Karakterisasi Bakteri Isolat Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e.
KARAKTERISASI ISOLAT Bacillus sp. NTT 3a
DAN Bacillus sp. NTT 3e PENGHASIL AHL-LAKTONASE
RETNO KUSUMANINGRUM
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
ABSTRAK
RETNO KUSUMANINGRUM. Karakterisasi Isolat Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e
Penghasil AHL-Laktonase. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan ALINA AKHDIYA.
Quorum sensing (QS) merupakan mekanisme komunikasi bakteri yang bergantung pada
jumlah populasi bakteri dan diperantarai oleh molekul autoinduser (AI). Molekul AI pada bakteri
Gram negatif umumnya berupa molekul Acyl Homoserine Lactone (AHL). Enzim Acyl
Homoserine Lactone Lactonase (AHL-laktonase) yang disandikan oleh gen aiiA merupakan salah
satu enzim yang dapat menghidrolisis cincin lakton sehingga menghambat proses QS. Penelitian
ini bertujuan untuk mengkarakterisasi Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e penghasil
AHL-Laktonase. Karakterisasi dilakukan berdasarkan morfologi koloni, karakteristik
pertumbuhanan pada media NB (kurva tumbuh, laju pertumbuhan spesifik, dan waktu generasi),
dan aktivitas enzim AHL-laktonasenya. Aktivitas AHL-laktonase diamati menggunakan
bioindikator Chromobacterium violaceum.
Koloni Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e berbentuk bulat, elevasi cembung,
dan tepian licin. Warna koloni Bacillus sp. NTT 3a putih, sedangkan Bacillus sp. NTT 3e
berwarna krem. Laju pertumbuhan spesifik kedua bakteri tersebut berturut-turut adalah 0,005
menit-1 dan 0,0042 menit-1. Aktivitas AHL-laktonase dalam kedua kultur bakteri tertinggi tercapai
pada umur 42 jam (fase stasioner). Pada umur 48 jam, kadar total protein dalam supernatan kultur
Bacillus sp. NTT 3a (0,539 mg/ml) lebih rendah dibandingkan dengan Bacillus sp. NTT 3e (0,578
mg/ml). Walaupun demikian, aktivitas AHL-laktonase Bacillus sp. NTT 3a lebih tinggi dari
Bacillus sp. NTT 3e.
Kata kunci: quorum sensing, autoinduser, Anti-quorum sensing, AHL-laktonase
ABSTRACT
RETNO KUSUMANINGRUM. Characterization of Bacillus sp. NTT 3a and Bacillus sp. NTT 3e
Isolates Producing AHL-Lactonase. Under supervision of IMAN RUSMANA and ALINA
AKHDIYA.
Quorum sensing (QS) is a bacterial communication mechanism controled by bacterial
population and mediated by autoinducer (AI) molecule. AI molecule of Gram-negative bacteria
generally is Acyl Homoserine Lactone (AHL). Acyl Homoserine Lactone Lactonase (AHLlactonase) enzyme encoded by aiiA gene is an enzyme that can hydrolyze the lactone ring so that
inhibiting QS process. This study aimed to characterize the AHL-Lactonase producing bacteria i.e.
Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e. the characterization is based on colony morphology,
characteristics of growth in NB medium (growth curve, specific growth rate and generation time),
and activity of AHL-lactonase. AHL-lactonase activity was observed using bioindicator
Chromobacterium violaceum.
Colonies of Bacillus sp. NTT 3a and Bacillus sp. NTT 3e are round, have a convex
elevation and slippery ledges. The colony color of Bacillus sp. NTT 3a is white, while Bacillus sp.
NTT 3e is beige. The maximum specific growth rate of Bacillus sp. NTT 3a and Bacillus sp. NTT
3e was 0,005 minute-1 and 0,0042 minute-1 respectively. The highest activity of AHL-lactonase in
both of bacterial culture reached the age of 42 hours (stationary phase). Protein content of Bacillus
sp. NTT 3a (0,539 mg/ml) lower than Bacillus sp. NTT 3e (0,578 mg/ml) at the 48 hours.
However, the activity of AHL-lactonase in Bacillus sp. NTT 3a is higher than Bacillus sp. NTT 3e
Keywords: quorum sensing, autoinducer, anti-quorum sensing, AHL-lactonase
KARAKTERISASI ISOLAT Bacillus sp. NTT 3a
DAN Bacillus sp. NTT 3e PENGHASIL AHL-LAKTONASE
RETNO KUSUMANINGRUM
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Judul :
Nama :
NIM :
Karakterisasi Bakteri Isolat Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT
3e.
Retno Kusumaningrum
G34080047
Menyetujui,
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si
NIP 196507201991031002
Alina Akhdiya, M.Si
NIP 196812082001122001
Mengetahui,
Ketua Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.S
NIP 196410021989031002
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Alhamdulillahirobbil’alamin, puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas
rahmat dan karunia-Nya sehingga penelitian ini dapat diselesaikan. Judul penelitian ini adalah
“Karakterisasi Isolat Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e Penghasil AHL-laktonase”.
Penelitian ini dilaksanakan sejak bulan Januari hingga Juli 2012.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr.Ir. Iman Rusmana, M.Si dan Ibu
Alina Akhdiya, M.Si selaku pembimbing yang telah memberikan arahan dan bimbingan selama
penelitian dan penulisan skripsi ini. Terima kasih kepada Ibu Dra. Hilda Akmal, M.Si selaku
penguji yang telah memberikan saran dan masukan sehingga tulisan ini menjadi lebih baik. Terima
kasih kepada Ibu Heni dan Pak Jaka selaku laboran di laboratorium Mikrobiologi IPB atas segala
bantuan dan saran selama melakukan penelitian ini. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan
kepada Bapak, Ibu, Kakak, dan seluruh keluarga atas doa, motivasi dan kasih sayang yang
diberikan. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Jaka Ahmad J, Nono, Ginna, Iky,
Kebon, Ayang, teman-teman IR-crew, dan teman-teman seperjuangan di Biologi 45 atas
kebersamaan dan segala motivasi yang telah diberikan.
Penulis berharap semoga karya tulis ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu
pengetahuan.
Bogor, Oktober 2012
Retno Kusumaningrum
RIWAYAT HIDUP
Retno Kusumaningrum, dilahirkan di Bekasi pada tanggal 26 Maret 1991 dari ayah
bernama Baron Sumarto dan ibu Ch. Nunik Dwi Sumarmi. Penulis merupakan anak kedua dari
dua bersaudara. Tahun 2008 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Bekasi, dan pada tahun yang sama
penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) pada
Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif menjadi anggota Divisi Biologi World
(Bioworld) Himpunan Mahasiswa Biologi (Himabio), dan menjadi sekretaris acara Biologi On
Xperiment (BOX). Penulis juga menjadi asisten praktikum mata kuliah Biologi Tingkat Persiapan
Bersama tahun ajaran 2011/2012.
Penulis melakukan studi lapangan di kawasan Taman Wisata Alam Pangandaran dengan
judul makalah “Habitat Raflesia patma di Cagar Alam Wisata Pananjung Pangandaran”. Penulis
juga melakukan Praktik Lapangan di PT. Astaguna Wisesa (MORIN) di Cikarang dari bulan Juli
sampai Agustus tahun 2011, dengan judul makalah “Proses Produksi dan Kontrol Kualitas
Mikrobiologi Selai Buah Bluberi Kemasan Botol di PT. Astaguna Wisesa Cikarang”.
