Pengembangan Metode Isolasi Total RNA, mRNA dan Sintesis cDNA Sengon (Falcataria moluccana L. Nielsen) yang Sehat dan Terserang Hama Boktor (Xystrocera Festiva).

PENGEMBANGAN METODE ISOLASI TOTAL RNA, mRNA
DAN SINTESIS cDNA SENGON (Falcataria moluccana L.
Nielsen) YANG SEHAT DAN TERSERANG HAMA BOKTOR
(Xystrocera festiva)

ADE AYU DEWAYANI

DEPARTEMEN SILVIKULTUR
FAKULTAS KEHUTANAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Pengembangan Metode
Isolasi Total RNA, mRNA dan Sintesis cDNA Sengon (Falcataria moluccana L.
Nielsen) yang Sehat dan Terserang Hama Boktor (Xystrocera Festiva) adalah
benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan
dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari

penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juni 2015
Ade Ayu Dewayani
NIM E44090072

ABSTRAK
ADE AYU DEWAYANI. Pengembangan Metode Isolasi Total RNA, mRNA dan
Sintesis cDNA Sengon (Falcataria moluccana L. Nielsen) yang Sehat dan
Terserang Hama Boktor (Xystrocera Festiva). Dibimbing oleh ULFAH
JUNIARTI SIREGAR dan N. SRI HARTATI.
Sengon (Falcataria moluccana L. Nielsen) memiliki kemampuan alami untuk melindungi
diri dari serangan hama dengan mensintesis makromolekul tertentu seperti tripsin
inhibitor dan alfa amilase inhibitor. Karakterisasi gen-gen penyandi tripsin inhibitor
tersebut perlu dilakukan antara pohon yang resisten dengan yang rentan untuk
mengetahui perbedaannya guna menunjang pemuliaan pohon yang tahan hama. Penelitian
ini bertujuan untuk mengembangkan metode isolasi RNA, mRNA dan sintesis cDNA
yang tepat untuk jenis sengon yang memiliki kandungan enzim inhibitor. Bahan tanaman

yang digunakan adalah jaringan kambium dan kayu dari pohon yang resisten dan rentan
hama. Isolasi RNA total dilakukan dengan Total RNA Mini Kit dari Geneaid, isolasi
mRNA dilakukan dengan PolyATract mRNA Isolation System III with Magnetic Stand
dari Promega, dan sintesis cDNA dilakukan menggunakan cDNA Substraction Kit dari
Clontech dan RevertAid RT Transcription Kit dari Thermo. Hasil RNA total yang terbaik
yaitu sebesar 65,60ng/µl dihasilkan oleh metode modifikasi, selanjutnya hasil isolasi
mRNA yang paling baik dihasilkan oleh metode modifikasi. Hasil sintesis cDNA yang
terbaik yaitu sebesar 2296,17ng/µl dengan menggunakan metode modifikasi.
Kata kunci: sengon, isolasi RNA, sintesis cDNA

ABSTRACT
ADE AYU DEWAYANI. Developing Isolation Methods for Total RNA, mRNA
and cDNA of Sengon (Falcataria moluccana L. Nielsen) which Resistent and
Vulnerable to Stem Borer (Xystrocera Festiva). Supervised by ULFAH
JUNIARTI SIREGAR and N. SRI HARTATI.
Sengon (Falcataria moluccana L. Nielsen) has a natural self-defense mechanism towards
pest infection by synthesizing certain macromolecul such as tripsin inhibitor and alfaamilase inhibitor. Characterization of those genes which produce the inhibitor need to be
done on resistant trees and the vulnerable ones, to define the differences so that can be
used for tree improvement. This research aim to develop an appropriate isolation
methods of total RNA, mRNA and cDNA of plants that have a inhibitor enzymes such as

sengon. The materials used in this research were cambium and timber tissue from
resistant and vulnerable tree. Total RNA was isolated using Total RNA Mini Kit by
Geneaid, mRNA was isolated using PolyATract mRNA Isolation System III with
Magnetic Stand by Promega and cDNA synthesize was conducted using cDNA
Substraction Kit by Clontech and RevertAid RT Transcription Kit by Thermo. The
highest concentration of total RNA isolation were 65,60ng/µl from modification methods,
and the best mRNA yields was resulted by modification methods. The highest
concentration for cDNA synthesize were 2296,17ng/µl from modification methods.
Keywords: sengon, RNA and mRNA isolation, cDNA synthesize

PENGEMBANGAN METODE ISOLASI TOTAL RNA, mRNA
DAN SINTESIS cDNA SENGON (Falcataria moluccana L.
Nielsen) YANG SEHAT DAN TERSERANG HAMA BOKTOR
(Xystrocera festiva)

ADE AYU DEWAYANI

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Kehutanan

pada
Departemen Silvikultur

DEPARTEMEN SILVIKULTUR
FAKULTAS KEHUTANAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yesus Kristus atas segala
karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih
dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2014 ini ialah
pengembangan metode isolasi total RNA, mRNA dan sintesis cDNA, dengan
judul Pengembangan Metode Isolasi Total RNA, mRNA dan Sintesis cDNA
Sengon (Falcataria moluccana L. Nielsen) yang Sehat dan Terserang Hama
Boktor (Xystrocera Festiva).
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr Ir Ulfah Juniarti Siregar, M.Agr
dan Dr. N Sri Hartati selaku dosen pembimbing. Di samping itu, penghargaan
penulis sampaikan kepada keluarga besar Laboratorium Genetika Molekuler dan

Modifikasi Jalur Biosintesis Tanaman – Pusat Penelitian Bioteknologi. Ungkapan
terima kasih juga disampaikan kepada Mama serta kakak-kakak tercinta Sari,
Wulan, dan Astri atas cinta, semangat, dukungan dan kepercayaannya kepada
penulis. Selain itu penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Lody, Arry,
Dewi, Dhita, Arni, Nitha, Artha, Gusti, Dery dan segenap keluarga besar
Silvikultur 46 untuk kesabaran dan dukungannya, juga kepada Pipit, Memet dan
(almh) Rai rekan satu bimbingan atas semangatnya untuk menyelesaikan karya
ilmiah ini.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Juni 2015
Ade Ayu Dewayani

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vi

DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

PENDAHULUAN

1

Latar Belakang

1

Tujuan Penelitian

3

Manfaat Penelitian

3

METODE PENELITIAN
Bahan dan Alat
HASIL DAN PEMBAHASAN
SIMPULAN DAN SARAN

4
4
9
19

Simpulan

19

Saran

19

DAFTAR PUSTAKA

19

LAMPIRAN

21

RIWAYAT HIDUP

24

DAFTAR TABEL
1 Matriks variasi komposisi total RNA yang digunakan pada metode
modifikasi sintesis cDNA.
2 Perbadingan metode kontrol dan metode modifikasi dari tiap prosedur
3 Hasil pengukuran pada Genequant Pro sampel RNA dengan metode
kontrol.
4 Hasil pengukuran pada Genequant Pro sampel RNA dengan metode
modifikasi.

5 Hasil pengukuran pada Spectrophotometer sampel cDNA dengan
metode kontrol.
6 Hasil pengukuran pada Spectrophotometer sampel cDNA dengan
metode modifikasi.

