Dfektur Program Pasea sajana IPB
beserta staf atas jdsymm sel.83a p d s menempuh pendidikan; Kepala Pusat
Pmlitian Bideknologi UP1 begesta stafyang telah memberikan ijin belajar serta
fasiritas penelitign; Dr. Made Sri Pram dm Dr. Titik K. Pransl, atas segala

dukmgmnya; Vivi Ang%raini, Elfawati dim Budi Saksono, atas semua saran
yang berkaitan dengan teknis pditian; Pak Yitno, untuk dokumentasi hasil
penelitian, Pak Nanang, atsrs bambmya dalam koleksi bahan penelitian; rekanrekan di Labomtmium Biologi Wekuler 3 yaitu Retno, Santi, Tati, Upi, Soni,
Bodhi, Tia, atas semua bantuan dan kebersamaan selama pemtlis melakukan
penelitian; kepada orang tua dan adik-adik, keluarga (Anwar dan Harits), atas
semua kasih sayang yang selalu menyertai perjalanan penulis; kepada semua
teman Program Studi B i o t c h o ~angkatan 99, Aryanti, Atmitri, Ragapadmi,
-F
Lizawati dan b s u s kepada Enung Sri Mulyaningsih, atas
kebemamaan yang sangat M.
Kegiatan penelitian ini didukung oleh proyek penelitian "Rekayisa
Genet& Sengon", kerjasama antam k t Penelitian Bioteknologi-LIP1 dengan
Perum Perhutani, dibawah koordinator Dr. Ir. Emy Sudarmonowati. Dengan
denikian, has3 penelitian yang diperoleh sepenuhnya milik kedua instansi
tersebut. Kepda kedua fihak, pa&s mengucapkan terimakasih atas kesempatan
yang dibuntuk d a k h &ah satu topik penelitian yang berkaitan
dengan kerjamma teastbut. Sdwgian studi penulis dibiayai oleh PPKT, Lembaga
Ilmu Pen@ahn Indonesia, terinrakasih atas kesempatan yang dibePikan.
Akhir kata, semoga intbrm6 yang dfsajikan Mam karya tulis ini
berguna bagi kemajw ilmu pengehhuan.

N. Sri Hartati

DAFTAR TABEL
DATAR GAMBAR

TINJAUAN PUSTAKA
Hama b o b (Xyslrwrafe3W)
Inter* h~ma-tammm
Konstruksi pustaka cDNA
Isolasi RNA
Isolasi mRNA
Sintesis cDNA
Perkifam jumlah Idon cDNA ymg ideal
BAHAN DAN METODE
Bahan tawnan
Persiapon alat dan bahan untuk igolasi RNA
Tahapan penelhian
Isolasi RNA total
Isolasi mRNA

Sintesis cDNA
Konstruksi plasmid rekomb'm
Introddcsi plasmid rekombinaakt dalam baktei
Analisis pustaka GDMA
HASIL DAN PEMBAHASAN
SeranganX jestbm t e r U p sagon
Isolasi RNA total
Isolasi mRNA
Sintesis cDNA
Konstnrksi pustaka cDNA
Analisis pustaka cDNA

KESIMPULAN
SARAN
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN

Halaman
Tabel 1 Jurnlah koloni hail transformasi plasmid
rekombinan dan fiekuensi rekombinan

41

-bar
1
GIMbar 2

Mekanisme pertahanan yang terinduksi oleh serangan hama.
Peta pSPORTl dan multi situs pengklonan (MCS: Mulriple
Cloning Sites)
Cirnbar 3
Penampalcan sengon yang terserang hama boktor
Gamh4
Hasil dektroforesis RNA total yang diperoleh dengan
metoda 1-3
Gambar 5
Hasil elektroforesis RNA total yang diperoleh dengan
metoda 4
Gambar 6
Isolasi mRNA melalui kolom oligo-dT selulosa

Gambar 7
Hasil elektroforesis mRNA
Gambar 8
Hasil elektroforesis cDNA
Gambar 9
Diagram sintesis cDNA dan penyambungan dengan
pSPORTl
Gambar 10 Koloni bakteri E colz DH5 yang mengalami transformasi
dengan plasmid rekominan
Gambar 1 1A Hasil elektroforesis pernotongan plasmid rekombinan
dan pSPORTl dengan EcoRl dan Not 1
Gambar 11B Hasil elektroforsis pernotongan plasmid rekombinan
dan pSPORT1 dengan b R l
Gambar 12 Hasil elektroforesis produk amplifikasi DNA sisipan
dengan PCR

7
28
31

33
34
35
36
37
39
40
42
43'
43

Latar Belakang
Sengon (Paraseriunthes f a l c c ~ t ~L.
a Nielsen) merupakan &ah satu
jenis pohon yang dilrembangkan dalam program Hutan Tanaman Industri.
Tanaman ini mempunyai sifat-sifat unggul yaitu dapat tumbuh cepat pada tanah
miskin hara dan drainase yang kurang baik, batang lurus, dan muki guna sebagai

kayu pertukangan maupun bahan baku industri pulp. Sifatnya yang turnbuh cepat
sangat sesuai digunakan dalam reboisasi dan penghijauan lahan-lahan kritis
sebagai penyubur tanah.
Masalah penting dalam tegakan sengon yang hampir selalu mengancam
program pembangunan hutan sengon adalah masalah hama dengan dampak
kerusakan yang cukup besar. Xystrosera festiw yang lebih dikenal sebagai
kumbang penggerek batang (uter, wowolan, boktor) merupakan hama utama
pohon sengon. Harna ini secara ekonomis sangat merugikan walaupun masih ada
hama-harna lain yang mengganggu tetapi merupakan hama sekunder (Suratmo,

Serangan X festiva dapat mengakibatkan turunnya kuditas kayu dan
kadang-kadang mematikan pohon inang. Pada serangan yang berat kulit pohon
akan mengering dan pecah-pecah, bahkan sebagian daunnya akan mengering dan
gugur (Nandika dan Wiseno, 1993). Penggerekan bathg mengakibatkan
msaknya bagian dalam kulit kayu sehingga kulit akan mati dan terkelupas. Bila
tidak terjadi serangan berulang-ulang, pertumbuhan pohon yang cepat akan
menyembuhkan luka-luka dengan cara pembentukan kalus. Akan tetapi
kerusakan oleh

X festiva sering terjadi berulang-ulang dalam beberapa tahun,

sthingga banyak pohon yang mati atau patah. Kerusakan tersebut akan

m n u n k a n volume dan kualitas kayu pertukangan yang dihasilkan (Husaeni
dan Nandika, 1991).
Cara pengendalian yang benar-benar efektif hingga saat ini. belum
ditemukan. Berklcan ha1 tersebut peflu dilalnrkan usaha untuk mengatasi
m a d a h hama yang melibatlcan pendekatan biologi molekuler. DaIam rangka
mengatasi hama boktor yang lebih komprehensif dengan pendekatan biologi
molehler, dipandan8 perh untuk melakukan karakterisasi gen-gen yang
terinduksi oleh serangan hama boktor.
Respon yang dilakukan oleh tanaman saat terjadi interaksi dengan hama,
adalah melakukan sintesis berbagai molekul toksik baik molekul protein rnaupun
non pratein yang m g s i untuk perliiungan terhadap hama. Perubahan yang
terjadi pada tanaman sebagai akibat adanya kerusakan atau cekaman dise6ut
sebagai respon dari suatu induksi. Warn beberapa kasus, respon terjadi sebagai
sistem ketahanan suatu tanaman terhadap pelukaan oleh herbivora atau patogen.