DAFTAR ISI
halaman
DAFTAR TABEL ..........................................................................................................................viii
DAFTAR GAMBAR .....................................................................................................................viii
DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................................................viii
PENDAHULUAN............................................................................................................................. 1
Latar Belakang .............................................................................................................................. 1
Tujuan ........................................................................................................................................... 1
METODE .......................................................................................................................................... 1
Waktu dan Tempat Penelitian ....................................................................................................... 1
Pemurnian dan Peremajaan Isolat ................................................................................................. 1
Verifikasi produksi AHL-laktonase .............................................................................................. 1
Penentuan Kadar Protein .............................................................................................................. 2
Pembuatan Kurva Tumbuh ........................................................................................................... 2
Penentuan Laju Pertumbuhan Spesifik ......................................................................................... 2
Pengukuran Aktivitas Isolat Bakteri ............................................................................................. 2
HASIL ............................................................................................................................................... 2
Pemurnian dan Peremajaan Isolat ................................................................................................. 2
Verifikasi Aktivitas AHL-laktonase ............................................................................................. 3
Kadar Protein Supernatan Kultur Bakteri ..................................................................................... 3
Kurva Pertumbuhan Bakteri ......................................................................................................... 3
Laju Pertumbuhan Spesifik Maksimum (μm) Isolat ..................................................................... 3
Aktivitas AHL-laktonase .............................................................................................................. 3
PEMBAHASAN ............................................................................................................................... 4
SIMPULAN ...................................................................................................................................... 5
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................................................... 5
LAMPIRAN ...................................................................................................................................... 7
DAFTAR TABEL
halaman
1. Morfologi koloni isolat bakteri Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e pada media NA. . 2
2. Kadar protein supernatan Kultur Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e umur 24 jam .... 3
3. Pertumbuhan spesifik maksimum (µm) dan waktu generasi Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus
sp. NTT 3e ................................................................................................................................... 3
4. Hasil Uji Aktivitas AHL-laktonase dalam supernatan kultur Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus
sp. NTT 3e menggunakan bioindikator C. violaceum ................................................................. 4
DAFTAR GAMBAR
halaman
1. Penampakan warna koloni Bacillus sp. NTT 3a........................................................................... 2
2. Penampakan warna koloni Bacillus sp. NTT 3e........................................................................... 2
3. Verifikasi aktivitas AHL-laktonase isolat Bacillus sp. NTT 3a ................................................... 3
4. Verifikasi aktivitas AHL-laktonase isolat Bacillus sp. NTT 3e ................................................... 3
5. Kurva pertumbuhan kultur Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e................................... 3
6. Zona degradasi violacein yang dihasilkan Bacillus sp. NTT 3a selama 24 jam pengamatan ....... 4
7. Zona degradasi violacein yang dihasilkan Bacillus sp. NTT 3e selama 24 jam pengamatan ....... 4
DAFTAR LAMPIRAN
halaman
1. Komposisi Media Pertumbuhan yang Digunakan ........................................................................ 8
2. Kurva Standard Bradford ............................................................................................................. 9
3. Kurva Pertumbuhan Spesifik Isolat Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e ..................... 9
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Quorum sensing (QS) merupakan suatu
mekanisme komunikasi bakteri dengan
perantara molekul sinyal yang disebut
autoinduser. Pada proses QS, autoinduser (AI)
disekresikan, kemudian diakumulasi di
lingkungan, selanjutnya diserap kembali ke
dalam sel dan dikenali oleh bakteri pada saat
proses QS terjadi (Rukayadi & Hwang 2009).
Sistem QS mampu mengkoordinasikan
perilaku populasi bakteri seperti pembentukan
biofilm, faktor virulensi, bioluminescence, dan
produksi antibiotik (Romero et al. 2008).
N-Acyl Homoserine Lactone (AHL) adalah
AI pada bakteri Gram negatif, yang berperan
penting dalam menginduksi ekspresi gen
virulensi pada beberapa spesies bakteri
patogen
tanaman
diantaranya
Erwinia
carotovora penyebab enyakit busuk lunak
(Dong et al. 2000). Kenyataan ini membangkitkan pemikiran bahwa virulensi bakteri
patogen dapat dinonaktifkan melalui inaktivasi
sistem QS (Zhu & Sun 2008).
Salah satu prinsip dari pengendalian bakteri
patogen dengan dasar QS adalah dengan
mencegah akumulasi sinyal AHL sehingga
gen-gen yang terlibat pada proses virulensinya
tidak dapat diekspesikan. Akumulasi sinyal
AHL dapat dicegah dengan mendegradasi
molekul sinyal tersebut. Senyawa atau molekul
yang dapat mencegah proses QS disebut
sebagai anti-QS (Yin et al. 2010). Senyawa
anti-QS merupakan salah satu alternatif
pengendalian penyakit dengan cara memblok
atau mengacau proses QS. Kelebihan Anti-QS
dalam mengontrol infeksi bakteri yaitu tidak
mempengaruhi pertumbuhan bakteri patogen nya, sehingga dapat menghindari timbulnya
tekanan seleksi yang sering menghasilkan
generasi patogen yang lebih resisten terhadap
antibiotik (White & Finan 2009).
AHL-Laktonase merupakan enzim anti-QS
yang termasuk ke dalam senyawa degradator
(Rukayadi & Hwang 2009). AHL-Laktonase
merusak sistem QS melalui hidrolisis
enzimatis cincin lakton pada molekul AHL
sehingga tidak terjadi ekspresi gen-gen
penyandi patogenitas. Gen Aiia merupakan
salah satu gen penyandi AHL-Laktonase dan
pertama kali ditemukan pada Bacillus sp. strain
240B1 (Dong et al. 2000).
Kemampuan
suatu
bakteri
dalam
menghasilkan AHL-Laktonase dapat diuji
antara lain dengan menggunakan biosensor
Chromobacterium violaceum. C. violaceum
dapat
menghasilkan
pigmen
violacein
berwarna ungu yang disandikan oleh gen Vio
(August et al. 2000).
AHL-laktonase merupakan salah satu
senyawa anti-QS yang dapat digunakan
sebagai alternatif dalam pengendalian bakteri
fitopatogen yang ramah lingkungan dan tidak
memicu resistensi. Pada penelitian sebelumnya
dua bakteri (NTT 3a dan NTT 3e) penghasil
enzim ini telah diisolasi dari lahan pertanian.
Karakterisasi molekuler menunjukkan isolat
NTT 3a dan NTT 3e memiliki gen yang
homolog dengan gen aiiA pada Bacillus sp. 91.
Gen 16S rRNA isolat NTT 3a mirip dengan
Bacillus sp. AF-777 dengan nilai identitas
99%, sedangkan isolat NTT 3e mirip dengan
Bacillus sp. NIOT-3 dengan nilai identitas
97% (Fitriyah 2011).
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi pertumbuhan isolat Bacillus sp.
NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e serta aktivitas
AHL-Laktonase yang dihasilkannya.
METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan
Januari sampai dengan Juli 2012, bertempat di
Laboratorium
Mikrobiologi
Departemen
Biologi FMIPA IPB.
Pemurnian dan Peremajaan Isolat
Kultur isolat bakteri NTT 3a dan NTT 3e
(Fitriyah
2011)
diremajakan
dengan
menggunakan metode gores kuadran pada
media Nutrient Agar (Lampiran 1).
Verifikasi produksi AHL-Laktonase
Sebanyak dua lup kultur murni bakteri
diinokulasi ke dalam 50 ml media Nutrient
Broth (NB) (Lampiran 1). Setelah diinkubasi
selama 24 jam di atas shaker (100 rpm pada
suhu ruang), kultur disentrifugasi selama 10
menit pada kecepatan 10000 rpm. Sebanyak
100 μL supernatan diteteskan pada paper disc
yang diletakkan pada permukaan media cawan
Luria Agar semi padat (Lampiran 1) yang telah
diinokulasi
dengan
Chromobacterium
violaceum (1%). Cawan tersebut kemudian
diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam
(Choo et al. 2006). Paper disk yang dikelilingi
oleh zona tidak berwarna ungu menunjukkan
adanya aktivitas degradasi AHL oleh enzim
AHL-laktonase.
2
Penentuan Kadar Protein
Kadar protein ditentukan dengan teknik
spektrofotometri menggunakan Commasie
Brilliant Blue G-250 sebagai pewarna. Sebagai
standar pengukuran protein digunakan larutan
Bovine Serum Albumin (BSA). Campuran
reaksi diukur absorbannya menggunakan
spektrofotometer (Spectronic 100) pada
panjang gelombang 595 nm (Bradford 1976).
Sampel supernatan diambil dari kultur bakteri
berumur 48 jam.
Pembuatan Kurva Tumbuh
Biakan induk disiapkan dengan cara
menginokulasikan satu lup biakan bakteri ke
dalam 50 ml media NB lalu diinkubasi selama
24 jam di atas shaker. Kemudian ke dalam 200
ml NB dimasukkan 10% biakan induk yang
telah tersedia. Inkubasi dilakukan di atas
shaker (100 rpm) pada suhu ruang. Setiap 6
jam selama 60 jam dilakukan pengukuran
kekeruhan sel pada panjang gelombang 620
nm dengan dua kali ulangan (duplo).
Chromobacterium violaceum, lalu diinkubasi
selama 24 jam. Pengukuran dilakukan setiap 6
jam selama 60 jam.
