Sitotoksisitas Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese terhadap Sel Kanker Serviks HeLa
SITOTOKSISITAS EKSTRAK KULIT KAYU Pinus merkusii
Jungh. et de Vriese TERHADAP SEL KANKER SERVIKS
HeLa
KHOEROTUN NISA’
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Sitotoksisitas Ekstrak
Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese terhadap Sel Kanker Serviks HeLa
adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Februari 2013
Khoerotun Nisa’
NIM G84080027
ABSTRAK
KHOEROTUN NISA’. Sitotoksisitas Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh.
et de Vriese terhadap Sel Kanker Serviks HeLa. Dibimbing oleh ANNA
PRIANGANI ROSWIEM dan SYAMSUL FALAH.
Kanker serviks merupakan kanker yang paling banyak menyebabkan
kematian pada wanita di Indonesia. Salah satu upaya pengobatan kanker dapat
dilakukan dengan memanfaatkan senyawa dari bahan alam. Beberapa tanaman
mempunyai potensi sebagai antikanker, salah satunya adalah kulit kayu Pinus
merkusii. Tujuan dari penelitian ini adalah menguji aktivitas sitotoksik ekstrak
kulit kayu Pinus merkusii terhadap sel HeLa dengan uji microculture tetrazolium
technique (MTT). Penelitian ini juga menguji kandungan fitokimia dan penapisan
awal sitotoksisitas dengan Artemia salina. Rendemen tertinggi diperoleh dari
ekstrak etanol 70% sebesar 6.30%. Pinus merkusii mengandung flavonoid,
triterpenoid, saponin, dan tanin. Hasil uji sitotoksisitas menggunakan A. salina
menunjukkan bahwa ekstrak kulit kayu P. merkusii memiliki aktivitas dan potensi
antikanker karena nilai LC50 < 1000 μg/mL. Ekstrak etanol 70% kulit kayu P.
merkusii memiliki aktivitas sitotoksik paling tinggi terhadap sel HeLa dengan
nilai IC50 sebesar 266.01 μg/mL daripada ekstrak metanol, air, dan aseton dengan
IC50 berturut-turut sebesar 408.13 μg/mL, 433.51 μg/mL, dan 880.24 μg/mL.
Kata kunci: kanker serviks, Pinus merkusii, sel HeLa, sitotoksisitas
ABSTRACT
KHOEROTUN NISA'. Cytotoxicity of Pinus merkusii Jungh. et de Vriese Bark
Extract against HeLa Cervical Cancer Cells. Under the direction of ANNA
PRIANGANI ROSWIEM and SYAMSUL FALAH.
Cervical cancer is the most common death cause of cancer in Indonesian
women. One of the efforts of cancer treatment is the utilization of natural
materials compounds. Some plants have potential as anticancer, one of them is
bark of Pinus merkusii. The purpose of this study was to determine the cytotoxic
activity of Pinus merkusii bark extract against HeLa cells by microculture
tetrazolium technique (MTT) assay. The study also tested the phytochemical
content and the initial screening of cytotoxicity with Artemia salina. The Highest
yield of 70% ethanol P. merkusii bark extract was 6.30%. Pinus merkusii contains
flavonoids, triterpenoids, saponins and tannins. The results of cytotoxicity assay
using A. salina showed that the Pinus merkusii bark extract has activity and
potential as anticancer indicated by its LC50 values < 1000 μg/mL. The 70%
ethanol extract of P. merkusii bark has highest cytotoxic activity against HeLa
cells with IC50 value of 266.01 μg/mL which was higher than methanol, water,
and aceton extract with IC50 values for respectively 408.13 μg/mL, 433.51 μg/mL,
dan 880.24 μg/mL.
Keywords: cervical cancer, cytotoxicity, HeLa cells, Pinus merkusii
SITOTOKSISITAS EKSTRAK KULIT KAYU Pinus merkusii
Jungh. et de Vriese TERHADAP SEL KANKER SERVIKS
HeLa
KHOEROTUN NISA’
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi : Sitotoksisitas Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de
Vriese terhadap Sel Kanker Serviks HeLa
Nama
: Khoerotun Nisa’
NIM
: G84080027
Disetujui oleh
Dr Anna P. Roswiem, MS
Pembimbing I
Dr Syamsul Falah, SHut, MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Alhamdulillahirobbil’alamin, puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah
SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan
skripsi ini. Shalawat serta salam pun tercurah pada Nabi Muhammad SAW. Karya
ilmiah dengan judul “Sitotoksisitas Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et
de Vriese terhadap Sel Kanker Serviks HeLa” disusun berdasarkan penelitian
yang telah dilaksanakan di Laboratorium Biokimia, IPB dan di Laboratorium
Mikrobiologi Pusat Studi Satwa Primata (PSSP), Bogor. Kegiatan penelitian
dilakukan pada Februari sampai Oktober 2012 di bawah bimbingan Dr Anna P.
Roswiem, MS dan Dr Syamsul Falah, SHut, MSi.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Dr Anna Priangani Roswiem,
MS selaku pembimbing utama dan Bapak Dr Syamsul Falah, SHut, MSi selaku
pembimbing kedua yang telah memberikan saran, kritik, dan motivasi serta atas
kesabarannya dalam membimbing selama penulisan karya ilmiah ini. Terima
kasih juga penulis ucapkan kepada Ibu Silmi Mariya, SSi, MSi yang telah
membantu mengerjakan dan membimbing dalam pelaksanaan uji MTT di PSSP.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada drh Sulistiyani, MSc, PhD; Dr Ir I
Made Artika, MAppSc; dan Prof Dr drh Maria Bintang, MS sebagai komisi
kelayakan skripsi dan penguji. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan
kepada Ayah, Ibu, dan seluruh keluarga atas doa dan motivasi yang selalu
diberikan pada penulis. Tidak lupa penulis ucapkan terima kasih kepada Annisa
Utami, Rina Fazilaturrahmi, Didit Haryadi, Khairrunnisa, Annisa Rosiyana, dan
Lusianawati atas bantuannya selama menjalankan penelitian dan penulisan karya
ilmiah ini serta Nia Nuzul Kurniasih, Eka Purwatresna, Aina Mardiyah, Nur
Sofiana S, Rian Triana, Yuanita N, Dita M, dan Satriaji Hartamto yang senantiasa
memberikan dukungan dan motivasinya.
Kekurangan dan kesalahan merupakan hal yang lazim ditemui dalam tiap
laporan, tidak terkecuali laporan ini. Oleh karena itu, penulis memohon maaf dan
menanti saran, koreksi, dan kritik yang membangun untuk penulisan berikutnya
yang lebih baik. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi kemajuan ilmu
pengetahuan.
Bogor, Februari 2013
Khoerotun Nisa’
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Bahan dan Alat
2
Metode Penelitian
2
HASIL
5
Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese
5
Fitokimia Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese
5
Sitotoksisitas pada Artemia salina Leanch
6
Sitotoksisitas Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese terhadap
sel HeLa
6
PEMBAHASAN
8
SIMPULAN
10
DAFTAR PUSTAKA
10
LAMPIRAN
12
RIWAYAT HIDUP
14
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
Rendemen ekstrak kulit kayu P. merkusii
Kandungan fitokimia ekstrak kulit kayu P. merkusii
Nilai LC50 ekstrak kulit kayu P. merkusii
Inhibisi ekstrak kulit kayu P. merkusii terhadap sel HeLa
5
6
6
7
DAFTAR GAMBAR
1 Nilai IC50 ekstrak kulit kayu P. merkusii
2 Sel HeLa: (a) tanpa perlakuan, (b) inhibisi < 50%, (c) inhibisi > 50%
7
8
DAFTAR LAMPIRAN
1 Inhibisi dan IC50 ekstrak kulit kayu P. merkusii terhadap sel HeLa
2 Analisis statistik % inhibisi ekstrak kulit kayu P. merkusii terhadap sel
HeLa menggunakan program SPSS
12
13
PENDAHULUAN
Kanker merupakan salah satu penyakit mematikan setelah penyakit
kardiovaskuler dan penyakit menular. Tahun 2008 terdapat 24.6 juta penderita
kanker (semua jenis), 12.7 juta kasus baru, dan 6.7 juta kematian akibat kanker.
Angka kematian akibat kanker secara global diperkirakan akan meningkat sebesar
45% dari 11.3 juta kasus baru kanker pada tahun 2007 menjadi 15.5 juta kasus
pada tahun 2030 (WHO 2010).
Kanker serviks (mulut atau leher rahim) merupakan salah satu kanker yang
paling sering dijumpai pada wanita. Kanker serviks sering terjadi karena infeksi
Human Papilloma Virus (HPV) (Melva 2008). Penelitian menunjukkan bahwa
terdapat 12 170 kasus kanker serviks di Amerika pada tahun 2012 (Siegel et al.
2012). Sebanyak 80% dari sekitar 500 000 wanita yang menderita kanker serviks
setiap tahun di seluruh dunia terjadi di negara-negara berkembang dan
mengakibatkan kematian sebanyak 250 000 orang (Wilson et al. 2004). Kanker
serviks merupakan kanker yang paling banyak menyebabkan kematian pada
wanita di Indonesia. Catatan medis di RS Dr. Sardjito Yogyakarta dalam kurun
waktu satu tahun, terdapat 235 kasus kanker serviks (Yuniarto & Warsito 2012).
Pengobatan kanker serviks dilakukan sesuai tingkatan stadium klinis dan
secara umum dapat digolongkan menjadi tiga, yaitu operasi, radioterapi, dan
kemoterapi (Hahn & Payne 2003). Operasi bertujuan untuk menghilangkan sel-sel
kanker dengan menghilangkan bagian yang terkena kanker dan jaringan di
sekitarnya. Operasi biasanya dilakukan pada kanker serviks stadium awal. Sisasisa sel kanker yang tidak bersih setelah operasi dapat muncul kembali. Selain itu,
operasi juga dapat menyebabkan penderita kehilangan kemampuan untuk
bereproduksi atau hamil. Pengobatan dengan radiasi menggunakan sinar berenergi
tinggi untuk membunuh sel-sel kanker. Pengobatan dengan radiasi memiliki efek
samping, seperti mual, muntah, diare, iritasi (NCI 2012) dan bahkan dapat
meningkatkan risiko munculnya kanker lain, seperti kanker uterus, ginjal, dan
kandung kemih (ACS 2012). Pengobatan dengan kemoterapi ditujukan untuk
menghancurkan sel kanker sehingga ukuran kanker mengecil dan kemunculannya
kembali setelah pengobatan dapat dicegah. Kemoterapi menggunakan obat-obatan
untuk membunuh sel kanker, dan pada kanker serviks kemoterapi biasanya
dikombinasikan dengan terapi radiasi. Kemoterapi mampu membunuh
pertumbuhan sel-sel kanker, tetapi juga dapat membahayakan sel-sel normal di
sekitarnya (NCI 2012). Kemoterapi juga dapat meningkatkan risiko timbulnya
kanker lain, yaitu leukemia (ACS 2012).
Berbagai kelemahan tersebut memicu perlunya suatu terobosan cara
pengobatan kanker dengan efektifitas tinggi dan efek samping yang minimal.
Salah satu upaya pengobatan kanker dapat dilakukan dengan memanfaatkan
senyawa yang terkandung dalam bahan alam. Polisakarida alam telah diteliti pada
hewan percobaan dan pasien kanker untuk mengetahui potensinya dalam
menghambat pertumbuhan tumor dan menginduksi apoptosis dalam sel kanker,
dengan demikian dapat meningkatkan hasil dari terapi pengobatan pada penderita
kanker (Oba et al. 2007). Selain itu, banyak jenis tanaman yang mempunyai
potensi sebagai antikanker, salah satu diantaranya adalah kulit kayu Pinus
merkusii Jungh. et de Vriese.
