Fermentasi Gliserol Hasil Samping Pabrik Biodiesel Menjadi 1,3-Propanadiol dengan Menggunakan Bakteri Enterobacter Aerogenes

LAMPIRAN 1
HASIL ANALISA
L1.1 CRUDE GLISEROL

Gambar L1.1 Hasil Kromatografi GC Crude Gliserol
L1.2 GLISEROL MURNI

Gambar L1.2 Hasil Kromatografi GC Gliserol Murni

60
Universitas Sumatera Utara

L1.3 HASIL FERMENTASI

Gambar L1.3 Hasil Fermentasi Gliserol 1 hari, 37 0C, 10 %

Gambar L1.4 Hasil Fermentasi Gliserol 3 hari, 25 0C, 10 %

61
Universitas Sumatera Utara

Gambar L1.5 Hasil Fermentasi Gliserol 2 hari, 37 0C, 10 %

Gambar L1.6 Hasil Fermentasi Gliserol 3 hari, 37 0C, 5 %
62
Universitas Sumatera Utara

Gambar L1.7 Hasil Fermentasi Gliserol 3 hari, 37 0C, 10 %

Gambar L1.8 Hasil Fermentasi Gliserol 3 hari, 37 0C, 7 %

63
Universitas Sumatera Utara

L1.4 KADAR GLISEROL SETELAH FERMENTASI
Variabel
No

Kadar

Waktu

Volume

Suhu Fermentasi

Fermentasi (hari)

Bakteri (%)

(0C)

1

1

5

25 (suhu kamar)

0

2

1

5

37

0

3

1

7

25 (suhu kamar)

0

4

1

7

37

0

5

1

10

25 (suhu kamar)

0

6

1

10

37

0

7

2

5

25 (suhu kamar)

0

8

2

5

37

0

9

2

7

25 (suhu kamar)

0

10

2

7

37

0

11

2

10

25 (suhu kamar)

0

12

2

10

37

0

13

3

5

25 (suhu kamar)

0

14

3

5

37

0

15

3

7

25 (suhu kamar)

0

16

3

7

37

0

17

3

10

25 (suhu kamar)

0

18

3

10

37

0

(%)

64
Universitas Sumatera Utara

LAMPIRAN 2
PERHITUNGAN
L2.1 CRUDE GLISEROL
L2.1.1 Densitas
Berat piknometer = 15,72 gram
Berat piknometer + air = 25,39 gram
Massa air = 9,67 gram
Suhu air dan sampel = 30 0C
�air (30 0C) = 0,99568 gr/cm3

Volume Piknometer=

Densitas =

m Air
ρ Air

m Sampel
Volume Piknometer

Dimana:
m air = Berat air (gr)
ρ air = Densitas air (gr/cm3)
Volume Piknometer=

9,67 gr
0,99568 gr/cm3

Volume Piknometer=9,712 cm3

Berat piknometer + gliserol = 27,76 gram
Berat gliserol = 12,04 gram
12,04 gr
9,712 cm3
gr
Densitas = 1,24 � 3
cm
Densitas =

L2.1.2 Kadar Air
Berat cawan kosong = 34,70 gram
Berat cawan kosong + sampel (berat sebelum dipanaskan )= 44,70 gram
Berat sesuda dipanaskan = 43,52 gram

65
Universitas Sumatera Utara

44,70 gr-43,52 gr
x 100 %
44,70 gr

Kadar Air=

Kadar Air= 2,64 %

L2.1.3 Kadar Abu
Berat sampel = 10 gram
Berat cawan = 44,51 gram
Berat cawan + abu = 45,61 gram
Kadar Abu =

(berat cawan + berat abu ) − berat cawan
x100%
berat sampel

Kadar Abu=

45,61-44,51
x 100 %
10

Kadar Abu=11 %

L2.1.4 Kadar Free Fatty Acid (FFA)
Normalitas NaOH = 0,1 N
Volume NaOH titrasi = 5,6 ml
Massa sampel = 20 gr
FFA=

Normalitas NaOH x Volume NaOH yang terpakai x BM Gliserol
x 100 %
Massa Sampel x 10
FFA=

0,1 x 5, 6 ml x 92,11
x 100 %
20 x 10
FFA= 25,79 %

L2.2 GLISEROL HASIL PEMURNIAN DENGAN H3PO4
L2.2.1 Densitas
Berat piknometer = 15,1 gram
Berat piknometer + air = 25 gram
Massa air = 9,9 gram
Suhu air dan sampel = 30 0C
66
Universitas Sumatera Utara

Ρair (30 0C) = 0,99568 gr/cm3
m Air
ρ Air
m Sampel
Densitas =
Volume Piknometer
Volume Piknometer=

Dimana:
m air = Berat air (gr)
ρ air = Densitas air (gr/cm3)

Volume Piknometer=

9,9 gr
0,99568 gr/cm3

Volume Piknometer=9,94 cm3

Berat piknometer + gliserol = 27,8 gram
Berat gliserol = 12,7 gram
12,7 gr
9,94 cm3
gr
Densitas = 1,277 � 3
cm
Densitas =

