Kapasitas Antioksidan dan Hubungannya Dengan Nilai Total Fenol Ekstrak Sayuran Indigenous

i;

, KAPASITAS ANTIOKSIDAN DAN HUBUNGANNYA
DENGAN NILAI TOTAL PENOL EKSTRAK
SAYURAN INDIGENOUS

DINY AGUSTINI SANDRASARI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Kapasitas Antioksidan dan
Hubungannya dengan Nilai Total Fenol Ekstrak Sayuran Indigenous adalah karya saya
dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun
kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau d i i t i p dari
karya yang diterbitkan maupun yang tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebut

dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, September 2008

Diny Agustini Sandrasari
F 251 040021

This present study was carried out to evaluate antioxidant capacity and its
relationship with total phenolic content of indigenous vegetables extracts.
The antioxidant capacity of indigenous vegetables extract was evaluated by four
different methods @PPH and ABTS, radical scavenging activity; reducing power and
TBA, inhibition of peroxide formation). Total phenolic conteilts were determined using
spectrophotometric technique, based on the Folin-Ciocalteau reagent and calculated as
gallic acid equivalents, GAEIg dw. Total phenolic cohtent ranged frbm 42.24 - 141.10
pg GAEImg extract.
Alinier positive relationship existed between total phenolic content and DPPH
and ABTS scavenging activity (r = 0.9431 and r = 0.9702 respectively), between total
phenolic content and reducing power (r = 0.8659), beween reducing power and DPPH
and ABTS (r = 0.8992 and 0.9033 respectively), also between total phenolic content and
inhibition of peroxide formation (r = 0.8395).

Key word : Total phenolic, antioxidant capacity, indigenous vegetables extract

DINY AGUSTINI SANDRASARI. Kapasitas Antioksidan dan Hubungannya dengan
Nilai Total Fenol Ekstrak Sayuran Indigenous. Dibimbing oleh HANNY WIJAYA dan
NURI A N D A R W A N .

Hasil pengujian epidemiologi menunjukkan bahwa mengkonsumsi buah-buahan
dan sayur-sayuran yang banyak mengandung senyawa fenol dapat menurunkan resiko
terkena penyakit jantung dan kanker. Hal ini dikarenakan, senyawa fenolik yang banyak
terdapat dalam tumbuhan dapat berfungsi sebagai antioksidan. Antioksidan
didefinisikan sebagai senyawa yang dapat menunda, memperlambat dan mencegah
terjadinya reaksi antioksidasi radikd bebas dalam oksidasi lipid. Salah satu jenis
sayuran yang dapat berfmgsi sebagai antioksidan adalah sayuran indigenous. Sayuran
indigenous merupakan sayuran yang banyak mengandung senyawa fenolik berupa
flavonoid. Batari (2007) menunjukkan bahwa sayuran indigenous meilgandung senyawa
flavonoid yang berupa flavonol dan flavone.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kapasitas antioksidan ekstrak sayuran
indigenous dan rnelakukan analisis data mengenai hubungan antam nilai total fen01 ekstrak
antioksidan sayuran indigenous dengan kapasitas antioksidan sebagai radikal scavenger,
kemampuan mereduksi dan pengharnbat oksidasi lipid lanjut. Sayuran indigenous yang

digunakan dalam penelitian ini adalah daun kenikir, beluntas, mangkokan, kemangi,
pohpohan, katuk, antanan, ginseng, kedondong cina, bunga kecombrang dan krokot.
Pembuatan ekstrak antioksidan dari sayuran ini dilakukan dengan menggunakan pelarut
metanol. Data hasil penelitian yang menyatakan hubungan antara nilai total fenol dan
kapasitas antioksidan sebagai radikal scavenger, dan kemampuan mereduksi serta
hubungan antara kemampuan mereduksi dan kapasitas antioksidan sebagai radikal
scavenger d i t u n g menggunakan persamaan regresi linier dan dinyatakan sebagai
koefisien korelasi. Persen penghambatan oksidasi lipid lanjut didapat dari rata-rata nilai
malonaldehid (MDA) yang terbentuk dibagi dengan rata-rata MDA tiap perlakuan yang
terbentuk dikalikan 100%.
H a i l analisis mengenai hubungan nilai total fen01 dengan kapasitas antioksidan
menunjukkan bahwa secara keseluruhan nilai total fenol berpengamh terhadap aktivitas
antioksidan sayuran indigenous. Semakin tinggi nilai total fenol ekstrak sayuran
indigenous diketahui semakin mampu menghambat perkembangan radikal bebas
maupun oksidasi lipid lanjut.

@ Hak Cipta milik IPB, tahun 2008.
Hak Cipta dilindungr Undang-Undang.
I. Dilarang mengut@sebagian atau seluruh k q a tulis ini tanpa mencantzcmkan
atau menyebutkan sumber.

a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan
katya ilmiah, penyusunan laporan, pemrlisan kritik atau tinjauan suatu
masalah.
b. Peizgutipan tidak inerugikan kepentingan yang wajar IPB.
2. Dilarang mengumumkan dun memperbanyak sebagian atau seluruh kava tulis
dalam bentuk apapun fanpa izin IPB.

KAPASITAS ANTIOKSIDAN DAN HUBUNGANNYA
DENGAN NILAI TOTAL FENOL EKSTRAK
SAYURAN INDIGENOUS

DINY AGUSTINI SANDRASARI

Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Ilmu Pangan

SEICOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR
2008

: Kapasitas Antioksidan dan Hubungannya dengan Nilai Total Fen01

Judul Tesis

Ekstrak Sayuran Indigenous.
Nama

:Diny Agustini Sandrasari

NRP

: F 251040021

Disetujui
Komisi Pembimbing

d

/

Dr. Ir. N ~ a n u u l a n MS
.
/mz3Jta

Ketua

Diketahui

Ketua Program Studi Ilmu Pangan

&W

Dr. Ir. Ratih Dewanti-Hariyadi, MSC

Tanggal Ujian

: 22 September 2008

Tanggal Lulus : 1 9 JAK 2009

PRAKATA
Bismillahirrohmanirrohim
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, atas berkat dan
rahmatNya penulis dapat menyelesaikan tesis yang bejudul Kapasitas Antioksidan
dan Hubungamya dengan Nilai Total Fenol Ekstrak Sayuran Indigenuus, sebagai
salah satu syarat untuk memperoleh gelar Master Sains pada Program Studi Ilmu
Pangan, Sekolah Pascasacja, Institut Pertanian Bogor.
Pada kesempatan ini tak lupa penulis mengucapkan terimakasih yang sebesarbesarnya kepada semua pihak yang telah memberi dorongan baik dorongan moril
maupun materiil. Ucapan khusus penulis sampaikan kepada Prof Dr. Ir. Hamy
Wijaya, M . A g selaku ketua komisi pembimbing dan Dr. Ir. Nuri Andanvulan, MS
selaku anggota komisi pembimbing yang disela-sela kesibukannya masih dapat
meluangkan waktu untuk memberi bimbingari arahan dan dorongan kepada penulis.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada semua staf di Laboratoriuin Kimia
SEAFAST dan Laboratorium Kimia Pusat Studi Biofarmaka (F'ak Raffi, mbak Nunu,
dan mbak Ina) atas segala bantuannya selama penulis melakukan penelitian ini.
Kepada suami tercinta Iman Prihana, SE dan anak-anak (Traditia Rizky Janatiar dan
Helmibhimo Rahmandia Fauzan) tercinta atas dukungan cinta kasih, semangat,

materiil dan segala perhatiannya. Orang tua (Mamah, Bapak, dan kedua Mertuaku)
atas dorongan moril dan materiil serta semangat kepada penulis. Tak lupa pula penulis
mengucapkan terima kasih kepada seluruh dosen dan staf di Fakultas Teknologi
Industri PertaNan UNversitas Sahid Jakarta yang telah membantu dan mendorong
penulis hingga selesainya tesis ini