2
Pinus merkusii Jungh. et de Vriese merupakan satu-satunya jenis tumbuhan
pinus yang tumbuh di Indonesia (Dahlian & Hartoyo 1997). Kulit kayu pinus
merupakan limbah industri pengolahan berbahan baku kayu pinus. Kayu pinus
dimanfaatkan untuk triplek, venir, pulp, konstruksi ringan, mebel, batang korek
api, dan sumpit. Getahnya dapat dijadikan sabun, gondorukem, perekat, cat dan
kosmetik, sedangkan kulit kayunya sampai saat ini hanya digunakan sebagai kayu
bakar (Khaerudin 1999).
Penelitian mengenai aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker dari beberapa
jenis pinus telah dilakukan. Kulit kayu Pinus koraiensis memiliki aktivitas
sitotoksik terhadap sel kanker serviks HeLa (Li et al. 2011). Selain itu, kulit kayu
Pinus massoniana memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker hati BEL7402 (Cui et al. 2005). Berdasarkan penelitian tersebut dapat diasumsikan bahwa
Pinus merkusii Jungh. et de Vriese juga memiliki kemampuan sitotoksik terhadap
sel kanker serviks HeLa.
Limbah kulit kayu P. merkusii belum banyak dimanfaatkan dan diteliti,
sehingga perlu diteliti tentang aktivitas sitotoksik ekstrak kulit kayu pinus
terhadap sel kanker serviks HeLa. Tujuan dari penelitian ini adalah menguji
aktivitas sitotoksik ekstrak kulit kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese terhadap
sel kanker serviks (HeLa) secara in vitro. Hipotesis yang diajukan dalam
penelitian ini adalah ekstrak kulit kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese
mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker serviks (HeLa). Penelitian ini
diharapkan dapat menambah nilai guna dari tanaman Pinus merkusii Jungh. et de
Vriese.
METODE
Bahan dan Alat
Bahan baku utama yang digunakan adalah kulit kayu Pinus merkusii Jungh.
et de Vriese yang diperoleh dari areal hutan pinus Fakultas Kehutanan, Institut
Pertanian Bogor, sel kanker serviks HeLa (American Type Culture Collection®
Catalog No. CCL-2TM), Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, fetal
bovine serum (FBS), Phosphate Buffered Saline (PBS), penisilin-steptomisin)
yang diperoleh dari Invitrogen USA), dan garam tetrazolium 3-(4,5-dimetiltiazol2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida.
Alat-alat yang digunakan adalah OGAWA® vacuum pan evaporator,
penggiling kayu Villey Mill® hammer mill dengan penyaring berukuran 20 mesh,
sentrifus Beckman®, Germany (tipe GS-6R dengan GH-3.8 swinging bucket
rotor), inkubator CO2 (BINDER® C 150 dengan konsentrasi CO2 5%, kelembaban
95%, suhu 37oC), dan Bio-Rad® microplate reader Model 680 dengan ketelitian
100% dan kisaran panjang gelombang 340-800 nm (kalibrasi dan servis alat
berkala setiap 3 bulan).
Metode Penelitian
Ekstraksi Simplisia Kulit Kayu Pinus Merkusii Jungh. et de Vriese
Kulit kayu pinus yang terdiri atas campuran inner dan outer bark
dibersihkan. Setelah itu, kulit kayu pinus dipotong-potong dan dikeringkan di
3
bawah sinar matahari. Setelah kering, kulit kayu pinus dibuat serbuk dengan
hammer mill. Serbuk kulit kayu pinus tersebut kemudian diekstraksi.
Ekstraksi Etanol 70% (BPOM 2005). Ekstraksi dilakukan dengan
mencampurkan 40 gram simplisia dengan 400 mL etanol 70%. Kemudian
simplisia direndam dalam pelarut selama 24 jam dan dipisahkan maseratnya.
Maserat yang diperoleh dipisahkan dengan menggunakan kertas saring Whatmann
No.1 dan proses maserasi diulang sebanyak dua kali. Semua maserat yang
diperoleh dikumpulkan dan diuapkan menggunakan vacuum pan evaporator.
Ekstraksi Air (Abbas & Mahmudatussaadah 2006). Ekstraksi ini
dilakukan dengan mencampurkan akuades dan simplisia dengan perbandingan
1:10, kemudian dipanaskan dengan suhu 80oC selama 3 jam. Ekstrak yang
diperoleh dipisahkan dengan menggunakan kertas saring Whatmann No.1 dan
proses tersebut diulang sebanyak dua kali dengan menggunakan simplisia dan
pelarut yang sama. Semua filtrat yang diperoleh dikumpulkan dan diuapkan
menggunakan vacuum pan evaporator.
Ekstraksi Aseton dan Metanol (Falah et al. 2010). Ekstraksi ini dilakukan
dengan mencampurkan simplisia dan aseton pada suhu ruangan selama 48 jam,
kemudian ekstrak yang diperoleh dipisahkan dengan menggunakan kertas saring
Whatmann No.1 dan proses tersebut diulang sebanyak dua kali. Residu yang
diperoleh dilarutkan kembali dalam metanol dan diulang sebanyak dua kali.
Semua filtrat yang diperoleh dikumpulkan dan diuapkan menggunakan vacuum
pan evaporator.
Uji Fitokimia (Harbone 1987)
Uji Flavonoid. Ekstrak sampel sebanyak 0.1 g ditambah 2 mL metanol
sampai terendam lalu dipanaskan. Filtratnya ditambahkan H2SO4 sebanyak 3 tetes.
Terbentuknya warna merah akibat penambahan H2SO4 pekat menunjukkan
adanya flavonoid.
Uji Alkaloid. Sebanyak 10 mL kloroform ditambah dengan ekstrak sampel
0.1 g dan beberapa tetes ammonia. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan
dengan 10 tetes H2SO4 2 M. Fraksi asam diambil dan dibagi menjadi 3 bagian ke
dalam plat tetes, kemudian ke dalam tiap bagian ditambahkan dengan masingmasing pereaksi, yaitu pereaksi Dragendorf, Meyer, dan Wagner. Adanya alkaloid
ditandai dengan terbentuknya endapan merah oleh pereaksi Dragendorf, endapan
putih oleh pereaksi Meyer, dan endapan coklat oleh pereaksi Wagner.
Uji Tanin. Sebanyak 1 g ekstrak sampel ditambah 10 mL akuades kemudian
dididihkan selama 30 menit. Setelah dingin, campuran disaring dan filtratnya
ditambah FeCl3 1% sebanyak 5 mL (b/v). Warna biru tua atau hitam menunjukkan
adanya tanin.
Uji Saponin. Ekstrak sampel sebanyak 0.1 g ditambah akuades 5 mL dan
dipanaskan selama 5 menit. Larutan tersebut didinginkan kemudian dikocok.
Timbulnya busa selama ± 10 menit menunjukkan adanya saponin.
Uji Triterpenoid dan Steroid. Ekstrak sampel sebanyak 0.1 g ditambah 2
mL etanol 30% kemudian dipanaskan dan disaring. Selanjutnya filtrat diuapkan
dan ditambahkan eter sebanyak 1 mL. Lapisan eter ditambah dengan pereaksi
Lieberman Buchard (3 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes H2S04 pekat). Warna
merah atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid dan warna hijau menunjukkan
adanya steroid.
4
Uji Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) (Meyer et al. 1982)
Telur udang Artemia salina L. sebanyak 1 sudip dilarutkan dalam 250 ml air
laut, kemudian dimasukkan aerator ke dalamnya dan didiamkan selama 2x24 jam
supaya menjadi larva udang. Selanjutnya disiapkan stok larutan sampel dengan
konsentrasi 2 000 μg/mL. Ke dalam masing-masing sumur dimasukkan 10 larva
udang yang telah didiamkan 2x24 jam dalam 200 µL air laut. Kemudian
ditambahkan 800 µL air laut. Selanjutnya pada sumur secara berurutan dari baris
pertama sampai baris keempat dimasukkan sampel sehingga konsentrasi akhir
menjadi 1 000 ppm, 500 ppm, 100 ppm, dan 10 ppm. Perhitungan larva yang
masih hidup dan yang mati dilakukan setelah 24 jam. Setelah itu, dilakukan
perhitungan untuk menentukan nilai LC50 melalui program SPSS.
Pengujian Aktivitas Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese
pada Sel HeLa secara in vitro
Pengujian ini dilakukan oleh Laboratorium Bagian Mikrobiologi dan
Imunologi Pusat Studi Satwa Primata, Bogor.
Media Sel Kanker (LCAG 2009). Media DMEM bubuk dimasukkan ke
dalam botol steril dan ditambahkan 3.7 gram NaHCO3, antibiotik penisilinstreptomisin 1%, dan 10% FBS, kemudian dihomogenisasi dan ditambahkan
akuabides sampai larutan media menjadi 1000 mL.
Kultur Sel HeLa (Li et al. 2011). Sel HeLa ditumbuhkan dalam flask yang
berisi media DMEM. Setelah sel tumbuh (menempel pada dinding flask),
medianya dibuang dan sel HeLa dalam flask dibilas dengan larutan PBS. Setelah
itu, dimasukkan enzim tripsin sebanyak 5 mL, lalu dinkubasikan selama 5 menit,
dan kemudian ditambahkan media DMEM. Campuran tersebut disentrifus pada
kecepatan 1500 rpm selama 5 menit. Supernatan yang diperoleh dibuang dan pelet
(sel HeLa) yang diperoleh ditambah dengan 5 mL DMEM. Setelah itu, dilakukan
perhitungan jumlah sel HeLa. Jumlah sel dihitung hingga masing-masing sumur
akan terisi 5.000 unit sel dari 100 μL kultur sel HeLa, dan dimasukkan ke dalam
tiap sumur sebanyak 96 sumur. Kultur sel tersebut diinkubasi selama 24 jam (over
night) dalam inkubator CO2.
Perlakuan Ekstrak. Setelah kultur sel HeLa diinkubasi selama 24 jam
medianya dibuang, kemudian dilanjutkan dengan perlakuan ekstrak. Ekstrak yang
diuji meliputi ekstrak air, ekstrak etanol 70%, ekstrak aseton, dan ekstrak metanol.
Masing-masing larutan ekstrak terdiri dari 5 konsentrasi akhir pada microplate.
Tahap awal perlakuan ekstrak adalah dengan membuat stok larutan ekstrak
dengan konsentrasi masing-masing 2 000 μg/mL, yang dibuat dengan cara
melarutkan 5 mg ekstrak dengan 50 μL DMSO, kemudian ditambah dengan 950
μL DMEM. Masing-masing larutan ekstrak kemudian diencerkan dengan
menambahkan DMEM untuk mendapatkan konsentrasi akhir pada microplate.
Konsentrasi akhir yang digunakan pada ekstrak etanol 70%, aseton, dan metanol
adalah 10, 50, 100, 150, dan 200 μg/mL, sedangkan pada ekstrak air adalah 10, 75,
150, 300, dan 500 μg/mL. Ke dalam tiap sumur microplate yang berisi sel HeLa
dari tahap sebelumnya (kultur sel HeLa), ditambahkan 100 μL larutan ekstrak uji
di atas sebagai perlakuan, dan ditambahkan 100 μL DMEM sebagai kontrol
negatif. Campuran dalam microplate tersebut diinkubasi selama 48 jam dalam
inkubator CO2.
5
Uji Sitotoksisitas dengan MTT (CCRC 2000). Setelah diinkubasi 48 jam,
dimasukkan garam tetrazolium sebanyak 10 μL tiap sumur. Warna campuran
menjadi kuning. Setelah itu, diinkubasi selama 4 jam pada inkubator CO2. Setelah
diinkubasi dan telah terbentuk kristal formazan, larutan ekstrak dibuang. Kristal
formazan yang terbentuk dilarutkan dengan 100 μL etanol 96% pada tiap sumur.