L2.2.2 Kadar Air
Berat cawan kosong = 28,50 gram
Berat cawan kosong + sampel (berat sebelum dipanaskan )= 38,50 gram
Berat sesudah dipanaskan = 38,0 gram

Kadar Air=

38,5 gr-38 gr
x 100 %
38,5 gr

Kadar Air= 1,298 %

L2.2.3 Kadar Abu

67
Universitas Sumatera Utara

Berat sampel = 10 gram
Berat cawan = 112, 1 gram
Berat cawan + abu = 112,7 gram
Kadar Abu =

(berat cawan + berat abu ) − berat cawan
x100%
berat sampel

Kadar Abu=

112,7-112,1
x 100 %
10

Kadar Abu=6 %

L2.2.4 Kadar Free Fatty Acid (FFA)
Normalitas NaOH = 0,1 N
Volume NaOH titrasi = 1,7 ml
Massa sampel = 20 gram

FFA=

Normalitas NaOH x Volume NaOH yang terpakai x BM Gliserol
x 100 %
Massa Sampel x 10
FFA=

0,1 x 1,7 ml x 92,11
x 100 %
20 x 10
FFA= 7,83 %

L2.3 KADAR GLISEROL SETELAH FERMENTASI

Kadar Gliserol (%)=

�T1-T2�x N x 9,209
W

[34]

dengan;
T1 = volume NaOH untuk titrasi contoh (ml)
T2 = volume NaOH untuk titrasi blangko (ml)
N = normalitas NaOH (N)
W = bobot contoh (gram)
Faktor gliserol = 9,209
T2 = 0,05 ml
N = 0,5 N ; W = 0,5 gram

68
Universitas Sumatera Utara

Tabel L2.1 Hasil Titrasi Sampel Hasil Fermentasi
Variabel
No

T1

Waktu

Volume

Suhu Fermentasi

Fermentasi (hari)

Bakteri (%)

(0C)

1

1

5

25 (suhu kamar)

0,05

2

1

5

37

3

1

7

25 (suhu kamar)

0,05
0,05

4

1

7

37

5

1

10

25 (suhu kamar)

6

1

10

37

7

2

5

25 (suhu kamar)

8

2

5

37

9

2

7

25 (suhu kamar)

10

2

7

37

11

2

10

25 (suhu kamar)

12

2

10

37

13

3

5

25 (suhu kamar)

14

3

5

37

15

3

7

25 (suhu kamar)

16

3

7

37

17

3

10

25 (suhu kamar)

0,05
0,05

18

3

10

37

0,05

Kadar Gliserol (%)=

(ml)

0,05
0,05
0,05
0,05
0,05
0,05
0,05
0,05
0,05
0,05
0,05
0,05

(0,05-0,05)x 0,5 x 9,209
0,5

Kadar gliserol = 0 %

L2.4 PERHITUNGAN KONSENTRASI 1,3-PROPANADIOL

69
Universitas Sumatera Utara

Konsentrasi (mol/ml) =

ρcamp x 10 x %
BM

dimana :
ρcamp
= densitas campuran (gr/ml)
%

= kemurnian 1,3-Propanadiol

BM

= berat molekul 1,3-Propanadiol (gr/mol)

Perhitungan densitas campuran dapat dihitung dengan rumus : Σ � x %

Contoh perhitungan konsentrasi 1,3-Propanadiol pada fermentasi 1 hari dengan
suhu 37℃ dan Rasio Inokulum : Substrat 0,1 :
Diketahui :

ρasam laktat

=1,209 gr/ml

;

%asam laktat = 8,596 %

ρ3-hidroksipdhd =1,016 gr/ml

;

%3-hidroksipdhd

ρasam butirat

=0,964 gr/ml

;

%asam butirat = 23,499 %

ρ2,3-butanadiol =1,002 gr/ml

;

%2,3-butanadiol

= 18,960 %

ρ1,3-propanadiol =1,053gr/ml

;

%1,3-propanadiol

= 46,068 %

= 2,037 %

Densitas campuran :
ρcamp = Σ � x %

=(ρasam laktat x %asam laktat)

+

(ρ3-hidroksipdhd x

%3-hidroksipdhd)

+

(ρasam butirat x %asam butirat) + (ρ2,3-butanadiol x %2,3-butanadiol) +
(ρ1,3-propanadiol x %1,3-propanadiol)
= (1,209 x 0,08596) + (1,016 x 0,02037) + (0,964 x 0,23499) + (1,002 x
0,18960) + (1,053 x 0,46068)
= 1,023 gr/ml
Sehingga konsentrasi 1,3-Propanadiol :
ρcamp x 10 x %

Konsentrasi 1,3-Propanadiol (mol/ml) =
Konsentrasi 1,3-Propanadiol =

BM

1,023 gr/ml x 10 x 46,0685
76,11 gr/mol

= 6,196 mol/ml

Tabel L2.2 Hasil Perhitungan Konsentrasi 1,3-Propanadiol dari Fermentasi
Gliserol Pada Suhu 37℃ dan Rasio Inokulum : Substrat 0,1
70
Universitas Sumatera Utara