RIWAYAT HIDUP
Penulis didahirkan di Jakarta pada tanggal 3 Agustus 1970. Penulis adalah anak
ke tiga dari empat bersaudara pasangan Eddy Sukirman dan Murniati.
Pada tahun 1983 penulis lulus dari Sekolah Dasar Negeri 03 Pagi Cibubur.
Tahun 1986 penulis lulus dari Sekolah Menengah Pertama Negeri 49 Jakarta dan lulus
dari Sekolah Menengah Atas Negeri 39 Jakarta pada tahun 1989. Pada Tahun 1989,
penulis diterima di Akademi Kimia Analis (AKA) Bogor dan lulus pada tahun 1992.
Pada tahun yang sama penulis melanjutkan pendidikan di Fakultas Teknik Program
Studi Teknologi Pangan Universitas Sahid Jakarta dan lulus pada tahun 1996. Dengan
berbekal ilmu dari AKA-Bogor, pada tahun 1993 penulis diterima bekerja sebagai
laboran di Laboratorium Kimia, Pusat Penelitian dan Pengembangan Ekologi
Kesehatan Lingiwngan, Departemen Kesehatan hingga awal tahun 1997.
Penulis memulai karir sebagai asisten dosen di Fakultas Teknik Universitas
Sahid Jakarta pada awal tahun 1997 hingga tahun 2000. Kemudian pada tahu11 2000

penulis diangkat sebagai dosen tetap di Fakultas Teknologi Industri Pertanian Program
Studi Teknologi Pangan Univesitas Sahid Jakarta hingga sekarang.

DAFTAR IS1

Halaman
DAFTAR ISI.. . ....... ................ ...... ..... ................. .......... ... ..........

I

DAFTAR TABEL.. .. . ............ ... .. ..... .... . ... . .... . .... .. .. .. ....... .... .........

111

DAFTAR GAMBAR.. .... ... .. ... .. . .. . . . . .......... ........... ... .. ......... . . . . .....

iv

DAFTAR LAMPIRAN.. ..... ... .. ....... ... . . ....... . . ...... ....... . ... ... . ... ........

v

...

PENDAHULUAN
Latar Belakang. ... ..... ...... ............ ....................... ................ ....
. . .......... ......... ... . .......... ................................
Tujuan Penelltlan..
. . ... . ..... ..... . . . . ..... .... . ............... ......... . .........
Hipotesis Penelltian..

1

3
3

TINJAUAN PUSTAKA
. . Llpid..
. . ...... ...... ........ ......... ..... .... .... .......... .............. .
Oksidasi

kntioksidan.. .... ................... .. ........... ..................................
Sayuran Indigenous.. ......... ... ........ .. .......................................
Senyawa Fenolik.. ....... ...... ......... ... ... ..... ............ ........... ........

21

METODOLOGI
Telnpat dan Waktu.. ..... .. .... .... ... . .... . .. .... .. . . ... . ...... .. . . . .. .... ..... .
Bahan dan Alat.. ........ . ...... . . . .. . ... ... .... . . ..... ...... .... .. ..... ... .. .....
. . ...... .. ... .... . .... ... .. ....... . . ... . . ... .. . ..... ............
Metode Peneht~an..
Pengainatan.. . . . . .... ..... . . .. . ... ...... . .. . .. .... ........... ... . ... .... ... .. . . ....
Analisis Data.. .... .. .. .... .. . . ..... .. . .... ...... . ... . . . ... .. .. ... . . .. . ... . .... ....

24
24
25
29
35

HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakterisasi Sifat Fisik dan Kimia Ekstrak Antioksidan Sayuran Indigenous
Ekstraksi Komponen Antioksidan.. ...... ............. ..... .... .. .........
Rendemen dan Bahan Kering Ekstrak.. .... ............... ...............
Analisis Data Hubu~lganNilai Total Fenol Ekstrak Antioksidan dengan
. .
Kapasitas Antloksidan.. .... ........ . .... ... ........ .......... ...................
Analisis Total Fenol dan Kapasitas Antioksidan Sayurail Indigenous
Hubungan Nilai Total Fenol dengan Kapasitas Antioksidan Sebagai
Radikal Scavenger.. ....... ...................... ............................
Hubungan Nilai Total Fenol dengan Kemampuan Mereduksi.. .......
Hubungan Nilai Total Fenol dengan Kapasitas Antioksidan Sebagai
Penghambat Oksidasi Lipid Lanjut.. ..................... ... .. . . ..........
Ilubungan Kemampuan Mereduksi dengan Kapasitas Antioksidan
Sebagai Radikal Scaveizger.. .. .. . .. ... ....... . . .... . ..... . ... . ... ..........
Hubungan Ke~nampuanMereduksi dengan Nilai Total Flavonol dan
Nilai Total Flavone.. . .... . . .. . ............ ..... .... . . ......... . ... ...........

5
7
19

39
39
40
42
42

48
52
53
55

58

SIMPULAN DAN SARAN
Simpillan .........................................................................
Saran..............................................................................
DAFTAR PUSTAKA

60
60

DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1 Nilai total fenol dan kandungan flavonol dan flavon pada sayuran
Indigenous ..................... .......................................................................

20

Tabel 2 Bentuk substitusi dari flavonoid yang mempunyai aktivitas antiradikal

23

Tabel 3 Hasil pengamatan karakterisasi sifat fisik dan kimia ekstralc antioksidan
. .
Sayuran znd~genous...............................................................

41

Tabel 4 Nilai total fenol, flavonol, flavonol dan flavon, dan kapasitas antioksidan
Ekstrak sayuran indigenozrs.. ....................................................

43

DAFTAR GAMBAR

Halaman
Reaksi autooksidasi lipid ................................................
S t d m r Trolox ..............................................................
Reaksi penghambatan antioksidan primer terhadap radikal lipida
Antioksidan bertindak sebagai prooksidan pada konsentrasi tinggi
Mekanisme reaksi elektron transfer ....................................
Reaksi antara DPPH dan antioksidan ..................................
Mekanisme realtsi radikal ABTS .......................................
Struktur kompleks MDA-TBA .........................................
Sbulctur beberapa senyawa flavonoid....................................
. .
Struktur flavonoid dengan aktivitas antiradikal yang tmgg..................
Bentuk substitusi senyawa flavonoid yang terdapat pada sayuran
Indigenous ..................................................................
Gambar 12. Bagan alir pe~nbuatanbubuk sayuran indigenozrs ...........................
Gambar 1'3. Bagan alir proses ekstraksi komponen antioksidan .........................
Gambar 14. Hasil pengukuran pembentukan hidroperoltsida asam linoleat ......
Gambar 15 Grafik hubungan nilai total fenol dengan kapasitas antioksidan
menggunakan radikal bebas DPPH ....................................
Gambar 16 Grafik Hubungan Nilai Total Fen01 dengan Icapasitas Antioksidan
Menggunakan Radikal Bebas DPPH dan ABTS ......................
Gambar 17 Reaksi scrivenging DPPH' oleh flavonoid
. . ......................................
.........
.
.........................
Gambar IS Reaksi radikal ABTS dengan ant~oks~dan
mereduksi ...
Gambar 19 Grafik bubungan nilai total fen01 dengan ke~nampua~l

Gambar 1
Gambar 2
Gambar 3 .
Gambar 4
Gambar 5
Gambar 6
Gambar 7
Gambar 8
Ganbar 9
Gambar 10.
Gambarl 1

Gambar 20
Gambar 21
Gambar 22
Gambar 23
Gambar 24 .