8
8
13
13
17
18

DAFTAR GAMBAR
1 Proses reverse transcription yang dapat menghasilkan sekuens DNA
dari templat mRNA.
2 Bagan alur tahapan kerja dalam proses kloning sekuens cDNA.
3 Hasil elektroforesis RNA dengan Metode Kontrol. (SK= kayu dari
pohon sehat, SC= kambium dari pohon sehat, BK= kayu dari pohon
sakit, BC= kambium dari pohon sakit).
4 Hasil elektroforesis RNA dengan Metode Kontrol dari bagian

kambium pohon sehat (SC) dan bagian kambium pohon sakit (BC).
5 Hasil elektroforesis RNA dengan Metode Modifikasi pada bagian
kambium dari pohon sehat (SC) dengan nomor tube 25-35.
6 Hasil elektroforesis RNA dengan Metode Modifikasi pada bagian
kambium dari pohon sakit (BC) dengan nomor tube 10-15.
7 Hasil elektroforesis mRNA dengan Metode Kontrol dan Metode
Modifikasi.
8 Ilustrasi sintesis cDNA.
9 Hasil elektroforesis cDNA dengan menggunakan kit RevertAid RT
Transcription Kit (Thermo).

2
4

10
11
12
12
15
16

17

DAFTAR LAMPIRAN
1 Protokol Isolasi Total RNA Mini Kit (Geneaid)
2 Protokol PolyATract mRNA Isolation System III with Magnetic Stand
(Promega)
3 Protokol cDNA Substraction Kit (Clontech)

21
22
23

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Sengon (Falcataria moluccana L. Nielsen) adalah salah satu jenis pohon
yang paling banyak dikembangkan dalam program pembangunan hutan tanaman
dan hutan rakyat, khususnya di Pulau Jawa. Sengon adalah jenis cepat tumbuh
(fast growing species), kayunya juga memiliki beragam manfaat antara lain dapat
digunakan sebagai bahan dasar industri pulp dan kertas, konstruksi bangunan,
papan serat, papan partikel, korek api dan kayu bakar. Masalah yang biasa
dihadapi dalam pembangunan hutan sengon adalah serangan hama boktor, yang
dapat menyebabkan kematian pada individu pohon (Atmosuseno 1998).
Pengendalian hama boktor dapat dilakukan secara fisik/mekanik, silvikultur,
hayati, kimiawi dan pengendalian terpadu.
Sengon memiliki kemampuan alami untuk melindungi diri dari serangan
hama dengan mensintesis makromolekul tertentu seperti tripsin inhibitor dan alfa
amilase inhibitor. Tripisin inhibitor adalah senyawa yang mempunyai kemampuan
untuk menghambat aktivitas proteolitik enzim tripsin sehingga mengganggu
proses pencernaan protein pada larva hama. Senyawa alfa amilase inhibitor
menghambat kerja enzim yang mengubah karbohidrat rantai panjang menjadi
molekul yang lebih sederhana untuk dapat diolah menjadi pasokan energi (Siregar
2011). Gen-gen yang berperan menghasilkan senyawa-senyawa inhibitor tersebut
adalah gen TI dan AAI. Kedua gen tersebut telah banyak dipelajari dalam bidang
peningkatan resistensi tanaman lain terhadap hama. Gen-gen tersebut dapat
dipakai sebagai sarana untuk memindahkan sifat resistensi hama tertentu dari
suatu tanaman ke tanaman lain melalui rekayasa genetik (Tampang 2012).
Melalui pendekatan biologi molekuler dapat diterapkan proses pemuliaan
pohon dengan cara melakukan seleksi menggunakan penanda molekuler. Penanda
yang paling tepat digunakan untuk menguji sifat genetik yang dapat diwariskan ke
generasi berikutnya adalah penanda molekuler. Penanda molekuler dengan
menggunakan DNA genom sengon diperoleh dengan menandai utas DNA yang
berkaitan dengan ketahanan terhadap boktor, kemudian utas DNA tersebut
diisolasi serta diklon untuk keperluan lebih lanjut. Namun, tidak semua penanda
molekuler berbasis DNA genom terkait langsung dengan gen yang bertanggung
jawab terhadap ketahanan terhadap boktor. Untuk itu diperlukan pendekatan lain
guna menemukan gen yang bertanggung jawab untuk ketahanan terhadap boktor
yaitu dengan menggunakan RNA (Hilis 1987).
Asam nukleat adalah heteropolimer yang tersusun atas monomer-monomer
yang disebut nukleotida, rantai asam nukleat biasa disebut dengan polinukleotida.
Monomer-monomer yang menyusun asam nukleat terdiri atas tiga komponen
yaitu gula, grup fosfat, dan basa nitrogen. Dua tipe asam nukleat yaitu DNA
(Deoxyribose Nucleic Acid) dan RNA (Ribo Nucleic Acid), dinamakan sesuai
dengan komponen gula pada nukleotidanya. Nukleotida dapat membentuk satu
ikatan dengan menyatukan ujung 5’ fosfodiesternya ke ujung 3’, ujung 5’ dari

2
molekul akan memiliki grup fosfat yang bebas sedangkan ujung 3’ memiliki
gugus hidroksil yang bebas.

Gambar 1. Proses reverse transcription yang dapat menghasilkan sekuens DNA
dari templat mRNA. (diambil dari Module 2 Genetic Engineering
mrothery.co.uk)
Pada molekul dengan untai ganda seperti DNA, ikatan gula-fosfat yang
ditemukan berbentuk anti-paralel, dengan dua untai nukleotida yang terikat pada
arah berlawanan. Basa nitrogen adalah komponen yang sangat penting pada fungsi
penyandian di asam nukleat. Basa nitrogen yang terdapat pada DNA adalah
adenin (A), guanin (G), sitosin (C), dan timin (T). Pada RNA, basa timin
digantikan keberadaannya oleh basa urasil (U) dengan fungsi yang setara.
Senyawa adenin dan guanin tergolong sebagai purin yaitu senyawa yang memiliki
struktur cincin ganda, sedangkan sitosin dan timin/urasil tergolong sebagai
pirimidin yaitu senyawa dengan struktur cincin tunggal (Nicholl 1994).
Penentuan bahan dasar yang tepat dalam pekerjaan yang berkaitan dengan
molekuler sangatlah penting. Sebagai contoh, penggunaan DNA genom dalam
ukuran yang besar untuk mengisolasi suatu gen yang spesifik adalah langkah yang
kurang tepat. Oleh karena itu, penggunaan mRNA lebih disarankan untuk
mengisolasi suatu gen yang spesifik. RNA berada dalam bentuk yang sangat
mudah terdegradasi, maka perlu teknik penanganan khusus supaya RNA yang
dihasilkan memiliki kualitas tinggi, sehingga mRNA yang digunakan sebagai
bahan dasar suatu klon dari gen spesifik juga berkualitas.
Karakterisasi gen-gen penyandi TI atau AAI dapat dilakukan dengan
membandingkan mRNA dari tanaman yang resisten dengan tanaman yang rentan
terhadap hama, untuk selanjutnya dibuat DNA komplementer yang tahan terhadap
serangan hama boktor (Hartati 2002). DNA komplementer (cDNA) merupakan
DNA yang disintesis dari templat mRNA dalam reaksi yang dikatalis oleh enzim
reverse transcriptase seperti ilustrasi yang digambarkan pada Gambar 1. Ekspresi
sebuah gen dilakukan melalui produksi mRNA gen tersebut yang kemudian
diterjemahkan menjadi protein tertentu, dengan demikian maka cDNA merupakan
salinan ekspresi dari sebuah gen.
Struktur RNA pada dasarnya serupa dengan DNA, perbedaan paling utama
adalah keberadaan gula dalam bentuk ribosa dan basa urasil sebagai pengganti
basa timin. RNA pada umumnya berbentuk untai tunggal, walaupun rantai pendek