Waktu
(hari)
1
2
3

Kemurnian
1,3-Propanadiol
(%)
46,0685
32,6744
27,7948

Densitas
Campuran
(gr/ml)
1,0236
1,0148
1,0441

Berat Molekul
(gr/mol)

Konsentrasi
(mol/ml)

76,11

6,196
4,357
3,813

Tabel L2.3 Hasil Perhitungan Konsentrasi 1,3-Propanadiol dari Fermentasi
Gliserol Pada Suhu 37℃ dan Waktu Fermentasi 3 Hari
Rasio
Inokulum :
Substrat
0,05
0,07
0,10

Kemurnian
1,3-Propanadiol
(%)
29,5197
31,5919
27,7948

Densitas
Campuran
(gr/ml)
1,0321
1,0240
1,0441

Berat Molekul
(gr/mol)

Konsentrasi
(mol/ml)

76,11

4,003
4,251
3,813

Tabel L2.4 Hasil Perhitungan Konsentrasi 1,3-Propanadiol dari Fermentasi
Gliserol Pada Waktu Fermentasi 3 Hari dan Rasio Inokulum : Substrat 0,1
Suhu
(℃)
25
37

Kemurnian
1,3-Propanadiol
(%)
51,2461
27,79483

Densitas
Campuran
(gr/ml)
0,9554
0,7921

Berat Molekul
(gr/mol)

Konsentrasi
(mol/ml)

76,11

6,433
2,893

LAMPIRAN 3
71
Universitas Sumatera Utara

DOKUMENTASI PENELITIAN
L3.1

FOTO CRUDE GLISEROL

Gambar L3.1 Crude Gliserol

L3.2

FOTO CRUDE GLISEROL DENGAN PENAMBAHAN H3PO4

Gambar L3.2 Hasil Penambahan Asam Phospat

L3.3

FOTO GARAM HASIL PEMURNIAN GLISEROL

72
Universitas Sumatera Utara

Gambar L3.3 Garam yang Terbentuk Pada Proses
Pemurnian Crude Gliserol

L3.4

FOTO GLISEROL MURNI

Gambar L3.4 Gliserol Murni

L3.5

FOTO AUTOCLAVE

Gambar L3.5 Autoclave

L3.6

FOTO STERILISASI MEDIA PERTUMBUHAN

73
Universitas Sumatera Utara

Gambar L3.6 Proses Sterilisasi
Media Pertumbuhan

L3.7

FOTO INOKULASI BAKTERI

Gambar L3.7 Proses Inokulasi Bakteri

L3.8

FOTO PEMBIAKAN BAKTERI DALAM WATER BATCH

L3.9

Gambar L3.8 Pembiakan Bakteri Dalam Water Batch
FOTO PROSES PENGENCERAN 108
74
Universitas Sumatera Utara

Gambar L3.9 Pengenceran 108

L3.10 FOTO PERHITUNGAN KOLONI DENGAN COLONI COUNTER

Gambar L3.10 Perhitungan Jumlah Koloni
dengan Coloni Counter

L3.11 FOTO HASIL TITRASI PENENTUAN KADAR GLISEROL

Gambar L3.11 Hasil Titrasi Penentuan Kadar Gliserol
L3.12 FOTO DISTILASI HASIL FERMENTASI
75
Universitas Sumatera Utara

Gambar L3.12 Proses Distilasi

L3.13 FOTO 1,3-PROPANADIOL

(a)
Gambar L3.13

(b)
a) 1,3-Propanadiol sebelum proses Distilasi
b) 1,3 Propanadiol setelah proses Distilasi

76
Universitas Sumatera Utara

DAFTAR PUSTAKA
[1] Manurung Renita. “Optimasi dan Kinetika Transesterifikasi Minyak Sawit
Menjadi Etil Ester.” Tesis, Program Pasca Sarjana Fakultas Teknik USU, Medan,
2005.

[2] Purwadi, R., M.T.A.P. Kresnowati, L.Badriyah, Andini A.D.Puri, R.Aisyah,
“Pengolahan Gliserol, Limbah Biodiesel, Menjadi Produk Bermanfaat Melalui
Proses Biologis 1 : Pemilihan Mikroba Potensial,” Jurnal Teknik Kimia Indonesia,
11(4) 2013.

[3] Haryanto, Bode. “Bahan Bakar Alternatif Biodiesel.” Tesis, Departemen
Teknik Kimia Fakultas Teknik USU, Medan, 2002.

[4] Ringel, Anne Katrin, Erik Wikens, Diana Hortig, Thomas Wilke, Klaus-Dieter
Vorlop (2011). “An Improved Screening Method For Microorganism Able To
Convert Crude Glycerol to 1,3-propanediol and To Tolerate High Product
Concentration.” Biotechnological Products adnd Proceess Engineering, 93, 10491056. Springer.

[5] Yanuarta, Galuh dan Fajar Eko Febri. “Pabrik Gliserol Dari Minyak Kelapa
Sawit (CPO) Dengan Proses Continous Fat Splitting.” Skripsi, Fakultas Teknologi
Industri ITS, Surabaya, 2011

[6] Hakiki, Rizlinda. “Penentuan Zat Pereduksi Pada Gliserin Dengan
Menggunakan Spektrofotometri UV-Visible”. Skripsi, Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, USU, Medan, 2010.