Grafik hubungan antara nilai total fenol dengan ke Penghambatan
Pembentukan MDA .......................................................
Grafik hubungan kemampuan mereduksi dengan kapasitas
antioksidan menggunakan radikal DPPH .............................
Grafik llubungan kemampuan mereduksi dengall kapasitas
antioksidan sebagai radikal scavenger .................................
Grafik hubungan kemampuan mereduksi dengan nilai total flavonol
(a) dan nilai total flavonol dan flavon (b) ..................
.
..................
Hasil oksidasi radikal bebas DPPH oleh quercetin .......................

54
56
57
59
59

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman
Lampiran 1 Rekapitulasi hasil pengukuran kadar air sayuran segar, kadar
air bubuk kering, rendemen dan kadar bahan kering. ..... .....
Lampiran 2 Hasil pengukuran kadar air berbagai jellis sayuran indigenous
Lampiran 3 Hasil pengukuran kadar air bubuk kering berbagai sayuran
Indigenous.. .................
........................... .............
Lampiran 4 Hasil pengukuran kadar bahan kering ekstrak sayuran
. .
rndrgelzous .. ......................................... . ..... ..... .......
Lampiran 5 Hasil pengukuran rendemen ekstrak sayuran indigenous... .. ..
Lampiran 6 Hasil pengukuran nilai total fenol ekstrak sayuran indigenous
Lampiran 7 Kurva standar asam galat. .... . ........... ........... ................
Lampiran 8 Hasil pengukuran kemampuan mereduksi elcstrak sayuran
Indigenot~~.
...... .. . ........... .. ....... ............ ......... .........
Lampiran 9 Hasil pengulturan kapasitas antioksidan ekstrak sayuran
Indigenous menggunakan radikal DPPH.. ..................... ..
Hasil pengukuran kapasitas antioksidan ekstrak sayuran
I~idigenottsmenggunakan radikal ABTS.. ... . . ............... .. .
Lampiran 11 Hasil pengukuran kapasitas antioksidan metode FTC.. . .... ...
Lampiran 12 Masil pengukuran kapasitas antioksidan ekstrak sayuran
Iiidigenotrs metode TBA.. ............. . . ..... ... . . .. .. .. ... ........
Lampiran 13 Grafik hubungan nilai total fenol dan kapasitas antioksidan
meilggunakan radikal DPPH.. ..... . ... ..... ..... .... ......... . . .. .
Grafik hubungan nilai total fenol dan kapasitas antioksidan
Sebagai radikal scavenger.. .......... ..... ........ .................
Lampiran 15 Grafik hubungan nilai total fen01 dan kemampuan mereduksi
kemampuan
Lampiran 16 Grafik hubungan nilai total fen01 d m
penghanlbatan oksidasi lipid lanjut.. ............ ...... ..... .......
Larnpiran 17 Grafik hubungan kemampuan mereduksi dan kapasitas
antioksidan menggunakan radikal DPPH.. .. ..... ...............
Lampiran 18 Grafik hubungan kemampuan mereduksi dan kapasitas
antioksidan sebagai radikal scavenger.. ......... .................
Lampiran 19 Grafik hubungan kemampuan mereduksi dengan nilai total
flavonol dan flavon .......... ..... ............... .. .............. .....
Lampiran 20 Hasil pengujian identifikasildeterminasi sayuran indigenous.. .

PENDAHULUAN

La tar Wakang
Radikal bebas adalah molekul yang kehilangan elektron, sehingga molelrul
tersebut menjadi tidak stabil dan selalu bermaha malgambil elektron dari moleM

atau sel lain.. Radikal bebas dianggap berbahaya karena bersifat tidak stabil dan
menjadi sangat reaktif dalam upaya mendapatkan pasangan elektronnya sehingga
menyebabkan terbentuknya radilcal baru. Pembentukan radikal baru ini @at
meninbulkan kemsakan berbagai komponen sel dalam tubuh seped DNA, dan juga
dapat menyebabkan terjadinya peroksidasi lipid. Peroksidasi lipid m e ~ p a k a nreaksi
yang tqadi antara radikal bebas dengan asam lemak tidak jenuh ganda yang
menyusun membran sel sehingga terbenhk radikal

lipid peroksida (Anonim,

2008a).
Salah satu mekanisme untuk mengatasi radikal bebas adalah melalui
antioksidasi. Unhk menjalankan mekanisme tersebut diperlukan antioksidan
Aniioksidan adalah suatu senyawa yang dapat menghambat tejadinya proses
ohidasi dengan cara menghambat terjadinya reaksi oksidasi pada tahap inisiasi atau
propagasi (Velioglu et al. 1998). Terdapat dua katagori antioksidan yaitu antioksidan
alami dan antioksidan sintetik Antioksidan alami dapat bempa senyawa fenolik
(tokoferol, flavonoids, dan asam fenolat), senyawa nitrogen (alkaloids, turunan
Irlorofil, asam amino dan amina), atau karotenoid seperti asam askorbat (Apak et al.
2007).
Flavonoid memili ikatan difenilpropana yang diketahui dapat berfmgsi
sebagai antimutagenik dan anfikarsiogenik. Selain itu, senya\va ini juga mempunyai
sifat sebagai antioksidan, antiperadangan, antialergi dan dapat menghambat oksidasi
LDL (Low Density Lipoprotein). Eklund et al. (2005) mengataka bahwa senyawa
flavonoid yang banyak terdapat dalam antioksidan alami mempunyai pen@
biologis yang kuat hususnya sebagai antialergi, antibakten, antivirus, antiinflammatori, dan antihombotik Beberapa penelitian tentang &ivitas antiohidan
dari senyawra flavonoid telah dilaporkan dan dikatakan bahwa s t d w r dari senyatva
flavonoid berkontribusi terhadap A-tivitasnya (Apak et al. 2007). Akdivitas stmktur

dari flavonoid sangat bergantung pada jumlah dan lokasi gugus fenolik -OH yang
berperan dalam menetralkan radikal bebas. Terdapat tiga strubkr yang
memungkmkan aktivitas scavenging radikal dari flavonoid adalah adanya 3,4dihidroksil misalnya o-dihidroksil (stnk-tur katekol) pada cinch B, berperan sebagai
donor elektron dan menjadi target radikal. Struktur 3-OH dari cinch C juga
menguntungkan untuk aktivitas antioksidan flavonoid. Konjugasi ikatan rangkap
pada C2-C3 dengan gugus 4-keto, berperan untuk delokalisasi elektron dari cinch B,
meningkatkan kapasitas scavenging radial. Selain ini adanya gugus 3-OH dan 5OH dalam kombinasi dengan fungsi Ckarboni! dan &an

