BAHAN DAN ALAT RANCANGAN PERCOBAAN

III. METODE PENELITIAN

3.1 BAHAN DAN ALAT

Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah chips kering iles-iles kuning Amorphophalus oncophyllus yang diperoleh dari KPH Saradan, Desa Klangon, Kabupaten Madiun, dengan kadar air chips antara 8 – 10. Bahan yang digunakan dalam pemurnian tepung glukomanan adalah larutan bufer fosfat sitrat, enzim α-amilase, enzim xilanase, enzim selulase, larutan etanol 95 dan aquades. Bahan yang digunakan dalam analisis adalah larutan NaOH, larutan HCl, larutan kalium iodida, larutan H 2 SO 4 , larutan heksan, larutan KMnO 4 , larutan dinitrosalisilat, larutan fenol, larutan H 3 PO 4 , larutan Pb asetat, CuSO 4 hablur, Na 2 SO 4 hablur, larutan H 3 BO 3 , Na 2 CO 3 hablur, larutan indikator merah metil, larutan Na 2 S 2 O 3 , larutan Luff Schroll, larutan kanji dan larutan iod. Alat-alat yang digunakan dalam pemurnian tepung glukomanan adalah inkubator, sentrifuse, tabung sentrifuse, kain saring, pengaduk, saringan, termometer dan penangas air. Peralatan untuk melakukan analisis adalah cawan aluminium, cawan porselen, oven, tanur, Viscometer Brookfield LV, whiteness meter model C100, soxhlet, kertas saring, hot plate, buret, kjeltec, labu Kjeldahl, spektrofotometer Hach, mikroskop cahaya terpolarisasi dan peralatan gelas lainnya.

3.2 TATA LAKSANA PENELITIAN

Sistematika penelitian ini terdiri atas persiapan dan karakterisasi bahan baku, penentuan aktivitas dan kondisi kerja enzim yang akan digunakan, pemurnian glukomanan serta karakterisasi fisikokimia tepung glukomanan dan hidrolisat setelah dimurnikan.

3.2.1 Persiapan dan Karakterisasi Bahan Baku

Pembuatan tepung iles-iles dilakukan dengan cara menggiling chips dengan menggunakan disc mill kemudian diayak dengan ayakan berukuran 40 mesh sehingga dihasilkan tepung iles-iles yang siap untuk dimurnikan. Tepung iles-iles kemudian dianalisis komponen proksimatnya, meliputi: air, abu, serat, lemak, protein dan karbohidrat by difference. Komponen serat yang dianalisis meliputi ADF Acid Detergent Fiber, NDF Neutral Detergent Fiber dan selulosa, sedangkan komponen karbohidrat yang dianalisis, meliputi kadar pati, gula pereduksi dan kadar glukomanan. Prosedur analisis tersebut disajikan pada Lampiran 1.

3.2.2 Penentuan Aktivitas dan Kondisi Kerja Enzim α-amilase, Selulase dan Xilanase

Penentuan aktivitas ketiga enzim ini didasarkan pada pembentukan gula pereduksi yang dihasilkan dengan menghidrolisis substrat soluble starch α-amilase, CMC selulase dan xilan xilanase pada kondisi suhu dan pH yang optimum. Pada penelitian ini, penentuan aktivitas enzim α- amilase dilakukan pada pH 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8 dan 6.0 serta pada suhu 50ºC, 65ºC dan 95ºC. Penentuan aktivitas enzim xilanase dilakukan pada pH 6 dan suhu 50ºC, sedangkan enzim selulase pada pH 5 dan suhu 60ºC. Ketiga enzim tersebut diuji aktivitasnya dengan mengukur pembentukan gula pereduksi dan dibaca dengan pereaksi DNS. Prosedur selengkapnya disajikan pada Lampiran 1. 12