[7] Setyaningsih, Dwi, “Pembuatan Pupuk Potassium Dari Proses Pemurnian
Gliserol Hasil Samping Industri Biodiesel,” Konferensi Nasional - Pemanfaatan
Hasil Samping Industri Biodiesel dan lndustri Etanol serta Peluang
Pengembangan Industri Integratadnya (2007).
53
Universitas Sumatera Utara

[8] Marchand, Kimberly A. “Utilization of Biodiesel-Derived Crude Glycerol by
Fungi for Biomass and Lipid Production.” Thesis, University of Guelph, Canada,
2012.

[9] Bunyamin, Anas. “Pemanfaatan Gliserol Hasil Samping Produksi Biodiesel
Jarak Pagar Sebagai Komponen Coal Dust Suppressant.” Skripsi, Fakultas
Pertanian, IPB, Bogor, 2011.

[10] Pasaribu, Farida Arriany. “Peranan Gliserol Sebagai Plastisiser Dalam Film
Pati Jagung Dengan Pengisi Serbuk Halus Tongkol Jagung.” Skripsi, Program
Studi Ilmu Kimia, USU, Medan, 2009.

[11] Aziz, Isalmi, Siti Nurbayati, Juwita Suwandari. “Pemurnian Gliserol Dari
Hasil Samping Pembuatan Biodiesel Menggunakan Bahan Baku Minyak Goreng
Bekas.” Skripsi, Fakultas Sains dan Teknologi, UIN Syarif Hidayatullah, Jakarta,
2011.

[12] Silaban, Marisi. “Pengaruh Jenis Teh dan Lama Fermentasi Pada Proses
Pembuatan Teh Kombucha.” Skripsi, Fakultas Pertanian, Departemen Teknologi
Pertanian, USU, Medan, 2005.

[13] Afriani, Mutia. “Pengaruh Lama Fermentasi dan Konsentrasi Ragi Roti
Terhadap Kadar Bioetanol dari Fermentasi Glukosa Hasil Hidrolisis Selulosa
Tandan Kosong Kelapa Sawit.” Skripsi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Departemen Kimia, USU, Medan, 2011.

[14] Chojnacka, K, Fermentation Products, (United States: Enyclopedia of Life
Support Systems, Volume V, 2009).

[15] Silva, Gervasio Paulo, Matthias Mack, Jonas Contiero, “Glycerol : A
Promising and Abundant Carbon Source for Industrial Microbiology,” Research
Review Paper Biotechnology Advances, 27 (1) 2009 : hal. 30-39.

54
Universitas Sumatera Utara

[16] Afrianto, Pengawasan Mutu Baha/ Produk Pangan (Jakarta: Direktorat
Pembinaan Sekolah Menengah KejuruaN, Jilid 2, 2008), Hal 275-302

[17] Suharjono, et al., Isolasi Mikrobia Lipolitik, Proteolitik, Lignolitik, dan
Selulolitik

dari

Limbah

Pabrik

kelapa

Sawit,

(Malang:

Laboratorium

Mikrobiologi Jurusan Biologi Universitas Brawijaya, 2011)

[18] Rangkuti, Penuntun Praktikum Mikrobiologi (Padang: Sekolah Menengah
Analisa Kimia Padang, 1994)

[19] Nur, H.S, “Pembentukan Asam Organik oleh Isolat Bakteri Asam laktat pada
Media Buah Durian (Durio zibethinus Murr.),” Bioscientiae, 2(1) 2005 : hal. 1524

[20] He Wennan, Weidong Tian, Guang Zhang, Guo-Xiang Chen, Zengming
Zhan, “Production Of Novel Polyhydroxyalkanoates By Pseudomonas Stutzeri
1317 From Glucose And Soybean Oil,” FEMS Microbiology Letter, 169
(December, 1998), hal 45-49.

[21] Siregar. “Biosintesis 1,3-Propanadiol Dari Gliserol (Hasil Samping
Biodiesel) Oleh Bakteri Enterobacter Aerogenesis.” Tesis, IPB, Bogor, 2008.

[22] Jalaluddin, Sheikh, Jeanne-Marie Devaster, Robert Scheen, Michele Gerard,
Jean-Paul

Butzler,

“Molecular

Epidemiological

Study

of

Nosocomical

Enterobacter Aerogenes Isolates in A Belgian Hospital,” Journal of Clinical
Microbiology, 36 (7) 1998 : hal. 1846-1852.

[23] Leja, Katarzyna, Katarzyna Czaczyk, Kamila Myszka, “Biotechnological
Synthesis of 1,3-Propanediol Using Clostridum ssp,” Journal of Biotechnology,
10 (54) 2011.

55
Universitas Sumatera Utara

[24]

Drozdzynska,

Agnieszka,

Katarzyna

Leja,

Katarzyna

Czaczyk,

“Biotechnological Production of 1,3-Propanediol from Crude Glycerol,” Journal
of Biotechnology : Computational Biology and Bionanotechnology, 92 (1) 2011.

