Kemudian dilakukan pengenceran berganda dengan cara mengambil setengah dari konsentrasi ekstrak etanol umbi lobak 100 menggunakan mikropipet dan diletakkan
pada tabung kedua untuk mendapatkan ekstrak etanol umbi lobak 50 pengenceran berganda. Cara yang sama dilakukan untuk mendapatkan konsentrasi 25 dan
12,5. Masing-masing tersebut diberi label sesuai konsentrasinya.
4.5.3.2.2 Pembuatan Media Bakteri
Sebelum spesimen dibiakkan, terlebih dahulu dibuat media Trypticase Soy Agar TSA. Sebanyak 10 gr serbuk TSAdan 15 gr serbuk TSB dilarutkan dalam 500
ml akuades kemudian dituangkan pada tabung reaksi 20 mlpetri, lalu dipanaskan di atas tungku pemanas magnetik sampai mendidih. Setelah masak, media disterilkan
dalam autoklaf selama 15 menit dengan tekanan 2 atm dan suhu 121
o
C, lalu disimpan dalam lemari pendingin. Jika akan digunakan, media dipanaskan kembali hingga
mendidih lalu dituang ke dalam petri. Kemudian media dimasukkan ke dalam inkubator selama 24 jam untuk melihat apakah ada kontaminasi bakteri atau tidak.
4.5.3.2.3 Pembiakan Spesimen
Fusobacterium nucleatumyang digunakan adalah spesimen stem sel Fusobacterium nucleatum ATCC 25586 yang dibiakkan secara murni pada media
TSA dalam suasana anaerob pada inkubator CO
2
hingga didapatkan pertumbuhan yang sehat, yang berarti bahwa bakteri tumbuh subur. Ambil sebanyak 1-2 ose dari
biakan murni bakteri lalu disuspensikan dalam larutan 0,9 NaCl hingga diperoleh kekeruhan sesuai 0,5 Mc Farland Standard atau setara dengan jumlah 1 x
10
8
CFUml CFU: Colony Forming Unit.
4.5.3.2.4 Penentuan KHM Bahan Coba
Konsentrasi ektrak etanol umbi lobak yang diuji dalam penelitian ini adalah dimulai dari 100, 50, 25, 12,5. Dari masing-masing konsentrasi tersebut
diambil 4 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu tambahkan 1 ml suspensi bakteri dengan menggunakan mikropipet ke dalam masing-masing tabung bahan coba
tersebut kemudian divorteks, lalu diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam pada inkubator CO
2
. Amati kekeruhan yang terjadi secara visual, lalu bandingkan tabung- tabung tersebut dengan kontrol untuk menentukan nilai KHM, yaitu konsentrasi
minimal bahan coba yang mampu menghambat pertumbuhan Fusobacterium nucleatum dalam media pembenihan setelah diinkubasi 24 jam.
4.5.3.2.5 Penentuan KBM Bahan Coba
Hasil pengujian penentuan nilai KHM dilanjutkan dengan perhitungan jumlah koloni bakteri dengan menggunakan metode Pour Plate. Dengan metode ini dapat
dihitung jumlah bakteri hidup yang telah disuspensikan dalam bahan coba. Setelah diinkubasi pada prosedur penentuan KHM, bahan coba dari konsentrasi seperti di atas
divorteks dan diambil 100 µl untuk setiap konsentrasi lalu diteteskan ke dalam petri yang kemudian diisi dengan media padat Trypticase Soy Agarsambil diaduk supaya
suspensi bakteri tercampur merata dan koloni bakteri akan lebih mudah dihitung. Petri direplikasikan sebanyak 4 kali replikasi, diamkan selama 15-20 menit sampai
mengering kemudian diinkubasi dalam inkubator CO
2
dengan suhu 37
o
C selama 24 jam. Kemudian, dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri untuk mendapatkan
nilai KBM dengan bantuan mikroskop. Jumlah koloni bakteri dihitung dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan pada media padat akan tumbuh menjadi satu
koloni bakteri. Apabila bentuk koloni melebar dianggap berasal dari satu koloni, bila bentuknya dua koloni bersinggungan dianggap sebagai dua koloni. Koloni
Fusobacterium nucleatum pada media padat berbentuk bulat dan berwarna putih keruh.
Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing petri, dibuat rata- ratanya dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali. Oleh karena
pada penelitian konsentrasi yang dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri merupakan konsentrasi awal sebelum dilakukan dilusi maka faktor pengenceran x 1,
selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri pada media padat sebanyak 100 µl, maka hasil perhitungan harus dikali dengan faktor pengali 10 untuk
mendapatkan hasil sesuai satuan standar CFUml.
Contoh cara perhitungan koloni pada metode Pour Plate adalah a. Pada media padat ditetesi sebanyak 100 µl suspensi bahan coba dengan
mikropipet. b. Kemudian dihitung jumlah koloni yang ada dengan menggunakan
mikroskop dan didapatkanlah sebanyak 5 koloni. c. Jadi jumlah bakteri pada bahan coba tersebut adalah 5 x 1 faktor
pengenceran x 10 faktor pengali = 50 CFUml.
4.6 Pengolahan dan Analisis Data