3.2.3 Pemurnian Glukomanan

A. Pemilihan jenis enzim dalam pemurnian glukomanan

Pemurnian glukomanan dilakukan dengan menghidrolisis pati dan serat pada tepung iles-iles dengan cara: tepung iles-iles dibuat menjadi larutan 5, kemudian dipanaskan selama 2 jam dalam waterbath sampai larutan tergelatinisasi. Larutan kemudian ditambahkan enzim α-amilase dan konsorsium sesuai dengan konsentrasi yang telah ditentukan. Pada tahap ini digunakan dua faktor perlakuan sebagai berikut: i Suhu hidrolisis pada suhu 50ºC dan 65ºC. ii Enzim α-amilase yang ditambahkan yaitu sebesar 3 Ug dan konsorsium enzim dengan konsentrasi masing- masing enzim 3 Ug untuk α-amilase, 10 Ug untuk selulase dan 10 Ug untuk enzim xilanase. Sebagai pembanding, tepung iles- iles juga dimurnikan dengan perlakuan enzim α-amilase 3Ug pada suhu hidrolisis 95ºC selama 30 menit. Pembanding ini merupakan perlakuan terbaik dari hasil penilitian Nurjanah 2010. Glukomanan yang telah dimurnikan kemudian diisolasi secara kimiawi dengan cara: larutan hasil hidrolisis disentrifugasi sehingga terbentuk dua fase, yaitu: larutan kental yang mengandung campuran oligosakarida dan glukomanan serta bagian bawah adalah serat atau komponen yang tidak terhidrolisis. Larutan yang kental tersebut kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer, didinginkan dalam lemari es selama satu jam dan ditambahkan etanol 95 berlebih, yaitu 13 ml etanol 95 untuk tiap gram tepung. Etanol ditambahkan sedikit demi sedikit sambil diaduk- aduk kemudian dibiarkan sampai terjadi pemisahan antara hidrolisat dengan endapan glukomanan. Glukomanan yang mengendap dipisahkan dengan cara penyaringan vacuum menggunakan kain saring. Diagram alir penelitian pada tahap ini disajikan pada Gambar 3. Filtrat hasil penyaringan tersebut dianalisa gula pereduksi dan total gulanya, sedangkan endapan glukomanan dicuci dengan etanol dan dikeringkan dalam oven pada suhu 40ºC selama 48 jam. Tepung glukomanan yang dihasilkan dikarakterisasi sifat fisikokimianya, meliputi rendemen, kadar glukomanan, viskositas dan analisa mikroskopik. Prosedur analisis disajikan pada Lampiran 1.

B. Pengaruh waktu hidrolisis α-amilase terhadap pemurnian glukomanan

Pemurnian glukomanan pada tahap ini juga menggunakan metode yang sama dengan pemurnian sebelumnya, namun perlakuan yang digunakan yaitu penambahan enzim α-amilase dengan konsentrasi enzim 3 Ug pada suhu 50ºC dan perlakuan waktu inkubasi 1, 2 dan 3 jam. Filtrat hasil penyaringan juga dianalisa gula pereduksi dan total gulanya, sedangkan tepung glukomanan yang dihasilkan dikarakterisasi sifat fisikokimianya, meliputi rendemen, kadar glukomanan, viskositas dan derajat putih. Diagram alir selengkapnya disajikan pada Gambar 4.

3.3 RANCANGAN PERCOBAAN

Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap pada percobaan faktorial dengan dua ulangan. Model rancangan percobaan penelitian adalah sebagai berikut Gaspersz 1994: Y ij = µ + A i + ɛ ij 13 Dimana: Y ij = Nilai pengamatan dari penggunaan waktu hidrolisis ke-i pada ulangan ke-j µ = Rataan A i = Pengaruh faktor penggunaan waktu hidrolisis ke-i i = 1,2,3 ɛ ij = Pengaruh galat percobaan dari perlakuan ke-i pada ulangan ke-j Dalam hidrolisis tepung glukomanan, perlakuan waktu hidrolisis diberi simbol A sehingga dengan perlakuan waktu 1, 2 dan 3 jam diberi simbol berturut-turut A1, A2 dan A3. Tepung glukomanan yang menjadi pembanding diberi simbol A0. Hidrolisis dengan enzim Enzim α-amilase Enzim konsorsium Tepung iles-iles Hasil hidrolisat Karakterisasi komposisi kimia  Suhu inkubasi: 50ºC  Konsentrasi α- amilase 3Ug  Waktu inkubasi: 2 jam  Suhu inkubasi: 50ºC  Konsentrasi enzim: - α-amilase : 3Ug - xilanase: 10Ug - selulase : 10Ug  Waktu inkubasi: 2 jam  Suhu inkubasi: 65ºC  Konsentrasi enzim: - α-amilase : 3Ug - xilanase: 10Ug - selulase : 10Ug  Waktu inkubasi: 2 jam  Suhu inkubasi: 65ºC  Konsentrasi α- amilase 3Ug  Waktu inkubasi: 2 jam Filtrat Sentrifugasi Endapan serat dan residu lain A Gelatinisasi 14 Filtrat Hasil hidrolisat Hidrolisis dengan: - Enzim α-amilase - Suhu inkubasi 50ºC Tepung iles-iles Waktu inkubasi 1 jam Waktu inkubasi 3 jam Waktu inkubasi 2 jam Sentrifugasi Endapan serat dan residu lain Gelatinisasi A Gambar 3. Diagram alir tahapan penelitian pemilihan jenis enzim dalam pemurnian tepung glukomanan A Pengeringan dengan oven T = 40ºC, t = 2 hari Penggilingan Glukomanan murni Karakteristik fisiko kimia Ekstraksi secara kimia Etanol 95 Uji gula pereduksi dan total gula Filtrat Penyaringan 15 Gambar 4. Diagram alir tahapan penelitian pengaruh waktu hidrolisis α-amilase terhadap pemurnian glukomanan Uji gula pereduksi dan total gula Ekstraksi secara kimia Etanol 95 Pengeringan T = 40ºC, t = 2 hari Penggilingan Glukomanan murni Karakteristik fisiko kimia Filtrat Penyaringan A