Warna larutan menjadi ungu. Nilai absorban dari formazan yang terbentuk diukur
dengan microplate reader pada panjang gelombang 595 nm. Semua perlakuan
dilakukan triplo.
Analisis Data
Data yang diperoleh dari uji sitotoksisitas dengan MTT berupa nilai
absorban tiap sumur, kemudian nilai absorban tersebut dikonversi
menjadi %inhibisi dengan menggunakan rumus (Zhang et al. 2005):
% Inhibisi =
A kontrol-A sampel
x100%
A kontrol
Nilai Inhibition concentration 50% (IC50) ditentukan melalui persamaan
regresi linear dari log konsentrasi yang digunakan dengan nilai %sel hidup
(CCRC 2000). Analisis statistik untuk membandingkan inhibisi tiap ekstrak
dilakukan dengan menggunakan One-Way ANOVA dengan SPSS. Jika terdapat
perbedaan yang nyata, maka analisis dilanjutkan dengan uji Duncan menggunakan
program SPSS.
HASIL
Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese
Kulit kayu Pinus merkusii yang diekstraksi adalah simplisia berupa serbuk
yang berwarna coklat kemerahan. Ekstraksi serbuk kulit kayu pinus menghasilkan
ekstrak yang berbentuk serbuk setelah diuapkan. Ekstrak air yang diperoleh
berwarna jingga kemerahan, ekstrak metanol dan etanol 70% berwarna coklat
kemerahan, dan ekstrak aseton berwarna coklat kehitaman. Nilai rendemen
ekstrak kulit kayu Pinus merkusii yang diperoleh dapat dilihat pada Tabel 1.
Berdasarkan hasil yang diperoleh, ekstraksi dengan etanol 70% pada kulit kayu
Pinus merkusii menghasilkan rendemen terbesar yaitu sebesar 6.30%.
Fitokimia Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese
Hasil uji fitokimia pada ekstrak kulit kayu pinus dapat dilihat pada Tabel 2.
Keempat ekstrak mengandung senyawa flavonoid, tanin, saponin, dan triterpenoid.
Tabel 1 Rendemen ekstrak kulit kayu P. merkusii
Ekstrak
Air
Etanol 70%
Aseton
Metanol
Rendemen (%)
4.61
6.30
3.29
4.67
6
Berdasarkan hasil uji fitokimia, walaupun mengandung senyawa yang sama tetapi
intensitas warna yang ditimbulkan berbeda.
Sitotoksisitas pada Artemia salina Leanch
Aktivitas suatu senyawa ditunjukkan sebagai nilai konsentrasi letal 50
(LC50). Nilai LC50 dihitung dengan menggunakan analisis probit dengan SPSS.
Tabel 3 menunjukkan hasil uji BSLT pada ekstrak kulit kayu P. merkusii.
Keempat ekstrak kulit kayu Pinus merkusii memiliki nilai LC50 lebih kecil dari
1000 μg/mL.
Sitotoksisitas Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese
terhadap sel HeLa
Hasil dari uji sitotoksisitas dengan metode MTT berupa nilai absorban dari
masing-masing ekstrak dengan beberapa konsentrasi. Rerata nilai absorban dari
triplo masing-masing ekstrak dengan beberapa konsentrasi yang diperoleh
digunakan untuk menghitung nilai % inhibisi (Lampiran 1). Nilai % inhibisi ini
diperoleh dari perhitungan (Zhang et al. 2005), dan untuk mendapatkan rerata %
inhibisi serta beda nyata antar perlakuan menggunakan Oneway ANOVA yang
dilanjutkan dengan uji Duncan (Lampiran 2). Nilai % inhibisi masing-masing
ekstrak kulit kayu pinus dengan beberapa konsentrasi dapat dilihat pada Tabel 4.
Berdasarkan data hasil yang diperoleh, ekstrak etanol 70% dengan konsentrasi
200 μg/mL dan ekstrak air konsentrasi 500 μg/mL mampu menginhibisi sel HeLa
lebih dari 50%. Ekstrak aseton dan metanol dengan konsentrasi yang digunakan
belum mampu menghambat sel HeLa lebih dari 50%. Ekstrak air memiliki persen
inhibisi terbesar terhadap sel HeLa dengan nilai % inhibisi sebesar 59.34% pada
Tabel 2 Kandungan fitokimia ekstrak kulit kayu P. merkusii
Ekstrak
Uji fitokimia
Air
Etanol 70%
Aseton
Flavonoid
+++
+++
++
Alkaloid
Tanin
++
++
+++
Saponin
+++
+++
+
Steroid
Triterpenoid
++
+
+++
Metanol
+++
+
++
++
+
Keterangan: tanda (+) menunjukkan tingkat intensitas warna dan (-) menunjukkan senyawa
metabolit sekunder tidak terdapat pada ekstrak
Tabel 3 Nilai LC50 ekstrak kulit kayu P. merkusii
Ekstrak
Air
Etanol 70%
Aseton
Metanol
LC50 (μg/mL)
634.79
465.45
206.43
398.89
7
mL. Nilai % inhibisi in
ni tidak berrbeda nyataa dengan ek
kstrak
konsentrassi 500 µg/m
etanol denngan konsenntrasi 200 μg/mL
μ
deng
gan % inhibbisi sebesar 51.94%. Hal
H ini
menunjukkkan bahwa ekstrak etaanol 70% lebih
l
efektif daripada ekstrak air kulit
kayu P. merkusii.
Selaain nilai % inhibisi,
i
padda penelitian
n ini juga dicari
d
nilai IC50 dari maasingmasing ekkstrak kulit kayu pinus dalam men
nghambat peertumbuhann sel HeLa. Nilai
IC50 diperroleh berdassarkan persaamaan gariss dari regreesi linear anntara rerata % sel
hidup denngan log konnsentrasi ekkstrak yang digunakan (Lampiran 1) (CCRC 2000).
2
Sesuai Gaambar 1, ekkstrak etanol 70% kulitt kayu pinuus memiliki nilai IC50 paling
p
tinggi, yaiitu 266.01 μg/mL.
μ
Tabel 4 Inhibisi ekstraak kulit kayyu P. merku
usii terhadapp sel HeLa
Konsenntrasi (μg/m
mL)
Eksstrak
Inhibissi (%)
Air
0
0.000
75
4.36a
150
15.31a,b,c
300
34.557e,f
500
59.344h
Etanol 70%
%
0
0.000
50
32.599e,f
42.555f,g
100
150
35.88e,f
200
51.94g,h
Aseton
0
0.000
4.61a
50
2.477a
100
150
7.088a,b
200
36.055e,f
Metanol
0
0.000
50
8.81a,b
100
27.82c,d,e
150
29.555d,e,f
35.880e,f
200
Keterangan: angka yang diikuti huruf yang sama tiidak berbeda nyata pada uj
uji Duncan den
ngan
5
taraf nyata 5%
100
00
880.24
IC50 (μg/mL)
80
00
60
00
433.51
1
40
00
408.13
266.01
20
00
0
air
etanol 70%
%
aseton
metanol
Gambbar 1 Nilai IC
I 50 ekstrak
k kulit kayu P. merkusiii
8
(a)
(b)
(c)
mbar 2 Sel HeLa: (a) taanpa perlakkuan, (b) inh
hibisi < 50%
%, (c) inhibiisi > 50%
Gam
Morfologii sel HeLa dapat diam
mati dengan bantuan miikroskop (G
Gambar 2).
Gam
mbar (a) meemperlihatkkan bentuk dan pertu
umbuhan seel HeLa yaang masih
norm
mal atau tannpa perlakuuan. Gambaar (b) dan (c) adalah sel HeLa yyang telah
menddapatkan peerlakuan dann mengalam
mi inhibisi.
PEMB
BAHASA
AN
Beberapa jenis tanam
man telah diteliti mem
miliki kemaampuan meenghambat
pertuumbuhan sel
s kanker,, salah saatunya darii keluarga Pinaceae. Senyawa
prosiianidin dari kulit kayu Pinus koraaiensis mem
miliki aktivittas sitotoksiik terhadap
sel HeLa
H
(Li et al. 20111), dan senyawa
s
ku
uersetin daari kulit kaayu Pinus
masssoniana mem
miliki aktivvitas sitotokksik terhadap
p sel kankeer hati BEL--7402 (Cui
et al. 2005). Prosianidin
P
dan kuerssetin termaasuk dalam
m senyawa flavonoid.
Adannya ketertaarikan terhhadap senyyawa yang
g diduga mampu
m
meenghambat
pertuumbuhan seel kanker, yakni flavonnoid telah mendasari
m
peemilihan peelarut yang
digunnakan untukk ekstraksi. Senyawa flavonoid
fl
daapat bersifatt polar atau semipolar,
sehinngga digunaakan pelarutt air, asetonn, etanol 70%
%, dan metaanol.
Uji fitokim
mia dilakukkan untuk menguji
m
keeberadaan senyawa
s
yaang diduga
dapaat mengham
mbat pertumbbuhan sel kanker,
k
dan senyawa metabolit
m
sekkunder lain
padaa ekstrak kuulit kayu P. merkusii. Senyawa
S
yaang diduga mampu meenghambat
pertuumbuhan seel kanker addalah flavonnoid. Ekstraak air, etanol 70%, meetanol, dan
9
aseton kulit kayu P. merkusii menunjukkan hasil positif pada uji flavonoid.
Berdasarkan hasil uji fitokimia tersebut, kulit kayu P. merkusii diduga mampu
menghambat pertumbuhan sel kanker serviks HeLa.
Penapisan awal senyawa yang diduga berkhasiat sebagai antikanker dapat
dilakukan dengan metode BSLT (Anderson 1991). BSLT merupakan salah satu
metode untuk menguji bahan-bahan yang bersifat sitotoksik. Metode ini
menggunakan larva Artemia salina Leach sebagai hewan coba. Suatu ekstrak
dikatakan aktif sebagai antikanker berdasarkan metode BSLT jika nilai LC50 <
1000 μg/mL (Meyer et al. 1982). Berdasarkan hasil uji BSLT, keempat ekstrak
kulit kayu pinus, yaitu ekstrak air, etanol 70%, aseton, dan metanol menunjukkan
nilai LC50 < 1000 μg/mL. Hal ini menandakan bahwa keempat ekstrak tersebut
memiliki aktivitas sebagai antikanker. Setelah tahap praskrining atau penapisan
awal terhadap senyawa antikanker dengan metode BSLT, maka perlu dilanjutkan
dengan uji sitotoksisitas menggunakan sel kanker secara in vitro untuk melihat
pengaruh ekstrak secara langsung terhadap sel kanker.
Uji sitotoksisitas menggunakan sel kanker serviks HeLa dilakukan untuk
melihat ada tidaknya aktivitas sitotoksik ekstrak kulit kayu Pinus merkusii
terhadap sel kanker serviks. Metode pengujian sitotoksisitas yang banyak
digunakan adalah dengan penggunaan microculture tetrazolium technique (MTT)
(Arung et al. 2009). Metode pengujian sitotoksisitas MTT didasarkan pada prinsip
kolorimetri (Itharat & Ooraikul 2007). Prinsip dari uji MTT adalah terjadinya
mekanisme perubahan warna kuning dari garam tetrazolium (3-(4,5-dimetiltiazol2-il)-2,5-difeniltetrazoliumbromida) yang tereduksi menjadi kristal formazan
berwarna ungu dalam mitokondria sel hidup (Mosmann 1983).
Uji sitotoksisitas digunakan untuk menentukan parameter nilai IC50. Nilai
IC50 menunjukkan nilai konsentrasi yang menghasilkan hambatan proliferasi sel.