Pelukaan jaringan tanaman dapat menginduksi sintesis senyawa fitokimia
tertentu sebagai bent& respon tamman. Respon ini bervariasi sesuai dengan
genotip tanaman, ontogmi, fenologi serta interaksi antara tanaman dengan
lingkungan abiotik dan biotik. Panda dan Kush (1995) mengemukakan bahwa
d a l m beberapa penelitian, respon tamman t d a p hama ditunjukkan oleh
adanya perubahan dalam kandungan tanin dan fen01 yang merupakan produk
jalur asam sikimat. Disamping itu aktifitas relatif fenil alanin ammonia liase
(PAL) dapat mempengaruhi produksi senyawa fenolik seperti lignin, sehingga

a k t i h PAL dapat menjadi indikator adanya tingkat ketahanan tanaman
twhadap suatu cekaman.

Pada jenis tanaman tertentu seperti kentang, telah dike&&

adanya

proddcsi senyawa fitoaleksin yang berbobot molekul rendah dan terakumulasi
wbagai respon tanaman terhadap m g g a (hama). Akumulasi fitoaleksin
s
e
w respon tehadap kerusftkan oleh hama, mikroba atau pelukaan secara

mekanik telah diketahui terjadi pada beberapa famili tanaman meliputi

Legummoseae, &Ahnaceae,

dan Compositae. Perkembangan lebih lanjut,

beberapa peneliti berhasil mengungkapkan adanya respon k e t a b n tanaman
terhadap hama yang melibatkan sekelompok inhibitor proteinase seperti pada
Salix viminalis (Saarikoski et al., 1996), kentang (Gruden et al.,1997), ubi jalar

(Yeh el al., 1997) dan buncis (Gin et al., 1998).
Penapisan gen-gen yang terlibat dalam sintesis senyawa-senyawa yan'g
berhubungan denga. pertahanan terhadap hama dapat dilakukan terhadap

pustaka cDNA yang disintesis dari mRNA. Penapisan suatu gen yang terinduksi
atau yang didEspresh pada jwingan tertentu dari pustaka cDNA, dapat
dilakukan melahi penapisan d i f m i a l atau plus minus screening maupun
hibridisasi asam nukIeat &ngan pelacak berupa gen tertentu. Penapisan
diferensial dilakulcan dengan melacak pustaka cDNA dengan dua jenis pelacak

berbeda baupa cDNA yang b r a d dari jaringan yang mengekspresikan gen
I

terinduksi dan yang tidak terinduksi atau jaringan cDNA dari dua jenis jaringan
yang berbeda.
Ukuran -men

c~~~-urnum
lebih
n ~kecil
a dibandingkan dengan gen

yang diperoleh melalui teknik shot grm, sehingga plasmid dapat digunakan

sebagai vektor untuk mengklon cDNk Melalui konstmbi pustaka cDNA
sengoa mbngguItakan plasrnid pSPORTI diharaph dgpat diperoleh cDNA ymg
khubungan dengan g~n-genketahanan yang twinWsi oleh m g a n hama

Tujuan Penelitian
Penelitian ini M j u a n untuk mengkonstntksi pustaka cDNA tanaman
sengon Yang terinduksi oleh arangan hama bolctor, sehingga dapat digunahn

sebagai bahan penapisan untuk gen-gen yang berkaitm dengan ketahanan
terhadap serangan k a a dalarn m g k a perbailcan sifat tanaman sengon di masa
yang akan datang.

Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Biologi Molelculer 3, Pu&
Penelitian Bioteknologi LPI. Penelitian dilaksanakan sejak bulan Februari 2001

hingga November 2001.

TINJAUAN PUSTAKA

Hama sengon yang secant ekommis sangat merugikan adalah penggerek
batang boktor (Xystrmerafern). Hama ini mempunyai nama daerah uter-uter,
boktor, wowolan, kumbang serendeng, dan engkes-engkes, yang tennasuk ke
dalam famili Cerambicidae clan ordo Coleoptera. Hama ini menyerang beberapa
spesies dari famili Leguminoceae sepwti Albizia falcatma (P.falcataria), A.
sumparm, A. strfilda, A. lebbeck, dan Pithecellobiurn lobdurn (Suratmo, 1982;

Nandika dan Wiseno, 1993).
Hama ini biasanya menyerang saat sengon berumur 3 tahun dan bila

serangan dibiarkan selama 2-5 tahun selwh tanaman &an rusak . Serangan
ditandai dengan warna merah kecokhtan pada batang. Serangan yang terjadi
pada kayu kadang sampai sekeliling batang dan bila demikian maka tajuk akan
menguning sehingga daun berguguran dan akhirnya pohon &an mati.
Derajat serangan hama pohon sengon dipengaruhi oleh umur pohon,
ketinggian, diameter batang serta p l a taaam. Derajat serangan kumbang
penggerek pada sengon cenderung semakin besar menghti pertumbuhan pohon
dan serangan terbesar terjadi pa& ketinggian batang 6,s

- 9 m (Hasan et al.,

1990). Hama boktor pada umumya menyerang batang-batang pohon yang besar
sehingga dapat diambil kesimpulan bahwa semakin tuai umur pohon maka
serangan hama ini pada sengon akan semakin besar. Berdaszukan pengamatan
dilapangan, besar kerusakan yang diakibatkan oleh serangan X festiva mencapai
80% dari seluruh pertanaman.

Bebentpa peaelitian mengenai penggunaan insektisida tetah dilakukan
untuk mengatasi m&ah

hama seperti insektisida kontak Sumithion SO EC dan

Sumialpha 25 EC serta insek-tisida sistemik Suscon Blue yang disemprotkan
langsung. Insektisida ini dapat rnematikan imago maupun larva X' f e s t h .
Berbagai usaha yang dilakukan untuk mengatasi masalah hama baik dengan cars
men-

pola tanam maupun penggunaan insektisida belum efektif untuk

mengendalikan serangan hama.

Interaksi hama-tanaman

Mekanisme perlindungan tanaman terhadap hama dan patogen terdiri dari
mekanisme konstitutif dan mekanisme terinduksi. Mekanisme konstitutif berupa
ciri-ciri yang dibentuk pada perhunbuhan vegetatif dan perkembangan tanaman,
seperti trikoma yang merupakan perlindungan daerah aerial pada berbagai
spesies tanaman. Pada mekanisme tefinduksi, hama atau patogen memicu

tanaman membentuk suatu sistem pertahanan. Mekanisme ini mungkin
melibatkan produk gen in situ yang telah siap, seperti induksi alrtivitas callme
synthase, gluiranase, kithast atclu inhibitor pfdeinase (Ayres, 1992). Infeksi

hama yang dilakukan pada daun melon ternyata meningkatkan aktivitas inhibitor
proteinase, sehingga diduga protein tersebut berperan dalam sistem pertahanan
tanaman melon terhadap hama (Hammersmidt dan Kuc', 1995). Mekanisme yang
lain adalah yang mengarah kepada pengaktifan gen-gen pertahanan.
Gen-gen yang terlibat didalam pertahanan mungkin menyandi sejumlah
produk yang behngsi secara langsung seperti deterrents, anti feedtmts ataupun
gen penyandi enzim yang mensintesis produk-produk yang berhubungan dengan

ketahanan sejxrti fitodeksin (Ayres, 1992). Kecepatan serta i~ltmsitasbiosintesis
senyawa yang terlibat ddam respon ketahatlan tanaman terhadap serangga
tergmtung pada jarak dari titik pelukaan, besarnya kerusakan, dan jenis elisitor
yang terlibat.