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 KARAKTERISTIK KOMPOSISI KIMIA TEPUNG ILES-ILES

Umbi iles-iles merupakan umbi batang dengan kadar air yang tinggi. Penelitian ini menggunakan tepung iles-iles yang merupakan hasil dari penghancuran chips kering umbi dan lolos ayakan 40 mesh. Hasil uji proksimat tepung iles-iles disajikan pada Tabel 3. Tabel 3. Komposisi kimia tepung iles-iles Amorphophallus oncophyllus Komponen Tepung iles-iles bk Air Abu Protein Lemak Serat kasar Karbohidrat by difference 8.34 bb 12.22 8.65 1.45 8.85 77.68 11.10 bb 3.36 3.29 0.04 3.08 95.64 Glukomanan Pati 28.35 34.44 23.10 - Selulosa Hemiselulosa Lignin 8.04 13.93 5.00 - - - Nurjanah 2010 Pada Tabel 3, terlihat bahwa karbohidrat merupakan komponen utama penyusun tepung iles- iles yaitu sebesar 77.68 bk. Hal ini juga didukung oleh Zahid dan Siregar 1991 yang menyebutkan bahwa iles-iles dapat dijadikan sebagai sumber karbohidrat karena kandungan karbohidratnya hingga 85. Karbohidrat pada tepung iles-iles terdiri atas pati, serat dan glukomanan. Glukomanan merupakan komponen karbohidrat yang paling penting dalam iles-iles. Menurut Erniati dan Laksamanahardja 1994, kadar glukomanan pada umbi iles-iles segar berkisar antara 44 – 46 tergantung dari varietas tanaman iles-iles tersebut. Salah satu jenis iles-iles yang mempunyai kadar glukomanan tinggi adalah iles-iles kuning Amorphophallus oncophyllus yaitu sekitar 55 – 65 dari total padatan. Selain itu, jenis lain yang juga mengandung glukomanan dalam jumlah yang cukup tinggi adalah iles-iles putih yaitu sekitar 10 – 15 dari total padatan Gumbira Sa’id dan Rahayu 2009. Sumarwoto 2004 juga menyebutkan bahwa umur panen dapat mempengaruhi tinggi rendahnya kadar glukomanan pada umbi iles-iles, dimana umur umbi 6, 17 dan 24 bulan akan menghasilkan kadar glukomanan berturut-turut sebesar 37.99, 47.34 dan 48.54. Pengukuran kadar glukomanan dilakukan dengan mengekstraksi tepung glukomanan dari tepung iles-iles dengan pengkristalan kembali menggunakan larutan etanol 95 Murtinah 1977. Dengan metode tersebut, didapatkan kadar glukomanan pada tepung iles-iles sebesar 28.35 bk. Kadar glukomanan pada tepung iles-iles ini lebih tinggi dibandingkan dengan kadar glukomanan yang didapatkan oleh Nurjanah 2010 yaitu 23.10 bk. Perbedaan kadar glukomanan pada tepung iles- iles dapat dipengaruhi oleh faktor-faktor berikut, antara lain perlakuan pendahuluan bentuk