Nilai LC50 ekstrak kulit kayu P. merkusii dengan metode BSLT tidak
menunjukkan adanya hubungan positif dengan nilai IC50 terhadap sel kanker
serviks HeLa dengan metode MTT. Penelitian lain juga menunjukkan hal yang
serupa. Senyawa isopropanol dari ekstrak spesies invertebrata dan makroalga laut
menunjukkan korelasi yang rendah antara sitotoksisitas dengan BSLT dan
sitotoksisitas terhadap sel kanker paru-paru (A-549) serta sel kanker usus (HT-29)
(Carballo et al. 2002). Klasifikasi aktivitas sitotoksik ekstrak terhadap sel kanker
dapat digolongkan menjadi tiga, yaitu kategori sangat toksik jika nilai IC50 < 10
μg/mL, kategori toksik jika nilai IC50 10-100 μg/mL, dan kategori cukup toksik
jika nilai IC50 100-500 μg/mL (Weerapreeyakul et al. 2012). Berdasarkan
klasifikasi tersebut, ekstrak etanol 70%, air, dan metanol kulit kayu P. merkusii
yang memiliki nilai IC50 antara 100-500 μg/mL, mempunyai aktivitas sitotoksik
yang tergolong cukup sitotoksik terhadap sel kanker serviks HeLa.
Morfologi sel HeLa dapat diamati dengan bantuan mikroskop (Gambar 2).
Bentuk dan pertumbuhan sel HeLa tanpa perlakuan tampak melekat ke semua
bagian permukaan tempat tumbuh dan menempel antar sel serta bentuknya masih
tampak jelas. Sel HeLa yang telah mendapatkan perlakuan dan terjadi inhibisi
mengalami perubahan pada morfologi selnya. Beberapa sel HeLa yang mengalami
inhibisi < 50% masih tampak sama dengan sel HeLa tanpa perlakuan dan sebagian
sel telah mengalami kerusakan. Perubahan morfologi sel yang paling terlihat
adalah pada sel HeLa yang mengalami inhibisi > 50%. Sel terlihat tidak beraturan
dan telah lepas dari permukaan tempat tumbuh maupun antar sel. Sel HeLa juga
10
terlihat seperti terdegradasi menjadi bagian-bagian kecil seperti badan-badan
apoptotik pada sel yang mengalami proses apoptosis.
Mekanisme penghambatan pertumbuhan sel kanker HeLa sendiri tidak
diteliti dalam penelitian ini, sehingga belum diketahui secara pasti mekanisme
penghambatan ekstrak kulit kayu P. merkusii terhadap sel HeLa. Senyawa
prosianidin ekstrak etanol 95% kulit kayu P. koraiensis mampu menghambat
pertumbuhan sel kanker HeLa melalui induksi apoptosis (Li et al. 2011). P.
merkusii merupakan keluarga Pinaceae dan satu keluarga dengan P. koraiensis.
Oleh karena itu, dapat diasumsikan bahwa mekanisme penghambatan terhadap sel
HeLa dari ekstrak kulit kayu P. merkusii juga terjadi melalui induksi apoptosis.
SIMPULAN
Ekstrak etanol 70% kulit kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese memiliki
aktivitas sitotoksik paling tinggi terhadap sel kanker serviks HeLa secara in vitro
dengan nilai IC50 sebesar 266.01 μg/mL daripada ekstrak metanol, air, dan aseton
(IC50 > 400 μg/mL).
DAFTAR PUSTAKA
Abbas A, Mahmudatussaadah A. 2006. Minuman Fungsional Berbahan Dasar Teh
dan Kayu Manis untuk Penderita Diabetes. Prosiding Seminar Nasional
Iptek Solusi Kemandirian Bangsa; 2006 Ags 2-3; Yogyakarta,Indonesia.
Yogyakarta (ID): ISBN. hlm 105-110.
[ACS] American Cancer Society. 2012. Cancer Facts & Figures 2012. Atlanta
(US): American Cancer Soc.
Anderson A. 1991. List of insect pest susceptible to neem products. The Neem
Tree-Source of Unique Natural products for Integrated Pest Management,
Medicine, Industry and Other Purposes. ipp. Weinheim: VCH. 9: 195-204.
Arung et al. 2009. Anti-cancer properties of diethylether extract of wood from
sukun (Artocarpus altilis) in human breast cancer (T47D) cells. Trop J
Pharm Res. 8:317-324.
[BPOM] Badan Pengawas Obat dan Makanan. 2005. Monografi Ekstrak
Tumbuhan Obat Indonesia. Jakarta (ID): BPOM RI.
[CCRC] Cancer Chemoprevention Research Center. 2000. Prosedur Tetap Uji
Sitotoksis Metode MTT. Yogyakarta (ID): Fakultas Farmasi, Universitas
Gajah Mada.
Carballo JL, Inda ZLH, Pérez P, Grávalos MDG. 2002. A comparison between
two brine shrimp assays to detect in vitro cytotoxicity in marine natural
products. BMC Biotechnology. 2(17):1-5.
Cui Y, Xie H, Wang J. 2005. Potential biomedical properties of Pinus massoniana
bark extract. Phytother. Res. 19:34-38.doi:10.1002/ptr.1619.
Dahlian E, Hartoyo. 1997. Komponen kimia terpentin dari getah tusam (Pinus
merkusii) asal Kalimantan Barat. Info Hasil Hutan. 4(1): 38-44.
11
Falah S, Safithri M, Katayama T, Suzuki T. 2010. Hypoglycemic effect of
mahogany (Swietenia macrophylla King) bark extracts in alloxan-induced
diabetic rats. Wood Research Journal. 1(2): 89-94.
Hahn DB, Payne WA. 2003. Focus on Health. New York (US): Mc-Graw Hill.
Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia. Bandung: ITB Pr.
Itharat A, Ooraikul B. 2007. Research on Thai medicinal plants for cancer
treatment. Research Signpost. 37(2):287-314.
Khaerudin. 1999. Pembibitan Tanaman HTI. Jakarta (ID): Penebar Swadaya.
Li K, Li Q, Zhang T, Han Z, Li J, Liu Z, Zheng F. 2011. Procyanidins from Pinus
koraiensis bark inhibits HeLa cell growth by inducing apoptosis and
reducing survivin protein expression. Afr. J. Biotechnol. 10(40):7766-7771.
[LCAG] Lonza Cologne AG. 2009. Amaxa® Cell Line Nucleofector® Kit R for
HeLa Cells [ATCC® CCL-2™]. Jerman (DE): Lonza Cologne AG.
Melva. 2008. Faktor-faktor yang mempengaruhi kejadian kanker leher rahim pada
penderita yang datang berobat di RSUP H. Adam Malik Medan tahun 2008
[tesis]. Medan (ID): Sekolah Pasacasarjana Universitas Sumatera Utara.
Meyer BN, Ferrigni NR, Putnam JE, Jacobsen LB, Nichols DE, Mclaughlin JL.
1982. Brine shrimp: a convenient general bioassay for active plants
constituent. J. Medical Plant Res. 45: 31-34.
Mosmann T. 1983. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:
application to proliferation and cyotoxicity. J. Immuno. Method. 65: 55-63.
[NCI] National Cancer Institute. 2012. Cancer Treatment. National Cancer
Institut [internet]. [diunduh 2012 Okt 3]. Tersedia pada:
http://www.cancer.gov/cancertopics/wyntk/cervix/page8.
Oba K, Teramukai S, Kobayashi M, Matsui T, Kodera Y, Sakamoto J. 2007.
Efficacy of adjuvant immunochemotherapy with polysaccharide K for
patients with curative resections of gastric cancer. Cancer Immunol.
Immunother. 56(6): 905–911.
Siegel R, Naishadham D, Jemal A. 2012. Cancer statistics, 2012. Cancer J. Clin.
62:10-29. doi:10.3322/caac.20138.
Weerapreeyakul N, Nonpunya A, Barusrux S, Thitimetharoch T, Sripanidkulchai
B.2012. Evaluation of the anticancer potential of six herbs against a
hepatoma cell line. Chinese Medicine. 7(15):1-7.
Wilson CM, Tobin S, Young RC. 2004. The exploding worldwide cancer burden:
The impact of cancer on women. Int. J. Gynecol Cancer 14: 1–11.
[WHO] World Health Organization. Globocan Stats Section of Cancer
Information. 2010. Cancer. WHO [internet]. [diunduh 2012 Sep 16].
Tersedia pada: http://www.who.int/about/copyright/en/
Yuniarto Mi, Warsito B. 2012. Hubungan antara umur perkawinan dengan
kejadian karsinoma serviks di Rumah Sakit Dr. Sardjito periode 1 Januari 31 Desember 2005. FKIK, siap terbit.
Zhang M, Zhang JJ, Adelman RA, Liu Y, Zhang MX, Lu F, Yan M. 2005.
Inhibition of the human choroidal microvascular endothelial cells
proliferation by endostatin. Invest Ophthalmol Vis. Sci. 46: 3355-3360.
12
Lampiran 1 Inhibisi dan IC50 ekstrak kulit kayu P. merkusii terhadap sel HeLa
Contoh perhitungan % inhibisi:
Ekstrak etanol 70% 200 µg/ml
R
A
• % Inhibisi =
R
.
=
.
= 51.94%
.
A
R
x
A
%
x
%
• Rerata % sel hidup = 100% - % inhibisi
= 100% - 51.94%
= 48.06%
Keterangan: Rerata % inhibisi diperoleh dari Oneway ANOVA program SPSS
Contoh perhitungan nilai IC50:
Sel hidup (%)
Ekstrak etanol 70%
120
100
80
60
40
20
0
y = -24.306x + 108.942
R² = 0.934
0
0.5
1
1.5
2
Log konsentrasi (μg/mL)
Grafik Log konsentrasi dengan % sel hidup
Perhitungan nilai IC50 berdasarkan persamaan garis:
y = ax + b
Keterangan: y = % inhibisi
x = log konsentrasi
y = -24.306x + 108.942
50 = -24.306x + 108.942
x = 2.425
IC50 = antilog 2.425
= 266.01 μg/mL
2.5
13
Lampiran 2 Analisis statistik % inhibisi ekstrak kulit kayu P. merkusii terhadap
sel HeLa menggunakan program SPSS
14
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan pada tanggal 16 Mei 1990 di Pemalang, Jawa Tengah dari
pasangan Amsori dan Mutmainah. Penulis merupakan anak terakhir dari tujuh
bersaudara. Penulis lulus pada tahun 2002 dari SD Negeri 1 Wiyorowetan,
kemudian melanjutkan pedidikan di SMP Negeri 1 Ulujami. Penulis lulus dari
SMA Negeri 1 Comal pada tahun 2008 dan diterima di Departemen Biokimia,
IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) pada tahun yang sama.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif dalam beberapa organisasi,
antara lain sebagai anggota Badan Eksekutif Mahasiswa Tingkat Persiapan
Bersama pada tahun 2008-2009 dan anggota himpunan profesi Biokimia IPB
(CREBs) pada tahun 2009-2010 dan 2010-2011. Penulis juga mengikuti
kepanitiaan beberapa acara di IPB. Selain itu, penulis juga aktif mengikuti
beberapa kompetisi menulis baik tingkat nasional maupun internasional. Penulis
mendapatkan hibah dana bersaing dari Dikti melalui Program Kreativitas
Mahasiswa bidang Pengabdian Masyarakat pada tahun 2011 dan bidang Penelitian
pada tahun 2012.
Penulis pernah menjadi asisten praktikum Matrikulasi Kimia Dasar pada
tahun 2010 dan praktikum Kimia Dasar untuk mahasiswa Tingkat Persiapan
Bersama tahun 2010. Tahun 2011 penulis melakukan kegiatan praktik lapangan di
Balai Besar Penelitian Pascapanen, Cimanggu, Bogor di bawah bimbingan Ibu
Popi Asri Kurniatin, SSi, Apt, MS; dan Ibu Ermi Sukasih, STP, MSi.