rangkap C2-C3

menaikkan ak-tivitas scavenging radikal (Amic et 01.2002).
Sayuran indigenous merupakan sayuran lokal yang sudah lama dikonsumsi
oleh masyarakat Indonesia terutama masyarakat Jawa Barat yang diietahui memiliki
khasiat tertentu dan sangat potensial untuk dikernbangkan sebagai pangan yang
bemilai tinggi. ~ a y k a nini seringkali digunakan sebagai obat-obatan maupun jamujamuan karena mengandung senyawa fitokimia yang beriungsi sebagai antioksidan
yang sangat menguntungkan bagi kesehatan (Exarchou el al. 2002). Diketahui pula
bahwa sayuran ini mempunyai potensi yang sangat baik untuk menjaga kesehatan
dan melindungi dari penyakit jantung koroner dan kanker. Efek antiohidatif dari
sayuran ini terutama disebabkan oleh kandungan senyawa fenoliknya.
Sayuran ir~digenousseperti kenikir, beluntas, mangkokan, ginseng, antanan,
pohpohan, kah& kedondong cina, kemangi: bunga kewmbrang dan lcrokot
merupakan sayuran yang diketahui mengandung senyawa fenol yang berupa
golongan flavonoid. Hasil penelitian yang dilakukan oleh Batari (2007)
menunjukkan bahwa sayuran indigenous sebagaimana disebutkan di atas
mengandung senyawa flavonoid yang berupa flavonol (quercetiq miricetin dan
kaempferol) dan flavone (luteolin dan epigenin). Flavonol dan flavone merupakan
flavonoid penting yang terdapat dalam tanaman sebab senyawa tersebut diketahui
mernpunyai aktivitas antioksidan dan bersifat sebagai scavenging radikal bebas.
Kedua senyawa tersebut dibedaitan berdasarkan jumlah dan bentuk substitusi dari
gugus hidroksilnya
Metode pengujian terhadap aktivitas antioksidan yang berasal dari ekstrak
sayran yang berisi senyaxra phenolik

telah banyak dikembangkan. Metode

pengujian ini dikelompokkan dalam dua kategori yaitu berdasarkan elektron transfer
(ET) dan transfer atom hidrogen (HAT). Pengujian berdasarkan transfer atom

hidrogen dilakukan untuk men@

jumlah atom hidrogen yang dilepaskan pada

reaksi radikal berantai. Lebii jauh dikatakan bah~vaHAT me~pakanreaksi
kompetisi antara antioksidan dan substrat membentuk radikal peroksil melalui
dekomposisi senyawa azo. Metode ini meliputi penghambatan dari reaksi lipid lanjut
yang dapat diuji dengan metode TBA Sedangkan pengujian berdasarkan ET
dilakukan untuk mengukur kapasitas antioksidan dalam mereduksi oksidan Pada
reaksi ini tejadi perubahan wama dirnana tingkat pembahan wama berhubungan
dengan konsentrasi antioksidan yang terdapat dalam sampel. Metode pengujian ini
meliputi pengujian total fenol dengan reagen Folin Ciocalteau (FCR), radikal ABTS,
dan DPPH serta kemampuan mereduksi (Apak et 01.2007).
Berdasarkan uraian diatas, dapat diketahui bahwa meskipun telah banyak
penelitian mengenai ak4vitas antioksidan pada berbagai tanamq tetapi belum ada
penelitian mengenai hubungan antara nilai total fenol dari suatu flavoncid
khususnya yang berasal dari sayuran indigenous dan kemampuan senyawa tersebut
sebagai radikal scavenger, kemampuan mereduksi d m penghambat tejadinya
oksidasi lipid lanjut.
Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui kapasitas antioksidan
ekstrak sayuran indigenous dan melakukan analisis data mengenai hubungan antara
nilai total fenol ekstrak antioksidan sayuran indigenous dengan kapasitas
antioksidan sebagai radikal scavenger, kemampuan mereduksi dan penghambat
oksidasi lipid lanjut
Hipotesis
Sayuran indigenous merupakan sayuran yang mengandung senyawa
fenolik berupa flavonoid yaitu flavonol dan flavon yang dapat berperan sebagai
antioksidan. Akivitas strukur dari flavonoid sangat bergantung pada jumlah dan

lokasi gugus fenolik -OH yang berperan dalam menetralkan radikal bebas.
Kemampuan flavonoid dalam menekan perkembangan radikal bebas tersebut
berkaitan erat dengan kemampuannya dalam mendonorkan elektronnya.
Berdasarkan uraian diatas maka:
Semakin tinggi nilai total fen01 rnaka semakin tinggi kemampuan antioksidan
dalam mendonorkan elektromya sehingga semakin tinggi kemampuannya
dalam menekan perkembangan

radikal bebas,

semakin meningkat

kemampuan mereduksi, dan semakin meningkat kemampuannya dalam
menghambat oksidasi lipid lanjut.
Semakin tinggi kernampuan mereduksi suatu antioksidan maka semakin
besar kapasitas antioksidan dalam menekan perkembangan radikal bebas.
Semakin tinggi nilai total flavonol dan flavon suatu antioksidan maka
semakin tinggi kemampuan mereduksinya

TINJAUAN PUSTAKA
Oksidasi Lipid
Lipid mempakan biomolekul yang paling rentan terhadap oksidasi
terutama asam-asam lemak tak jenuh. Tingkat ketidak jenuhan, jumlah dan ikatan
rangkap suatu asam lemak berhubungan langsung dengan kerentanan terhadap
oksidasi. Oksidasi pada lipid sering disebut sebagai autooksidasi karena reaksi
dapat terjadi walaupun tanpa ada zat pengoksidasi. Oksidasi lipid biasanya
berlangsung melalui proses pembentukan radikal bebas yang terdiri dari tiga
proses dasar yaitu inisiasi, propagasi dan terminasi (Buck, 1991).
Inisiasi :

RH

h

R

ROOH+ Mn+

'

+

B'

RO'

+

M("+"' +OH

+

M"+

+ H+

ROO' +

RO'

+ HzO

ROOK+ M("'*

-----,ROO'

2 ROOH

--+

Propagasi :
R'

+0

ROO'

+ RH

----a- ROOH

RO'

+ RH

-----+

ROH

R'

+

R'

----+

RR

R'

+

ROO' ----+ ROOR

2

-----+ ROO'

+

R'

+

R'

Terminasi :

ROO' + ROO'

---+

ROOR

+0

2

Gambar 1 Reaksi autooksidasi lipid (Kochhar, 1990)

RH, R', RO', ROO', ROOH dan M bertumt-turut merupakan simbol untuk
asam lemak tidak jenuh atau ester dengan atom H pada atom karhon alilik, radikal
alkil, radikal alkoksi, radikal peroksi, hidroperoksida dan logam transisi (Kochhar,
1990).