3
untai ganda RNA dapat ditemukan pada daerah komplementer. RNA terdiri dari
dua jenis yaitu RNA yang berhubungan dengan ekspresi gen dan RNA yang tidak
berhubungan dengan ekspresi gen (Hartati 2002). Pada RNA yang berhubungan
dengan ekspresi gen terdapat tiga tipe yaitu messenger RNA (mRNA), ribosomal
RNA (rRNA), dan transfer RNA (tRNA). Tipe yang paling melimpah pada total
sel RNA adalah rRNA yaitu sebanyak 85%, hal tersebut terkait dengan fungsi
ribosom yang berperan penting pada proses translasi. Kelimpahan tRNA pada
total RNA yaitu sebanyak 10% dan berfungsi sebagai penyeleksi asam amino
yang tepat untuk disisipkan ke dalam protein yang sedang disintesis. mRNA
diberikan nama sesuai dengan tugasnya yaitu untuk membawa informasi genetik
dari DNA ke mesin translasi (rRNA) dan biasanya hanya terdapat sekitar 5% dari
jumlah keseluruhan total RNA (Nicholl 1994). Pada umumnya mRNA sangat
tidak stabil terutama pada suhu tinggi dan senyawa alkali, mRNA prokariot
memiliki masa hidup hanya sekitar 3 menit, sebaliknya mRNA eukariot
cenderung lebih stabil dengan masa hidup >10 jam namun ada pula yang hanya
memiliki masa hidup sekitar 30 menit atau selama protein yang disandikan masih
diproduksi (Albert et al 1989).
RNA juga mudah terdegradasi oleh RNase yang adalah sebuah enzim yang
dapat memutus ikatan 3’-O-P pada RNA. Oleh karena itu pada saat mengisolasi
RNA, aktivitas RNase harus dihambat dengan senyawa 8-hydroxyquinolin atau
dengan cara memanaskan peralatan yang digunakan selama proses isolasi di
autoklaf suhu
C (Hartati 2002). Ketidakstabilan molekul RNA mengharuskan
adanya strategi lain dalam penelitian molekuler yaitu pembuatan cDNA dari RNA
agar lebih mudah ditangani dalam proses selanjutnya seperti reverse transcription
polymerase chain reaction (RT-PCR), pustaka cDNA, dan ekspresi gen
microarray (Tattersal 2005).

Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan metode isolasi total RNA,
mRNA, serta sintesis cDNA sengon dari pohon yang sehat maupun yang terserang
hama boktor yang dapat digunakan untuk penelitian identifikasi gen penyandi
ketahanan terhadap hama boktor.

Manfaat Penelitian
Hasil dari penelitian ini diharapkan menghasilkan metode yang paling tepat
untuk melakukan isolasi total RNA, mRNA serta sintesis cDNA yang dapat
dimanfaatkan untuk menunjang program pemuliaan sengon dengan teknik biologi
molekuler.

4

METODE PENELITIAN
Tempat dan Waktu
Penelitian dilakukan di Laboratorium Genetika Molekuler dan Modifikasi
Jalur Biosintesis Tanaman – Pusat Penelitian Bioteknologi, Lembaga Ilmu
Pengetahuan Indonesia (LIPI), Cibinong, Kabupaten Bogor. Penelitian dilakukan
mulai bulan Maret-September 2014 dan November 2014-Januari 2015.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan untuk percobaan adalah jaringan kayu dan kambium
dari pohon sengon yang sehat dan terserang hama boktor. Pohon sengon yang
digunakan berasal dari kebun Kebun Plasma Nutfah – Pusat Bioteknologi LIPI
dengan tegakan yang sama untuk setiap percobaan. Selain itu digunakan juga
bahan-bahan untuk isolasi RNA (Total RNA Mini Kit dari Geneaid®), isolasi
mRNA (PolyATract mRNA Isolation System III with Magnetic Stand dari
Promega®), elektroforesis, pengecekan konsentrasi, dan sintesis 1st cDNA (cDNA
Substraction Kit dari Clontech® dan RevertAid RT Transcription Kit dari
Thermo®). Alat yang digunakan antara lain microtube, alu, mortar, mikro pipet
Eppendorf Research Plus, centrifudge Eppendorf 5430R, timbangan analitik,
vorteks, thermal cycler Techne TC-5000, Wise Clean Waterbath, perangkat
elektroforesis, UV transilluminator.
Prosedur Pelaksanaan
Penelitian terdiri dari isolasi total RNA dari jaringan kambium pohon
sengon yang sehat dan yang terinfeksi penyakit boktor, isolasi mRNA dan sintesis
cDNA. Gambar 2 menunjukkan bagan alur tahapan-tahapan percobaan untuk
pembuatan sekuens cDNA.

Pengambilan
sampel

Isolasi Total
RNA

Isolasi
mRNA

Kloning

Amplifikasi

Sintesis
cDNA

Gambar 2. Bagan alur tahapan kerja dalam proses kloning sekuens cDNA.

5
Pengambilan Sampel
Sampel yang diambil berupa jaringan kambium segar yang segera diambil
atau dipisahkan dari potongan kayu sengon dari pohon yang sehat dan pohon yang
terserang hama boktor. Cara penanganan sampel kayu sebelum pemisahan
kambium adalah dengan cara dimasukkan ke dalam plastik dan disimpan di
coolbox berisi es. Sebelum sampel jaringan diambil, dilakukan dahulu
pengamatan mengenai pohon yang benar-benar sehat dan pohon yang benar-benar
mengalami serangan hama. Setelah diambil dari pohon, dalam jangka waktu
antara 30-60 menit jaringan yang diambil harus segera digunakan dan diproses
untuk menghindari degradasi RNA dalam sel sehingga diperoleh total RNA
dengan kualitas yang tinggi.
Isolasi Total RNA
Metode Kontrol (Sesuai Protokol Total RNA Mini Kit dari Geneaid)
Isolasi total RNA dilakukan dengan menggunakan Total RNA Mini Kit
dari Geneaid. Persiapan yang dilakukan adalah membersihkan area meja yang
akan digunakan dengan menggunakan semprotan alkohol 70%. Alat penggerus
(mortar dan alu) yang akan digunakan harus sudah disterilisasi. Alat penggerus
disemprotkan dengan RNase Inhibitor kemudian diamkan sampai benar-benar
kering dengan cara dianginkan, hindari melakukan pengusapan dengan tisu.
Tujuannya adalah untuk menghilangkan kontaminasi RNA yang kemungkinan
menempel pada alat yang digunakan.
Lisis
Microtube berukuran 2ml diisi dengan 500µl RB Buffer ditambah 5µl ßmerkaptoetanol. Bahan sampel kambium sebanyak 50-100mg digerus dengan
menggunakan nitrogen cair. Penggerusan dilakukan hingga sampel berbentuk
bubuk dengan berupa butiran halus. Selanjutnya bubuk sampel dimasukkan ke
dalam tube yang sudah berisi campuran RB buffer dan ß-merkaptoetanol. Tube
tersebut kemudian diinkubasi selama 10 menit di dalam es. Setelah inkubasi
selesai, larutan sampel divorteks dengan tujuan untuk menghomogenkan larutan,
kemudian larutan dipindahkan ke tube baru yang telah dipasangi Filter Column.
Larutan disentrifuse selama 10 menit dengan kecepatan 5000 rpm pada suhu 4°C.
Pengikatan RNA
Setelah sentrifugasi selesai, Filter Column dibuang dan ditambahkan 250
µl ethanol absolut ke dalam larutan yang telah disentrifuse, kemudian seluruhnya
dipindahkan ke dalam RB Column. Larutan disentrifuse kembali selama 2 menit
dengan kecepatan 12000 rpm pada suhu 4°C. Larutan sisa yang berada di bawah
microtube dibuang.
Pencucian
400 µl W1 Buffer ditambahkan tepat ke tengah RB column. Larutan
kemudian disentrifuse lagi selama 2 menit dengan kecepatan 12000 rpm pada
suhu 4°C. Larutan yang berada di bawah microtube dibuang, kemudian
ditambahkan 500 µl Wash Buffer tepat ke tengah RB column. Larutan disentrifuse
selama 3 menit dengan kecepatan 12000 rpm pada suhu 4°C.
Elusi
RB column dipindahkan ke microtube baru, kemudian diteteskan 50 µl
RNase free water ke tengah column. Sentrifuse selama 1-2 menit dengan