Jungh. et de Vriese TERHADAP SEL KANKER SERVIKS
HeLa
KHOEROTUN NISA’
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Sitotoksisitas Ekstrak
Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese terhadap Sel Kanker Serviks HeLa
adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Februari 2013
Khoerotun Nisa’
NIM G84080027
ABSTRAK
KHOEROTUN NISA’. Sitotoksisitas Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh.
et de Vriese terhadap Sel Kanker Serviks HeLa. Dibimbing oleh ANNA
PRIANGANI ROSWIEM dan SYAMSUL FALAH.
Kanker serviks merupakan kanker yang paling banyak menyebabkan
kematian pada wanita di Indonesia. Salah satu upaya pengobatan kanker dapat
dilakukan dengan memanfaatkan senyawa dari bahan alam. Beberapa tanaman
mempunyai potensi sebagai antikanker, salah satunya adalah kulit kayu Pinus
merkusii. Tujuan dari penelitian ini adalah menguji aktivitas sitotoksik ekstrak
kulit kayu Pinus merkusii terhadap sel HeLa dengan uji microculture tetrazolium
technique (MTT). Penelitian ini juga menguji kandungan fitokimia dan penapisan
awal sitotoksisitas dengan Artemia salina. Rendemen tertinggi diperoleh dari
ekstrak etanol 70% sebesar 6.30%. Pinus merkusii mengandung flavonoid,
triterpenoid, saponin, dan tanin. Hasil uji sitotoksisitas menggunakan A. salina
menunjukkan bahwa ekstrak kulit kayu P. merkusii memiliki aktivitas dan potensi
antikanker karena nilai LC50 < 1000 μg/mL. Ekstrak etanol 70% kulit kayu P.
merkusii memiliki aktivitas sitotoksik paling tinggi terhadap sel HeLa dengan
nilai IC50 sebesar 266.01 μg/mL daripada ekstrak metanol, air, dan aseton dengan
IC50 berturut-turut sebesar 408.13 μg/mL, 433.51 μg/mL, dan 880.24 μg/mL.
Kata kunci: kanker serviks, Pinus merkusii, sel HeLa, sitotoksisitas
ABSTRACT
KHOEROTUN NISA'. Cytotoxicity of Pinus merkusii Jungh. et de Vriese Bark
Extract against HeLa Cervical Cancer Cells. Under the direction of ANNA
PRIANGANI ROSWIEM and SYAMSUL FALAH.
Cervical cancer is the most common death cause of cancer in Indonesian
women. One of the efforts of cancer treatment is the utilization of natural
materials compounds. Some plants have potential as anticancer, one of them is
bark of Pinus merkusii. The purpose of this study was to determine the cytotoxic
activity of Pinus merkusii bark extract against HeLa cells by microculture
tetrazolium technique (MTT) assay. The study also tested the phytochemical
content and the initial screening of cytotoxicity with Artemia salina. The Highest
yield of 70% ethanol P. merkusii bark extract was 6.30%. Pinus merkusii contains
flavonoids, triterpenoids, saponins and tannins. The results of cytotoxicity assay
using A. salina showed that the Pinus merkusii bark extract has activity and
potential as anticancer indicated by its LC50 values < 1000 μg/mL. The 70%
ethanol extract of P. merkusii bark has highest cytotoxic activity against HeLa
cells with IC50 value of 266.01 μg/mL which was higher than methanol, water,
and aceton extract with IC50 values for respectively 408.13 μg/mL, 433.51 μg/mL,
dan 880.24 μg/mL.
Keywords: cervical cancer, cytotoxicity, HeLa cells, Pinus merkusii
SITOTOKSISITAS EKSTRAK KULIT KAYU Pinus merkusii
Jungh. et de Vriese TERHADAP SEL KANKER SERVIKS
HeLa
KHOEROTUN NISA’
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi : Sitotoksisitas Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de
Vriese terhadap Sel Kanker Serviks HeLa
Nama
: Khoerotun Nisa’
NIM
: G84080027
Disetujui oleh
Dr Anna P. Roswiem, MS
Pembimbing I
Dr Syamsul Falah, SHut, MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Alhamdulillahirobbil’alamin, puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah
SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan
skripsi ini. Shalawat serta salam pun tercurah pada Nabi Muhammad SAW. Karya
ilmiah dengan judul “Sitotoksisitas Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et
de Vriese terhadap Sel Kanker Serviks HeLa” disusun berdasarkan penelitian
yang telah dilaksanakan di Laboratorium Biokimia, IPB dan di Laboratorium
Mikrobiologi Pusat Studi Satwa Primata (PSSP), Bogor. Kegiatan penelitian
dilakukan pada Februari sampai Oktober 2012 di bawah bimbingan Dr Anna P.
Roswiem, MS dan Dr Syamsul Falah, SHut, MSi.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Dr Anna Priangani Roswiem,
MS selaku pembimbing utama dan Bapak Dr Syamsul Falah, SHut, MSi selaku
pembimbing kedua yang telah memberikan saran, kritik, dan motivasi serta atas
kesabarannya dalam membimbing selama penulisan karya ilmiah ini. Terima
kasih juga penulis ucapkan kepada Ibu Silmi Mariya, SSi, MSi yang telah
membantu mengerjakan dan membimbing dalam pelaksanaan uji MTT di PSSP.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada drh Sulistiyani, MSc, PhD; Dr Ir I
Made Artika, MAppSc; dan Prof Dr drh Maria Bintang, MS sebagai komisi
kelayakan skripsi dan penguji. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan
kepada Ayah, Ibu, dan seluruh keluarga atas doa dan motivasi yang selalu
diberikan pada penulis. Tidak lupa penulis ucapkan terima kasih kepada Annisa
Utami, Rina Fazilaturrahmi, Didit Haryadi, Khairrunnisa, Annisa Rosiyana, dan
Lusianawati atas bantuannya selama menjalankan penelitian dan penulisan karya
ilmiah ini serta Nia Nuzul Kurniasih, Eka Purwatresna, Aina Mardiyah, Nur
Sofiana S, Rian Triana, Yuanita N, Dita M, dan Satriaji Hartamto yang senantiasa
memberikan dukungan dan motivasinya.
Kekurangan dan kesalahan merupakan hal yang lazim ditemui dalam tiap
laporan, tidak terkecuali laporan ini. Oleh karena itu, penulis memohon maaf dan
menanti saran, koreksi, dan kritik yang membangun untuk penulisan berikutnya
yang lebih baik. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi kemajuan ilmu
pengetahuan.
Bogor, Februari 2013
Khoerotun Nisa’
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Bahan dan Alat
2
Metode Penelitian
2
HASIL
5
Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese
5
Fitokimia Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese
5
Sitotoksisitas pada Artemia salina Leanch
6
Sitotoksisitas Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese terhadap
sel HeLa
6
PEMBAHASAN
8
SIMPULAN
10
DAFTAR PUSTAKA
10
LAMPIRAN
12
RIWAYAT HIDUP
14
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
Rendemen ekstrak kulit kayu P. merkusii
Kandungan fitokimia ekstrak kulit kayu P. merkusii
Nilai LC50 ekstrak kulit kayu P. merkusii
Inhibisi ekstrak kulit kayu P. merkusii terhadap sel HeLa
5
6
6
7
DAFTAR GAMBAR
1 Nilai IC50 ekstrak kulit kayu P. merkusii
2 Sel HeLa: (a) tanpa perlakuan, (b) inhibisi < 50%, (c) inhibisi > 50%
7
8
DAFTAR LAMPIRAN
1 Inhibisi dan IC50 ekstrak kulit kayu P. merkusii terhadap sel HeLa
2 Analisis statistik % inhibisi ekstrak kulit kayu P. merkusii terhadap sel
HeLa menggunakan program SPSS
12
13
PENDAHULUAN
Kanker merupakan salah satu penyakit mematikan setelah penyakit
kardiovaskuler dan penyakit menular. Tahun 2008 terdapat 24.6 juta penderita
kanker (semua jenis), 12.7 juta kasus baru, dan 6.7 juta kematian akibat kanker.
Angka kematian akibat kanker secara global diperkirakan akan meningkat sebesar
45% dari 11.3 juta kasus baru kanker pada tahun 2007 menjadi 15.5 juta kasus
pada tahun 2030 (WHO 2010).
Kanker serviks (mulut atau leher rahim) merupakan salah satu kanker yang
paling sering dijumpai pada wanita. Kanker serviks sering terjadi karena infeksi
Human Papilloma Virus (HPV) (Melva 2008). Penelitian menunjukkan bahwa
terdapat 12 170 kasus kanker serviks di Amerika pada tahun 2012 (Siegel et al.
2012). Sebanyak 80% dari sekitar 500 000 wanita yang menderita kanker serviks
setiap tahun di seluruh dunia terjadi di negara-negara berkembang dan
mengakibatkan kematian sebanyak 250 000 orang (Wilson et al. 2004). Kanker
serviks merupakan kanker yang paling banyak menyebabkan kematian pada
wanita di Indonesia. Catatan medis di RS Dr. Sardjito Yogyakarta dalam kurun
waktu satu tahun, terdapat 235 kasus kanker serviks (Yuniarto & Warsito 2012).
Pengobatan kanker serviks dilakukan sesuai tingkatan stadium klinis dan
secara umum dapat digolongkan menjadi tiga, yaitu operasi, radioterapi, dan
kemoterapi (Hahn & Payne 2003). Operasi bertujuan untuk menghilangkan sel-sel
kanker dengan menghilangkan bagian yang terkena kanker dan jaringan di
sekitarnya. Operasi biasanya dilakukan pada kanker serviks stadium awal. Sisasisa sel kanker yang tidak bersih setelah operasi dapat muncul kembali. Selain itu,
operasi juga dapat menyebabkan penderita kehilangan kemampuan untuk
bereproduksi atau hamil. Pengobatan dengan radiasi menggunakan sinar berenergi
tinggi untuk membunuh sel-sel kanker. Pengobatan dengan radiasi memiliki efek
samping, seperti mual, muntah, diare, iritasi (NCI 2012) dan bahkan dapat
meningkatkan risiko munculnya kanker lain, seperti kanker uterus, ginjal, dan
kandung kemih (ACS 2012). Pengobatan dengan kemoterapi ditujukan untuk
menghancurkan sel kanker sehingga ukuran kanker mengecil dan kemunculannya
kembali setelah pengobatan dapat dicegah. Kemoterapi menggunakan obat-obatan
untuk membunuh sel kanker, dan pada kanker serviks kemoterapi biasanya
dikombinasikan dengan terapi radiasi. Kemoterapi mampu membunuh
pertumbuhan sel-sel kanker, tetapi juga dapat membahayakan sel-sel normal di
sekitarnya (NCI 2012). Kemoterapi juga dapat meningkatkan risiko timbulnya
kanker lain, yaitu leukemia (ACS 2012).
Berbagai kelemahan tersebut memicu perlunya suatu terobosan cara
pengobatan kanker dengan efektifitas tinggi dan efek samping yang minimal.
Salah satu upaya pengobatan kanker dapat dilakukan dengan memanfaatkan
senyawa yang terkandung dalam bahan alam. Polisakarida alam telah diteliti pada
hewan percobaan dan pasien kanker untuk mengetahui potensinya dalam
menghambat pertumbuhan tumor dan menginduksi apoptosis dalam sel kanker,
dengan demikian dapat meningkatkan hasil dari terapi pengobatan pada penderita
kanker (Oba et al. 2007). Selain itu, banyak jenis tanaman yang mempunyai
potensi sebagai antikanker, salah satu diantaranya adalah kulit kayu Pinus
merkusii Jungh. et de Vriese.