Pa& tahap awal reaksi terjadi pelepasan hidrogen dari asam lemak tidak
jenuh secara homolitik sehingga terbentuk radikal alkil yang terjadi karena adanya
inisiator (panas, oksigen aktif, logam atau cahaya). Reaksi oksidasi lipid juga
dapat diinisiasi oleh beberapa faktor seperti molekul H202, ROOH, '02.
Tahap propagasi dimulai dengan penambahan molekul oksigen pada
radikal alkil. Pada keadaan normal radikal alkil cepat bereaksi dengan oksigen
membentuk radikal peroksi dimana radikal peroksi ini bereaksi lebih lanjut
dengan asam lemak tidak jenuh membentuk hidroperoksida dengan radial alkil,
kemudian radikal alkil yang terbentuk bereaksi dengan oksigen. Dengan demikian
reaksi autoksidasi adalah reaksi berantai radikal bebas(Gutteridge, 1995).
Laju reaksi antara r a d i l alkil dengan oksigen berlangsung cepat, maka
kebanyakan radikal bebas berbentuk radikal peroksi. Akibatnya, reaksi terminasi
utama biasanya melibatkan 2 radikal peroksi. Laju oksidasi meningkat dengan
meningkatnya jumlah ikatan rangkap pada asam Iemak, sebagai contoh, asam
lioleat (18:2) dioksidasi 10 kali lebii cepat daripada asam oleat (18:l) dan asam
linoleat (18:3) dioksidasi 20-30 kali lebih cepat daripada asam oleat.
Hidroperoksida dapat terbentuk pada berbagai posisi dimana ikatan rangkap
berada, sebagai contoh pada asam oleat terdapat 4 hidroperoksida yang dibedakan
atas posisi peroksida yaitu dapat pada posisi 8, 9, 10 atau 11. Semakin banyak
ikatan rangkap asam lemak, maka semakin banyak pula kemungkinan posisi
hidroperoksida yang terbentuk. Hal ini berarti akan semakin banyak jenis produk
degradasi asam lemak yang bersangkutan. Hidroperoksida asam lemak tak jenuh
yang terbentuk karena oksidasi sangat tidak stabil dan dengan mudah terdegradasi
membentuk berbagai senyawa volatil dan nonvolatil. Dekomposisi hidroperoksida
melibatkan pemutusan gugus -0OH sehingga terbentuk radikal alkoksi dan
radikal hidroksi. Radikal alkoksi kemudian mengalami pemutusan beta pada rantai
C-C sehingga terbentuk aldehid dan radikal alkil atau vinil. Berbagai komponen

dihasilkan dari degradasi lipid diantaranya hidrokarbon, aldehid, keton, asam
karboksilat. alkohol dan heterosiklik (Buck, 1991).

Antioksidan
Antioksidan adalah suatu senyawa yang dapat mencegah kerusakan pada
makanan yang mengandung lemak. Adanya antioksidan dalam lemak akan
mengurangi kecepatan proses oksidasi. Secara umum, antioksidan didefinisikan
sebagai senyawa yang dapat menunda, memperlarnbat atau mencegah terjadinya
proses oksidasi lipida. Dalarn arti k h m q antioksidan adalah zat yang dapat menunda
atau mencegah teijadinya reaksi autooksidasi radikal bebas dalam oksidasi lipida
@dash et d.2006).

Berdasarkan fimgsinya, antioksidan dikelompokkan menjadi antioksidan
primer d m antioksidan sekmder. Antioksidan primer (antioksidan pemecah rantai)
yaitu antioksidan yang dapat bereaksi dengan radikal lipida lalu mengubahnya
kebentuk yang lebii stabil. Lebii jauh dijelaskan bahwa suatu molekul antioksidan

dapat disebut sebagai antioksidan piimei (AH), jika dapat mendonorkan atom
hidrogennya secara cepat ke radikal lipida (RO')dan radial turunan antioksidan
tersebut (A*) lebih stabil dibandingkan radikal lipida atau mengubahnya ke bentuk
lebii stabil (Gordor, 1990).
Gordon (1990) mendefinisikan bahwa antioksidan sekunder mempakan
antioksidan pencegah yaitu suatu senyawa yang dapat memperlambat laju reaksi
autooksidasi lipida. Antioksidan ini bekeja dengan berbagai mekanisme seperti
mengikat ion metal, menangkap oksigen, memecah hidroperoksida ke bentukbentuk non radikal, menyerap radiasi ultra violet atau mendeaktifkan singlet
oksigen.
Berdasarkan sumber asalnya, antioksidan dibedakan menjadi dua
kelompok yaitu antioksidan sintetik dan antioksidan alami. Antioksidan sintetik
adalah antioksidan yang diperoleh dari hasil sintesa reaksi kimia. Sedangkan
antioksidan alami adalah antioksidan hasil ekstraksi bahan alami (Ardiansyah,
2008).

Antioksidan sintetik yang penggunaannya luas dan teeebar diselumh dunia
antara lain adalah Butil Hidroksi Anisol (BHA), Butil Hidroksi Toluen (BHT), Tert-

ButiI Hidroksi Quinon (TBHQ, Propil Galaf dan Tokoferol. Antioksidan tokoferol
merupakan antioksidan alami yang telah diproduksi secara sintetis untuk tujuan
komersial (Buck, 1991).
BHA memiliki kemampuan antioksidan yang baik pada lemak hewan
dalam system makanan panggang, namun relatif tidak efekti pada minyak
tanaman. BHA bersifat sangat larut dalam lemak dan tidak larut dalam air,
berbentuk padat putih, dan dijual dalam bentuk tablet atau serpih bersifat volatile
sehingga berguna ke material pengemas (Buck, 1991).
Menurut Sherwin (1990) antioksidan sintetik BHT memiliki sifat serupa
BHA sehingga antioksian ini dapat memberikan efek sinergis bila dimanfaatkan
bersama dengan BHA,berbentuk kristal putih, dan digunakan secara luas karena
harganya yang relatif murah.
Propil galat merupakan kristal putih yang mempunyai karakteristik sensitif
terhadap panas dan terdekomposisi pada titik cair 14S°C, dapat membentuk
kompleks warna dengan ion metal sehingga kemampuan antioksidamya rendah.
Antioksidan ini memberikan efek sinergis dengan BHA dan BHT (Buck, 1991).
TBHQ merupakan antioksidan paling efektif untuk lemak dan minyak
khususnya minyak tanaman karena memiliki kamampuan antioksidan yang baik
pada penggorengan dan kurang baik pada pembakaran. TBHQ yang
dikombinasiican dengan BHA akan memiliki kemampuan antioksidn yang baik pada
pemanwgan.
Tokoferol merupakan antioksidan alami yang dapat ditemukan hampir
disetiap minyak tanaman tetapi saat ini telah diproduksi secara kimia. Tokoferol
memiliki karakteristik berwama kuning terang, larut dalam lipida karena
mempunyai rantai C yang panjang. Pengaruh nutrisi secara lengkap dari tokoferol
belum diketahui tetapi a-tokoferol dikenal sebagai sumber vitamin E. Di dalam
jaringan hidup, aktivitas antioksidan tokoferol cenderung a->f3->x->6-tokoferol,
tetapi dalam makanan aktivitas tokoferol terbalik 6-%->f3->a-tokoferol (Belitz
dan Grosch, 1987). Sedangkan menurut Sherwin (1990) urutan tersebut kadang
bervariasi tergantung pada substrat dan kondisi lain seperti suhu.
Trolox atau Trolox-C (asam 6-hidroksi-2,5,7,8-tetrameti1 kruman-2karboksilat) merupakan antioksidan sintetik. Secara struktur, trolox sempa dengan atokoferol kecuali penamtian rantai samping hidrokarbon dengan gugus COOH.

Trolox me~pZ+kan
padatan tidak b e m a , dan tidak berasa. Trolox stabil pada suhu
22-45'~(Madhavi et ~2.1996).

Gambar 2 Struktur Trolox (Madhavi et ~1.1996).
Trolox mempunyai aktivitas antioksidan 2 sampai 4 kaii lebii besar daripada

BHA dan BHT dalam minyak tumbuhan dan lemak hewan. Disamping itu troloxjuga
dilaporkan bersifat lebih aktif dibandigkan dengan a-tokoferol, propil galat secta
askorbil palmitat (Madhavi et al. 1996).

Antioksidan alami di dalam makanan dapat berasal dari (a) senyawa
antioksidan yang sudah ada dari satu atau dua komponen makanan, (b) senyawa
antioksidan yang t e h t u k dari reaksi-reaksi selama proses pengolahan, (c) senyawa
antioksidan yang diisolasi dari sumber alami dan ditamhhkm ke makanan sebagai M a n
pangan .