Fragmen tanaman dm dinding sel cendawan mengandung oligosakarida
dalam s t d c h r polisakaridanya. Oligosakarida yang dibebaskan ketika sel
mengalami kerusakan oleh hama atau mikroorganisme dapat befingsi sebagai
sinyd yang mengaktifkan gen-gen penyandi enzim untuk menghasilkan
senyawa-senyawa yang berkaitan dengan kelahanan tanaman (Gambar 1).
Fragmen poli dan oligosakarida yang dilepaskan akibat serangan hama dapat
distimulasi secara in viiro, yaitu meldui kontak antara dinding sel dengan
endopoligalalcturonase (ERhe) yang mempakan suatu enzim yang dilepaskan
oleh bagian tertentu di dalam sel akibat serangan hama.

avon no id
Diterpen

Gambztr 1. Mekanisme pertahanan yang terinduksi oleh serangan hama (Panda
1995).

Penelitian-pelitim

yang berkaitan dengan pengaktifan sistem

pertahanan tamman telah banyak dil-.

Pemggeaek polong (Helicoverpa

armigera) yang diinfeks'lkan pada polong buncis 12 sampai 60 hari setelah

inhibitor proteinase dengan aktivitas penghdmbatan

pemtwngaan, meng*

yang berbeda terhadap tripsin, kimotripsin, proteinase pencemaan ulat dan
proteinase bakteri (Giri et d.,1998). Aktivitas inhibitor tripsin pada kedelai yang
terinduksi oleh hama lebih tinggi d i b a n d i i a n dengan tanpa induksi (Zhao et
al., 1996). Pelukaan secara mekanik juga diketahui dapat menginduksi gen

penyandi inhibitor tripsin. Gen swin 1.1 penyandi inhibitor protease serin
d i t e m u h pada Salk viminalis yang dilukai secara mekanik, yang ditapis dari
pustaka genom dengan menggunakan pelacak win 3 dari populus (Saarikoski et
al., 1996).

Penelitian lain menunjukkan adanya perbedaan respon secara rnolekulQ
antara pelukaan yang disebabkan oleh harna dan pelukaan secara rnekanik. Pada

kentang (So-

tuberam), akumulasi transkrip mRNA untuk proteinase

inhibitor I1 @in 11)dan 3-hydK,xy-3-methylalutsryI-coeaymeakibat kerusakan
oleh harna lebih besar dibandihg dengan pernotongan daun (Korth ctan Dixon,
1997).

Konstruksi Pustaka cDNA

Pengklonan gen melalui cara pemotongan DNA genom dengan suatu
enzim restriksi yang kemudian disisipkan dalam suatu vektor dan dipelihara
dalam suatu inang disebut dengan shot gun cloning. Setiap vektor yang
membawa fragmen"DNA genom disebut dengan klon DNA genom dan

SekumpUtan klon DNA goaom mempakan pustaka genom. Fragmen DNA genom

yang dihorsilltan 58npt banyrrk, clan k e n a pemotmgm teajadi seam acak maka
hanya sedikit fiagmen saja yang mengandung gen. Cara lain untuk memperoleh
klon DNA ymg berupa gen dapat dilalrukan dengan memilih sekuen penyandi
saja. Enzim trankriptase balik dapat d i m a n f w untuk ntensintesis DNA
komplementer (cDNA) dengan menggunakan RNA sebagai cetakan (tRNA,
rIUUA, mRNA).
Gen-gen eukariot urnumnya terdiri dari sekuen-sekuen DNA yang
dipisahkm oleh sekuen bukan penyandi (intron). Intron ini akan dibuang pada
proses pasca transkripsi mRNA yang disebut dengan splicing. Klon cDNA

eukariot yang diperoleh dari mRNq tidak mengandung intron-clanberguna untuk
mempelajari ekspresinya di dalam sel bakteri misalnya Escheriichia coli. Pada
umumnya prokariot tidak &pat memproses intron (Old dan Primrose, 1985).
Bakteri yang digunakan untuk membuat klon cDNA umumnya adalah E. coli.

Secara umum pembuatan pustaka cDNA dilakulcan melalui tahap-tahap
sebagai befilnrt ( Huang et al., 1982):
I . Isolasi RNA total

bahaa untuk isolasi mRNA

2. Sintesis utas pertama dan utas kedua cDNA
3. Konstruksi vektor rekombinan. Jika vektor ystng digunakan berupa plasmid,

selanjutnya plasmid rekombinan diintmduksikan ke dalam sel inang.
4. Seleksi vektor r e k o m b i i berdasarkan gen penanda yang terdapat pada

vektor.
Plasmid merupakan salah satu vektor yang &pat digunakan untuk
mengkonstruksi pustaka c D N k Plasmid yang digunakan antara lain pT7T3D

untuk klon cDNA Br&m

napus (Kim et al., 1998), pGEX-2T untuk klon

cDNA ubi jalar (Yeh et al., 1997) dan pSPORTl untuk mengkIon gen-gen
kedelai yang terinduksi oleh alumunium (Miftahudin et al., 1995; Yuniati, 1999;
ARWar, 2000). Pembuatan pustaka cDNA dapat pula dilakukan dengan

menggunakan vektor lain seperti cosmid dan vektor h. Vektor h banyak
digunakan untuk mengkonstruksi cDNA seperti ZAPXR untuk konstruksi cDNA
Cicer arietinum (Munoz et al, 1998), h gtl 1 untuk kentang (Gruden et al.,
1997),

A Zap 11 untuk Brassim campestris L. ssp. pekinensis dan Arabidopsis

(Lim et al., 1996 ;Park et al., 1998).
Masing-masing klon dari suatu pustaka cDNA dapat dimanfaatkan untuk
berbagai tujuan seperti peningkatan produksi protein yang disandikan oleh klon
cDNA tertentu dalam sel inang, karakterisasi gen maupun transfer cDNA kepada
sel lain. Gen mustard tripsin PI2 (mti-2) yang diperoleh dari klon cDNA telah
dimasukkan ke dalam Nicotiana tabacum L. cv Xanthi dan Arabidopsis L.
(Heynh.) dan digunakm untuk mempelajari pengaruh tingkat ekspresi inhibitor

proteinase terhadap larva S ' t e r a lifforalis (Leo et al., 1998).
Klon cDNA juga dapat d i d -

dalarn upaya mengurutkan DNA

genom. Pada eukariot tingkat tinggi urutan DNA keseluruhan genom masih sulit
dilakukan karena ukurannya besar dan kompleks, sehingga analisis genom
dimulai dengan mengenali wutan DNA yang diekspresikan