2
Pinus merkusii Jungh. et de Vriese merupakan satu-satunya jenis tumbuhan
pinus yang tumbuh di Indonesia (Dahlian & Hartoyo 1997). Kulit kayu pinus
merupakan limbah industri pengolahan berbahan baku kayu pinus. Kayu pinus
dimanfaatkan untuk triplek, venir, pulp, konstruksi ringan, mebel, batang korek
api, dan sumpit. Getahnya dapat dijadikan sabun, gondorukem, perekat, cat dan
kosmetik, sedangkan kulit kayunya sampai saat ini hanya digunakan sebagai kayu
bakar (Khaerudin 1999).
Penelitian mengenai aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker dari beberapa
jenis pinus telah dilakukan. Kulit kayu Pinus koraiensis memiliki aktivitas
sitotoksik terhadap sel kanker serviks HeLa (Li et al. 2011). Selain itu, kulit kayu
Pinus massoniana memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker hati BEL7402 (Cui et al. 2005). Berdasarkan penelitian tersebut dapat diasumsikan bahwa
Pinus merkusii Jungh. et de Vriese juga memiliki kemampuan sitotoksik terhadap
sel kanker serviks HeLa.
Limbah kulit kayu P. merkusii belum banyak dimanfaatkan dan diteliti,
sehingga perlu diteliti tentang aktivitas sitotoksik ekstrak kulit kayu pinus
terhadap sel kanker serviks HeLa. Tujuan dari penelitian ini adalah menguji
aktivitas sitotoksik ekstrak kulit kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese terhadap
sel kanker serviks (HeLa) secara in vitro. Hipotesis yang diajukan dalam
penelitian ini adalah ekstrak kulit kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese
mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker serviks (HeLa). Penelitian ini
diharapkan dapat menambah nilai guna dari tanaman Pinus merkusii Jungh. et de
Vriese.
METODE
Bahan dan Alat
Bahan baku utama yang digunakan adalah kulit kayu Pinus merkusii Jungh.
et de Vriese yang diperoleh dari areal hutan pinus Fakultas Kehutanan, Institut
Pertanian Bogor, sel kanker serviks HeLa (American Type Culture Collection®
Catalog No. CCL-2TM), Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, fetal
bovine serum (FBS), Phosphate Buffered Saline (PBS), penisilin-steptomisin)
yang diperoleh dari Invitrogen USA), dan garam tetrazolium 3-(4,5-dimetiltiazol2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida.
Alat-alat yang digunakan adalah OGAWA® vacuum pan evaporator,
penggiling kayu Villey Mill® hammer mill dengan penyaring berukuran 20 mesh,
sentrifus Beckman®, Germany (tipe GS-6R dengan GH-3.8 swinging bucket
rotor), inkubator CO2 (BINDER® C 150 dengan konsentrasi CO2 5%, kelembaban
95%, suhu 37oC), dan Bio-Rad® microplate reader Model 680 dengan ketelitian
100% dan kisaran panjang gelombang 340-800 nm (kalibrasi dan servis alat
berkala setiap 3 bulan).
Metode Penelitian
Ekstraksi Simplisia Kulit Kayu Pinus Merkusii Jungh. et de Vriese
Kulit kayu pinus yang terdiri atas campuran inner dan outer bark
dibersihkan. Setelah itu, kulit kayu pinus dipotong-potong dan dikeringkan di
3
bawah sinar matahari. Setelah kering, kulit kayu pinus dibuat serbuk dengan
hammer mill. Serbuk kulit kayu pinus tersebut kemudian diekstraksi.
Ekstraksi Etanol 70% (BPOM 2005). Ekstraksi dilakukan dengan
mencampurkan 40 gram simplisia dengan 400 mL etanol 70%. Kemudian
simplisia direndam dalam pelarut selama 24 jam dan dipisahkan maseratnya.
Maserat yang diperoleh dipisahkan dengan menggunakan kertas saring Whatmann
No.1 dan proses maserasi diulang sebanyak dua kali. Semua maserat yang
diperoleh dikumpulkan dan diuapkan menggunakan vacuum pan evaporator.
Ekstraksi Air (Abbas & Mahmudatussaadah 2006). Ekstraksi ini
dilakukan dengan mencampurkan akuades dan simplisia dengan perbandingan
1:10, kemudian dipanaskan dengan suhu 80oC selama 3 jam. Ekstrak yang
diperoleh dipisahkan dengan menggunakan kertas saring Whatmann No.1 dan
proses tersebut diulang sebanyak dua kali dengan menggunakan simplisia dan
pelarut yang sama. Semua filtrat yang diperoleh dikumpulkan dan diuapkan
menggunakan vacuum pan evaporator.
Ekstraksi Aseton dan Metanol (Falah et al. 2010). Ekstraksi ini dilakukan
dengan mencampurkan simplisia dan aseton pada suhu ruangan selama 48 jam,
kemudian ekstrak yang diperoleh dipisahkan dengan menggunakan kertas saring
Whatmann No.1 dan proses tersebut diulang sebanyak dua kali. Residu yang
diperoleh dilarutkan kembali dalam metanol dan diulang sebanyak dua kali.
Semua filtrat yang diperoleh dikumpulkan dan diuapkan menggunakan vacuum
pan evaporator.
Uji Fitokimia (Harbone 1987)
Uji Flavonoid. Ekstrak sampel sebanyak 0.1 g ditambah 2 mL metanol
sampai terendam lalu dipanaskan. Filtratnya ditambahkan H2SO4 sebanyak 3 tetes.
Terbentuknya warna merah akibat penambahan H2SO4 pekat menunjukkan
adanya flavonoid.
Uji Alkaloid. Sebanyak 10 mL kloroform ditambah dengan ekstrak sampel
0.1 g dan beberapa tetes ammonia. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan
dengan 10 tetes H2SO4 2 M. Fraksi asam diambil dan dibagi menjadi 3 bagian ke
dalam plat tetes, kemudian ke dalam tiap bagian ditambahkan dengan masingmasing pereaksi, yaitu pereaksi Dragendorf, Meyer, dan Wagner. Adanya alkaloid
ditandai dengan terbentuknya endapan merah oleh pereaksi Dragendorf, endapan
putih oleh pereaksi Meyer, dan endapan coklat oleh pereaksi Wagner.
Uji Tanin. Sebanyak 1 g ekstrak sampel ditambah 10 mL akuades kemudian
dididihkan selama 30 menit. Setelah dingin, campuran disaring dan filtratnya
ditambah FeCl3 1% sebanyak 5 mL (b/v). Warna biru tua atau hitam menunjukkan
adanya tanin.
Uji Saponin. Ekstrak sampel sebanyak 0.1 g ditambah akuades 5 mL dan
dipanaskan selama 5 menit. Larutan tersebut didinginkan kemudian dikocok.
Timbulnya busa selama ± 10 menit menunjukkan adanya saponin.
Uji Triterpenoid dan Steroid. Ekstrak sampel sebanyak 0.1 g ditambah 2
mL etanol 30% kemudian dipanaskan dan disaring. Selanjutnya filtrat diuapkan
dan ditambahkan eter sebanyak 1 mL. Lapisan eter ditambah dengan pereaksi
Lieberman Buchard (3 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes H2S04 pekat). Warna
merah atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid dan warna hijau menunjukkan
adanya steroid.
4
Uji Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) (Meyer et al. 1982)
Telur udang Artemia salina L. sebanyak 1 sudip dilarutkan dalam 250 ml air
laut, kemudian dimasukkan aerator ke dalamnya dan didiamkan selama 2x24 jam
supaya menjadi larva udang. Selanjutnya disiapkan stok larutan sampel dengan
konsentrasi 2 000 μg/mL. Ke dalam masing-masing sumur dimasukkan 10 larva
udang yang telah didiamkan 2x24 jam dalam 200 µL air laut. Kemudian
ditambahkan 800 µL air laut. Selanjutnya pada sumur secara berurutan dari baris
pertama sampai baris keempat dimasukkan sampel sehingga konsentrasi akhir
menjadi 1 000 ppm, 500 ppm, 100 ppm, dan 10 ppm. Perhitungan larva yang
masih hidup dan yang mati dilakukan setelah 24 jam. Setelah itu, dilakukan
perhitungan untuk menentukan nilai LC50 melalui program SPSS.
Pengujian Aktivitas Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese
pada Sel HeLa secara in vitro
Pengujian ini dilakukan oleh Laboratorium Bagian Mikrobiologi dan
Imunologi Pusat Studi Satwa Primata, Bogor.
Media Sel Kanker (LCAG 2009). Media DMEM bubuk dimasukkan ke
dalam botol steril dan ditambahkan 3.7 gram NaHCO3, antibiotik penisilinstreptomisin 1%, dan 10% FBS, kemudian dihomogenisasi dan ditambahkan
akuabides sampai larutan media menjadi 1000 mL.
Kultur Sel HeLa (Li et al. 2011). Sel HeLa ditumbuhkan dalam flask yang
berisi media DMEM. Setelah sel tumbuh (menempel pada dinding flask),
medianya dibuang dan sel HeLa dalam flask dibilas dengan larutan PBS. Setelah
itu, dimasukkan enzim tripsin sebanyak 5 mL, lalu dinkubasikan selama 5 menit,
dan kemudian ditambahkan media DMEM. Campuran tersebut disentrifus pada
kecepatan 1500 rpm selama 5 menit. Supernatan yang diperoleh dibuang dan pelet
(sel HeLa) yang diperoleh ditambah dengan 5 mL DMEM. Setelah itu, dilakukan
perhitungan jumlah sel HeLa. Jumlah sel dihitung hingga masing-masing sumur
akan terisi 5.000 unit sel dari 100 μL kultur sel HeLa, dan dimasukkan ke dalam
tiap sumur sebanyak 96 sumur. Kultur sel tersebut diinkubasi selama 24 jam (over
night) dalam inkubator CO2.
Perlakuan Ekstrak. Setelah kultur sel HeLa diinkubasi selama 24 jam
medianya dibuang, kemudian dilanjutkan dengan perlakuan ekstrak. Ekstrak yang
diuji meliputi ekstrak air, ekstrak etanol 70%, ekstrak aseton, dan ekstrak metanol.
Masing-masing larutan ekstrak terdiri dari 5 konsentrasi akhir pada microplate.
Tahap awal perlakuan ekstrak adalah dengan membuat stok larutan ekstrak
dengan konsentrasi masing-masing 2 000 μg/mL, yang dibuat dengan cara
melarutkan 5 mg ekstrak dengan 50 μL DMSO, kemudian ditambah dengan 950
μL DMEM. Masing-masing larutan ekstrak kemudian diencerkan dengan
menambahkan DMEM untuk mendapatkan konsentrasi akhir pada microplate.
Konsentrasi akhir yang digunakan pada ekstrak etanol 70%, aseton, dan metanol
adalah 10, 50, 100, 150, dan 200 μg/mL, sedangkan pada ekstrak air adalah 10, 75,
150, 300, dan 500 μg/mL. Ke dalam tiap sumur microplate yang berisi sel HeLa
dari tahap sebelumnya (kultur sel HeLa), ditambahkan 100 μL larutan ekstrak uji
di atas sebagai perlakuan, dan ditambahkan 100 μL DMEM sebagai kontrol
negatif. Campuran dalam microplate tersebut diinkubasi selama 48 jam dalam
inkubator CO2.
5
Uji Sitotoksisitas dengan MTT (CCRC 2000). Setelah diinkubasi 48 jam,
dimasukkan garam tetrazolium sebanyak 10 μL tiap sumur. Warna campuran
menjadi kuning. Setelah itu, diinkubasi selama 4 jam pada inkubator CO2. Setelah
diinkubasi dan telah terbentuk kristal formazan, larutan ekstrak dibuang. Kristal
formazan yang terbentuk dilarutkan dengan 100 μL etanol 96% pada tiap sumur.