HASIL
Pemurnian dan Peremajaan Isolat
Isolat Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp.
NTT 3e berhasil dimurnikan dan diremajakan
pada media NA. Kedua isolat menunjukkan
perbedaan warna koloni pada media NA. Isolat
Bacillus sp. NTT 3a berwarna putih (Gambar
1), sedangkan Bacillus sp. NTT 3e berwarna
krem (Gambar 2). Warna koloni kedua isolat
menjadi kekuningan setelah tujuh hari. Ciri
dan morfologi kedua isolat ditampilkan pada
tabel dibawah ini.
Penentuan Laju Pertumbuhan Spesifik
Maksimum (μm) Isolat
Laju pertumbuhan spesifik maksimum
bakteri (μm) diukur dari fase logaritmik bakteri
terhadap waktu inkubasinya. Kemudian dibuat
grafik antara ln OD sel bakteri sebagai sumbu
y dan waktu inkubasi sebagai sumbu x. Nilai
kemiringan (slope) pada persamaan regresi
garis pada fase log merupakan laju
pertumbuhan spesifik bakteri.
Pengukuran Aktivitas AHL-Laktonase
Isolat Bakteri
Sebanyak 2 ml kultur biakan disentrifugasi
pada 10.000 rpm selama 10 menit untuk
diambil supernatannya. Sebanyak 100 µl
supernatan diteteskan perlahan ke dalam paper
disc, kemudian paper disc diletakkan di atas
media LA semi padat yang telah
diinokulasikan
dengan
1%
kultur
Gambar 1 Penampakan warna
koloni Bacillus sp. NTT 3a.
Gambar 2 Penampakan warna
koloni Bacillus sp. NTT 3e.
Tabel 1 Morfologi koloni isolat bakteri Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e
pada media NA
Morfologi koloni pada umur 24 jam
Isolat
Diameter koloni (mm)
Warna
Bentuk
Elevasi
Tepian
Bacillus NTT 3a
Putih
Bundar
Cembung
Licin
6
Bacillus NTT 3e
Krem
Bundar
Cembung
Licin
4
3
Verifikasi Aktivitas AHL-Laktonase
Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT
3e menunjukkan adanya zona tidak ungu di
sekeliling paper disc (Gambar 3 & 4). Zona
tidak ungu ini menunjukkan aktivitas enzim
AHL-laktonase.
Paper disc
Zona degradasi
AHL
Gambar 3 Verifikasi aktivitas AHL-laktonase
isolat Bacillus sp. NTT 3a.
Kurva Pertumbuhan Bakteri
Pengukuran kekeruhan kultur Bacillus sp.
NTT 3e selama inkubasi menunjukkan
pertumbuhan yang lambat pada 6 jam pertama.
Berbeda dengan Bacillus sp. NTT 3e, kultur
Bacillus NTT 3a menunjukkan pertumbuhan
yang cepat di awal pertumbuhannya. Kedua
kultur bakteri menunjukkan fase pertumbuhan
eksponensial sampai umur 18 jam inkubasi.
Selanjutnya kedua kultur mengalami fase
stasioner sampai umur 54 jam (Gambar 5).
1
0,9
0,8
0,7
0,6
O
0,5
D 0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66
Waktu inkubasi (Jam)
Gambar 5 Kurva pertumbuhan kultur Bacillus
sp. NTT 3a ( ) dan Bacillus sp. NTT 3e ( )
pada media NB.
Paper disc
Zona degradasi
AHL
Gambar 4 Verifikasi aktivitas AHL-laktonase
isolat Bacillus sp. NTT 3e.
Kadar Protein Supernatan Kultur Bakteri
Absorbansi supernatan kultur Bacillus sp.
NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e berturut-turut
adalah 0,2735 dan 0,316. Setelah dimasukkan
ke dalam persamaan regresi kurva standar
protein BSA (Lampiran 2), maka rata-rata
kadar protein dari Bacillus sp. NTT 3a dan
Bacillus sp. NTT 3e adalah 0,539 mg/ml dan
0,578 mg/ml (Tabel 2).
Tabel 2 Kadar protein supernatan kultur
Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e
pada umur 24 jam
Isolat
Kadar Protein
(mg/ml)
NTT 3a
0,539
NTT 3e
0,578
Laju Pertumbuhan Spesifik Maksimum
(µm) Isolat
Berdasarkan persamaan yang diperoleh
(lampiran 3), isolat Bacillus sp. NTT 3a
memiliki laju pertumbuhan spesifik (µm)
sebesar 0,005 menit-1, sedangkan Bacillus sp.
NTT 3e sebesar 0,0042 menit-1 (Tabel 3).
Tabel 3 Pertumbuhan spesifik maksimum (µm)
dan waktu generasi Bacillus sp. NTT 3a dan
Bacillus sp. NTT 3e
Isolat
µmax
(menit -1)
Waktu
generasi
(menit)
NTT 3a
0,005
138
NTT 3e
0,0042
164
Aktivitas AHL-Laktonase
Hasil pengukuran aktivitas AHL-laktonase
yang berhasil diamati yaitu pada jam ke-0, ke6, ke-12, dan ke-42. Kedua isolat menunjukkan
adanya aktivitas AHL-laktonase pada jam ke6. Dilihat dari diameter zona tidak ungu yang
dihasilkan, dapat diketahui bahwa aktivitas
degradasi AHL pada isolat Bacillus sp. NTT
3a lebih tinggi dari isolat Bacillus sp. NTT 3e.
4
Tabel 4 Hasil uji aktivitas AHL-laktonase
dalam supernatan kultur Bacillus sp. NTT 3a
dan Bacillus sp. NTT 3e menggunakan
bioindikator C. violaceum
Umur
contoh
supernatan
kultur (jam)
dz-dp (mm)
Bacillus
sp. NTT
3a
0
6
12
42
0
1
2
3
Bacillus
sp. NTT
3e
0
6
12
42
0
0,5
1
2
Ket: dz = diameter zona tidak berwarna ungu
dp= diameter paper disc
0 jam
6 jam
12 jam
42 jam
Gambar 6 Zona degradasi autoinduser yang
dihasilkan Bacillus sp. NTT 3a selama 42 jam
pengamatan.
0 jam
6 jam
12 jam
42 jam
Gambar 7 Zona degradasi autoinduser yang
dihasilkan Bacillus sp. NTT 3e selama 42 jam
pengamatan.
PEMBAHASAN
Verifikasi produksi AHL-laktonase oleh
kedua bakteri menggunakan bioindikator
Chromobacterium violaceum menunjukkan
terbentuknya zona tidak ungu disekeliling
paper disc pada cawan uji. Difusi AHLlaktonase yang terkandung dalam supernatan
kultur dari paper disc ke media disekitarnya
menyebabkan degradasi senyawa AI yang
diekskresikan oleh C. violaceum. Degradasi
senyawa AI tersebut menyebabkan sel-sel C.
violaceum yang tumbuh di sekitar paper disc
tidak dapat berkomunikasi sehingga tidak
memproduksi pigmen violacein. AHLlaktonase secara spesifik menghidrolisis cincin
lakton pada molekul L-homoserine lacton.
Aktivitas enzim ini stabil pada suhu di bawah
37o tetapi tidak stabil pada suhu yang tinggi
(Wang et al. 2004).
Hasil pengamatan terhadap pertumbuhan
Bacillus sp. NTT 3e pada media NB (Gambar
5) menunjukkan adanya fase lag pada awal
pertumbuhan (6 jam pertama). Fase lag adalah
fase adaptasi bakteri dimana tidak ada
pertambahan nyata pada populasi sel, namun
sel mengalami pertambahan massa, dan
komposisi kimiawi, serta peningkatan aktivitas
metabolisme (Dias 2003). Fase lag tidak
teramati pada kultur Bacillus sp. NTT 3a. Hal
ini mengindikasikan bahwa bakteri tersebut
mampu beradaptasi dengan cepat. Fase
eksponensial kedua kultur bakteri berlangsung
sampai umur 18 jam, dan selanjutnya masuk
ke fase stasioner sampai umur 54 jam. Gambar
5 menunjukkan bahwa sepanjang pertumbuhannya, nilai OD kultur Bacillus sp.