6
kecepatan 12000 rpm pada suhu 4°C. Pindahkan larutan total RNA ke tube yang
baru untuk disimpan maupun dilakukan pengecekan elektroforesis.
Metode Modifikasi
Isolasi total RNA dilakukan dengan menggunakan Total RNA Mini Kit
dari Geneaid, secara umum langkah yang dilakukan sama dengan metode kontrol.
Beberapa perubahan yang dilakukan adalah waktu inkubasi bubuk sampel di
dalam campuran 500 µl RB Buffer ditambah 5 µl ß-merkaptoetanol dilakukan
lebih lama yaitu 30 menit di dalam es. Hal tersebut dilakukan dengan tujuan
supaya proses lisis dapat berlangsung dengan lebih sempurna sehingga hasil akhir
total RNA yang diperoleh akan lebih banyak. Modifikasi yang berikutnya adalah
jangka waktu inkubasi RB collumn dengan RNase Free Water dilakukan selama
10-15 menit di dalam es. Hal tersebut dilakukan dengan tujuan supaya RNA yang
tertinggal di RB collumn dapat seluruhnya larut dalam RNase Free Water.
Perbandingan antara metode kontrol dan metode modifikasi pada isolasi total
RNA dapat dilihat di Tabel 1.
Isolasi mRNA
Setelah RNA total diperoleh, selanjutnya dilakukan isolasi mRNA atau poly
A+ RNA dengan menggunakan kit PolyATract mRNA Isolation System III with
Magnetic Stand dari Promega.
Metode Kontrol (Sesuai dengan Protokol PolyATract mRNA Isolation System III
with Magnetic Stand dari Promega)
Annealing
Isolasi diawali dengan proses anealing, campuran kurang lebih 200µl total
RNA dengan RNase freewater dengan total volume 500µl dipanaskan
menggunakan water bath dengan suhu 65ºC selama 10 menit. Sebanyak 3µl
Biotinylated-oligo (dT) Probe dan 13µl 20X Saline Sodium Citrate (SSC)
ditambahkan ke dalam larutan total RNA. Larutan diinkubasi pada suhu ruang
sampai dingin.
Pencucian Partikel Streptavidin Paramagnetic Particles (SA-PMP)
SA-PMP partikel yang terdapat dalam kit disuspesikan sampai tercampur
rata, kemudian tangkap partikel dengan Magnetic Stand dan buang supernatannya.
SA-PMP partikel dicuci dengan 300µl 0,5X SSC sebanyak 3 kali, pada setiap
pencucian buang supernatan secara hati-hati. Setelah pencucian terakhir, SA-PMP
partikel disuspensikan dalam 100µl 0,5X SSC.
Pengikatan mRNA
Larutan dari proses annealing ditambahkan ke dalam suspensi SA-PMP
partikel dalam 0,5X SSC. Campuran larutan annealing dengan 0,5X SSC
diinkubasikan selama 10 menit, dan tube dikocok-kocok setiap 1-2 menit dengan
tujuan untuk menghomogenkan larutan. Partikel SA-PMP yang sudah dicuci
kemudian ditangkap dengan magnetic stand, dan dibuang supernatannya.
Pencucian dilakukan sebanyak empat kali dengan 300µl 0,1X SSC, setelah tahap
pencucian terakhir usahakan untuk membuang sebanyak mungkin supernatan
yang tersisa tanpa membawa partikel SA-PMP.

7
Elusi
SA-PMP partikel yang sudah mengandung mRNA dicampurkan dengan
100µl RNase free water, kemudian SA-PMP partikel ditangkap dengan Magnetic
Stand, RNase free water yang sudah mengandung partikel mRNA diambil dan
pindahkan ke microtube baru. SA-PMP partikel dapat dielusi ulang dengan
menggunakan 150µl RNase free water kemudian ulangi tahap pengambilan
RNase free water yang sudah mengandung mRNA dari partikel SA-PMP.
Metode Modifikasi
Isolasi dilakukan dengan menggunakan kit PolyATract mRNA Isolation
System III with Magnetic Stand dari Promega. Secara umum metode yang
dilakukan menyerupai metode kontrol, hanya dilakukan beberapa perubahan di
bagian tertentu. Perubahan pertama dilakukan terhadap proses anealing, campuran
total RNA dengan RNase Free Water dengan total volume 500µl tidak dipanaskan,
namun langsung ditambahkan 3 µl Biotinylated-oligo(dT) probe dan 13 µl 20X
SSC dan diinkubasi di dalam es. Langkah berikutnya sama dengan langkah
pencucian pada Metode Kontrol. Perubahan berikutnya dilakukan terhadap proses
elusi, partikel SA-PMP yang sudah mengandung mRNA diinkubasi selama 2-3
menit dengan 50 µl RNase Free Water baru setelah itu ditangkap menggunakan
magnetic stand dan supernatannya dimasukkan ke dalam microtube baru yang
steril. Proses elusi ulang dilakukan dengan 100 µl RNase Free Water diinkubasi
selama 2-3 menit di dalam es, kemudian partikel SA-PMP ditangkap
menggunakan magnetic stand dan supernatannya dimasukkan ke dalam microtube
baru yang steril. Perbandingan antara metode kontrol dan metode modifikasi
isolasi mRNA dapat dilihat di Tabel 2.
Sintesis cDNA dari mRNA
Setelah mRNA diperoleh dari proses isolasi, dalam waktu kurang dari
60menit untuk segera diakukan proses selanjutnya dari tahapan kloning yaitu
sintesis cDNA utas pertama. Sintesis cDNA akan dibedakan menjadi dua metode
yaitu metode kontrol dengan menggunakan pereaksi SSH (Suppression
Subtractive Hybridization) Kit dan metode modifikasi dengan menggunakan
pereaksi RevertAid RT Reverse Transcription Kit dari Thermo.
Metode Kontrol (Sesuai dengan cDNA Substraction Kit dari Clontech)
Sintesis diawali dengan inkubasi campuran 2-3 µl mRNA dan 1 µl cDNA sintesis
primer pada thermal cycler selama 2 menit dengan suhu 700C. Setelah itu
campuran didinginkan dan ditambahkan reagen 5X First-Strand Buffer (2 µl);
Deuxynucleotide (dNTP) mix 10 mM (1 µl); H20 steril (1 µl); DTT 20 mM (1 µl);
Reverse Transcriptase (1 µl). Campuran mRNA dan reagen dihomogenkan
dengan menggunakan vorteks kemudian diinkubasi kembali pada suhu 420C
selama 90 menit pada thermal cycler. Setelah proses inkubasi selesai, larutan
disimpan di es dengan tujuan untuk menghentikan sintesis cDNA utas pertama.
Metode Modifikasi (RevertAid RT Reverse Transcription Kit dari Thermo)
Sintesis diawali dengan mencampurkan 7 µl total RNA dengan oligo(DT) primer
(1 µl); 5X Reaction Buffer (4 µl); riboLock (1 µl); 10 mM dNTP mix (2 µl),
Revert Aid (1 µl); dan Diethylpyrocarbonate (DEPC) water (4 µl) secara