[25] Vanajakshi, Jalasutram dan Jetty Annapurna, “Isolation and Identification of
1,3-Propanediol Producing Strain of K. pneumoniae 141B from Soil and
Optimization of Process Parameters,.” Research Journal of Biotechnology, 6 (2)
2011.

[26] Saxena, R.K., Pinki Anand, Saurabh Saran, Jasmine Isar, “Microbial
Production

of

1,3

–propanediol:

Recent

Developments

and

Emerging

Opportunities,” Biotechnology Advances, 27 (6) 2011 : hal. 895-913.

[27] Wilkens, Erik, Anne Katrian Ringel, Diana Hortig, Thomas Wilke, Klaus
Dieter-Vorlop, “High-Level Production of 1,3-Propanediol from Crude Glycerol
by Clostridium butyricum AKR102a,” Appl Microbial Technology, 93 (3) 2012 :
hal. 1057-1063.

[28] Boonoun, P., C. Muangnapoh, P. Prasitchoke, V. Tantayakom, A. Shotipruk,
“Reactive Extraction of 1,3-Propanediol from Model Mixture of Fermentation
Broth Using Novel Carbon Based Catalyst,” Journal of Sustainable Energy &
Environment, 1 (2010) : hal 1-4.

[29] Irawan, Bambang T.A. “Peningkatan Mutu Minyak Nilam Dengan Ekstraksi
dan Destilasi Pada Berbagai Komposisi Pelarut.” Tesis, Magister Teknik Kimia,
Universitas Diponegoro, Semarang, 2010.

[30] Dewi. “Mempelajari Pertumbuhan Clostridium Butyricum Pada Pati Resistan
Beras Dan Sagu Serta Profil Asam Lemak Rantai Pendek Yang Dihasilkannya.”
Skripsi, Departemen Ilmu Dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian,
IPB, Bogor, 2009.

56
Universitas Sumatera Utara

[31] Walangare, K.B.A, A.S.M Lumenta, J.O.Wuwung, B.A. Sugiarso, “Rancang
Bangun Alat Konversi Air Laut Menjadi Air Minum Dengan Proses Distilasi
Sedehana Dengan Menggunakan Pemanas Elektrik,” Jurnal Teknik Elektro dan
Komputer (2013) : hal. 1-10.

[32] Nugroho, Bonita, Eka Puji Fitirana, Fitriyah Ningsih, Pika Nurropiah,
Kromatografi Gas (Semarang: Program Studi D4 Analis Kesehatan. Universitas
Muhammadiyah, 2012).

[33] Pardi. “Optimasi Proses Produksi Gliserol Monooleat Dari Gliserol Hasil
Samping Pembuatan Biodiesel.” Tesis, Program Pasca Sarjana Fakultas Teknik
USU, Medan, 2005.

[34] Farobie, Obie. “Pemanfaatan Gliserol Hasil Samping Produksi Biodiesel
Sebagai Bahan Penolong Penghancur Semen.” Skripsi, IPB, Bogor, 2009.

[35] Mu’azu K, Mohammed-Dabbo, S.M Waziri, A.S.Ahmed, I.M.Bugaje,
A.S.Ahmad (2013). “Development of A Mathematical Model For The
Esterification of Jatropha curcas Seed Oil.” Journal of Petroleum Technology
and Alternative Fuels, 4(3), 44-52.

[36] AOAC (Association of Official Analitycal Chemist), Official Method of
Analysis of The Association of Official Analytical of Chemist (USA: The
Association of Official Analitycal Chemist, Inc.,1995).

[37] Acros, Organics (2009). “Material Safety Data Sheet: Glycerol.” Diakses 5
April 2014. http://www.acros.com/glycerol-reagent.

[38] Avantor (2011). “Material Safety Data Sheet: Glycerol.” Diakses 5 April
2014. http://www.avantormaterials.com/glycerol.

57
Universitas Sumatera Utara

[39] Rahmi, Ulfa. “Pengaruh Jenis Asam dan ph Pada Pemurnian Residu Gliserol
Dari Hasil Samping Produksi Biodiesel.” Skripsi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan, USU, Medan, 2006.

[40] Ito, Takeshi, Yutaka Nakashimada, Koichiro Senba, “Hydrogen and Ethanol
Production from Glycerol-Containing Wastes Discharged after Biodiesel
Manufacturing Process,” Journal of Bioscience and Bioengineering, 100 (3) 2005.

[41] Silalahi, Fitri Yulyanti. “Fermentasi Fruitghurt Dengan Variasi Kulit Buah.”
Skripsi, Departemen Teknik Kimia, Universitas Diponegoro, Semarang, 2008.

[42] Ferdaus, Fani, Meilani Okta Wijayanti, Ery Susiani Retnoningtyas, Wenny
Irawati, “Pengaruh pH, Konsentrasi Substrat, Penambahan Kalsium Karbonat dan
Waktu Fermentasi Terhadap Perolehan Asam Laktat dari Kulit Pisang,” Jurnal
Teknik, 7 (1) 2008 : hal. 1-14

[43] Xu Yun-Zhen, Ru-Chun Wu, Zeng-Mig Zheng, De-Hua Liu (2010).
“Influence of dhaT Mutation of K.Pneumoniae on 1,3-Propanadiol Fermentation.”
World Journal Microbial Bioethanol, 27, 1491-1497.