saja atau yang

dikenal dengan analisis EST (Expremed Sequence Tags). Dalam analisis EST,
cDNA diklon ke dalarn suatu vektor dan selanjutnya dilakukan pengurutan DNA
dari ujung 5' ke ujung 3'. Urutan DNA yang diperokh dengan panjang 300-500

pasang basa cukup untuk mengidentifikasi gen dengan cara membandingkannsa
dengan database publik.
Menurut data per September 2000 sudah lebih dari 26000 sekuen EST
l,o/ri.s japot~ictrs yang telah tercatat dalam database publik. Sekuen vang
ditemukan tersebut dibagi menjadi beberapa grup dengan berbagai fungsi seperti
respon terhadap lingkungan, sintesis protein, proses seluler, respon terhadap
patogen dan metabolit sekunder (Asamizu el al., 2000). Beberapz- famili gen
pinus seperti chaperonin 60, thiolase, elongnizon.fact)r i a,acid phoshatase, actin
Jeplymerizing factor,

heat shock polypeptide

HSP 90 dan alcohol

dehidrogenase telah diidentifikasi dengan cara mensekuen cDNA (Kinlaw dan
Neale, 1997). Gen penyandi Notch dari Drosophila juga telah diteliti urutan
basanya dari cDNA (Caballero, 1992).

Isolasi RNA
RNA merupakan polimer linier yang terdiri dari monomer ribonukleosida
monofosfat yang dihubungkan oleh ikatan fosfodiester (Farrell, 1993). RNA
terdiri dari dua jenis yaitu RNA yang berhubungan dengan ekspresi gen serta
yang tidak berhubungan dengan ekspresi gen, yaitu RNA primer dalam repiikasi
DNA dan RNA dalam struktur kromosom bakteri.
Terdapat tiga jenis RNA yang berhubungan dengan ekspresi gen yaitu
rRNA (ribosomal RNA), tRNA (trmfer RNA) dan m w A (messenger RNA).
rRNA merupakan komponen utama penyusun ribosom yang berperan dalam
sintesis rantai protein, yaitu sebagai tempat pertemuan antara mRNA dengan
tRNA yang bermuatan asam amino. Jumlah rRNA di dalam sel adalah yang

paling banyak y a h 80-85% dari RNA total. Pada eukariot terdapat 4 jenis rRNA
yaitu rRNA 18s (17s pada khamir), 28s (25s pada khamir), 5,8S, dan 5s
(Sambrook et al., 1989).
Jumlah tRNA lebih sedikit dibanding rIWA yaitu 15-20%. RNA transfer
b b n g s i mentejemahkan kodon yang terdapat pada mRNA menjadi satu jenis

asam amino pada proses translasi. mRNA merupakan model cetakan dalam
proses penyusunan asam-asam amino pada rantai polipeptida dan disandi oleh

mas khas. Proporsi mRNA adalah yang paling sedikit yaitu 1-2% dari RNA total
dan hanya ada sehtna protein yang disandikan masih diproduksi. Kebanyakan

rnRNA prokariot sangat tidak stabil clan mempunyai waktu paruh sekitar 3 menit
sedangkan mRNA eukariot lebih stabil dengan waktu paruh >10 jam

(P-globin)

dan ada pula yang hanya 30 menit atau h a n g (Albert et al.,1989).
Populasi mRNA dalam sel mamalia terbagi menjadi tiga jenis yaitu tipe

mRNA beriimpah (12000 kopi per sel), tipe intermediet (300 kopi per sel) dan
tipe jarang (15 kopi per sel) (Farrel, 1993). Sambrook et al. (1989) membagi
mRNA menjadi dua jenis yaitu abuncht mRNA dan low abumhce mRNA
( 4 4 kopi per sel). Fro@

low abtnsdance mRNA adalah. 30% dari jumlah

mRNA.
Secara kimiawi maupun biologi, RNA lebih labil dibanding DNA

terutama pada suhu tinggi (%S°C) dan terhadap alkali. RNA juga sangat mudah
terdegradasi oleh RNase, yang merupakan enzim yang sangat stabil. Pada saat
mengisolasi RNA,aktivitas RNase h a s dihambat, yang dapat dilakukan dengan
menambahkan inhibitor RNase misalnya 8-hydroxyquinolin, memanaskan
peralatan gelas yang akan digunakan hingga 200°C atau direndam &lam DEPC.

Air yang digunakan untuk melarutkan bahan untuk isolasi RNA juga harus bebas

RNase.
Sifat RNA yang tidalc stabil memerlukan cara-cara yang tepat u~ltuk
mengisolasinya. Beberapa ha1 yang perlu diperhatikan dalam isolasi RNA dari
jaringan tanaman yaitu:
1. Penghancuran dinding sel tamman

Se1 tanaman dilcelilingi oleh dinding sei yang terdiri dari selulosa, pektin dan
xyloglucan. Pada prinsipnya isolasi RNA dilakukan dengan rrierusak dinding

sel untuk mengeluarkan sitoplasma dan RNA. Penggunaan nitrogen cair ketika
penggerusan jaringan tanaman sangat penting untuk menjaga jaringan tanaman

tetap beku karena suhu sangat rendah (-196°C) sehingga ribonuklease tidak
aktif (Wilkins dan Smart, 1996).
2. Pdisakarida dan metabolit sekunder

Kandungan polisakarida dan metabolit sekunder pada sel tanaman sering
menyulitkan dalam isolasi RNA. Banyak jaringan tanaman yang mengandung
polisakarida cukup tinggi yang sifirtnya mirip dengan asam nuWestt sehingga
dapat mengendap bersama RNA Polisakarida dapat menghalangi atau
menghambat pengendapan RNA, mengganggu kuantifikasi RNA yang
berdasarkan absorbansi, menghsmbat aktivitas enzirnatik pada percobaan
selanjutnya seperti terhadap enzim restriksi, ligase dan polimerase,
menghambat seleksi poly(~)'-RNA (mRNA) dan mengg-

migrasi RNA

saat elektroforesis (Wilkins clan Smart, 1996). Karena sifatnya yang mirip
dengan asam nukleat, pemisahan polisakarida dari RNA sangat sulit.
Pengendapan diferensial mengpnakan 2-Butil Ether (2-BE) pada beberapa

tanaman seperti Geranium, poinsetia, pinus putih dan k h o dapat
menghasilkan RNA yang ba& (Schultz et al., 1994 dan Santoso, 1996).
Senyawa fenolik dm metabolit sehnder lain seperti antosianin, lateks dan

asam anacardic dapat mempengaruhi proses isolasi RNA dan percobaan
selanjutnyo yang menggunakan RNA.Terdapat beberapa cara untuk mengatasi

ha1 ini antam lain penggunam polivinilpirolidon (PVP) yang bekerja melalui
ikatm hidrogen dm mengendapkan senyawa fenolik serta metabolit sekunder.
Senyawa pereduksi seperti $-mercaptoethanol dan dithithreitol

me@

(Dm) &pat

oksidasi senyawa fenolik sehingga menghambat aktifitas radial

bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fen01 terhadap asam nukleat. Bufer alkalin
dapat menghambat reduksi senyawa fenolik oleh difenol oksidase. Penggunaan
proteinase K dapat mendegradasi enzim pengoksidasi senyawa fenolik dan
metabolit sekunder.
3. Aktivitas nuklease