8
berurutan. Larutan tersebut diinkubasikan pada thermal cycler dengan suhu 420C
selama 60 menit dan suhu 700C selama 5 menit. Kemudian larutan disimpan di es
dengan tujuan menghentikan sintesis cDNA utas pertama. Metode modifikasi
dengan menggunakan kit RevertAid RT Transcription dari Thermo dilakukan
dalam beberapa variasi dalam hal jumlah total RNA yang digunakan pada satu
reaksi. Hal tersebut dilakukan untuk mendapatkan hasil sintesis utas pertama yang
maksimal. Tabel 1 menyajikan perbedaan komposisi pereaksi yang digunakan
sebagai variasi dalam metode modifikasi sintesis cDNA.
Tabel 1. Matriks variasi komposisi pereaksi yang digunakan pada metode
modifikasi sintesis cDNA.
Jumlah (µl)

Nama Bahan

C1

C2

S1

S2

S3

S4

S5

B1

B2

B3

B4

B5

Control/Total RNA

2

4

7

2

10

1

5

7

2

10

1

5

Oligo (dT) primer

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

5X Reaction Buffer

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4

riboLock Inhibitor

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

10 mM DNTP Mix

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

Revert Aid

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

DEPC Treated Water

9

7

4

9

1

10

6

4

9

1

10

6

20

20

20

20

20

20

20

20

20

20

20

20

∑

9
Tabel 2. Perbandingan metode kontrol dan metode modifikasi dari tiap prosedur

Isolasi Total RNA

Proses inkubasi pada
tahapan lisis dilakukan
selama 10 menit.

Metode
Kontrol

Pada proses elusi RB
collumn yang sudah
ditetesi dengan RNAse
Free Water tidak
diinkubasi terlebih
dahulu.

Proses inkubasi pada
tahapan lisis dilakukan
selama 30 menit.

Metode
Modifikasi

Pada proses elusi RB
collumn yang sudah
ditetesi dengan RNAse
Free Water diinkubasi
terlebih dahulu selama
10-15 menit di es.

Isolasi mRNA
Total RNA yang akan
digunakan dipanaskan
terlebih dulu pada
suhu 65ºC selama 10
menit.
Elusi larutan RNAse
Free Water dan
partikel SA-PMP yang
sudah mengikat
mRNA tidak
diinkubasi terlebih
dahulu. Elusi
dilakukan sebanyak 2
kali dengan RNAse
Free Water sebanyak
masing-masing 100µl
dan 150µl.
Total RNA yang akan
digunakan pada proses
anealing tidak
dipanaskan terlebih
dahulu pada suhu
65ºC.
Elusi larutan RNAse
Free Water dan
partikel SA-PMP yang
sudah mengikat
mRNA diinkubasi
selama 2-3 menit pada
suhu 4ºC. Elusi
dilakukan 2 kali
dengan RNAse Free
Water sebanyak
masing-masing 50µl
dan 100µl.

Sintesis cDNA
Bahan awal yang
digunakan
adalah mRNA
dari hasil isolasi
mRNA.

Menggunakan
kit cDNA
Substraction Kit
dari Clontech.

Bahan awal yang
digunakan
adalah total RNA
dari hasil isolasi
total RNA.

Menggunakan
kit RevertAid RT
Transcription Kit
dari Thermo.

10
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi RNA
Pengukuran kuantitas dan kualitas RNA dapat dilakukan melalui beberapa
metode seperti: penampakan pita RNA pada gel agarose, penyerapan cahaya pada
260/280 nm, penyerapan cahaya pada 260/230 nm, kemampuan untuk
menghasilkan produk RT-PCR, dan menggunakan bioanalyzer. Penelitian ini
menggunakan dua metode untuk mengukur kuantitas dan kualitas RNA yang
dihasilkan yaitu metode visual dan metode spektofotometri. RNA dengan kualitas
tinggi akan menghasilkan dua atau lebih pita RNA yang jelas terlihat, tergantung
berapa lama waktu yang digunakan pada proses elektroforesis sehingga dapat
memisahkan rRNA 16S dari 23S dan18S dari 28S (Tattersal 2005).
M

SK

SC

BK 1

BK 2

BC

Gambar 3. Hasil elektroforesis RNA dengan Metode Kontrol. (SK= kayu dari
pohon sehat, SC= kambium dari pohon sehat, BK= kayu dari pohon
sakit, BC= kambium dari pohon sakit).
Sampel yang digunakan pada isolasi total RNA sengon adalah jaringan
kambium pohon sengon yang sehat dan yang terkena serangan hama boktor. Hal
tersebut dilakukan untuk memperoleh untai RNA yang secara spesifik
menunjukkan ekspresi gen terhadap serangan hama yang terjadi di bagian batang
pohon. Pada awalnya isolasi dilakukan dengan menggunakan sampel jaringan
kayu dan kambium namun hasil elektroforesis menunjukkan bahwa pita RNA
yang berasal dari jaringan kambium lebih jelas dibandingkan pita RNA dari
jaringan kayu. Hal tersebut disebabkan karena jaringan kayu memiliki struktur
yang cenderung lebih sulit untuk dihancurkan dan pada umumnya sel-sel pada
jaringan kayu sudah mati sehingga kandungan RNA dan DNA hanya terdapat
dalam jumlah yang sangat sedikit. Hasil penyaringan melalui filter kolom pada
jaringan kayu juga menghasilkan lebih banyak ampas yang berlendir, hal tersebut
mengindikasikan bahwa pada jaringan kayu lebih banyak mengandung
polisakarida dan zat metabolit sekunder.
Gambar 3 menunjukkan hasil isolasi RNA dengan menggunakan prosedur
Metode Kontrol yang digunakan terhadap sampel jaringan kayu dan kambium.
Sampel yang digunakan dibedakan menjadi 4 jenis yaitu jaringan kayu yang
berasal dari pohon yang sehat (SK), jaringan kambium yang berasal dari pohon

12
polimerase; menghambat seleksi poly(A)+-RNA (mRNA); dan juga mengganggu
migrasi RNA saat dilakukan running elektroforesis. Selain polisakarida, senyawa
bawaan dari tanaman berkayu yang dihasilkan selama proses isolasi RNA adalah
senyawa fenolik dan metabolit sekunder yang dapat mempengaruhi proses isolasi
RNA dan percobaan lanjutan yang menggunakan total RNA. Terdapat beberapa
cara untuk mengatasi hal tersebut, salah satunya adalah menggunakan senyawa
pereduksi seperti ß-merkaptoetanol dan dithithreitol (DTT) yang dapat mencegah
oksidasi senyawa fenolik sehingga menghambat aktifitas radikal bebas yang
dihasilkan oleh oksidasi senyawa fenol terhadap asam nukleat (Wilkins dan Smart,
1996).
M

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

Gambar 5. Hasil elektroforesis RNA dengan Metode Modifikasi pada bagian
kambium dari pohon sehat (SC) dengan nomor tube 25-35.
M