Warna larutan menjadi ungu. Nilai absorban dari formazan yang terbentuk diukur
dengan microplate reader pada panjang gelombang 595 nm. Semua perlakuan
dilakukan triplo.
Analisis Data
Data yang diperoleh dari uji sitotoksisitas dengan MTT berupa nilai
absorban tiap sumur, kemudian nilai absorban tersebut dikonversi
menjadi %inhibisi dengan menggunakan rumus (Zhang et al. 2005):
% Inhibisi =
A kontrol-A sampel
x100%
A kontrol
Nilai Inhibition concentration 50% (IC50) ditentukan melalui persamaan
regresi linear dari log konsentrasi yang digunakan dengan nilai %sel hidup
(CCRC 2000). Analisis statistik untuk membandingkan inhibisi tiap ekstrak
dilakukan dengan menggunakan One-Way ANOVA dengan SPSS. Jika terdapat
perbedaan yang nyata, maka analisis dilanjutkan dengan uji Duncan menggunakan
program SPSS.
HASIL
Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese
Kulit kayu Pinus merkusii yang diekstraksi adalah simplisia berupa serbuk
yang berwarna coklat kemerahan. Ekstraksi serbuk kulit kayu pinus menghasilkan
ekstrak yang berbentuk serbuk setelah diuapkan. Ekstrak air yang diperoleh
berwarna jingga kemerahan, ekstrak metanol dan etanol 70% berwarna coklat
kemerahan, dan ekstrak aseton berwarna coklat kehitaman. Nilai rendemen
ekstrak kulit kayu Pinus merkusii yang diperoleh dapat dilihat pada Tabel 1.
Berdasarkan hasil yang diperoleh, ekstraksi dengan etanol 70% pada kulit kayu
Pinus merkusii menghasilkan rendemen terbesar yaitu sebesar 6.30%.
Fitokimia Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese
Hasil uji fitokimia pada ekstrak kulit kayu pinus dapat dilihat pada Tabel 2.
Keempat ekstrak mengandung senyawa flavonoid, tanin, saponin, dan triterpenoid.
Tabel 1 Rendemen ekstrak kulit kayu P. merkusii
Ekstrak
Air
Etanol 70%
Aseton
Metanol
Rendemen (%)
4.61
6.30
3.29
4.67
6
Berdasarkan hasil uji fitokimia, walaupun mengandung senyawa yang sama tetapi
intensitas warna yang ditimbulkan berbeda.
Sitotoksisitas pada Artemia salina Leanch
Aktivitas suatu senyawa ditunjukkan sebagai nilai konsentrasi letal 50
(LC50). Nilai LC50 dihitung dengan menggunakan analisis probit dengan SPSS.
Tabel 3 menunjukkan hasil uji BSLT pada ekstrak kulit kayu P. merkusii.
Keempat ekstrak kulit kayu Pinus merkusii memiliki nilai LC50 lebih kecil dari
1000 μg/mL.
Sitotoksisitas Ekstrak Kulit Kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese
terhadap sel HeLa
Hasil dari uji sitotoksisitas dengan metode MTT berupa nilai absorban dari
masing-masing ekstrak dengan beberapa konsentrasi. Rerata nilai absorban dari
triplo masing-masing ekstrak dengan beberapa konsentrasi yang diperoleh
digunakan untuk menghitung nilai % inhibisi (Lampiran 1). Nilai % inhibisi ini
diperoleh dari perhitungan (Zhang et al. 2005), dan untuk mendapatkan rerata %
inhibisi serta beda nyata antar perlakuan menggunakan Oneway ANOVA yang
dilanjutkan dengan uji Duncan (Lampiran 2). Nilai % inhibisi masing-masing
ekstrak kulit kayu pinus dengan beberapa konsentrasi dapat dilihat pada Tabel 4.
Berdasarkan data hasil yang diperoleh, ekstrak etanol 70% dengan konsentrasi
200 μg/mL dan ekstrak air konsentrasi 500 μg/mL mampu menginhibisi sel HeLa
lebih dari 50%. Ekstrak aseton dan metanol dengan konsentrasi yang digunakan
belum mampu menghambat sel HeLa lebih dari 50%. Ekstrak air memiliki persen
inhibisi terbesar terhadap sel HeLa dengan nilai % inhibisi sebesar 59.34% pada
Tabel 2 Kandungan fitokimia ekstrak kulit kayu P. merkusii
Ekstrak
Uji fitokimia
Air
Etanol 70%
Aseton
Flavonoid
+++
+++
++
Alkaloid
Tanin
++
++
+++
Saponin
+++
+++
+
Steroid
Triterpenoid
++
+
+++
Metanol
+++
+
++
++
+
Keterangan: tanda (+) menunjukkan tingkat intensitas warna dan (-) menunjukkan senyawa
metabolit sekunder tidak terdapat pada ekstrak
Tabel 3 Nilai LC50 ekstrak kulit kayu P. merkusii
Ekstrak
Air
Etanol 70%
Aseton
Metanol
LC50 (μg/mL)
634.79
465.45
206.43
398.89
7
mL. Nilai % inhibisi in
ni tidak berrbeda nyataa dengan ek
kstrak
konsentrassi 500 µg/m
etanol denngan konsenntrasi 200 μg/mL
μ
deng
gan % inhibbisi sebesar 51.94%. Hal
H ini
menunjukkkan bahwa ekstrak etaanol 70% lebih
l
efektif daripada ekstrak air kulit
kayu P. merkusii.
Selaain nilai % inhibisi,
i
padda penelitian
n ini juga dicari
d
nilai IC50 dari maasingmasing ekkstrak kulit kayu pinus dalam men
nghambat peertumbuhann sel HeLa. Nilai
IC50 diperroleh berdassarkan persaamaan gariss dari regreesi linear anntara rerata % sel
hidup denngan log konnsentrasi ekkstrak yang digunakan (Lampiran 1) (CCRC 2000).
2
Sesuai Gaambar 1, ekkstrak etanol 70% kulitt kayu pinuus memiliki nilai IC50 paling
p
tinggi, yaiitu 266.01 μg/mL.
μ
Tabel 4 Inhibisi ekstraak kulit kayyu P. merku
usii terhadapp sel HeLa
Konsenntrasi (μg/m
mL)
Eksstrak
Inhibissi (%)
Air
0
0.000
75
4.36a
150
15.31a,b,c
300
34.557e,f
500
59.344h
Etanol 70%
%
0
0.000
50
32.599e,f
42.555f,g
100
150
35.88e,f
200
51.94g,h
Aseton
0
0.000
4.61a
50
2.477a
100
150
7.088a,b
200
36.055e,f
Metanol
0
0.000
50
8.81a,b
100
27.82c,d,e
150
29.555d,e,f
35.880e,f
200
Keterangan: angka yang diikuti huruf yang sama tiidak berbeda nyata pada uj
uji Duncan den
ngan
5
taraf nyata 5%
100
00
880.24
IC50 (μg/mL)
80
00
60
00
433.51
1
40
00
408.13
266.01
20
00
0
air
etanol 70%
%
aseton
metanol
Gambbar 1 Nilai IC
I 50 ekstrak
k kulit kayu P. merkusiii
8
(a)
(b)
(c)
mbar 2 Sel HeLa: (a) taanpa perlakkuan, (b) inh
hibisi < 50%
%, (c) inhibiisi > 50%
Gam
Morfologii sel HeLa dapat diam
mati dengan bantuan miikroskop (G
Gambar 2).
Gam
mbar (a) meemperlihatkkan bentuk dan pertu
umbuhan seel HeLa yaang masih
norm
mal atau tannpa perlakuuan. Gambaar (b) dan (c) adalah sel HeLa yyang telah
menddapatkan peerlakuan dann mengalam
mi inhibisi.
PEMB
BAHASA
AN
Beberapa jenis tanam
man telah diteliti mem
miliki kemaampuan meenghambat
pertuumbuhan sel
s kanker,, salah saatunya darii keluarga Pinaceae. Senyawa
prosiianidin dari kulit kayu Pinus koraaiensis mem
miliki aktivittas sitotoksiik terhadap
sel HeLa
H
(Li et al. 20111), dan senyawa
s
ku
uersetin daari kulit kaayu Pinus
masssoniana mem
miliki aktivvitas sitotokksik terhadap
p sel kankeer hati BEL--7402 (Cui
et al. 2005). Prosianidin
P
dan kuerssetin termaasuk dalam
m senyawa flavonoid.
Adannya ketertaarikan terhhadap senyyawa yang
g diduga mampu
m
meenghambat
pertuumbuhan seel kanker, yakni flavonnoid telah mendasari
m
peemilihan peelarut yang
digunnakan untukk ekstraksi. Senyawa flavonoid
fl
daapat bersifatt polar atau semipolar,
sehinngga digunaakan pelarutt air, asetonn, etanol 70%
%, dan metaanol.
Uji fitokim
mia dilakukkan untuk menguji
m
keeberadaan senyawa
s
yaang diduga
dapaat mengham
mbat pertumbbuhan sel kanker,
k
dan senyawa metabolit
m
sekkunder lain
padaa ekstrak kuulit kayu P. merkusii. Senyawa
S
yaang diduga mampu meenghambat
pertuumbuhan seel kanker addalah flavonnoid. Ekstraak air, etanol 70%, meetanol, dan
9
aseton kulit kayu P. merkusii menunjukkan hasil positif pada uji flavonoid.
Berdasarkan hasil uji fitokimia tersebut, kulit kayu P. merkusii diduga mampu
menghambat pertumbuhan sel kanker serviks HeLa.
Penapisan awal senyawa yang diduga berkhasiat sebagai antikanker dapat
dilakukan dengan metode BSLT (Anderson 1991). BSLT merupakan salah satu
metode untuk menguji bahan-bahan yang bersifat sitotoksik. Metode ini
menggunakan larva Artemia salina Leach sebagai hewan coba. Suatu ekstrak
dikatakan aktif sebagai antikanker berdasarkan metode BSLT jika nilai LC50 <
1000 μg/mL (Meyer et al. 1982). Berdasarkan hasil uji BSLT, keempat ekstrak
kulit kayu pinus, yaitu ekstrak air, etanol 70%, aseton, dan metanol menunjukkan
nilai LC50 < 1000 μg/mL. Hal ini menandakan bahwa keempat ekstrak tersebut
memiliki aktivitas sebagai antikanker. Setelah tahap praskrining atau penapisan
awal terhadap senyawa antikanker dengan metode BSLT, maka perlu dilanjutkan
dengan uji sitotoksisitas menggunakan sel kanker secara in vitro untuk melihat
pengaruh ekstrak secara langsung terhadap sel kanker.
Uji sitotoksisitas menggunakan sel kanker serviks HeLa dilakukan untuk
melihat ada tidaknya aktivitas sitotoksik ekstrak kulit kayu Pinus merkusii
terhadap sel kanker serviks. Metode pengujian sitotoksisitas yang banyak
digunakan adalah dengan penggunaan microculture tetrazolium technique (MTT)
(Arung et al. 2009). Metode pengujian sitotoksisitas MTT didasarkan pada prinsip
kolorimetri (Itharat & Ooraikul 2007). Prinsip dari uji MTT adalah terjadinya
mekanisme perubahan warna kuning dari garam tetrazolium (3-(4,5-dimetiltiazol2-il)-2,5-difeniltetrazoliumbromida) yang tereduksi menjadi kristal formazan
berwarna ungu dalam mitokondria sel hidup (Mosmann 1983).
Uji sitotoksisitas digunakan untuk menentukan parameter nilai IC50. Nilai
IC50 menunjukkan nilai konsentrasi yang menghasilkan hambatan proliferasi sel.