Dalam kondisi senescens, pelukaaq serangan patogen atau kekwangan fosfat,
produksi r i b o d e a s e endogen bisa meningkat. Hal ini dapat diiasi dengan
penambahan peredulrsi kuat seperti $-merkaptoe&mol atau DTT,proteinase K,
guanidin isotiosianat, beberrrpa jenis inhibitor nuWease seperti VDR (vanadyl
ribonuclease complexes), RNasin dan RNAguard. Beberapa bahan lain yang
dapat menghambat aktivitas nuklease adalah guanidine hydrochloride, SDS,
sarcosyl, phenol : chloroform : isoamylalcohol, 8-hydroxyquinoline, cesium
chloride d m cesium tri fluoroacetate (Farrell, 1993; Wilkins dan Smart, 1996)
Larutan untuk isolasi RNA yang siap pakai telah tersedia , seperti TRIzoL~~

(GIBCOBRL)yang telah digunakan untuk isolasi RNA dari alfalfa (Medicago

varia) dm sel HeLa dengan kualitas RNA yang dihasilkan

baik (Kapros dm

Weterborg, 1995; Braccete et al., 1 999)

Isolasi mRNA
Pada sel eukafiot mRNA matang dibentuk dari prekursor hnRNA
(heterogenw nuclear RNA) meldui proses pasca transkripsi RNA. Sekitar 14% RNA total yang terdapat ddam sitoplasma merupakan mRNA matang. Pasca

transkripsi RNA terdiri dari pemasangan tudung ( 5 ' q ) yang krupa

pemunbahan nukleotida 7-methyl guanosine (m7G) pada ujung 5', met3asi pada
posisi N-7 dari nukleotida panin, pembuangan intron (intron splicing) dan
penambahan ekor (3'-end processing) yaitu penambahan 50-300 nukleotida
adenin pada ujung 3' (Farrel, 1993).
Ketmadaan poly-A+ yang baperan menjaga kestabilan stmktuf mRNA
dapat dimanfbtkan untuk memisahkan mRNA dari rRNA dan tRNA. Isolasi

mRNA dapat dilakukan dengan melalui beberapa cara yaitu hksinasi mRNA
daIam kolom digo-dT

penggunaan partikel magnetik, biotinilasi secara

kimia maupun enzimatik atrurpvn metoda kombinasi seperti fraksinasi oligo dT
berlapis &el

magnet dan strep avidin berlapis partikel magnet (Jones et al.,

1994). Seluruh metoda isolasi RNA berdwrkan pada perpasangan basa antara
*

residu adenilat dari mRNA dengsn residu timidilat (oligo-dT) 'Mau residu urasilat
(poly-U) (Cleaver et al., 1996).

Sintesis eDNA
Prinsip sintesis cDNA addab membentuk DNA kornplementer meialui
proses enzimatik dengan RNA sebagai cetakan. Sintesis cDNA dari mRNA
terdiri dari dua tahap yaitu sintesis utas perkma yang memanfhtkan ekor plyA+
pada ujung 3' yang @at berpasangan dengan primer oligo dT untuk memulai
sintesis utas pertama dm sintesis utas kedua dengan cetakan utas pertama dari
cDNA yang terbentuk. Pada sintesis utas pertama diperlukan molekul mRNA
sebagai mtakan, suatu primer sebagai umpan untuk memulai sintesis, cmpat
macam nukleotida yaitu d A Z , dCTP, dGTP dan dTTP, enzim transkriptase
terbalik dan larutan penyangga reaksi.
Sintesis utas kedua cDNA dapat dilakukan dengan metode seypriming
yang memanfatkan 'simpul jepit rambut' yang terbentuk pada ujung 3' sebagai
primer. Sintesis utas kedua diitalisis oleh fiagmen Klenow dari DNA
polimerase I E cob dan selanjutnya simpul ini dipotong dengan S1 nuklease.
Metoda ini mempunyai kelemahan, yaitu penggunaan S1 nuklease untuk
memotong simpul jepit nunbut mmpakan reaksi yang sulit dikontrol.

Cara lain untuk rhensintesisutas kedua cIlNA addah metoda replacement
synthesis yang dikembangkan oleh Okayama dan Berg (1982) dan dimojifikasi
oleh Gubler dan Hoffman (1983). Metoda ini menggunakan mRNA yang
berpasangan dengan utas pertama cDNA sebagai bahan r@csi nick translasi
RNaseH. Hasil pernotongan RNaseW pada rnRNA digunakan sebagai primer
untuk sintesis utas kedua cDNA.

*

Perkiraan jumlah klon cDNA yang ideal
Pengklonan cDNA untuk memperoleh jenis kopi mRNA berlimpah
seperti penyandi globin, imunoglobulin dan ovalbumin yang proporsinya
mencapai 50-90% dari M

A sitoplasma, tidak memerlukan tahap purifikasi

lebih lanjut sebelum disintesis menjadi cDNA utas ganda.
Konstruksi pustaka cDNA yang lengkap, yaitu yang mengandung seluruh
jenis mRNA yang berbeda Mam sel membutuhkan jumlah klon cDNA yang
tinggi. Menurut Kamalay dan Goldberg (1980) yang disitir oleh Slightom dan
Quemada (1988), diperkirakan dalam sel tembakau terdapat 25.000 jenis mRNA
dan sekitar 6000 diantaranya unik untuk setiap organ seperti daun, akar, cabang,
petal, anter atau ovari.
Jumlah klon cDNA yang diperlukan agar jenis mRNA jenis low.

abundance tercakup dalam pustaka, dapat diperkirakan dengan rumus sebagai
berikut (Sambrook et al., 1989):
N = ln (1 - P) 1l(1 - lln)
N :jumiah Mon yang d h t d b q P :probabilitas ,bhany-a:0,99, n:fraksipopulasi
mRNA total yang dinpesewasilcanoleh satu jenis low abundcmce mRNk

Sebagai contoh, dalam sel fibroblast manusia yang mengandung 30% RNA jenis
low abundance dengan 11.000 jenis sekuen yang berbeda, dibutuhkan 170.000

klon cDNA untuk menyusun pustaka cDNA yang lengkap.
Penapisan klon cDNA untuk mengidentifikasi sekuen yang diinginkan
dari sejumlah klon cDNA yang sangat banyak merupakan pekerjaan yang sulit
dan membutuhkan biaya yang ti@.

Untuk memudahkan penapisan, jumlah

klon cDNA bisa dibatasi dengan cara melakukan fraksinasi mRNA atau
fraksinasi cDNA.

Fraksinasi mRNA kdasarkan ukuran merupakan cara paling sederhana
untuk mendapatkan populasi mRNA yang mengandung h

n yang diinginkan.

Fraksinasi mRNA dapat cEilakukan dengan cara sentrifugsi dalam gradien
sukrosa yang mengandung bahan yang dapat mendenaturasi struktur sekunder
RNA. Fraksinasi cDNA lebih menguntungkan dibandingkan fiaksinasi mRNA

karena DNA lebih tahan terhadap degradasi oleh rmklease, dapat dilakukan
fiaksinasi secara lebih akurat melalui elektrof~esispada gel agarose, dan karena
fidcsinasi cDNA dilakukan pada tahap yang lebih lanjut maka kemungkinan
untuk memperolehfill-length c M A lebih besar.