[44] Nwachukwu, Raymond E S, Abolghasem Shahbazi, Ujun Wang, Mulumebet
Worku, Salam Ibrahim, Keith Schimmel (2013). “Optimization of Cultural
Conditions for Conversion of Glycerol to Ethanol by Enterobacter aerogenes
S012.” Original Article, 3 (1) 2013.

[45] Song, Qin., Yun Huang, Hui Yang, “Optimization of Fermentation
Conditions for Antibiotic Production by Actinomycetes YJI Strain against
Sclerotinia sclerotiorum,” Journal of Agricultural Science, 4 (7) 2012, hal .95102, 2012.

[46] Amelia, Sri. “Isolasi dan Identifikasi Berbagai Bakteri Patogen.” Skripsi,
Fakultas Kedokteran Departemen Mikrobiologi, USU, Medan, 2011.

58
Universitas Sumatera Utara

[47] Knob, A & Carmona, E.C. (2008). “Xylanase production by Penicillium
sclerotiorum and its characterization”. World Applied Sciences Journal, 4(2), 277283.

[48] Suriani Sanita, Spemarno, Suharjono, “Pengaruh Suhu dan pH terhadap
Laju Pertumbuhan Lima Isolat Bakteri Anggota Genus Pseudomonas yang
diisolasi dari Ekosistem Sungai Tercemar Deterjen di sekitar Kampus Universitas
Brawijaya,” J-PAL, 3(2) 2013 : hal. 58-62

[49] Xiao, Heather (2011). “Enterobacter aerogenes.” Diakses 29 Juni 2014 dari
Modern

Medicine

Bacteria

Index.

http://www.modmedmicrobes.wiki

spaces.com/Enterobacter+aerogenes.

[50] Barbirato, F., P Soucaille, A Bories (1996). “Physiologic Mechanisms
Involved In Accumulation of 3-Hydroxypropionaldehyde during Fermentation
Glycerol by Enterobacter agglomerans.” Applied and Enviromental Microbiology,
62 (12).

59
Universitas Sumatera Utara

BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
3.1 LOKASI PENELITIAN
Penelitian dilakukan di Laboratorium Bioproses Pusat Penelitian Kelapa
Sawit (PPKS) di Jalan Bridjen Katamso, Medan.

3.2

BAHAN

3.2.1 Bahan Baku
Bahan baku dalam percobaan ini adalah gliserol dari hasil samping proses
pembuatan biodiesel. Crude Gliserol diambil dari salah satu industri pengolahan
minyak kelapa sawit menjadi biodiesel yang ada di Dumai dan dibawa ke
laboratorium. Dan bakteri Enterobacter aerogenes yang diperoleh dari
laboratorium mikrobiologi Badan Pegawasan Obat dan Makanan (BPOM) Medan.

3.2.2 Bahan Purifikasi Gliserol
Bahan purifikasi yang digunakan dalam percobaan ini adalah H3PO4 5 %
yang diencerkan sebanyak 50 ml untuk setiap 150 ml gliserol, NaOH, dan
aquadest dan karbon aktif 2 % dari berat total gliserol.

3.2.3 Bahan Pembuatan Media Kultur Stok
Adapun bahan yang digunakan dalam pembuatan kultur stok adalah
Enterobacter aerogenes, ekstrak sapi, pepton, margarin, glukosa, unsur makro
yaitu : FeCl3.6 H2O, CaCl2.H2O, CuSO4.5H2O, MnSO4.4 H2O, ZnSO4.7H2O, dan
unsur mikro adalah : (NH4)2SO4, MgSO4.7 H2O, Na2SO3, KH2PO4 dan aquadest.

3.2.4 Bahan Media Perhitungan Jumlah Bakteri Yang Tumbuh
Adapun bahan yang digunakan dalam mengetahui jumlah bakteri yang
tumbuh

adalah kultur stok Enterobacter aerogenes yang telah dibiakkan,

aquadest steril, dan nutrien agar.

22
Universitas Sumatera Utara

3.2.5

Bahan Analisa

3.2.5.1 Bahan Analisa Kadar Air Gliserol
1. Gliserol
Fungsi : Sebagai bahan baku yang akan di analisa kadar airnya.
3.2.5.2 Bahan Analisa Densitas Gliserol
1. Gliserol
Fungsi : Sebagai bahan baku yang akan di analisa densitasnya.
2. Aquadest
Fungsi : Sebagai bahan kalibrasi piknometer.
3.2.5.3 Bahan Analisa Kadar Abu
1. Gliserol
Fungsi : Sebagai bahan baku yang akan diketahui kadar abunya.
3.2.5.4 Bahan Analisa Free Fatty Acid (FFA) Gliserol
1. Gliserol
Fungsi : Sebagai bahan baku yang akan diketahui kadar FFAnya.
2. Etanol 96 %
Fungsi : Sebagai bahan baku yang akan diketahui kadar FFAnya.
3. NaOH 0,1 N
Fungsi : Sebagai bahan pentiter.
4. Phenopthalein
Fungsi : Sebagai indicator
5. Aquadest
Fungsi : Sebagai pelarut universal
3.2.5.5 Analisa GC
Analisis GC dilakukan pada gliserol dan 1,3-Propanadiol. Analisis GC
juga dilakukan pada hasil fermentasi sebelum separasi dan setelah separasi dengan
menggunakan distilasi dan rotari evaporator. Analisis GC dilakukan dengan
menggunakan GC QP2010 Shimadzu dengan automatic sampling system yang
mampu menganalisis 50 scans perdetik. Kolom yang digunakan DB 5 HT dengan
bahan pengisi 100% dimethyl polysiloxane, yang mampu menganalisis senyawa
essential oils, hydrocarbons, semivolatiles dan pesticides. Analisis GC dilakukan
dengan menggunakan pelarut akuades dengan gas pembawa helium dengan