Menurut Pratt dan Hudson (1992), kebanyakan senyawa antioksidan yang
diisolasi dari sumber alami adalah berasal dari tumbuhan. Isolasi antioksidan alami
telah dilakukan dari tumbuhan yang dapat dimakan, tetapi tidak selalu dari bagian
yang dapat diiakan. Antioksidan alami tersebar di beberapa bagian tanaman seperti
pada kayu,kulit kayu, akar, daun, buah, bunga, biuji dan serbuk sari.
Menurut Apak et al. (2007) senyawa antioksidan alami tumbuhan umumnya
adalah senyawa fenolik atau polifenolii yang dapat berupa golongan flavonoid,
turunan asam sinamat, kumarin, tokoferol, dan asam-asam organik polifungsional.
Golongan flavonoid yang memiliki aktivitas antioksidan meliputi flavon, flavonol,
isoflavon, katekin, flavanon dan kalkon. Sementara turunan asam sinamat meliputi
asam kafeat, asam ferulat, asam klorogenat dan lain-lain. Senyawa antioksidan
alami polifenolik ini adalah multifungsional dan dapat bereaksi sebagai (a)

pereduksi, @) penangkap radial bebas, (c) pengkelat logam, (d) peredam
terbentuknya singlet oksigen (Javanmardi et al. 2003)
Menurut Ivkukham (1988), kira-kira 2%dari seluruh k a b n yang dii~to~ntesis
oleh tumbuhan diubah menjadi flavonoid atau senyawa yang behitan erat dengannya,
sehingga flavonoid melupakan salah satu golongan fenol alam terbesar. Lebi lanjut
disebutkan bahwa sebenamya flavonoid terdapat ddam semua tumbuhan hijau, sehingga

@lab ditemukan pula p& setiap telaah ekstmk tumbuhan. Ditulii oleh Pratt dan
Hudson (1992), kebanyakan golongan dari 5avonoid dan senyawa yang behitan erat
dengannya memiliki sifatsifaf antioksidan baik di &lam

lipida cair maupun dalam

makananberlipida,

Berdasarkan mekanisme kejanya, antioksidan memiliii dua fungsi. Fungsi
pertama adalah sebagai pemberi atom hidrogen. Antioksidan (AH) yang
nempunyai fungsi utama tersebut sering disebut sebagai antioksidan primer.
Senyawa ini dapat memberikan atom hidrogennya secara cepat ke radikal lipida

(R', ROO') atau mengubahnya ke bentuk yang lebih stabil, sementara turunan
radikal antioksidan (A') tersebut memiliki keadaan lebih stabil dibanding mdikal
lipida. Fungsi kedua melupakan hngsi sekunder antioksidan, yaitu memperlambat
laju autooksidasi dengan berbagai mekanisme diluar mekanisme pemutusan rantai
autooksidasi dengan pengubahan radikal lipida ke bentuk yang lebih stabil (Gordon,
1990).
Penambahan antioksidan (AH) primer dengan konsentrasi rendah pada
lipida dapat menghambat atau mencegah reaksi autooksidasi lemak dan minyak.
Penambahan tersebut dapat menghalangi reaksi oksidasi pada tahap inisiasi
maupun propagasi (Gambar 3). Radikal-radikal antioksidan (A') yang terbentuk
pada reaksi tersebut relatif stabil dan tidak mempunyai cukup energi untuk dapat
bereaksi dengan molekul lipida lain membentuk m d i i l lipida baru. Menurut Apak et
al. (2007), mekanisme pemutusan rantai dapat terjadi dengan cara :

L* + AH

Tahap inisiasi:

Radikal lipida

Tahap Propagasi:

LO*
LOO'

+ AH

-

+ AH -----+

LH

+A

LQH
LOOH

+A
+A

Gambar 3. Reaksi penghambatan antioksidan primer terhadap radikal
lipida (Apak et al. 2007)
Konsentrasi antioksidan yang ditambahkan dapat berpengaruh pada laju
oksidasi. Pada konsentrasi tinggi, aktivitas antioksidan grup fenolik sering lenyap
bahkan antioksidan tersebut lenyap menjadi prooksidan (Gambar 4). Pengaruh

-

jumlah konsentrasi pada laju oksidasi tergantung pada struktur antioksidan,
kondisi dan sampel yang diujikan.
AH

+02

A'

+ HOUAH + ROOH

I

Gambar 4 Antioksidan bertindak sebagai prooksidan pada konsentrasi
tinggi (Gordon, 1990).
Pratt dan Hudson (1992) berpendapat bahwa penghambatan oksidasi lipida

oleh antioksidan melalui lebih dari satu mekanisme tergantung pada kondisi reaksi
dan sistem makanan. Ada empat kemungkinan mekanisme penghambatan
tersebut, yaitu (a) pemberian hidrogen, @) pemberian elektron, (c) penambahan
lipida pada cincin aromatik antioksidan, (d) pembentukan kompleks antara lipida
dan cincin aromatik antioksidan. Studi lebih lanjut mengamati bahwa ketika atom
hidrogen labil pada' suatu antioksidan tertentu diganti dengan deuterium,
antioksidan tersebut menjadi tidak efektif. Hal ini menunjukkan bahwa mekanisme
penghambatan dengan pemberian hidrogen lebih baik dibandig pemberian
elektron. Beberapa penelitian menyatakan bahwa pemberian hidrogen atau elektron
mempakan mekanisme. utama, sementara pembentukan kompleks antara
antioksidan dengan rantai lipida adalah reaksi sekunder.

Antioksidan sekunder merupakan senyawa yang menghambat laju reaksi
autooksidasi lipid melalui m e h i s m e yang berbeda dari antioksidanprimer. Antioksidan
sekunder seperti asam sitrat, asam askorbat, clan estemya, sering ditambahkan pada
lemak dan minyak sebagai kombiiasi dengan antioksidan primer. K o m b i i i tersebut
dapat memberi efek sinergis sehiigga menambah keefektifan kerja antioksidan
primer. Antioksidan sekunder ini bekej a dengan satu atau lebih mekanisme berikut
(a) memberikan suasana asam pada medium (sistem makanan), (b) meregenemi
antioksidan utama, (c) mengkelat atau m e n d e a k t i i kontaminan prooksidan, (d)
menangkap oksigen, (e) mengikat singlet oksigen dan mengubahnya ke bentuk
triplet oksigen (Godon, 1990).
Antioksidan sebaiknya ditambahkan ke lipida seawal mungkin untuk
menghasilkan efek maksimum. Menurut Coppen (1983), antioksidan hanya akan
benar-benar efektif bila ditambahkan seawal mungkin selama periode induksi, yaitu
suatu periode pada awal oksidasi lipida tejadi d i a n a oksidasi masih lmjalan secara
lambat dengan laju kecepatan semgam.
Faktor-Faktor yang Mempengamhi Aktivitas Antioksidan
Beberapa faktor yang berpengaruh terhadap oksidasi lipid juga
mempengaruhi aktivitas antioksidan seperti s~lbstrat lipid, faktor fisik serta
keadaan fisiko kimia sistem lipid. Disamping itu, aktivitas antioksidan juga sangat
dipengaruhi oleh faktor lain seperti struktur dan konsentrasi antioksidan.
Pada umumnya yang tergolong sebagai antioksidan primer adalah
senyawa-senyawa fenolik. Walaupun sebenamya senyawa fen01 tidak bersifat
sebagai antioksidan, tetapi terdapatnya substituen atau gugus pada posisi orto dan
para dapat meningkatkan densitas elektron pada gugus hidroksil melalui efek
induktif. Peningkatan densitas elektron pada OH akan menurunkan energi ikat
oksigen-hidrogen sehingga berakibat pada meningkatnya reaktivitas terhadap
radikal bebas alkil (Gordon, 1990; Maslarova, 2001). Disamping pengaruh
induktif, faktor sterik dan elektronik serta adanya ikatzn hidrogen juga
mempengaruhi kekuatan ikatan atom hidrogen pada antioksidan (A-H).