BAHAN DAN METODE

Bahan tanaman
Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini berupa kambium
batang sengon yang terinfeksi hama boktor dan tidak terinfeksi yang diperoleh
dari kebun koleksi plasma nu-

Puslit Bioteknologi LIPI.

Persiapan alat dan bahan untuk isolasi RNA
Semua tahapan ekstraksi RNA dilakukan pada kondisi dingin dengan
menggunakan peralatan dan air yang bebas RNase. Peralatan dibebaskan dari
RNase dengan merendamnya dalam 0,l % DEPC (dietil pirokarbonat) dan
diautoklaf. Air yang digunakan ditambah dengan 0,l % DEPC, diaduk beberapa
jam dan diautoklaf.

Tahapan penelitian
Penelitian ini dilakukan melalui beberapa tahap yang dirangkum pada
Lampiran 1. Proses pengendapan dengan sentrifbgasi pada seluruh percobaan
dilakukan dengan menggunakan dua jenis sentrifbs. Sentrihgasi yang
menggunakan tabung sentrihs 50 ml dilakukan dengan Bioftse 28RSLHeraeus
(No. rotor: 3746), sedangkan sentrifbgasi yang menggunakan tabung mikro 1,5
ml dilakukan dengan Biofbse fresco.

Isolasi RNA total.
I d a s i RNA total dilakukan segera setelah bahan tanaman dikoleksi.
Empat metoda isolasi RNA (metoda 1, 2, 3 dan 4) dicoba untuk menentukan

metoda isolasi RNA yang paling sesuai. Analisis kualitatif RNA total dilalcukan
dengan cara elektroforesis pda 1% gel agarose menggunakan bufer 0,5X TBE
(0,05M Tris-HCl, pH 8,3; 0,0415 M asam borat; 0,SmM EDTA).

Met& 1
Sebanyak 0,s g kambium sengon digenrs bersama nitrogen cair dan 0,3 g
polivinilpirolidon (PW)
hingga halus. Selanjutnya dimaddcan pada tabung
wntrifus 50 ml yang berisi 5 ml bufer pengekstrak CTAB (100mM Tris-HC1 pH
8,O; 1,4 M NaCI; 20rnM EDTA, 0,02% B-merkaptoetmol; 2% CTAB), kemudian

dicampur perlahan-lahan dan diinkubasi pada 65°C selama 1 jam.

Setelah

inkubasi campuran didinginkan pada suhu ruang selama 6 menit dan kemudian
ditambahkan 6 ml k l o r o f o d l - oktanol (24:l). Selanjutnya disentrifbgasi pada
10.000 rpm, 4OC selama 20 menit. Cairan bagian atas diambil dan diekstraksi

dengan klorofodl-oktanol (24: 1) yang dilakukan sebanyak 3 kali. Supernatan
yang diperdeh pada tahap ekstraksi ditambahkan dengan 112 volume 5M NaCl,
dicampur pertahan dan ditambah dengan 2 volume 95% etanol clan disimpan
pada -20°C se1ama beberap8 jam. Selanjutnya disentrifugasigasi
pada 10.000 rpm,
4°C selama 20 menit. Endapan dicuci dengan lamtan etanol 70% dingin dan

dikeringkan pada suhu ruang. Endapan yang telah dikeringkan ditambah dengan
1 ml air bebas nuklease dan 114 volume 10M LiCl dan disimpan selama 1

malam pada suhu ruang. Selanjutnya disentrihgasi pada 10.000 rpm selama 20
menit. Endapan dilarutkan dalam air bebas nuklease, ditambah dengan 1/10
volume 3M sodium asetat pH 5,2 dan 2,5 volume 95% etano1 dan dibiarkan
selama 1 malam pada -20°C. Selanjutnya disentrihgasi pada 10.000 rpm, 4°C

.

selama 20 menit. Endapan yang dihasilkan dicuci dengan 70?4 etml,
dikeringha pada suhu m g dan dilamtkan dengan 40 pl air.

Tahapan isolasi RNA pada metoda 2, hingga tahapgn presipitasi asam
nukleat setelah ekstraksi dmgan Morofodl-oktanol(24: 1) sama dengan met&
I. Enciapan yang dihasilkan selanjutnya dilmtkan dalam bufer resuspensi (25

m M baric acid; 50 mM Tris-HCl pH 7,6; 1,25 mM EDTA (pH 8,O); 0,l M NaCI)
serta 0,4 vohune 2-Butil Eter (2-BE).Campuran dihomogenkan menggunakan
vorteks dan diinkubasi di es selama 30 menit. Selanjutnya disentrifbgasi pada
10.000 rpm, 4OC selama 20 menit. Selanjutnya supernatan ditambah dengan 1

volume 2-BE untuk mengendapkan asam nukleat. Campuran dihomogenkan
menggunakan vorteks selama 2 menit, diinkubasi di es selama 30 menit dan
dilanjutkan dengm sentrifugasi pa& 10.000 rpm, 4°C selama 20 menit. Endapan
dicuci dengan 70% etanol

untuk xnenghdangkan 2-BE dan selanjutnya

dilarutkan dalam lml air bebas rmklease. Pengendapan RNA dilakukan dengan
8M LiCl (Irowntrasi aWrir WII) dan disimpan pada 4°C selama 1 malam.
Endapan yang diperoleh melalui sentrifbgasi pacia 10.000 rpm, 4°C selama 20
menit dicuci dengan 70% etanol dim dikeringkan pa& suhu ruang.

Met& 3
Sebanyak 0,s g jaringan digerus bersarna 0,3 g PVP dan nitrogen cair
hingga halus dan segera dipindahkirn ke dalam tabung sentrifbs 50 mi yang
berisi 10 ml HB (HwnogenizcztionBuger) yang terdiri dari 100 m M Tris pH 8,5,

'

100 mM LiCl, 5mM EDTA, 100 m M NaCl dan 1%

SDS (Wilkins dan Smart,

1996). Setanjutnya ditapnbah dengan 5 ml fenol yang dipanaskan pa& 60°C dan
dihomogedcan dengan vorteks selarna 2 menit. Ke ddam campuran ditambahkan
5 ml klorofbnn/isoamilalkohol(24:1) dan dihomogenkan dengan vorteks selama

2 menit, kemudian dilanjutkan dengan sentrifbgasi pada 3500 rpm, 4°C selama
10 menit. Bagian atas larutan dipindahkan dan ditambah dengan 10 ml fenol-

klorofonn-isoamilalkohol (25:24:1), dihomogenkan dengan vorteks selama 2
menit dan disentrifbgasi pada 3500 rpm, 4°C selarna 10 menit. Tahapan ini
dilaktdm sebanyak 2 kali. Selanjutnya pada bagian atas larutan ditambahkan

kloroform/isoamilalkohol(24:l)dengan volume yang sama dan disentrifugasi
pada 3500 rpm, 4°C selama 10 menit. Bagian atas larutan ditambah dengan 113
volume 8M LiCl dan disimpan pada 4°C selama semalam. Endapan yang
diperoleh meldui sentrifbgasi pada 10.000 rpm, 4OC selama 20 menit, dicuci
dengm 2M LiCl dingin sebanyak 2 ml. Selanjutnya disentrifbgasi pada 10.000
rpm, 4°C selama 20 menit. E n m a n dikeringkan pada suhu ruang, dilarutkan
dalam 250 pl air bebas mklease dm ditambah dengan 1/10volume 3M sodium
asetat dan 2,s volume etano1 absolut wrta disimpan pada -20°C selama semalam.
Selanjutnya disentrihgasi pada 13.000 rpm , 4°C selama 20 menit. Endapan
dicuci dmgan 70% etanol, dikeringkan pada suhu ruang dan dilarutkan dalam 40
pl air bebas nukIease.