Nilai LC50 ekstrak kulit kayu P. merkusii dengan metode BSLT tidak
menunjukkan adanya hubungan positif dengan nilai IC50 terhadap sel kanker
serviks HeLa dengan metode MTT. Penelitian lain juga menunjukkan hal yang
serupa. Senyawa isopropanol dari ekstrak spesies invertebrata dan makroalga laut
menunjukkan korelasi yang rendah antara sitotoksisitas dengan BSLT dan
sitotoksisitas terhadap sel kanker paru-paru (A-549) serta sel kanker usus (HT-29)
(Carballo et al. 2002). Klasifikasi aktivitas sitotoksik ekstrak terhadap sel kanker
dapat digolongkan menjadi tiga, yaitu kategori sangat toksik jika nilai IC50 < 10
μg/mL, kategori toksik jika nilai IC50 10-100 μg/mL, dan kategori cukup toksik
jika nilai IC50 100-500 μg/mL (Weerapreeyakul et al. 2012). Berdasarkan
klasifikasi tersebut, ekstrak etanol 70%, air, dan metanol kulit kayu P. merkusii
yang memiliki nilai IC50 antara 100-500 μg/mL, mempunyai aktivitas sitotoksik
yang tergolong cukup sitotoksik terhadap sel kanker serviks HeLa.
Morfologi sel HeLa dapat diamati dengan bantuan mikroskop (Gambar 2).
Bentuk dan pertumbuhan sel HeLa tanpa perlakuan tampak melekat ke semua
bagian permukaan tempat tumbuh dan menempel antar sel serta bentuknya masih
tampak jelas. Sel HeLa yang telah mendapatkan perlakuan dan terjadi inhibisi
mengalami perubahan pada morfologi selnya. Beberapa sel HeLa yang mengalami
inhibisi < 50% masih tampak sama dengan sel HeLa tanpa perlakuan dan sebagian
sel telah mengalami kerusakan. Perubahan morfologi sel yang paling terlihat
adalah pada sel HeLa yang mengalami inhibisi > 50%. Sel terlihat tidak beraturan
dan telah lepas dari permukaan tempat tumbuh maupun antar sel. Sel HeLa juga
10
terlihat seperti terdegradasi menjadi bagian-bagian kecil seperti badan-badan
apoptotik pada sel yang mengalami proses apoptosis.
Mekanisme penghambatan pertumbuhan sel kanker HeLa sendiri tidak
diteliti dalam penelitian ini, sehingga belum diketahui secara pasti mekanisme
penghambatan ekstrak kulit kayu P. merkusii terhadap sel HeLa. Senyawa
prosianidin ekstrak etanol 95% kulit kayu P. koraiensis mampu menghambat
pertumbuhan sel kanker HeLa melalui induksi apoptosis (Li et al. 2011). P.
merkusii merupakan keluarga Pinaceae dan satu keluarga dengan P. koraiensis.
Oleh karena itu, dapat diasumsikan bahwa mekanisme penghambatan terhadap sel
HeLa dari ekstrak kulit kayu P. merkusii juga terjadi melalui induksi apoptosis.
SIMPULAN
Ekstrak etanol 70% kulit kayu Pinus merkusii Jungh. et de Vriese memiliki
aktivitas sitotoksik paling tinggi terhadap sel kanker serviks HeLa secara in vitro
dengan nilai IC50 sebesar 266.01 μg/mL daripada ekstrak metanol, air, dan aseton
(IC50 > 400 μg/mL).
DAFTAR PUSTAKA
Abbas A, Mahmudatussaadah A. 2006. Minuman Fungsional Berbahan Dasar Teh
dan Kayu Manis untuk Penderita Diabetes. Prosiding Seminar Nasional
Iptek Solusi Kemandirian Bangsa; 2006 Ags 2-3; Yogyakarta,Indonesia.
Yogyakarta (ID): ISBN. hlm 105-110.
[ACS] American Cancer Society. 2012. Cancer Facts & Figures 2012. Atlanta
(US): American Cancer Soc.
Anderson A. 1991. List of insect pest susceptible to neem products. The Neem
Tree-Source of Unique Natural products for Integrated Pest Management,
Medicine, Industry and Other Purposes. ipp. Weinheim: VCH. 9: 195-204.
Arung et al. 2009. Anti-cancer properties of diethylether extract of wood from
sukun (Artocarpus altilis) in human breast cancer (T47D) cells. Trop J
Pharm Res. 8:317-324.
[BPOM] Badan Pengawas Obat dan Makanan. 2005. Monografi Ekstrak
Tumbuhan Obat Indonesia. Jakarta (ID): BPOM RI.
[CCRC] Cancer Chemoprevention Research Center. 2000. Prosedur Tetap Uji
Sitotoksis Metode MTT. Yogyakarta (ID): Fakultas Farmasi, Universitas
Gajah Mada.
Carballo JL, Inda ZLH, Pérez P, Grávalos MDG. 2002. A comparison between
two brine shrimp assays to detect in vitro cytotoxicity in marine natural
products. BMC Biotechnology. 2(17):1-5.
Cui Y, Xie H, Wang J. 2005. Potential biomedical properties of Pinus massoniana
bark extract. Phytother. Res. 19:34-38.doi:10.1002/ptr.1619.
Dahlian E, Hartoyo. 1997. Komponen kimia terpentin dari getah tusam (Pinus
merkusii) asal Kalimantan Barat. Info Hasil Hutan. 4(1): 38-44.
11
Falah S, Safithri M, Katayama T, Suzuki T. 2010. Hypoglycemic effect of
mahogany (Swietenia macrophylla King) bark extracts in alloxan-induced
diabetic rats. Wood Research Journal. 1(2): 89-94.
Hahn DB, Payne WA. 2003. Focus on Health. New York (US): Mc-Graw Hill.
Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia. Bandung: ITB Pr.
Itharat A, Ooraikul B. 2007. Research on Thai medicinal plants for cancer
treatment. Research Signpost. 37(2):287-314.
Khaerudin. 1999. Pembibitan Tanaman HTI. Jakarta (ID): Penebar Swadaya.
Li K, Li Q, Zhang T, Han Z, Li J, Liu Z, Zheng F. 2011. Procyanidins from Pinus
koraiensis bark inhibits HeLa cell growth by inducing apoptosis and
reducing survivin protein expression. Afr. J. Biotechnol. 10(40):7766-7771.
[LCAG] Lonza Cologne AG. 2009. Amaxa® Cell Line Nucleofector® Kit R for
HeLa Cells [ATCC® CCL-2™]. Jerman (DE): Lonza Cologne AG.
Melva. 2008. Faktor-faktor yang mempengaruhi kejadian kanker leher rahim pada
penderita yang datang berobat di RSUP H. Adam Malik Medan tahun 2008
[tesis]. Medan (ID): Sekolah Pasacasarjana Universitas Sumatera Utara.
Meyer BN, Ferrigni NR, Putnam JE, Jacobsen LB, Nichols DE, Mclaughlin JL.
1982. Brine shrimp: a convenient general bioassay for active plants
constituent. J. Medical Plant Res. 45: 31-34.
Mosmann T. 1983. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:
application to proliferation and cyotoxicity. J. Immuno. Method. 65: 55-63.
[NCI] National Cancer Institute. 2012. Cancer Treatment. National Cancer
Institut [internet]. [diunduh 2012 Okt 3]. Tersedia pada:
http://www.cancer.gov/cancertopics/wyntk/cervix/page8.
Oba K, Teramukai S, Kobayashi M, Matsui T, Kodera Y, Sakamoto J. 2007.
Efficacy of adjuvant immunochemotherapy with polysaccharide K for
patients with curative resections of gastric cancer. Cancer Immunol.
Immunother. 56(6): 905–911.
Siegel R, Naishadham D, Jemal A. 2012. Cancer statistics, 2012. Cancer J. Clin.
62:10-29. doi:10.3322/caac.20138.
Weerapreeyakul N, Nonpunya A, Barusrux S, Thitimetharoch T, Sripanidkulchai
B.2012. Evaluation of the anticancer potential of six herbs against a
hepatoma cell line. Chinese Medicine. 7(15):1-7.
Wilson CM, Tobin S, Young RC. 2004. The exploding worldwide cancer burden:
The impact of cancer on women. Int. J. Gynecol Cancer 14: 1–11.
[WHO] World Health Organization. Globocan Stats Section of Cancer
Information. 2010. Cancer. WHO [internet]. [diunduh 2012 Sep 16].
Tersedia pada: http://www.who.int/about/copyright/en/
Yuniarto Mi, Warsito B. 2012. Hubungan antara umur perkawinan dengan
kejadian karsinoma serviks di Rumah Sakit Dr. Sardjito periode 1 Januari 31 Desember 2005. FKIK, siap terbit.
Zhang M, Zhang JJ, Adelman RA, Liu Y, Zhang MX, Lu F, Yan M. 2005.
Inhibition of the human choroidal microvascular endothelial cells
proliferation by endostatin. Invest Ophthalmol Vis. Sci. 46: 3355-3360.
12
Lampiran 1 Inhibisi dan IC50 ekstrak kulit kayu P. merkusii terhadap sel HeLa
Contoh perhitungan % inhibisi:
Ekstrak etanol 70% 200 µg/ml
R
A
• % Inhibisi =
R
.
=
.
= 51.94%
.
A
R
x
A
%
x
%
• Rerata % sel hidup = 100% - % inhibisi
= 100% - 51.94%
= 48.06%
Keterangan: Rerata % inhibisi diperoleh dari Oneway ANOVA program SPSS
Contoh perhitungan nilai IC50:
Sel hidup (%)
Ekstrak etanol 70%
120
100
80
60
40
20
0
y = -24.306x + 108.942
R² = 0.934
0
0.5
1
1.5
2
Log konsentrasi (μg/mL)
Grafik Log konsentrasi dengan % sel hidup
Perhitungan nilai IC50 berdasarkan persamaan garis:
y = ax + b
Keterangan: y = % inhibisi
x = log konsentrasi
y = -24.306x + 108.942
50 = -24.306x + 108.942
x = 2.425
IC50 = antilog 2.425
= 266.01 μg/mL
2.5
13
Lampiran 2 Analisis statistik % inhibisi ekstrak kulit kayu P. merkusii terhadap
sel HeLa menggunakan program SPSS
14
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan pada tanggal 16 Mei 1990 di Pemalang, Jawa Tengah dari
pasangan Amsori dan Mutmainah. Penulis merupakan anak terakhir dari tujuh
bersaudara. Penulis lulus pada tahun 2002 dari SD Negeri 1 Wiyorowetan,
kemudian melanjutkan pedidikan di SMP Negeri 1 Ulujami. Penulis lulus dari
SMA Negeri 1 Comal pada tahun 2008 dan diterima di Departemen Biokimia,
IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) pada tahun yang sama.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif dalam beberapa organisasi,
antara lain sebagai anggota Badan Eksekutif Mahasiswa Tingkat Persiapan
Bersama pada tahun 2008-2009 dan anggota himpunan profesi Biokimia IPB
(CREBs) pada tahun 2009-2010 dan 2010-2011. Penulis juga mengikuti
kepanitiaan beberapa acara di IPB. Selain itu, penulis juga aktif mengikuti
beberapa kompetisi menulis baik tingkat nasional maupun internasional. Penulis
mendapatkan hibah dana bersaing dari Dikti melalui Program Kreativitas
Mahasiswa bidang Pengabdian Masyarakat pada tahun 2011 dan bidang Penelitian
pada tahun 2012.
Penulis pernah menjadi asisten praktikum Matrikulasi Kimia Dasar pada
tahun 2010 dan praktikum Kimia Dasar untuk mahasiswa Tingkat Persiapan
Bersama tahun 2010. Tahun 2011 penulis melakukan kegiatan praktik lapangan di
Balai Besar Penelitian Pascapanen, Cimanggu, Bogor di bawah bimbingan Ibu
Popi Asri Kurniatin, SSi, Apt, MS; dan Ibu Ermi Sukasih, STP, MSi.