Aktivitas antioksidan secara mum dipengaruhi oleh konsentrasi dan shuktur
kimia dari 5avonoid Tiga sk&m

yang berpengaruh terfiadap aktivitas antioksidan

adalah :(1) struktur odihidroksi (btekol) pada cinch B, berperan sebagai donor elektron

dan menjadi target radiil. Struktur 3-0H dari cinch C juga menguntungkan untuk
aktivitas antioksidan 5avonoid; (2) Konjugasi ikatan rangkap pada C2C3 dengan gugus
4ket0, berperan untuk delokalisasi elektron dari cinch B, menin-

kapasitas

scavenging radikal; (3) adanya gugus 3-OH dan 5-OH dalam kombinasi dengan h g s i 4-

karb.mil dan ikatan rangkap C2C3 menaikkan aktivitas scavenging radikal (Amic et al.
2003).
Metode Pengujian AMivitas Antiohidan
Berdasarkan reaksi kimia yang terjadi, metode pengujian aktivitas
antioksidan dapat dibagi dalam dua katagori yaitu: (I) berdasarkan transfer atom
hidrogen (hydrogen atom fransrfer, HAT) dan (2) berdasarkan transfer elektron
(electron tranfer, ET). Pengujian dengan metode HAT didasarkan pada reaksi

kinetik, dan melibatkan reaksi kompetisi dimana antioksidan dan substrat bersaing
membentuk radikal peroksil yang dihasilkan melalui dekomposisi senyawa azo
(Huang et al. 2005). HAT digunakan untuk mengukur kemampuan antioksidan
dalam menghambat radikal bebas (radikal peroksil) oleh donor atom hidrogen.
Mekanisme HAT dari antioksidan yaitu atom hidrogen yang berasal dari phenol
(Ar-OH) ditransfer pada radikal ROO, reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut :
ROO'

+ AWArOH ------+

ROOH

+ A- 1ArO'

Radikal ariloksi (ArO') dibentuk dari reaksi antioksidan phenol dengan peroksil
radikal yang distabilisasi dengan resonansi. Oksidan dan antioksidan bereaksi
dengan ROO', aktivitas antioksidan dapat diukur dari kompetisi kinetik dengan
cara mengukur penghilangan wama oksidan karena kahadiran antioksidan (Huang
et al. 2005).

Sedangkan metode ET didasarkan pada reaksi redoks. Metode ini
digunakan untuk mengukur kapasitas antioksidan yang ditandai dengan perubahzn

wama pada saat reaksi reduksi terjadi. Mekanisme reaksi elektron transfer

-

sebagaimana dapat dilihat pada Gambar 5.

RQQ' + AWArQkl
A H C I A ~ O P+ H20
ROQ'

+ H3Q'

RQQ' + AH+ I&Q@
A-/ArO'

+~30'

ROQH + H2Q

Gambar 5 Mekanisme reaksi elektron transfer (Ou et al. 2002)
Pada metode ET, reaksi berjalan lebih lambat dibandiigkan dengan
metode HAT dan reaksi dipengaruhi oleh jenis pelarut dan kondisi pH. Metode ini
merupakan metode yang sangat popuier. Termasuk dalam metode ini adalah
pengukuran

total

fenol

menggunakan

reagen Folin-Ciccalteau

TEACIABTS, DPPH dan reducing power.

(FCR),

Dalam reaksinya, metode ini

dipengaruhi oleh dua komponen yaitu antioksidan dan oksidan. Dasar dari reaksi
ini adalah reaksi transfer elektron. Oksidan yang memperoleh elektron dari
antioksidan akan mengalami pembahan wama. Tingkat pembahan wama
sebanding dengan konsentrasi antioksidan. Titik akhir reaksi dicapai ketika
perubahan wama sudah tidak terjadi lagi. Perubahan nilai absorbansi diplot
terhadap konsentrasi antioksidan yang digambarkan pada kurva linier. Slope kurva
menunjukkan kapasitas reduksi dari antioksidan, yang diekspresikan sebagai

Polox equivalen (TE) atau gaNic acid equivalent (GAE) untuk pengujian total
fenol (Huang et al. 2005).

1. Metode Pengujian DPPH (2,2-diphenyl-I-picrylhidracyr)
DPPH adalah salah satu radikal bebas yang secara komersial tersedia
dalam bentuk radikal nitrogen dan mempunyai penghambatan maksimum pada
panjang gelombang 515 nm. Pada saat reduksi, wama larutan akan menghilang
dan selanjutnya dapat diukur dengan menggunakan spektrofotometer. Huang et al.
(2005) melaporkan bahwa DPPH merupakan metode pengujian yang didasarkan
pada elektron transfer (ET).

Aktivitas antioksidan dapat diukur dengan menggunakan metode
penangkapan radikal bebas stabil DPPH (2,2-diphenyl-I-picrylhidracyl).DPPH
adalah suatu radial bebas stabil yang dapat bereaksi dengan radikal lain
membentuk suatu senyawa stabil. Selain itu DPPH juga dapat bereaksi dengan
atom hidrogen @erasal dari suatu antioksidan) membentuk DPPH tereduksi @PP
Hidrazin) yang stabil (Molyneux, 2004). Prinsip pengujian aktivitas antioksidan
dengan metode ini adalah mengukur daya peredaman sampel (ekstrak sayuran
indigenous) terhadap radial bebas DPPH. DPPH akan bereaksi dengan atom
hidrogen dari senyawa peredam radikal bebas membentuk DPP Hidrazin yang
lebih stabil. Senyawa peredam radikal bebas yang bereaksi dengan DPPH akan
menjadi radial baru yang stabil atau senyawa bukan radikal. Aktivitas
antioksidan dinyatakan dengan persentase penghambatan (inhibisi) yang diperoleh
dari nilai absorbansi blanko dikurangi absorbansi sample (Singh et al. 2002).
Untuk mengetahui aktivitas antioksidan suatu ekstrak tumbuhan, metode
DPPH adalah metode yang cepat, mudah, dan sensitive. Reaksi peredaman
(scnvenging) antara radikal DPPH dan flavonoid dapat ditulis sebagai berikut :

...-

DPPH

Gambar 6 Reaksi antara DPPH dan antioksidan (Prakash et al. 2008)
Antioksidan bereaksi dengan DPPH' yang menstabilkan radikal bebas dan
mereduksi DPPH. Sebagai konsekuensinya penyerapan radikal DPPH* menurun
ke bentuk DPPH-H. Derajat diskolorasi menunjukkan potensi peredaman radikal
bebas dari substansi antioksidan atau ekstrak dengan memberikan hidrogen.
DPPH yang bereaksi dengan antioksidan akan mengalami perubahan warna dari
ungu ke kuning, intensitas warna tergantung kemampuan dari antioksidan
(Molineux et al. 2004).
Sebaliknya peredam radikal bebas yang kehilangan H' akan menjadi
radikal baru yang reaktif. Banyak senyawa yang mampu meredam radikal bebas,

tetapi suatu senyawa dapat digunakan sebagai peredam radikal bebas yang
bermanfaat jika setelah bereaksi dengan radikal bebas akan menghasilkan radikal
baru yang stabil atau senyawa bukan radikal. Pada radial bebas stabilitasnya
dapat disebabkan oleh pengaruh resonansi, halangan ruang maupun besamya
molekul (Apak et al. 2007).