1

5

4

3

2

10

11

12

13

14

15

Gambar 6. Hasil elektroforesis RNA dengan Metode Modifikasi pada bagian
kambium dari pohon sakit (BC) dengan nomor tube 10-15.
Metode modifikasi memaksimalkan fungsi ß-merkaptoetanol sebagai
pereduksi senyawa fenolik terhadap asam nukleat sehingga hasil akhir RNA yang
dihasilkan akan lebih berkualitas. Hal tersebut dapat dilihat pada Gambar 5 dan
Gambar 6, pita RNA yang dihasilkan sudah lebih tebal (tidak smear) dan terbagi
menjadi dua pita yang berbeda. Pada Gambar 6 sampel yang digunakan adalah BC
10-15 kemudian pada Gambar 5 sampel yang diisolasi adalah SC 25-35.
Penomoran pada nama sampel mengindikasikan nomor tube yang digunakan pada

13
saat proses isolasi berlangsung, namun jaringan yang digunakan berasal dari
pohon yang sama. Berdasarkan pengendapan RNA pada agarose, sampel yang
menghasilkan pita RNA paling bagus adalah sampel jaringan kambium dari pohon
sengon sehat yang menggunakan metode modifikasi. Walaupun diisolasi secara
bersamaan, namun hasil pita di agarose tidak secara keseluruhan sama.
Kualitas RNA juga dapat diukur menggunakan penyerapan cahaya dengan
menggunakan alat spektrofotometer, data yang dihasilkan adalah penyerapan
cahaya pada panjang gelombang 230, 260, 280, 320 dan konsentrasi RNA. Rasio
A260/280 mengindikasikan tingkat kontaminasi protein berdasarkan teori yang
menyatakan bahwa asam nukleat menunjukkan penyerapan optimum pada 260 nm,
sedangkan protein menunjukkan penyerapan maksismum pada 280 nm (Winfrey
et al. 1997). Oleh karena itu semakin besar nilai rasio A260/280 maka kemurnian
RNA yang dihasilkan semakin tinggi. Rasio A260/230 menunjukkan tingkat
kontaminasi dari polisakarida dan polifenol. Nilai rasio 2.5 adalah nilai yang
menunjukkan tidak adanya kontaminasi (Loulakakis et al. 1996, Schultz et al.
1994). Pengukuran kualitas RNA dengan parameter rasio A260/280, A260/230
serta konsentrasi RNA dilakukan dengan menggunakan Genequant Pro dengan
pelarut berupa RNase free water, hasil dari pengukuran tersebut dapat ditemukan
pada Tabel 3 dan 4.
Tabel 3. Hasil pengukuran pada Genequant Pro sampel RNA dengan metode
kontrol.
Nama Sampel

A260/280

SC 7
SC 8
SC 9
SC 10
Rata-rata
BC 5

A260/230

0,1
2
2,13
2,23
1,62
3,13

C (ng/µl)

2,28
0,09
0,21
0,14
0,68
0,63

29,2
16
46
31,2
30,6
10

Tabel 4. Hasil pengukuran pada Genequant Pro sampel RNA dengan metode
modifikasi.
Nama Sampel A260/280 A260/230
SC 25
SC 26
SC 27
SC 28
SC 29
SC 30
SC 31

2,01
2,23
3,29
2,07
2,09
2,1
2,1

0,54
0,48
0,06
0,2
0,44
0,4
0,88

C (ng/µl)
93,2
27,6
50
37,2
49,2
50,4
64,8

14
Nama Sampel
SC 32
SC 33
SC 34
SC 35
Rata-rata
BC 10
BC 11
BC 12
BC 13
BC 14
BC 15
Rata-rata

A260/280
2,05
2,11
2,04
2
2,19
2,28
2,67
2,36
0,03
3,78
2,79
2,32

A260/230
0,47
0,19
0,52
0,92
0,46
0,22
0,06
0,05
0,03
0,36
0,36
0,18

C
(ng/µl)
79,6
44,8
69,2
155,6
65,6
22,8
16
23,6
9,2
13,6
15,6
16,8

Konsentrasi RNA pada sampel dari jaringan kambium pohon yang sehat
memiliki rata-rata konsentrasi sebesar 30,60 ng/µl pada metode kontrol dan 65,60
ng/µl pada metode modifikasi. Rata-rata tingkat kemurnian (A260/280) yang
paling tinggi terdapat pada sampel jaringan kambium pohon sakit dengan metode
modifikasi yaitu sebesar 2,36. Sedangkan untuk tingkat kontaminasi (A260/230)
yang paling bebas dari kontaminasi polisakarida adalah sampel jaringan kambium
pohon sehat dengan metode kontrol yaitu senilai 0,92.
Isolasi mRNA
Melakukan kloning dengan materi organisme eukariot akan dihadapkan
pada pemilihan bahan awalan yang akan digunakan yaitu menggunakan DNA
genom atau mRNA. Pada dasarnya DNA genom mewakili keseluruhan genom
yang terdapat pada organisme tersebut, namun pada genom terdapat kemungkinan
adanya DNA non-koding seperti intron, kontrol region, dan sekuens yang
berulang. Keberadaan non-koding DNA dapat menjadi masalah, terutama bila
genom yang digunakan sangat besar dengan tujuan mengisolasi gen yang spesifik.
mRNA memiliki dua kelebihan dibanding DNA genom sebagai materi sumber
untuk mengklon gen spesifik. Pertama, mRNA menggambarkan informasi genetik
yang diekspresikan oleh tipe sel tertentu yang sudah dipilih, hal tersebut sangat
berguna sebagai mekanisme seleksi awal sehingga tidak keseluruhan DNA genom
tergambarkan pada populasi mRNA. Apabila gen yang diamati terekspresi dengan
kuat hal tersebut dapat terlihat dari kelimpahan mRNA dan dapat membuat isolasi
klon menjadi lebih mudah. Hal kedua yang menguntungkan dari mRNA adalah
keberadaan sekuens pengkode gen, dengan tidak adanya intron yang dihilangkan
selama pemrosesan RNA, sehingga proses produksi protein rekombinan menjadi
lebih spesifik dengan keberadaan klon mRNA (Nicholl 1994).

15
M

14-1 14-2

M

a

35-1 35-2

35-A

b

Gambar 7. Hasil elektroforesis mRNA dengan Metode Kontrol (a) dan Metode
Modifikasi (b).
Gambar 7a menunjukkan hasil isolasi mRNA dengan kit PolyATract
mRNA Isolation System III with Magnetic Stand dari Promega dengan metode
kontrol. Terdapat 3 sumur yang digunakan, terdiri dari (secara berurutan) Gene
Ruler 1kb (M), elusi 100 µl RNase free water (14-1), dan elusi 150 µl RNase free
water (14-2). Pada foto hasil elektroforesis tidak nampak pita yang
merepresentasikan keberadaan mRNA. Selanjutnya pada gambar 7b menunjukkan
hasil isolasi mRNA dengan metode modifikasi. Terdapat 4 sumur yang digunakan,
terdiri dari (secara berurutan) Gene Ruler 1kb (M), elusi 50 µl RNase free water
(35-1), elusi 100 µl RNase free water (35-2), dan supernatan dari proses annealing
(35-A). Terlihat bahwa mRNA dari elusi pertama maupun elusi kedua terlihat
sangat kabur (smear), namun larutan annealing menunjukkan seutas pita yang
terlihat menyerupai pita RNA total yang mengindikasikan bahwa masih terdapat
RNA total yang berkualitas pada larutan annealing.
Salah satu hal kesulitan utama dalam proses isolasi mRNA adalah
kelimpahan mRNA yang hanya berkisar 5% dari total RNA sehingga
membutuhkan teknik dan tingkat akurasi yang sangat tinggi selama penanganan
bahan mentah maupun alat-alat pendukung proses isolasi. Selama proses isolasi
mRNA seluruh alat yang digunakan harus dipastikan steril dan terbebas dari
kontaminasi RNase yang dapat mendegradasi mRNA secara cepat. Terdapat
perbedaan yang sangat nyata dari kenampakan pita mRNA dengan metode kontrol
dan modifikasi pada agarose, hal tersebut terjadi karena pada metode kontrol
proses annealing dilakukan pada suhu 65°C sedangkan pada metode modifikasi
proses annealing dilakukan pada suhu ruang. Hasil isolasi mRNA yang kurang
begitu nampak pada agarose juga menunjukkan bahwa konsentrasi dari RNA total
harus ditingkatkan supaya mendapatkan hasil pita mRNA yang jelas. Pada hasil
isolasi mRNA tidak dilakukan pengecekan dengan spektofotometer dikarenakan
selama proses penelitian hasil mRNA langsung digunakan untuk tahapan sintesis
cDNA yang harus dilakukan secepatnya mengingat masa hidup mRNA yang
sangat singkat.