5
NTT 3e lebih rendah dari OD kultur Bacillus
sp. NTT 3a. Tingginya nilai OD kultur
Bacillus sp. NTT 3a menunjukkan tingkat
pertumbuhan yang lebih cepat dibandingkan
dengan kultur Bacillus sp. NTT 3e. Hal ini
sesuai dengan hasil penghitungan laju
pertumbuhan spesifik dan waktu generasi
kedua bakteri tersebut (Tabel 3).
Laju pertumbuhan spesifik maksimum
(µm) isolat Bacillus sp. NTT 3a adalah 0,005
menit-1 sedangkan pada Bacillus sp. NTT 3e
0,0042 menit-1 dengan waktu generasi berturutturut adalah 138 menit dan 164 menit. Laju
pertumbuhan spesifik merupakan salah satu
parameter dari kinetika pertumbuhan bakteri
yang menunjukkan kecepatan maksimum
bakteri untuk membelah. Laju pertumbuhan
spesifik (µ) ini dipengaruhi oleh jenis dan
konsentrasi substrat yang digunakan. Laju
pertumbuhan spesifik akan menurun pada
konsentrasi substrat yang tinggi karena sel
bakteri telah mengalami kejenuhan dalam
memanfaatkan substrat yang ada (Lehninger
1982). Pertumbuhan bakteri diindikasikan
dengan peningkatan teratur jumlah sel, baik
ukuran, berat, maupun volume sel tunggal atau
koloni. Hal ini tergantung pada kemampuan sel
membentuk protoplasma baru dari nutrien
yang dapat digunakan di lingkungannya (Dias
2003). Suatu populasi dengan µm yang lebih
tinggi akan tumbuh lebih cepat dibandingkan
suatu populasi dengan µm yang rendah. Waktu
generasi dan µm secara umum berbanding
terbalik pada kisaran spesies yang sangat luas
(Campbell et al. 2004).
Berdasarkan pengukuran yang dilakukan,
kadar protein pada supernatan kultur Bacillus
sp. NTT 3e lebih tinggi dari Bacillus sp. NTT
3a dengan selisih 0,039 mg/ml. Namun
aktivitas degradasi autoinduser oleh enzim
yang terkandung dalam supernatan kultur NTT
3a lebih tinggi walaupun kadar protein totalnya
lebih rendah dari supernatan kultur NTT 3e.
Hal ini diduga disebabkan oleh aktivitas
spesifik AHL-laktonase pada kultur Bacillus
sp. NTT 3a lebih tinggi dibandingkan dengan
AHL-laktonase pada kultur NTT 3e. Selain itu,
tingginya kadar protein total pada supernatan
kultur NTT3e diduga disebabkan oleh berbagai
protein selain AHL-laktonase yang diekskresikan ke dalam kultur.
Aktivitas enzim AHL-laktonase menunjukkan peningkatan seiring dengan bertambahnya
populasi sel dalam kultur. Zona tidak ungu
yang terbentuk sebagai hasil aktivitas AHLlaktonase mulai terdeteksi pada sampel
supernatan kultur yang diambil pada fase log.
Aktivitas AHL-laktonase tertinggi tampak
pada hasil pengujian sampel yang diambil pada
fase stasioner yaitu pada umur 42 jam. Hai ini
menunjukkan bahwa semakin tinggi populasi
bakteri dalam kultur, semakin tinggi akumulasi
AHL-laktonase yang diproduksinya sehingga
semakin luas juga zona tidak ungu yang
terbentuk. Aktivitas AHL-laktonase Bacillus
sp. NTT 3a lebih tinggi dari Bacillus sp. NTT
3e (Gambar 5 dan 6).
SIMPULAN
Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT
3e mampu memproduksi enzim AHLlaktonase. AHL-laktonase yang dihasilkan dari
kedua isolat dapat mendegradasi AHL
sehingga menghambat produksi violacein.
Produksi AHL-laktonase kedua isolat tertinggi
pada fase stasioner. Laju pertumbuhan NTT 3a
lebih baik dari pada Bacillus sp. NTT 3e,
begitu pula dalam pengukuran aktivitas AHLlaktonasenya.
DAFTAR PUSTAKA
August PR et al. 2000. Sequence analysis and
functional characterization of the
violacein biosynthetic pathway from
Chromobacterium violaceum. J Mol
Microbiol Biotechnol 2: 513-519.
Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive
method for the quantitation of
microgram quantities of protein
utilizing the principle of protein-dye
binding. Anal Biochem 72 : 248-254.
Campbell NA, Reece JB, Mitchell LG. 2004.
Biologi. Ed ke-5. Wasmen Manalu,
penerjemah; A Safitri, editor. Jakarta:
Erlangga. Terjemahan dari: Biology.
Choo JH, Rukayadi Y, Hwang JK. 2006.
Inhibition of bacterial QS by vanilla
extract. Lett Appl Microbiol 42:637–
641.
Dias LP. 2003. Karakteristik Morfologi dan
Kurva Pertumbuhan Bacillus brevis dan
Bacillus apiarus [skripsi]. Bogor.
Fakultas Kedokteran Hewan, Institut
Pertanian Bogor.
Dong YH, Xu JL, Li XC, Zang LH. 2000.
aiiA, a novel enzyme inactivates acylhomoserine-lactone
quorum-sensing
signal and attenuates the virulence of
Erwinia carotovora. Proc Natl Acad Sci
97: 3526-3531.
Fitriyah A. 2011. Isolasi dan Karakterisasi
Bakteri Penghasil AHL-Laktonase Asal
6
Lahan Pertanian Luar Pulau Jawa
[skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika
dan Ilmu pengetahuan Alam, Institut
Pertanian Bogor.
Lehninger
AL.
1982.
Principles
of
Biochemistry. New York: Worth
Publishers.
Romero M, Diggle SP, Heeb S, Camara M,
Otero A. 2008. Quorum quenching
activity in Anabaena sp. PCC7120:
identification of AiiC, a novel AHLacylase. FEMS Microbiol 280: 73-80.
Rukayadi Y, Hwang JK. 2009. Pencegahan
quorum sensing: suatu pendekatan baru
dalam mengatasi infeksi bakteri.
Medicinus 22: 22-27.
Wang LH, Weng LX, Dong YH, Zhang LH.
2004. Specifity and enzym kinetics of
the
quorum-quenching
N-Acyl
Homoserine Lactone Lactonase (AHL-
lactonase). J Biol Chem. 279: 1364513651.
White CE, Finan TM. 2009. Quorum sensing
in Agrobacterium tumefaciens: chance
or necessity?. J Bacteriol 191: 11231125.
Yin XT et al. 2010. Isolation and
characterization of an AHL-lactonase
gene from Bacillus amyloliquefaciens.
World J Microbial Biotechnol 26:1361
– 1367.
Zhu H, Sun SJ. 2008. Inhibition of Bacterial
Quorum Sensing-Regulated Behaviors
by Tremella fuciformis Extract. Curr
Microbiol. 57: 418-422.
LAMPIRAN
8
Lampiran 1. Komposisi media pertumbuhan yang digunakan
A. Media Nutrien Agar (NA)
- 0.8 g nutrient broth
- 1,5 g agar
- 100 ml akuades
B. Media Nutrien Broth (NB)
- 0,8 g nutrient broth
- 100 ml akuades
C. Media Luria Agar (LA)
- 1 g Trypton
- 1 g NaCL
- 0,5 g yeast extract
- 0,1 g CaCO3
- 1,5 g agar
- 100 ml akuades
D. Media Luria Agar (LA) semi padat
- 1 g Trypton
- 1 g NaCL
- 0,5 g yeast extract
- 0,1 g CaCO3
- 1g agar
- 100 ml akuades
E. Media Luria Broth (LB)
- 1 g Trypton
- 1 g NaCL
- 0,5 g yeast extract
- 100 ml akuades
9
Lampiran 2. Kurva Standard Bradford
0,6
absorban
0,5
0,4
y = 0,931x + 0,2836
R² = 0,9603
0,3
absorban
Linear (absorban)
0,2
0,1
0
0
0,1
0,2
konsentrasi
0,3
0,4
Lampiran 3. Kurva Pertumbuhan Spesifik Isolat Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e.
A. Bacillus sp. NTT 3a
1
menit
0
-1 0
500
1000
1500
ln OD
-2
-3
ln 3a
y = 0,005x - 4,8873
R² = 0,735
-4
Linear (ln 3a)
-5
-6
-7
B. Bacillus sp. NTT 3e
menit
0
0
500
1000
1500
-1
ln OD
-2
ln 3e
-3
-4
-5
-6
y = 0,0042x - 4,8759
R² = 0,9228
Linear (ln 3e)
DAN Bacillus sp. NTT 3e PENGHASIL AHL-LAKTONASE
RETNO KUSUMANINGRUM
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
ABSTRAK
RETNO KUSUMANINGRUM. Karakterisasi Isolat Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e
Penghasil AHL-Laktonase. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan ALINA AKHDIYA.