2. Metode Pengujian TEAUABTS
Metode TEACIABTS pertama kali dikembangkan oleh Miller dan RiceEvans pada tahun 1993 dan saat ini telah banyak mengalami perkembangan. Re et
al. mengembangkan pengujian radikal kation ABTS menggunakan persulfat dari

2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazole-6-sulfoic acid) (ABTs'.)

sebagai oksidan.

Metode TEAC dikembangkan dalam tiga periode, TEAC I (ABTs'

dihasilkan

secara enzimatik dengan metmioglobin dan hidrogen peroksidase), TEAC I1
(radikal dihasilkan dengan fiitrasi menggunakan MnOz sebagai oksidan) dan
TEAC 111(dengan KzSaOssebagai oksidan). Dari ketiga metode tersebut, metode
TEACIABTS mempunyai kelebihan dibanding yang lainnya yaitu pengujian
sederhana, mudah diulang. dan yang paling penting adalah fleksibel dan dapat
diynakan untuk mengukur aktivitas antioksidan yang bersifat hidrophilik maupun
lipophilik dalam ekstrak makanan dan cairan (Apak et al. 2007).
Metode TEAC/ABTS merdpakan metode pengujian untuk mengukur
jumlah radikal yang dapat ditangkal oleh antioksidan yang dikenal dengan
kapasitas antioksidan (Lien et al. 1999). Senyawa yang biasa digunakan untuk
pengujian metode TEAC adalah trolox. Trolox bereaksi sangat cepat dengan
AJ3TS', hanya dalam beberapa detik reaksi berjalan sempuma. Cara terbaru yang
dikembangkan pada metode ini adalah dengan menambahkan larutan ABTS
radikal (ABTS')

kedalam antioksidan dan setelah stabil diukur dengan

menggunakan spektrofotometer (Berg van den

et al. 1999). Penurunan

konsentrasi ABTS' dinyatakan sebagai konsentrasi antioksidan, ekivalen dengan
trolox dan dinyatakan sebagai nilai TEAC dari antioksidan.
Namun demikian, terdapat perbedaan yang signifikan pada kedua metode
tersebut dalam ha1 kemampuannya menangkal radikal bebas. Metode ABTS' lebih
baik dibandingkan dengan metode DPPH'. Hal ini disebabkan karena metode

ABTS' dapat dioperasikan pada range pH yang besar, mudah, murah, berkorelasi
terhadap aktivitas antioksidan dalam system biologis dan lebih cepat
'

dibandingkan dengan metode DPPH (Arts et al. 2004).
Prinsip pengujian dengan metode ini adalah mengukur daya peredaman
antioksidan terhadap radikal bebas ABTS. Sebagai pembandig digunakan standar
Trolox, dan hasil pengujian dinyatakan sebagai Trolox Ekivalen. Radikal kation
ABTs" akan bereaksi dengan atom hidrogen dari senyawa peredam radikal bebas
dan menjadi ABTS yang lebih stabil. Senyawa peredam radikal bebas yang
bereaksi dengan ABTs+ akan menjadi mdikal baru yang stabil atau senyawa
bukan radikal.

Gambar 7 Mekanisme reaksi radikal ABTS (Huang et al. 2005)

3. Metode Pengujian TBA
Efektivitas suatu antioksidan baik sintetik maupun alami dapat diukur
dengan menentukan stabilitas oksidatif lipid. Penentuan stabilitas oksidatif lipid
dapat dibagi menjadi dua yaitu pembahan primer dan perubahan sekunder.
Pembahan primer pada umumnya diukur dengan memonitor (1) hilangnya asamasam lemak tidak jenuh, (2) oxygen uptake, (3) biIangan peroksida, (4) bilangan
diena terkonjugasi. Perubahan sekunder mengukur secara kuantitatif pembentukan
(1) senyawa karbonil, (2) malonaldehid serta hidrokarbon (Shahidi dan

Wanasundara, 1997).
Hidroperoksida asam linoleat (LOOH) merupakan salah satu produk
primer oksidasi asam linoleat yang mampu mengoksidasi Fez+ menjadi ~ e ~ + .
Reaksi oksidasi yang dikemukakan oleh Fenton di dalam Mathew (2000) adalah
sebagai berikut:

Pada metode FTC ini, reaksi antara ~ e hasil
~ + oksidasi FeClz oleh
hidroperoksida dengan SCN menghasilkan senyawa kompleks benvarna merah
Fe[Fe(SCN)6] dengan serapan maksimum pada panjang gelombang 500 nm.
2 ~ e ' ++ 6 SCN ----)

Fe[Fe(SCN)6]

Absorbansi dari kompleks berwama merah tersebut berbanding lums
dengan konsentrasi hidroperoksida asam linoleat yang terbentuk. Oleh karena itu
dilakukan pengukuran absorbansi setiap 24 jam hingga tercapai absorbansi
maksimum.
Beberapa faktor yang mempengaruhi autooksidasi asam linoleat adalah
panas, pH, cahaya, oksigen, ion logam katalitk dan radikal lipid itu sendiri
(Buck, 1991). Pada sistem ini, asam linoleat ditempatkan pada botol gelap
bertutup kemudian diinkubasi selama 6 hari pada suhu 40°C. Inkubasi sampel
dikondisikan sedemikian mpa sehingga hanya panas, oksigen, pH dan radikal lipid
yang mempengaruhi oksidasi asam linoleat.
Pada tahap awal oksidasi asam linoleat (fase lag) akan terbentuk
hidroperoksida. Selanjutnya diikuti tahap propagasi dimana kadar hidroperoksida
terus meningkat dan mencapai nilai maksimum pada hari ke-5. Kemudian disusul
dengan tahap terminasi dimana hidroperoksida akan mengalami dekomposisi
membentuk malonaldehid.
Menurut Chen (1998) nilai absorbansi pada hari ke-0 hams dibawah 0.3,
karena jika absorbansinya lebih dari 0.3 menunjukkan asam linoleat telah msak
(teroksidasi). Waktu selama absorbansi masih di bawah 0.3 dinyatakan sebagai
periode induksi dari autooksidasi lipida Periode induksi juga menunjukkan
lamanya tahap inisiasi berlangsung.
Peroksidasi lipid akan menghasilkan produk akhir berupa senyawa
malonaldehid (MDA), yaitu senyawa aldehida berkarbon tiga yang reaktif dengan
berat molekul yang rendah yang mempakan hasil aktivitas peroksidase pada asam

lemak tak jenuh rantai panjang. Peroksidasi lipid mudah tejadi pada asam lemak
berantai panjang dengan lebii dari satu ikatan rangkap seperti linoleat, linolenat,
dan arakidonat (Murray et al. 2003).

Gambar 8 Struktur kompleks MDA-TBA (Anonim, 2008b)
Senyawa MDA yang dihasilkan dari peroksidasi lipid tersebut dapat
diukur dengan metode TBA (Thiobarbituric Acid), karena MDA dapat bereaksi
dengan TBA membentuk produk berwarna yang dapat diukur pada panjang
gelombang 532 nm. Pada penelitian