16
Sintesis cDNA

Gambar 8. Ilustrasi sintesis cDNA. (Sumber: monografias.com)
Pada proses kloning gen dengan menggunakan DNA komplementer,
mRNA harus dikonversi terlebih dahulu sebelum dimasukkan ke dalam vektor
(Gambar 8). Hal tersebut dapat terjadi oleh keberadaan enzim reverse
transkriptase yang dapat menghasilkan cDNA (DNA komplementer). Walaupun
rantai poly(A) dari mRNA sering digunakan sebagai dasar dalam sintesis cDNA,
terkadang ada beberapa kasus yang membuat hal tersebut tidak dapat terjadi. Halhal tersebut adalah ketika mRNA tidak dalam bentuk polyadenylated maka primer
oligonukleotid random dapat digunakan sebagai dasar pembuatan cDNA, atau
ketika seluruh/sebagian sekuen asam amino dari protein yang dibutuhkan telah
diketahui maka primer oligonukleotid yang spesifik dapat digunakan sebagai
dasar pembuatan cDNA (Nicholl 1994).
Sintesis cDNA yang menggunakan metode kontrol dengan kit SSH, tidak
menghasilkan utas cDNA sama sekali karena bahan dasar mRNA yang digunakan
memiliki konsentrasi yang rendah sehingga hasil akhir cDNAnya tidak cukup
untuk dapat ditangkap oleh elektroforesis dengan agarose. Selanjutnya sintesis
cDNA dilakukan dengan menggunakan kit dari Thermo.

17
M C1 C2 S1 S2 B1 B2

S3 S4

S5

B3 B4 B5

a

b

Gambar 9. Hasil elektroforesis cDNA dengan menggunakan kit RevertAid RT
Transcription Kit dari Thermo.
Pada metode modifikasi, telah dilakukan beberapa variasi dengan tujuan
untuk mendapatkan hasil sintesis cDNA yang maksimal. Variasi yang dilakukan
adalah merubah kuantitas total RNA yang digunakan pada setiap sintesis, seperti
yang telah dicantumkan pada tabel 1. Berdasarkan kenampakan pita cDNA pada
agarose, diketahui bahwa sampel yang menggunakan total RNA sebanyak 7µl
menghasilkan gambaran fisik pita cDNA yang lebih jelas dibandingkan yang
lainnya. Pada Gambar 9a terlihat bahwa reaksi dengan kontrol RNA (C1 dan C2)
menghasilkan pita yang sangat jelas, hal tersebut mengindikasikan bahwa reaksi
berlangsung dengan baik di mana semua pereaksinya masih bekerja. Sedangkan
untuk reaksi yang menggunakan total RNA hasil isolasi hanya terlihat pita cukup
jelas pada reaksi S1 (7µl total RNA dari kambium pohon sehat) dan B1 (7µl total
RNA dari kambium pohon sakit). Kualitas cDNA yang tergambar melalui
pengendapan pada agarose tidak terlihat sejelas pita RNA pada agarose, hal
tersebut dapat disebabkan karena materi genetik yang terkandung dalam cDNA
semakin spesifik dan jumlahnya pun semakin sedikit. Tabel 5 dan 6 menyajikan
konsentrasi cDNA yang diukur dengan spectrophotometer.
Tabel 5. Hasil pengukuran pada Spectrophotometer sampel cDNA dengan metode
kontrol.
Nama Sampel
SC 4
SC 5
BC 4
SC 5
Rata-rata

A260/280
1,54
1,54
1,59
1,61
1,57

A260/230
1,88
1,91
1,77
1,93
1,87

C (ng/µl)
1852
1822
1932
2002
1902

18
Tabel 6. Hasil pengukuran pada Spectrophotometer sampel cDNA dengan metode
modifikasi.
Nama Sampel
SC 77
SC 78
SC 79
SC 80
SC 79 (2)
SC 80 (2)
SC 78 (1)
SC 78 (2)
SC 77 (1)
SC 77 (2)
SC 78 (3)
SC 79 (3)
Rata-rata
BC 12
BC 13
BC 14
BC 15
BC 12 (1)
BC 12 (2)
BC 14 (1)
BC 14 (2)
BC 15 (1)
BC 15 (2)
Rata-rata

A260/280 A260/230 C (ng/µl)
1,63
1,63
1,62
1,63
1,61
1,57
1,60
1,63
1,62
1,58
1,62
1,61
1,61
1,62
1,63
1,60
1,60
1,63
1,51
1,63
1,62
1,50
1,61
1,59

2,05
2,10
2,02
2,03
1,98
1,97
1,44
1,78
1,89
1,86
1,90
1,90
1,91
1,99
1,87
1,64
1,97
1,84
1,60
1,95
1,95
1,69
1,86
1,84

2745
3019
3294
3408
2388
1842
1262
1840
1913
1867
2090
1886
2296,17
2306
1987
1998
2092
2024
1786
1898
1908
1369
1949
1931,70

Data pada Tabel 6 menunjukkan bahwa cDNA yang dihasilkan dari
sintesis utas pertama memiliki konsentrasi yang cukup tinggi dan nilai kemurnian
yang cukup tinggi pula. Ketidakmunculan pita yang cukup jelas pada agarose
dapat dipengaruhi oleh beberapa hal, seperti konsentrasi agarose yang kurang
tinggi ataupun pewarna ethidium bromide (ETBR) yang sudah tidak pekat lagi
sehingga komponen cDNA yang seharusnya diendapkan tidak dapat diendapkan
dengan maksimal. Jaringan kambium dari pohon yang sehat yang memiliki ratarata konsentrasi lebih tinggi dibandingkan jaringan kambium dari pohon yang
sakit, begitu juga bila ditinjau dari tingkat kemurnian dan tingkat bebas
kontaminasi. Hal tersebut dapat disebabkan karena pada kondisi pelukaan atau
serangan patogen produksi ribonuklease endogen dapat meningkat (Hartati 2002).