Quorum sensing (QS) merupakan mekanisme komunikasi bakteri yang bergantung pada
jumlah populasi bakteri dan diperantarai oleh molekul autoinduser (AI). Molekul AI pada bakteri
Gram negatif umumnya berupa molekul Acyl Homoserine Lactone (AHL). Enzim Acyl
Homoserine Lactone Lactonase (AHL-laktonase) yang disandikan oleh gen aiiA merupakan salah
satu enzim yang dapat menghidrolisis cincin lakton sehingga menghambat proses QS. Penelitian
ini bertujuan untuk mengkarakterisasi Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e penghasil
AHL-Laktonase. Karakterisasi dilakukan berdasarkan morfologi koloni, karakteristik
pertumbuhanan pada media NB (kurva tumbuh, laju pertumbuhan spesifik, dan waktu generasi),
dan aktivitas enzim AHL-laktonasenya. Aktivitas AHL-laktonase diamati menggunakan
bioindikator Chromobacterium violaceum.
Koloni Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e berbentuk bulat, elevasi cembung,
dan tepian licin. Warna koloni Bacillus sp. NTT 3a putih, sedangkan Bacillus sp. NTT 3e
berwarna krem. Laju pertumbuhan spesifik kedua bakteri tersebut berturut-turut adalah 0,005
menit-1 dan 0,0042 menit-1. Aktivitas AHL-laktonase dalam kedua kultur bakteri tertinggi tercapai
pada umur 42 jam (fase stasioner). Pada umur 48 jam, kadar total protein dalam supernatan kultur
Bacillus sp. NTT 3a (0,539 mg/ml) lebih rendah dibandingkan dengan Bacillus sp. NTT 3e (0,578
mg/ml). Walaupun demikian, aktivitas AHL-laktonase Bacillus sp. NTT 3a lebih tinggi dari
Bacillus sp. NTT 3e.
Kata kunci: quorum sensing, autoinduser, Anti-quorum sensing, AHL-laktonase
ABSTRACT
RETNO KUSUMANINGRUM. Characterization of Bacillus sp. NTT 3a and Bacillus sp. NTT 3e
Isolates Producing AHL-Lactonase. Under supervision of IMAN RUSMANA and ALINA
AKHDIYA.
Quorum sensing (QS) is a bacterial communication mechanism controled by bacterial
population and mediated by autoinducer (AI) molecule. AI molecule of Gram-negative bacteria
generally is Acyl Homoserine Lactone (AHL). Acyl Homoserine Lactone Lactonase (AHLlactonase) enzyme encoded by aiiA gene is an enzyme that can hydrolyze the lactone ring so that
inhibiting QS process. This study aimed to characterize the AHL-Lactonase producing bacteria i.e.
Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e. the characterization is based on colony morphology,
characteristics of growth in NB medium (growth curve, specific growth rate and generation time),
and activity of AHL-lactonase. AHL-lactonase activity was observed using bioindicator
Chromobacterium violaceum.
Colonies of Bacillus sp. NTT 3a and Bacillus sp. NTT 3e are round, have a convex
elevation and slippery ledges. The colony color of Bacillus sp. NTT 3a is white, while Bacillus sp.
NTT 3e is beige. The maximum specific growth rate of Bacillus sp. NTT 3a and Bacillus sp. NTT
3e was 0,005 minute-1 and 0,0042 minute-1 respectively. The highest activity of AHL-lactonase in
both of bacterial culture reached the age of 42 hours (stationary phase). Protein content of Bacillus
sp. NTT 3a (0,539 mg/ml) lower than Bacillus sp. NTT 3e (0,578 mg/ml) at the 48 hours.
However, the activity of AHL-lactonase in Bacillus sp. NTT 3a is higher than Bacillus sp. NTT 3e
Keywords: quorum sensing, autoinducer, anti-quorum sensing, AHL-lactonase
KARAKTERISASI ISOLAT Bacillus sp. NTT 3a
DAN Bacillus sp. NTT 3e PENGHASIL AHL-LAKTONASE
RETNO KUSUMANINGRUM
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Judul :
Nama :
NIM :
Karakterisasi Bakteri Isolat Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT
3e.
Retno Kusumaningrum
G34080047
Menyetujui,
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si
NIP 196507201991031002
Alina Akhdiya, M.Si
NIP 196812082001122001
Mengetahui,
Ketua Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.S
NIP 196410021989031002
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Alhamdulillahirobbil’alamin, puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas
rahmat dan karunia-Nya sehingga penelitian ini dapat diselesaikan. Judul penelitian ini adalah
“Karakterisasi Isolat Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e Penghasil AHL-laktonase”.
Penelitian ini dilaksanakan sejak bulan Januari hingga Juli 2012.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr.Ir. Iman Rusmana, M.Si dan Ibu
Alina Akhdiya, M.Si selaku pembimbing yang telah memberikan arahan dan bimbingan selama
penelitian dan penulisan skripsi ini. Terima kasih kepada Ibu Dra. Hilda Akmal, M.Si selaku
penguji yang telah memberikan saran dan masukan sehingga tulisan ini menjadi lebih baik. Terima
kasih kepada Ibu Heni dan Pak Jaka selaku laboran di laboratorium Mikrobiologi IPB atas segala
bantuan dan saran selama melakukan penelitian ini. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan
kepada Bapak, Ibu, Kakak, dan seluruh keluarga atas doa, motivasi dan kasih sayang yang
diberikan. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Jaka Ahmad J, Nono, Ginna, Iky,
Kebon, Ayang, teman-teman IR-crew, dan teman-teman seperjuangan di Biologi 45 atas
kebersamaan dan segala motivasi yang telah diberikan.
Penulis berharap semoga karya tulis ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu
pengetahuan.
Bogor, Oktober 2012
Retno Kusumaningrum
RIWAYAT HIDUP
Retno Kusumaningrum, dilahirkan di Bekasi pada tanggal 26 Maret 1991 dari ayah
bernama Baron Sumarto dan ibu Ch. Nunik Dwi Sumarmi. Penulis merupakan anak kedua dari
dua bersaudara. Tahun 2008 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Bekasi, dan pada tahun yang sama
penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) pada
Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif menjadi anggota Divisi Biologi World
(Bioworld) Himpunan Mahasiswa Biologi (Himabio), dan menjadi sekretaris acara Biologi On
Xperiment (BOX). Penulis juga menjadi asisten praktikum mata kuliah Biologi Tingkat Persiapan
Bersama tahun ajaran 2011/2012.
Penulis melakukan studi lapangan di kawasan Taman Wisata Alam Pangandaran dengan
judul makalah “Habitat Raflesia patma di Cagar Alam Wisata Pananjung Pangandaran”. Penulis
juga melakukan Praktik Lapangan di PT. Astaguna Wisesa (MORIN) di Cikarang dari bulan Juli
sampai Agustus tahun 2011, dengan judul makalah “Proses Produksi dan Kontrol Kualitas
Mikrobiologi Selai Buah Bluberi Kemasan Botol di PT. Astaguna Wisesa Cikarang”.
