Gambar 3. Metode Tuang Pour Plate Method pada Metode Hitungan Cawan Plate Count Method
c. Analisis Bacillus cereus
Analisis Bacillus cereus dilakukan dengan metode modifikasi BAM 2001b. Sebanyak 20 gram sampel bubuk insant diencerkan dengan 100 ml
larutan pengencer Butterfield’s phosphate-buffered sesuai dengan petunjuk penyajian yang tertera pada kemasan dan pengujian dilakukan dengan cara
menginokulasi suspensi sebanyak 1 ml yang dibagi kedalam 3 buah cawan petri yang berisi media mannitol egg yolk polymyxine MYP agar padat masing-
masing 0.3 ml, 0.3 ml dan 0.4 ml. Suspensi kemudian diratakan pada permukaan media dengan menggunakan hockey stick steril yang terbuat dari kaca.
Selanjutnya, cawan petri diinkubasi selama 24 jam pada suhu 30 ⁰C dengan posisi
cawan dibalik. Media mannitol egg yolk polymyxine agar MYP yang digunakan ditambah dengan egg yolk emulsion dan polymyxin B.
Bacillus cereus tidak memiliki kemampuan untuk memfermentasi mannitol pada media MYP agar, sehingga koloni Bacillus cereus akan
menunjukkan warna pink pada media MYP agar. Egg yolk emulsion mengandung lesitin. Lesitin merupakan substrat untuk enzim lesitinase yang diproduksi oleh
Bacillus cereus. Enzim lesitinase dapat menghidrolisis lesitin dan menyebabkan timbulnya zona keruh disekeliling koloni BD, 2010. Polymyxin B yang
ditambahkan ke dalam MYP agar merupakan antibiotik yang berfungsi untuk menghambat pertumbuhan bakteri gram negatif Oxoid, 2001. Bacillus cereus
adalah bakteri gram positif dan sangat resisten terhadap polymyxin B sehingga penambahan polymyxin B tidak akan menghambat pertumbuhan Bacillus cereus
Batt, 2000. Koloni Bacillus cereus yang tumbuh pada MYP agar dihitung dengan rumus standard plate count. Perhitungan Bacillus cereus, yang dihitung
hanya pada cawan yang mengandung jumlah koloni sebanyak 15-150 koloni BAM, 2001b.
Koloni yang diduga Bacillus cereus kemudian diisolasi dan ditumbuhkan pada media Tryptone Soya Agar miring TSA dan disimpan pada lemari
pendingin sebagai koloni stok yang nantinya akan diuji konfirmasi Bacillus cereus secara biokimia.
d . Konfirmasi kultur Bacillus cereus
Uji konfirmasi yang dilakukan adalah pewarnaan spora, pewarnaan gram, uji katalase, uji reaksi terhadap kuning telur dan uji motilitas. Uji konfirmasi
kultur Bacillus cereus dilakukan pada kultur yang berumur 24-72 jam. Prosedur pewarnaan spora modifikasi Hussey et al., 2007, yaitu dibuat
olesan bakteri di atas kaca objek dan difiksasi. Olesan bakteri kemudian digenangi dengan hijau malasit selama 10 menit kemudian diletakkan diatas gelas kimia
yang berisi air mendidih, yang dipanaskan diatas penangas air sehingga uap yang dihasilkan akan mengenai kaca objek yang berisi bakteri. Kaca objek kemudian
dibilas dengan aquades dan ditiriskan. Selanjutnya, digenangi dengan safranin selama 1 menit. Kemudian dibilas dengan aquades, dikeringkan dan diamati di
bawah mikroskop. Prosedur perwarnaan gram menurut dilakukan BAM 2001c, yaitu dibuat
olesan bakteri di atas kaca objek dan difiksasi. Olesan bakteri lalu digenangi dengan pewarna kristal violet-ammonium oksalat selama 1 menit. Kemudian
dibilas dengan aquades dan dikeringkan. Selanjutnya, digenangi dengan Gram’s iodine selama 1 menit, dibilas dengan aquades, dan dikeringkan. Warnanya
dihilangkan dengan etanol 95 hingga tidak ada lagi warna biru yang menempel pada kaca objek. Lalu dibilas dengan aquades, dikeringkan, digenangi dengan
pewarna safranin selama 10-30 detik. Selanjutnya, dibilas dengan aquades, dikeringkan dan diamati dibawah mikroskop.
Prosedur uji katalase dilakukan menurut Rhodehamel dan Harmon 1998, yaitu disiapkan gelas objek yang bersih. Biakan diambil sebanyak 1 ose kemudian
diinokulasi pada kaca objek dan difiksasi. Olesan bakteri kemudian ditetesi dengan H
2
O
2
3 sebanyak 2-3 tetes. Amati perubahan yang terjadi, jika ada gelembung udara maka bakteri tersebut katalase positif gelembung terbentuk dari
hasil penguraian H
2
O
2
Prosedur uji motilitas dilakukan menurut BAM 2001c, yaitu medium motilitas, medium Sulfide-Indole-Motility SIM ditusuk dengan jarum yang telah
dicelupkan ke dalam kultur isolat Bacillus cereus, kemudian diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 30
⁰C dan diamati tipe pertumbuhan yang terjadi disepanjang garis tusukan. Mikroba yang motil akan tumbuh secara difus menjauhi garis
tusukan tersebut. Untuk diagram alir proses analisis Bacillus cereus secara keseluruhan dapat dilihat pada Gambar 4.
.
Diencerkan dengan 100 ml BPB sesuai dengan prosedur penyajian dan dihomogenkan
Penanaman sebanyak 1 ml pada media MYP agar masing-masing sebanyak 0.3 ; 0.3 dan 0.4 ml kemudian
diinkubasi pada suhu 30
o
C selama 24 jam Koloni yang berwarna merah jambu dan lecithinase
positif Uji konfrimasi : pewarnaan gram, pewarnaan spora, uji
katalase, uji reaksi terhadap kuning telur, dan uji motilitas
Gambar 4. Skema pengujian sampel terhadap Bacillus cereus
Sampel komersil bubuk instant kering sebanyak 20
g
Evaluasi Pengaruh Suhu Preparasi dan Penyimpanan MP-ASI bubuk instan terhadap Bacillus cereus ATCC 10876
a. Pengawetan dan Penyegaran Kultur