19

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Jaringan yang terbaik untuk isolasi RNA total sengon resisten dan rentan
boktor adalah jaringan kambium. Modifikasi prosedur dari protokol asli pada kit
komersial yang digunakan untuk isolasi RNA total, mRNA dan sintesis cDNA
dapat memberikan hasil yang lebih baik. Kualitas RNA yang tergambar pada hasil
elektroforesis metode modifikasi lebih jelas, begitupun konsentrasi RNA yang
dihasilkan oleh metode modifikasi rata-rata lebih tinggi yaitu sebesar 65,60 ng/µl
dibandingkan metode kontrol sebesar 30,60 ng/µl. Hal yang serupa juga terlihat
dari hasil elektroforesis isolasi mRNA metode modifikasi menunjukkan pita
mRNA yang lebih jelas dibanding metode kontrol. Begitu juga hasil sintesis
cDNA yang menggunakan metode modifikasi terlihat lebih jelas pada hasil gel
elektroforesis dibandingkan pada metode kontrol dan memiliki rata-rata nilai
konsentrasi tertinggi yaitu 2296,17ng/µl.

Saran
Saran untuk perbaikan hasil penelitian lebih lanjut adalah penanganan
sampel harus sangat diperhatikan kesterilannya dan waktu isolasi dari mRNA
menjadi utas pertama cDNA harus kurang dari 24jam untuk mendapatkan hasil
yang lebih sempurna. Begitu juga hasil isolasi dari setiap tahap harus segera
dilanjutkan dalam waktu kurang dari 24jam untuk pengerjaan tahap berikutnya
untuk menghindari adanya degradasi yang dapat mengurangi kualitas hasil isolasi.

DAFTAR PUSTAKA
Atmosuseno BS. 1998. Budi Daya, Kegunaan dan Prospek Sengon. Jakarta.
Penebar Swadaya.
Albert B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts M, Watson JD. 1989. Molecular
Biology of The Cell, 2nd Edition. New York. Garland Publishing.
Hartati NS. 2002. Konstruksi Pustaka cDNA Sengon yang Terinduksi oleh
Serangan Hama Boktor [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Hillis DM. 1987. Molecular versus morphological approaches to systematics.
Annual Review of Ecology and Systematics 18(1): 23-42.
Loukakis KA, Roubelakis-Angelakis KA, Kanellis AK. 1996. Isolation of
functional RNA from grapevines tissues poor in nucleic acid content. Am. J.
Enol. Vitic. 47:181-185.
Nicholl DST. 1994. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
Great Britain, University Press, Cambridge.
Schultz DJ, Craig R, Cox-Foster DL, Mumma RO, dan Medford JI. 1994. RNA
isolation from recalcitrant plant tissue. Plant Mol. Biol. Rep. 12:310-316.
Siregar UJ, Haheda NF, dan Flowrensia L. 2011. Hubungan antara trypsin
inhibitor dan alfa-amilase inhibitor pohon sengon terhadap perkembangan

20
larva boktor dalam artificial diet. Jurnal Silvikultur Tropika. Vol 3(01):
101-108.
Tampang A. 2012. Pengembangan Metode Kloning Gen Ketahanan Terhadap
Hama Pada Sengon (Paraseriathes falcataria) [tesis]. Bogor (ID): Institut
Pertanian Bogor.
Tattersal EAR, DeLuc L, Cushman JC, Cramer GR, Ergul A, AlKayal F. 2005.
Technical brief: comparison of methods for isolating high-quality RNA
from leaves of grapevine. Am. J. Enol. Vitic 56:400-406.
Wilkins TA, Smart LB. 1996. Isolation of RNA from Plant Tissue. New York.
Wiley – Liss.
Winfrey MR, Rott MA, Wortman AT. 1997. Unraveling DNA: Molecular
Biology for the Laboratory. New Jersey. Prentice-Hall, Upper Saddle River.

21
Lampiran 1 Protokol Isolasi Total RNA Mini Kit dari Geneaid

22
Lampiran 2 Protokol PolyATract mRNA Isolation System III with Magnetic Stand
dari Promega

23
Lampiran 3 Protokol cDNA Substraction Kit dari Clontech

24

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bekasi pada tanggal 24 Juli 1991 dari ayah (alm) Petrus
Djoko Sardjono dan ibu Veronica Widarsih. Penulis adalah putri keempat dari 4
bersaudara. Pada tahun 2009 penulis lulus dari SMA Negeri 5 Bekasi dan
kemudian diterima di Institut Pertanian Bogor melalui jalur Ujian Talenta Mandiri
IPB (UTM-IPB) dan diterima di Departemen Silvikultur, Fakultas Kehutanan,
Institut Pertanian Bogor.
Pada tahun 2011, penulis mengikuti Praktek Pengenalan Ekosistem Hutan
PPEH) di lokasi Sancang Timur – Papandayan pada bulan Juli. Tahun 2012
penulis mengikuti Praktek Pengelolaan Hutan (PPH) di lokasi Hutan Pendidikan
Gunung Walat (HPGW) Sukabumi, Bandung dan Cianjur pada bulan Juni-Juli.
Tahun 2013 penulis mengikuti Praktik Kerja Profesi (PKP) di lokasi Persemaian
Permanen Cimanggis, Balai Perbenihan Tanaman Hutan (BPTH) Jawa Barat pada
bulan Maret sampai dengan April. Selama menjalani perkuliahan, penulis aktif
dalam organisasi International Forestry Student Association Local Commitee IPB
(IFSA LC IPB) sebagai Head of Human Resources Division pada tahun
2011/2012, serta aktif dalam organisasi Himpunan Profesi Mahasiswa Silvikultur
yaitu Tree Grower Community (TGC) sebagai staff Divisi Informasi dan
Komunikasi pada tahun 2011/2012. Kepanitiaan yang pernah diikuti penulis
antara lain, Seminar Nasional dan Pelatihan Budidaya Jabon tahun 2012 sebagai
sekretaris, TGC in Action tahun 2013 sebagai Publikasi dan Dokumentasi, dan
Perayaan Natal Civitas Akademik IPB tahun 2013 sebagai Sekretaris. Pada bulan
Desember tahun 2011 penulis menjadi delegasi IFSA LC IPB pada South East
Asia Forestry Youth Meeting (SEAFYM) di Bogor, Indonesia. Pada bulan Mei
2012 penulis menjadi delegasi IFSA LC IPB pada Asia Regional Meeting (ARM)
IFSA World, di Yogyakarta dan Kamojang, Indonesia. Pada bulan Oktober 2012
penulis menjadi delegasi Fakultas Kehutanan dalam 19th Tri-U International Joint
Seminar and Symposium di Bogor, Indonesia. Pada bulan Oktober 2014 penulis
menjadi peserta 24th International Union Forest Research Organization (IUFRO)
World Congress di Salt Lake City, Utah, Amerika Serikat. Penulis menerima
penghargaan sebagai Mahasiswa Berprestasi dalam Bidang Ekstra Kurikuler
periode Agustus 2012 – Mei 2013 (SK Rektor IPB No: 68/IT3/KM/2013) dari
Direktorat Kemahasiswaan Institut Pertanian Bogor. Penulis pernah mengikuti
pelatihan Pengenalan Software untuk Genetika Molekuler dan Association
Mapping dan Pelatihan Mini Workshop DNA Barcoding pada bulan November
2013 di Fakultas Kehutanan, Institut Pertanian Bogor. Pada tahun 2012-2014
penulis menjadi asisten praktikum mata kuliah Dendrologi dan Ekologi Hutan di
Departemen Silvikultur, Fakultas Kehutanan, IPB.
Untuk memperoleh gelas Sarjana Kehutanan IPB, penulis menyelesaikan
skripsi dengan judul “Pengembangan Metode Isolasi Total RNA, mRNA dan
Sintesis cDNA Sengon (Falcataria moluccana L. Nielsen) yang Sehat dan
Terserang Hama Boktor (Xystrocera Festiva)” di bawah bimbingan Dr. Ir Ulfah
Juniarti, M.Agr dan Dr. N. Sri Hartati.