DAFTAR ISI
halaman
DAFTAR TABEL ..........................................................................................................................viii
DAFTAR GAMBAR .....................................................................................................................viii
DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................................................viii
PENDAHULUAN............................................................................................................................. 1
Latar Belakang .............................................................................................................................. 1
Tujuan ........................................................................................................................................... 1
METODE .......................................................................................................................................... 1
Waktu dan Tempat Penelitian ....................................................................................................... 1
Pemurnian dan Peremajaan Isolat ................................................................................................. 1
Verifikasi produksi AHL-laktonase .............................................................................................. 1
Penentuan Kadar Protein .............................................................................................................. 2
Pembuatan Kurva Tumbuh ........................................................................................................... 2
Penentuan Laju Pertumbuhan Spesifik ......................................................................................... 2
Pengukuran Aktivitas Isolat Bakteri ............................................................................................. 2
HASIL ............................................................................................................................................... 2
Pemurnian dan Peremajaan Isolat ................................................................................................. 2
Verifikasi Aktivitas AHL-laktonase ............................................................................................. 3
Kadar Protein Supernatan Kultur Bakteri ..................................................................................... 3
Kurva Pertumbuhan Bakteri ......................................................................................................... 3
Laju Pertumbuhan Spesifik Maksimum (μm) Isolat ..................................................................... 3
Aktivitas AHL-laktonase .............................................................................................................. 3
PEMBAHASAN ............................................................................................................................... 4
SIMPULAN ...................................................................................................................................... 5
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................................................... 5
LAMPIRAN ...................................................................................................................................... 7
DAFTAR TABEL
halaman
1. Morfologi koloni isolat bakteri Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e pada media NA. . 2
2. Kadar protein supernatan Kultur Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e umur 24 jam .... 3
3. Pertumbuhan spesifik maksimum (µm) dan waktu generasi Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus
sp. NTT 3e ................................................................................................................................... 3
4. Hasil Uji Aktivitas AHL-laktonase dalam supernatan kultur Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus
sp. NTT 3e menggunakan bioindikator C. violaceum ................................................................. 4
DAFTAR GAMBAR
halaman
1. Penampakan warna koloni Bacillus sp. NTT 3a........................................................................... 2
2. Penampakan warna koloni Bacillus sp. NTT 3e........................................................................... 2
3. Verifikasi aktivitas AHL-laktonase isolat Bacillus sp. NTT 3a ................................................... 3
4. Verifikasi aktivitas AHL-laktonase isolat Bacillus sp. NTT 3e ................................................... 3
5. Kurva pertumbuhan kultur Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e................................... 3
6. Zona degradasi violacein yang dihasilkan Bacillus sp. NTT 3a selama 24 jam pengamatan ....... 4
7. Zona degradasi violacein yang dihasilkan Bacillus sp. NTT 3e selama 24 jam pengamatan ....... 4
DAFTAR LAMPIRAN
halaman
1. Komposisi Media Pertumbuhan yang Digunakan ........................................................................ 8
2. Kurva Standard Bradford ............................................................................................................. 9
3. Kurva Pertumbuhan Spesifik Isolat Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e ..................... 9
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Quorum sensing (QS) merupakan suatu
mekanisme komunikasi bakteri dengan
perantara molekul sinyal yang disebut
autoinduser. Pada proses QS, autoinduser (AI)
disekresikan, kemudian diakumulasi di
lingkungan, selanjutnya diserap kembali ke
dalam sel dan dikenali oleh bakteri pada saat
proses QS terjadi (Rukayadi & Hwang 2009).
Sistem QS mampu mengkoordinasikan
perilaku populasi bakteri seperti pembentukan
biofilm, faktor virulensi, bioluminescence, dan
produksi antibiotik (Romero et al. 2008).
N-Acyl Homoserine Lactone (AHL) adalah
AI pada bakteri Gram negatif, yang berperan
penting dalam menginduksi ekspresi gen
virulensi pada beberapa spesies bakteri
patogen
tanaman
diantaranya
Erwinia
carotovora penyebab enyakit busuk lunak
(Dong et al. 2000). Kenyataan ini membangkitkan pemikiran bahwa virulensi bakteri
patogen dapat dinonaktifkan melalui inaktivasi
sistem QS (Zhu & Sun 2008).
Salah satu prinsip dari pengendalian bakteri
patogen dengan dasar QS adalah dengan
mencegah akumulasi sinyal AHL sehingga
gen-gen yang terlibat pada proses virulensinya
tidak dapat diekspesikan. Akumulasi sinyal
AHL dapat dicegah dengan mendegradasi
molekul sinyal tersebut. Senyawa atau molekul
yang dapat mencegah proses QS disebut
sebagai anti-QS (Yin et al. 2010). Senyawa
anti-QS merupakan salah satu alternatif
pengendalian penyakit dengan cara memblok
atau mengacau proses QS. Kelebihan Anti-QS
dalam mengontrol infeksi bakteri yaitu tidak
mempengaruhi pertumbuhan bakteri patogen nya, sehingga dapat menghindari timbulnya
tekanan seleksi yang sering menghasilkan
generasi patogen yang lebih resisten terhadap
antibiotik (White & Finan 2009).
AHL-Laktonase merupakan enzim anti-QS
yang termasuk ke dalam senyawa degradator
(Rukayadi & Hwang 2009). AHL-Laktonase
merusak sistem QS melalui hidrolisis
enzimatis cincin lakton pada molekul AHL
sehingga tidak terjadi ekspresi gen-gen
penyandi patogenitas. Gen Aiia merupakan
salah satu gen penyandi AHL-Laktonase dan
pertama kali ditemukan pada Bacillus sp. strain
240B1 (Dong et al. 2000).
Kemampuan
suatu
bakteri
dalam
menghasilkan AHL-Laktonase dapat diuji
antara lain dengan menggunakan biosensor
Chromobacterium violaceum. C. violaceum
dapat
menghasilkan
pigmen
violacein
berwarna ungu yang disandikan oleh gen Vio
(August et al. 2000).
AHL-laktonase merupakan salah satu
senyawa anti-QS yang dapat digunakan
sebagai alternatif dalam pengendalian bakteri
fitopatogen yang ramah lingkungan dan tidak
memicu resistensi. Pada penelitian sebelumnya
dua bakteri (NTT 3a dan NTT 3e) penghasil
enzim ini telah diisolasi dari lahan pertanian.
Karakterisasi molekuler menunjukkan isolat
NTT 3a dan NTT 3e memiliki gen yang
homolog dengan gen aiiA pada Bacillus sp. 91.
Gen 16S rRNA isolat NTT 3a mirip dengan
Bacillus sp. AF-777 dengan nilai identitas
99%, sedangkan isolat NTT 3e mirip dengan
Bacillus sp. NIOT-3 dengan nilai identitas
97% (Fitriyah 2011).
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi pertumbuhan isolat Bacillus sp.
NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e serta aktivitas
AHL-Laktonase yang dihasilkannya.
METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan
Januari sampai dengan Juli 2012, bertempat di
Laboratorium
Mikrobiologi
Departemen
Biologi FMIPA IPB.
Pemurnian dan Peremajaan Isolat
Kultur isolat bakteri NTT 3a dan NTT 3e
(Fitriyah
2011)
diremajakan
dengan
menggunakan metode gores kuadran pada
media Nutrient Agar (Lampiran 1).
Verifikasi produksi AHL-Laktonase
Sebanyak dua lup kultur murni bakteri
diinokulasi ke dalam 50 ml media Nutrient
Broth (NB) (Lampiran 1). Setelah diinkubasi
selama 24 jam di atas shaker (100 rpm pada
suhu ruang), kultur disentrifugasi selama 10
menit pada kecepatan 10000 rpm. Sebanyak
100 μL supernatan diteteskan pada paper disc
yang diletakkan pada permukaan media cawan
Luria Agar semi padat (Lampiran 1) yang telah
diinokulasi
dengan
Chromobacterium
violaceum (1%). Cawan tersebut kemudian
diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam
(Choo et al. 2006). Paper disk yang dikelilingi
oleh zona tidak berwarna ungu menunjukkan
adanya aktivitas degradasi AHL oleh enzim
AHL-laktonase.
2
Penentuan Kadar Protein
Kadar protein ditentukan dengan teknik
spektrofotometri menggunakan Commasie
Brilliant Blue G-250 sebagai pewarna. Sebagai
standar pengukuran protein digunakan larutan
Bovine Serum Albumin (BSA). Campuran
reaksi diukur absorbannya menggunakan
spektrofotometer (Spectronic 100) pada
panjang gelombang 595 nm (Bradford 1976).
Sampel supernatan diambil dari kultur bakteri
berumur 48 jam.
Pembuatan Kurva Tumbuh
Biakan induk disiapkan dengan cara
menginokulasikan satu lup biakan bakteri ke
dalam 50 ml media NB lalu diinkubasi selama
24 jam di atas shaker. Kemudian ke dalam 200
ml NB dimasukkan 10% biakan induk yang
telah tersedia. Inkubasi dilakukan di atas
shaker (100 rpm) pada suhu ruang. Setiap 6
jam selama 60 jam dilakukan pengukuran
kekeruhan sel pada panjang gelombang 620
nm dengan dua kali ulangan (duplo).
Chromobacterium violaceum, lalu diinkubasi
selama 24 jam. Pengukuran dilakukan setiap 6
jam selama 60 jam.
HASIL
Pemurnian dan Peremajaan Isolat
Isolat Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp.