23
Universitas Sumatera Utara

kondisi pengaturan temperatur pada alat GC (Colom, Injection, Ion Source dan
Interface).
Tabel 3.1 Program Pengatur GC [21]
Parameter

3.3

Nilai

Satuan

Temp Oven Kolom

60

0

C

Temp Injeksi

370

0

C

Tekanan

100

kPa

Kec Aliran

125,1

ml/min

Kecepatan Kolom

2,42

ml/min

Temp Sumber Ion

370

0

C

Temp Permukaan

360

0

C

PERALATAN
1. Erlenmeyer
Fungsi : Sebagai tempat fermentasi berlangsung
2. Kromatografi Gas (GC)
Fungsi : Sebagai alat analisa kandungan dari suatu bahan
3. Beaker glass
Fungsi : Sebagai wadah larutan
4. Gelas ukur
Fungsi : Sebagai alat mengukur volume suatu larutan
5. Corong gelas
Fungsi : Sebagai alat letaknya kertas saring untuk memisahkan padatan
dari gliserol
6. Oven
Fungsi : Sebagai alat untuk memisahkan gliserol dan air
7. Autoclave
Fungsi : Sebagai alat untuk mensterilkan peralatan yang digunakan
dalam fermentasi
8. Counter Colony
Fungsi : Sebagai alat untuk mengetahu jumlah koloni yang tumbuh

24
Universitas Sumatera Utara

9. Distilasi
Fungsi : Sebagai alat untuk memisahkan hasil fermentasi

3.4

PROSEDUR PENILITIAN

3.4.1 Prosedur Purifikasi Gliserol
Gliserol disiapkan dalam suatu beaker glass, lalu dipanaskan pada suhu 60
0

C selama ` jam untuk menguapkan kandungan metanol yang masih terdapat pada

gliserol, setelah itu ditambahkan H3PO4 5 % sehingga terbentuk 2 lapisan, dimana
lapisan bawah adalah gliserol murni dan lapisan atas adalah senyawa yang
terdapat pada crude gliserol dan menghasilkan pH 2. Larutan gliserol yang sudah
diperoleh dari pemisahan ditambahkan larutan NaOH hingga pH gliserol netral
(pH 7). Kemudian dipanaskan supaya terbentuk garam Na3PO4 dan disaring untuk
memisahkan garam dengan gliserol. Larutan gliserol kemudian ditambahkan
dengan karbon aktif 2 % dari berat total gliserol untuk mengurangi warna pada
gliserol tersebut, dipanaskan pada suhu 80 ℃ dan dibiarkan selama 12 jam dan

disaring untuk memisahkan karbon aktif dengan gliserol.
1.

Crude Gliserol di masukkan ke wadah dan dipanaskan pada suhu 60 0C
untuk menguapkan alkohol yang masih terkandung..

2.

Ditambahkan dengan H3PO4 5 % sebanyak 50 ml untuk setiap 150 ml
Crude Gliserol sehingga menghasilkan pH 2 dan dibiarkan selama 30
menit.

3.

Setelah terbentuk 2 lapisan, dipisahkan, dimana lapisan bawah gliserol dan
lapisan atas senyawa yang lain selain gliserol.

4.

Gliserol yang didapat ditambahkan NaOH hingga pH netral (pH 7), lalu
dipanaskan dan disaring.

5.

Gliserol yang didapat ditambahkan karbon aktif 2 % dan dibiarkan selama
12 jam dan dipanaskan, lalu disaring.

[33], [7], [21]

3.4.2 Prosedur Analisa Gliserol (Metode SNI)
Gliserol sebanyak 0,5 g dilarutkan dalam 50 ml air akuades lalu ditambah
indikator biru bromtimol sebanyak 5 tetes. Larutan kemudian diasamkan dengan
25
Universitas Sumatera Utara

H2SO4 0,2 N sampai terbentuk warna kuning kehijauan. Larutan dinetralkan
dengan NaOH 0,05 N secara hati-hati sampai terbentuk warna biru. Setelah itu,
larutan tersebut ditambah NaIO4 sebanyak 50 ml lalu diaduk secara perlahan.
Larutan selanjutnya ditutup dan didiamkan dalam ruangan gelap pada suhu kamar
selama 30 menit. Larutan kemudian ditambah etilena glikol sebanyak 10 ml lalu
ditutup dan didiamkan dalam ruangan gelap pada suhu kamar selama 20 menit.
Larutan diencerkan dengan 300 ml air akuades kemudian ditambah 3 tetes
indikator biru bromtimol. Larutan hasil campuran tersebut ditirasi perlahan-lahan
dengan NaOH 0,5 N sampai terbentuk warna biru. Proses tersebut juga dilakukan
untuk perlakuan blangko. Kadar gliserol dihitung dengan rumus :
Kadar Gliserol (%) =