Metode 4.
Jaringan tanaman sebanyak 1,O gram digerus bersama dengan 0,4 gram

PVP clan nitrogen cair, setelah halus segera dipindahkan ke dalarn tabung

sentrifbs 50 ml yang berisi 10 ml bufer HB, dicampur perlahan-lahan dan
dihomogenkm den-

slbakier pada kecepatan rendah (100 rpm) s e b a 10 menit.

Selanjutnya 10 d fenol ditambahkan ke dalam larutan tersebut dm

.

dihomogenkan dengan vorteks selama 2 menit. Ke dalam campuran ditambahkan
5 ml klorofonn-isoamildkohol (24:l) dan dicampur perlahan. Selanjutnya

disentrihgasi pada 7000 rpm, 4°C selama 10 menit. Bagian atas diambil dan
dilakukan kembali ekstraksi dengan 10 ml fen01 dan 5 ml klorofoxmisoamilzlkohol (24:l) serta disentrihgasi dengan kecepatan 7000 rpm, 4°C
selama 10 menit. Selanjutnya pada fase atas ditambahkan 5 ml kloroforml
isoamilalkohoI(24:1) dan disentrifiigasi pada 7000 rpm selama 10 menit. Tahap
ini dilakukan sebanyak 2 Mi. Setelah dilakukan ekstraksi dengan kloroformolctanol dan disentrifbgasi, pada fase atas ditambahkan 113 volume 8M LiCl dan
dibiarkan pada 4°C selarna semalam (pekerjaan dilakukan dalam tabung 1,5 mi).

Endapan yang diperoleh setelah dilakukan sentrifbgasi pada dengan kecepatan
12.000 rpm, 4°C selama 20 menit, dicuci dengan 200 pl larutan 2M LiCl dingin.
Selanjutnya larutan d i i h g a s i pada 12.000 rpm, 4°C selama 20 menit.
Endapan dikeringhm pa& whu ntaag dan kemudian dilarutkan dalam 300 pl air
bebas rmklease dan ditambahkan 1/10 volume 3M sodium asetat dan 2 volume
etanol absolut serta disimpan pada -20°C selama semalam. Selanjutnya lamtan
disentrifbgasi pada 13.000 rpm, 4°C selama 20 menit. Endapan dicuci dengan
I

70% etanol, dieringkan pada suhu ruang dan dilarutkan dalam 40 p1 air bebas
nuklease.

.

IsoIrsi d m A

I&

mRWA dilakukan dengan metoda fhtksinasi pttda kolom oligo-dT

selulosst. Tibp-tabap isolasi mRNA terdii dari preparasi RNA total, isolasi

mRNA ~eleksipertama dan isolasi mRNA seleksi kedua yang dilalrukan menurut
pro&

yang t&pat

pada panduan kit ME;SSAGEMK&X mRNA isolation

system (OBCO BRL).

Sinttsia cDNA
Tahapan sintesis cDNA terdiri dari (1) sintesis utas pertama dan (2) sintesis
utas kedua.
1. S i e s i s utas pertama. Sintesis utas pertama dilakukan dengan memhat

campuran lop1 mRNA (1,375 pg untuk sengon terinfeksi dan 2,s pg untuk
sengon tidak terinfeksi), 2 pl (0,s pglpl) primer adaptor Not1 (5'dAAATTWGGCCGC C(T)15 3') dan 3 pl air bebas nuklease. Campuran
diinkubasi pada 6S°C selama 5 rnenit. Selanjutnya pada campuran tersebut
ditambilhkan 10 pl 5X bufk reaksi utas pertama (50 ,nMTris-HC1 pH 8,3;
75 m M KCI; 3mEul MgCh), 5 p l DTT (0,1M), 2,s pl dNlT (10 mM), 15 p1

air bebas nuklease. Campuran ini diinlnrbasi pada 42°C selama 5 menit.
Sehjutnya ditambahkan 2,s pl M-MLV Reverse Transkriptuse (20U/@)
dan diinkubasi pada 37°C selama 1 jam, kemudian di simpan di es selama
30 menit. Realcsi dihentikan dengan menambahkan 0,25M EDTA sebanyak
1 fil.

2. Reaksi utas kedua. Utas kdua cDNA dibuat dengan mencampurkan 50 pl

reaksi utas pertama, 7,s pl dNTP (I-,

40 pl 1OX bufer utas kedua (25

m M Tfis-fK:l pH 8,3; 100 mM KCl; lOmM 0$304; 5mM MgCI2, 0,15
mM $-NAD), 10 pl DNA polimerase I (lOUlj~l),1,25 pI E coli DNA

ligase (lOUIpl), 1,75 pl RN&

(2U/fl), 289,s pl air bebas nuklease.

Campuran diinkubasi pada 15°C selama semalam. Selanjutnya reaksi
dihentikan dengan menambalkan 0,25 M EDTA pH 7,5 sebanyak 4 pl.
3. Ekstraksi clan presipitasi. Hasil pada reaksi utas kedua diekstraksi dengan

fen01 shnyak l x , kemudian disentrifbgasi pada 4"C, 12.000 rpm selama
20 menit. Kemudian diekstraksi dengan kloroform I isoamilalkohol (24:l)

sebanyak Ix dan disentrifbgasi dengm kecepatan 5000 rpm, 4OC selama 5
menit. Fase bagian atas dipresipitasi dengan 2 volume etano1 absolut dan 0,l
volume 3M sodium asetat pH 5,2 kemudian diinkubasi pada -20°C selama
semalam. Untuk memperoleh endapan cDNA, larutan disentrifbgasi pada
12.000 rpm, 4°C selama 30 menit. Selanjutnya endapan dibilas dengan etanol
70% dan akhirnya diresuspensi dengan 30 pl air bebas nuklease. Analisis

kualitatif cDNA dilakukan melalui elektroforesis pada 1,596 agarose
menggunakan bufer Ix TAE (0,04M Tris-HCI, pH 8,3; 0,0198M asam asetat
pekat; ImM EDTA).