NTT 3e berhasil dimurnikan dan diremajakan
pada media NA. Kedua isolat menunjukkan
perbedaan warna koloni pada media NA. Isolat
Bacillus sp. NTT 3a berwarna putih (Gambar
1), sedangkan Bacillus sp. NTT 3e berwarna
krem (Gambar 2). Warna koloni kedua isolat
menjadi kekuningan setelah tujuh hari. Ciri
dan morfologi kedua isolat ditampilkan pada
tabel dibawah ini.
Penentuan Laju Pertumbuhan Spesifik
Maksimum (μm) Isolat
Laju pertumbuhan spesifik maksimum
bakteri (μm) diukur dari fase logaritmik bakteri
terhadap waktu inkubasinya. Kemudian dibuat
grafik antara ln OD sel bakteri sebagai sumbu
y dan waktu inkubasi sebagai sumbu x. Nilai
kemiringan (slope) pada persamaan regresi
garis pada fase log merupakan laju
pertumbuhan spesifik bakteri.
Pengukuran Aktivitas AHL-Laktonase
Isolat Bakteri
Sebanyak 2 ml kultur biakan disentrifugasi
pada 10.000 rpm selama 10 menit untuk
diambil supernatannya. Sebanyak 100 µl
supernatan diteteskan perlahan ke dalam paper
disc, kemudian paper disc diletakkan di atas
media LA semi padat yang telah
diinokulasikan
dengan
1%
kultur
Gambar 1 Penampakan warna
koloni Bacillus sp. NTT 3a.
Gambar 2 Penampakan warna
koloni Bacillus sp. NTT 3e.
Tabel 1 Morfologi koloni isolat bakteri Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e
pada media NA
Morfologi koloni pada umur 24 jam
Isolat
Diameter koloni (mm)
Warna
Bentuk
Elevasi
Tepian
Bacillus NTT 3a
Putih
Bundar
Cembung
Licin
6
Bacillus NTT 3e
Krem
Bundar
Cembung
Licin
4
3
Verifikasi Aktivitas AHL-Laktonase
Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT
3e menunjukkan adanya zona tidak ungu di
sekeliling paper disc (Gambar 3 & 4). Zona
tidak ungu ini menunjukkan aktivitas enzim
AHL-laktonase.
Paper disc
Zona degradasi
AHL
Gambar 3 Verifikasi aktivitas AHL-laktonase
isolat Bacillus sp. NTT 3a.
Kurva Pertumbuhan Bakteri
Pengukuran kekeruhan kultur Bacillus sp.
NTT 3e selama inkubasi menunjukkan
pertumbuhan yang lambat pada 6 jam pertama.
Berbeda dengan Bacillus sp. NTT 3e, kultur
Bacillus NTT 3a menunjukkan pertumbuhan
yang cepat di awal pertumbuhannya. Kedua
kultur bakteri menunjukkan fase pertumbuhan
eksponensial sampai umur 18 jam inkubasi.
Selanjutnya kedua kultur mengalami fase
stasioner sampai umur 54 jam (Gambar 5).
1
0,9
0,8
0,7
0,6
O
0,5
D 0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66
Waktu inkubasi (Jam)
Gambar 5 Kurva pertumbuhan kultur Bacillus
sp. NTT 3a ( ) dan Bacillus sp. NTT 3e ( )
pada media NB.
Paper disc
Zona degradasi
AHL
Gambar 4 Verifikasi aktivitas AHL-laktonase
isolat Bacillus sp. NTT 3e.
Kadar Protein Supernatan Kultur Bakteri
Absorbansi supernatan kultur Bacillus sp.
NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e berturut-turut
adalah 0,2735 dan 0,316. Setelah dimasukkan
ke dalam persamaan regresi kurva standar
protein BSA (Lampiran 2), maka rata-rata
kadar protein dari Bacillus sp. NTT 3a dan
Bacillus sp. NTT 3e adalah 0,539 mg/ml dan
0,578 mg/ml (Tabel 2).
Tabel 2 Kadar protein supernatan kultur
Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e
pada umur 24 jam
Isolat
Kadar Protein
(mg/ml)
NTT 3a
0,539
NTT 3e
0,578
Laju Pertumbuhan Spesifik Maksimum
(µm) Isolat
Berdasarkan persamaan yang diperoleh
(lampiran 3), isolat Bacillus sp. NTT 3a
memiliki laju pertumbuhan spesifik (µm)
sebesar 0,005 menit-1, sedangkan Bacillus sp.
NTT 3e sebesar 0,0042 menit-1 (Tabel 3).
Tabel 3 Pertumbuhan spesifik maksimum (µm)
dan waktu generasi Bacillus sp. NTT 3a dan
Bacillus sp. NTT 3e
Isolat
µmax
(menit -1)
Waktu
generasi
(menit)
NTT 3a
0,005
138
NTT 3e
0,0042
164
Aktivitas AHL-Laktonase
Hasil pengukuran aktivitas AHL-laktonase
yang berhasil diamati yaitu pada jam ke-0, ke6, ke-12, dan ke-42. Kedua isolat menunjukkan
adanya aktivitas AHL-laktonase pada jam ke6. Dilihat dari diameter zona tidak ungu yang
dihasilkan, dapat diketahui bahwa aktivitas
degradasi AHL pada isolat Bacillus sp. NTT
3a lebih tinggi dari isolat Bacillus sp. NTT 3e.
4
Tabel 4 Hasil uji aktivitas AHL-laktonase
dalam supernatan kultur Bacillus sp. NTT 3a
dan Bacillus sp. NTT 3e menggunakan
bioindikator C. violaceum
Umur
contoh
supernatan
kultur (jam)
dz-dp (mm)
Bacillus
sp. NTT
3a
0
6
12
42
0
1
2
3
Bacillus
sp. NTT
3e
0
6
12
42
0
0,5
1
2
Ket: dz = diameter zona tidak berwarna ungu
dp= diameter paper disc
0 jam
6 jam
12 jam
42 jam
Gambar 6 Zona degradasi autoinduser yang
dihasilkan Bacillus sp. NTT 3a selama 42 jam
pengamatan.
0 jam
6 jam
12 jam
42 jam
Gambar 7 Zona degradasi autoinduser yang
dihasilkan Bacillus sp. NTT 3e selama 42 jam
pengamatan.
PEMBAHASAN
Verifikasi produksi AHL-laktonase oleh
kedua bakteri menggunakan bioindikator
Chromobacterium violaceum menunjukkan
terbentuknya zona tidak ungu disekeliling
paper disc pada cawan uji. Difusi AHLlaktonase yang terkandung dalam supernatan
kultur dari paper disc ke media disekitarnya
menyebabkan degradasi senyawa AI yang
diekskresikan oleh C. violaceum. Degradasi
senyawa AI tersebut menyebabkan sel-sel C.
violaceum yang tumbuh di sekitar paper disc
tidak dapat berkomunikasi sehingga tidak
memproduksi pigmen violacein. AHLlaktonase secara spesifik menghidrolisis cincin
lakton pada molekul L-homoserine lacton.
Aktivitas enzim ini stabil pada suhu di bawah
37o tetapi tidak stabil pada suhu yang tinggi
(Wang et al. 2004).
Hasil pengamatan terhadap pertumbuhan
Bacillus sp. NTT 3e pada media NB (Gambar
5) menunjukkan adanya fase lag pada awal
pertumbuhan (6 jam pertama). Fase lag adalah
fase adaptasi bakteri dimana tidak ada
pertambahan nyata pada populasi sel, namun
sel mengalami pertambahan massa, dan
komposisi kimiawi, serta peningkatan aktivitas
metabolisme (Dias 2003). Fase lag tidak
teramati pada kultur Bacillus sp. NTT 3a. Hal
ini mengindikasikan bahwa bakteri tersebut
mampu beradaptasi dengan cepat. Fase
eksponensial kedua kultur bakteri berlangsung
sampai umur 18 jam, dan selanjutnya masuk
ke fase stasioner sampai umur 54 jam. Gambar
5 menunjukkan bahwa sepanjang pertumbuhannya, nilai OD kultur Bacillus sp.
5
NTT 3e lebih rendah dari OD kultur Bacillus
sp. NTT 3a. Tingginya nilai OD kultur
Bacillus sp. NTT 3a menunjukkan tingkat
pertumbuhan yang lebih cepat dibandingkan
dengan kultur Bacillus sp. NTT 3e. Hal ini
sesuai dengan hasil penghitungan laju
pertumbuhan spesifik dan waktu generasi
kedua bakteri tersebut (Tabel 3).
Laju pertumbuhan spesifik maksimum
(µm) isolat Bacillus sp. NTT 3a adalah 0,005
menit-1 sedangkan pada Bacillus sp. NTT 3e
0,0042 menit-1 dengan waktu generasi berturutturut adalah 138 menit dan 164 menit. Laju
pertumbuhan spesifik merupakan salah satu
parameter dari kinetika pertumbuhan bakteri
yang menunjukkan kecepatan maksimum
bakteri untuk membelah. Laju pertumbuhan
spesifik (µ) ini dipengaruhi oleh jenis dan
konsentrasi substrat yang digunakan. Laju
pertumbuhan spesifik akan menurun pada
konsentrasi substrat yang tinggi karena sel
bakteri telah mengalami kejenuhan dalam
memanfaatkan substrat yang ada (Lehninger
1982). Pertumbuhan bakteri diindikasikan
dengan peningkatan teratur jumlah sel, baik
ukuran, berat, maupun volume sel tunggal atau
koloni. Hal ini tergantung pada kemampuan sel
membentuk protoplasma baru dari nutrien
yang dapat digunakan di lingkungannya (Dias
2003). Suatu populasi dengan µm yang lebih
tinggi akan tumbuh lebih cepat dibandingkan
suatu populasi dengan µm yang rendah. Waktu
generasi dan µm secara umum berbanding
terbalik pada kisaran spesies yang sangat luas
(Campbell et al. 2004).
Berdasarkan pengukuran yang dilakukan,
kadar protein pada supernatan kultur Bacillus
sp. NTT 3e lebih tinggi dari Bacillus sp. NTT
3a dengan selisih 0,039 mg/ml. Namun
aktivitas degradasi autoinduser oleh enzim
yang terkandung dalam supernatan kultur NTT
3a lebih tinggi walaupun kadar protein totalnya
lebih rendah dari supernatan kultur NTT 3e.
Hal ini diduga disebabkan oleh aktivitas
spesifik AHL-laktonase pada kultur Bacillus
sp. NTT 3a lebih tinggi dibandingkan dengan
AHL-laktonase pada kultur NTT 3e. Selain itu,
tingginya kadar protein total pada supernatan
kultur NTT3e diduga disebabkan oleh berbagai
protein selain AHL-laktonase yang diekskresikan ke dalam kultur.
Aktivitas enzim AHL-laktonase menunjukkan peningkatan seiring dengan bertambahnya
populasi sel dalam kultur. Zona tidak ungu
yang terbentuk sebagai hasil aktivitas AHLlaktonase mulai terdeteksi pada sampel
supernatan kultur yang diambil pada fase log.
Aktivitas AHL-laktonase tertinggi tampak
pada hasil pengujian sampel yang diambil pada
fase stasioner yaitu pada umur 42 jam. Hai ini
menunjukkan bahwa semakin tinggi populasi
bakteri dalam kultur, semakin tinggi akumulasi
AHL-laktonase yang diproduksinya sehingga
semakin luas juga zona tidak ungu yang
terbentuk. Aktivitas AHL-laktonase Bacillus
sp. NTT 3a lebih tinggi dari Bacillus sp. NTT
3e (Gambar 5 dan 6).
SIMPULAN
Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT
3e mampu memproduksi enzim AHLlaktonase. AHL-laktonase yang dihasilkan dari
kedua isolat dapat mendegradasi AHL
sehingga menghambat produksi violacein.
Produksi AHL-laktonase kedua isolat tertinggi
pada fase stasioner. Laju pertumbuhan NTT 3a
lebih baik dari pada Bacillus sp. NTT 3e,
begitu pula dalam pengukuran aktivitas AHLlaktonasenya.
DAFTAR PUSTAKA
August PR et al. 2000. Sequence analysis and
functional characterization of the
violacein biosynthetic pathway from
Chromobacterium violaceum. J Mol
Microbiol Biotechnol 2: 513-519.
Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive
method for the quantitation of
microgram quantities of protein
utilizing the principle of protein-dye
binding. Anal Biochem 72 : 248-254.
Campbell NA, Reece JB, Mitchell LG. 2004.
Biologi. Ed ke-5. Wasmen Manalu,
penerjemah; A Safitri, editor. Jakarta:
Erlangga. Terjemahan dari: Biology.
Choo JH, Rukayadi Y, Hwang JK. 2006.
Inhibition of bacterial QS by vanilla
extract. Lett Appl Microbiol 42:637–
641.
Dias LP. 2003. Karakteristik Morfologi dan
Kurva Pertumbuhan Bacillus brevis dan
Bacillus apiarus [skripsi]. Bogor.
Fakultas Kedokteran Hewan, Institut
Pertanian Bogor.
Dong YH, Xu JL, Li XC, Zang LH. 2000.
aiiA, a novel enzyme inactivates acylhomoserine-lactone
quorum-sensing
signal and attenuates the virulence of
Erwinia carotovora. Proc Natl Acad Sci
97: 3526-3531.
Fitriyah A. 2011. Isolasi dan Karakterisasi
Bakteri Penghasil AHL-Laktonase Asal
6
Lahan Pertanian Luar Pulau Jawa
[skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika
dan Ilmu pengetahuan Alam, Institut
Pertanian Bogor.
Lehninger
AL.
1982.
Principles
of
Biochemistry. New York: Worth
Publishers.
Romero M, Diggle SP, Heeb S, Camara M,
Otero A. 2008. Quorum quenching
activity in Anabaena sp. PCC7120:
identification of AiiC, a novel AHLacylase. FEMS Microbiol 280: 73-80.
Rukayadi Y, Hwang JK. 2009. Pencegahan
quorum sensing: suatu pendekatan baru
dalam mengatasi infeksi bakteri.
Medicinus 22: 22-27.
Wang LH, Weng LX, Dong YH, Zhang LH.
2004. Specifity and enzym kinetics of
the
quorum-quenching
N-Acyl
Homoserine Lactone Lactonase (AHL-
lactonase). J Biol Chem. 279: 1364513651.
White CE, Finan TM. 2009. Quorum sensing
in Agrobacterium tumefaciens: chance
or necessity?. J Bacteriol 191: 11231125.
Yin XT et al. 2010. Isolation and
characterization of an AHL-lactonase
gene from Bacillus amyloliquefaciens.
World J Microbial Biotechnol 26:1361
– 1367.
Zhu H, Sun SJ. 2008. Inhibition of Bacterial
Quorum Sensing-Regulated Behaviors
by Tremella fuciformis Extract. Curr
Microbiol. 57: 418-422.
LAMPIRAN
8
Lampiran 1. Komposisi media pertumbuhan yang digunakan
A. Media Nutrien Agar (NA)
- 0.8 g nutrient broth
- 1,5 g agar
- 100 ml akuades
B. Media Nutrien Broth (NB)
- 0,8 g nutrient broth
- 100 ml akuades
C. Media Luria Agar (LA)
- 1 g Trypton
- 1 g NaCL
- 0,5 g yeast extract
- 0,1 g CaCO3
- 1,5 g agar
- 100 ml akuades
D. Media Luria Agar (LA) semi padat
- 1 g Trypton
- 1 g NaCL
- 0,5 g yeast extract
- 0,1 g CaCO3
- 1g agar
- 100 ml akuades
E. Media Luria Broth (LB)
- 1 g Trypton
- 1 g NaCL
- 0,5 g yeast extract
- 100 ml akuades
9
Lampiran 2. Kurva Standard Bradford
0,6
absorban
0,5
0,4
y = 0,931x + 0,2836
R² = 0,9603
0,3
absorban
Linear (absorban)
0,2
0,1
0
0
0,1
0,2
konsentrasi
0,3
0,4
Lampiran 3. Kurva Pertumbuhan Spesifik Isolat Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e.
A. Bacillus sp. NTT 3a
1
menit
0
-1 0
500
1000
1500
ln OD
-2
-3
ln 3a
y = 0,005x - 4,8873
R² = 0,735
-4
Linear (ln 3a)
-5
-6
-7
B. Bacillus sp. NTT 3e
menit
0
0
500
1000
1500
-1
ln OD
-2
ln 3e
-3
-4
-5
-6
y = 0,0042x - 4,8759
R² = 0,9228
Linear (ln 3e)