Konstruksi plasmid rekambinan
Plasmid yang digunakan sebagai vektor untuk mengMon cDNA adalah
pSPORTl yang membawa gen penanda resistensi terhadap ampisitin (Ap3 dan
JacOPZ' penyandi $-galaktosidase. Konstruksi plasmid rekombinan terdiri dari,
(1) penyambungan cDNA dengan adaptor EcoR1, (2) pemotongan fbsi cDNAadaptor dengan enzim restriksi Notl, dan (3) penyisipan cDNA yang berujung
EcoRl dan Notl ke dalam pSPORTl yang telah dipotong dengan EcoRl dan
Not 1.
1. Penyambungun cDNA dengan adaptor EcoRlt

Reaksi dilakukan dengan mencampurkan 5 pl cDNA (5Ong/pl),6 pl 5X bufer
ligasi, 1 pl BSA (10 mglml), 1 pl adaptor EcoRI, 2,s U T4 DNA ligase dan.
Air bebas nuklease pada volume akhir reaksi 30 p1. Campuran diinkubasi
pada 15°C selama 4 jam. Inaktivasi enzim dilakukan pada 70°C selama 10
menit dan selsnjutnya disimpan di es.

-

2 . Pemotongan cDNA a&ptot dengan NoJl

Fusi cDNA dan adaptor dipotong dengan Notl yaitu dilakukan dengan cara
mengirhbasi campuran yang terdiri dari 30 pl reaksi ligasi, 4 p1 10X bufer
restriksi NotI, 45 U NotI dan air bebas nuklease pada volume akhir reaksi 40
p1, pada 37°C selama semalarn. Inaktivasi enzim dilakukan pada 65°C
selama 10 menit dan diencerkan d e n p dH20sebanyak 500 p1. Tahap
selanjutnya adalah ekstraksi dengan 1 volume fen01 : kloroform :

isoamilalkohol (25:24:1) dan disentrifigasi pada suhu ruang dengan
kecepatan 5000 rpm selama 3 menit. Presipitasi dilakukan dengan
mensunbahkan 0,1 vdume 3M sodium asetat pH 5,2 dan 2 volume etanol
absolut serta diinkubasi pada -20 "C selama semalam. Selanjutnya campuran
disentrifbgasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 30 menit. Endapan
dicuci dengan 70% etanol absolut, dikeringudarakan

dan diresuspensi

dengan I0 pl air bebas nuklease.
3. Pemotongun vektor pSPORTI (GIBCO, BRL) dengar, enzim Not1 dan

EcoRI
Pemotongan pSPORTl dengan enzim EcoRl dan Nor1 dilakukan bersamaan
karena kedua enzim restriksi yang digunakan membutuhkan suhu inkubasi
d m komposisi bufer restriksi yang sama. Setiap pg vektor dipotong dengan
6 unit enzim restriksi. Peta pSPORTl dan multi situs pengklonan disajikan
pada Garnbar 2.
4. Penyisipun cDNA Re &lam vektor

Reaksi ligasi yang terdii dari 2 p1 vektor ( 0,5 pglpl), 3 p1 cDNA (10 ng/pl),
1 pl 10X bufer T4 DNA ligase, 3U T4 DNA ligase dan air bebas nuklease
pada volume akhir 10 pl diinkubasi pada 16°C selama 16 t 18jam.

SP6 promoter

,\

-

A/

T7 promoter

11 lntergenlc

region

IacOPZ'

Gambar 2. Peta pSPORT 1 dan multi situs pengklonan (MCS : Multiple Cloning
Sites).

Introduksi plasmid rekombinan ke dalam bakteri

Pembuatan sel bakteri kompeten
Sebelum plasmid rekombinan diintroduksi ke dalam sel E. coli DHSa,
bakteri hams dalam keadaan kompeten. Pembuatan sel kompeten dilakukan
dengan menggunakan kalsium klorida (Tomley, 1996). Stok kultur E. coli DHSa
sebanyak 0,l ml dikultur dalam media LB (10 g/l tripton, 5 g/i yeast extract, 4,8
I

g/l NaC1, pH 7,O) selama semalam dalam inkubator shaker pada 37 "C dengan
kecepatan 150 rpm. Selanjutnya 0,5 ml kultur ini dimasukkan dalam 10 ml LB
dan diinkubasi pada kondisi yang sama hingga mencapai OD 0,4-0,6 (f 3 jam).

Sebany* 1 ml kultur ditransfer ke dalam tabung mikro steril dan disentrifugasi

pada 5000 rpm, 4 OC selama 2 rnenit.
Endapan yang diperoleh ditambah dengan lml larutan 0,lM CaClz dingin
dan disuspemikan. Suspensi kemudian disentrifugasi dengan kondisi yang sama

dan se:lanjutnya endapan disuspensikan kembali dalam 250 pl larutan 0,lM
CaC12 dingin. Selanjutnya diinkubasi di e.s selama 10 menit. Bakteri siap untuk
ditransfmnasi .

Transf-i

baRieri

Plasmid rekombinan hasil ligasi pSPORTl dengan cDNA sebanyak 10
dimasukkan dalam tabung mikro yang berisi 250 pl set E. coli DHSa kompeten.
Selanjutnya campran tersebut diinkubasi pada 42°C selama 45 detik ( heat

shock), kemudian disimpan di es selama 1 jam dan setiap 30 menit digoyang.
Heat shock dilakukan kembali 1 kali, selanjutnya dimasukkan ke dalam 2 ml
media LB. Suspensi bakteri dikultur pada inkubator shaker dengan kecepatan
150 rpm pada 37°C selama 1 jam. Selanjutnya disebar pada media seleksi.
Media seieksi yang digunakan adalah media LB padat yang mengandung 1,5%
bakto agar, 100 pglrnl ampisilin, 2 mg IPTG per cawan dan 1 mg X-gal per
cawan.

Anatisis putaka eDNA
Analisis terhadap pustaka cDNA yang diperoleh dilakukan terhadap
beberapa koloni yang berwarna putih yang diarnbil secara acak. Sisipan cDNA
dianalisis dengan PCR dengan menggunakan primer M13 (reverse dan forward)

dan pemotongan plasmid rekombinan dengan kombinasi enzim restriksi EcoRl

d m Not1 serta k o R 1 saja. PCR dilakukan s e b y a k 30 siklus den*

kondisi

sebagai berikut: 95OC, 9 menit (pra- PCR); 95OC, 1 menit (denaturasi); 60°C, 1
menit (pelelcatan); 72OC, 3 menit (pemanjangan); 72OC, 5 menit (pasca PCR).
Selain dengan PCR, pada beberapa kdoni yang lain, sisipan yang ada didalam
vektor dianalisis dengan pemotongan menggunakan enzim restriksi yang sesuai.
Plasmid dipotong dengan enzim restriksi pada perbandingan 1 pg plasmid dan 6
unit enzim restriksi.

HASIL DAN PEMBAHASAPJ

k q a s X fathterhttdap sagan

EWmg

S ~ ~ O yang
P I

temmmg X fed'w k a d m g - u dop;rt h a t i

dqgm mmperhatikan kulit ksyu yang

atma

ymg h2i.t kayunya tidak maam

yrtag

tetapi 8da @a
jetas - f

Kambium mngon y a q tidak terinfiksj hama War tamp&
kabgaft

air ymg tin&

sle@lar

3A).

d e w

serta w m a q a putih. Berbda dagan kambiurn

y u q -hat, k d i u m sengcm y q terserang hma b o b bienvgna

coklrtt dm seratnya ada yang Icehitaman serta kandungan airnya sadikit atau
mengering ( G m k 3B).

sengon yang terserang hama bktw: A. Kvlit kayu
terserarrg hama tetapi ti& mermmpdckm Ismsakan yang jefas,
Qyu = w n ylng *..'@&L*