�T1 - T2 � × N × 9,209

W

(3.1)

dimana :
T1 = volume NaOH untuk titrasi contoh (ml)
T2 = volume NaOH untuk titrasi blangko (ml)
N = normalitas NaOH
W = bobot contoh (g)
Faktor gliserol = 9,209
[34]

3.4.3 Penentuan Kadar Free Fatty Acid (FFA) Gliserol
Penentuan kadar asama lemak bebas (FFA) berdasarkan langkah-langkah
berikut [35] :
1. Sampel sebanyak 20 gram dimasukkan kedalam erlenmeyer dan di
larutkan dengan 100 ml etanol 95 %.
2. Dikocok hingga rata, dan diambil 10 ml untuk dianalisa.
3. Campuran larutan ditambahkan 3 tetes indikator phenolphalein.
4. Campuran dititrasi dengan 0,1 N natrium hidroksida sambil diaduk hingga
berubah warna menjadi merah muda selama 30 s.
5. Persentase FFA dihitung dengan persamaan :

% FFA=

Normalitas NaOH x Volume NaOH terpakai x BM Gliserol
x % (3.2)
Massa Sampel x 10

26
Universitas Sumatera Utara

3.4.4 Penentuan Densitas Gliserol
Piknometer terlebih dahulu dikalibrasi dengan air pada suhu 30 ℃, dimana

piknometer diisi air hingga penuh, lalu dicatat berat air untuk menghitung volume
piknometer yang digunakan. Dimasukkan sampel ke dalam piknometer hingga
penuh kemudian dilakukan penimbangan piknometer yang telah berisi sampel
sampai menunjukkan angka yang konstan. Penentuan densitas dihitung
berdasarkan persamaan berikut:
Berat Air
Densitas Air
Berat Sampel
Volume Piknometer=
Volume Piknometer
Volume Piknometer=

(3.3)
(3.4)

3.4.5 Penentuan Kadar Air Gliserol
Sebanyak 10 gram sampel dimasukkan kedalam cawan penguap. Sampel
dalam cawan tersebut dipanaskan di dalam oven pada suhu 105 ℃ selama ± 3 jam

lalu didinginkan di dalam desikator yang berisi silica gel selama 30 menit dan
ditimbang beratnya sampai menunjukkan angka timbangan yang konstan. Kadar
air dari sampel dihitung dengan persamaan berikut:

%Kadar Air=

Berat sampel-Berat setelah di panaskan
x 100 %
Berat sampel

(3.5)

3.4.6 Penentuan Kadar Abu Gliserol (A.O.C.S. Official Method Ca 11-55)
Cawan penguap yang telah di panaskan di dalam oven pada suhu 105 ℃

selama 60 menit dan didinginkan dalam desikator selama 30 menit dan ditimbang
berat kosongnya. Sampel sebanyak 10 gram dimasukkan ke dalam cawan penguap
lalu di panaskan ke dalam furnace pada suhu 550-650 ℃ selama 3 jam, lalu

didinginkan dan dimasukkan ke dalam desikator selama 30 menit. Ditimbang
beratnya sampai menunjukkan angka timbangan yang kostan. Kadar abu dari
sampel dapat dihitung dengan persamaan berikut [36]:
Kadar Abu =

(berat cawan + berat sampel ) − berat cawan
berat sampel

(3.6)

27
Universitas Sumatera Utara

3.4.7 Pembuatan Media Pertumbuhan
Pembuatan media pertumbuhan bakteri dilakukan dengan cara sebagai
berikut. Unsur Mikro : 20 gr FeCl3.6 H2O, 10 gr CaCl2 H2O, 0,03 gr CuSO4.5
H2O, 0,05 gr MnSO4.4 H2O, 0,1 ZnSO4.7H2O dilarutkan di dalam 1 liter aquadest.
Kedalam larutan, unsur mikro ditambahkan seperti (NH4)2SO4 0,5 gr,
MgSO4.7H2O 0,4 gr, Na2SO4 9,65 gr, KH2PO4 2,65 gr. Ditambahkan nutrisi
tambahan seperti ekstrak sapi 3 gr, pepton 3 gr, margarin 10 gr, 10 gr glukosa.
Larutan pertumbuhan media kemudian diukur pHnya. pH larutan harus antara 6,47,4, jika larutan dalam keadaan asam maka diberikan larutan NaOH tetes demi
tetes hingga mencapai pH yg telah ditentukan. Jika larutan dalam keadaan basa
maka ditambahkan HCl tetes demi tetes hingga mencapai pH yang sesuai. Larutan
kemudian dipanaskan sampai mendidih dan dibiarkan dingin, kemudian larutan
yang terdapat di dalam erlenmeyer ditutup menggunakan kapas dan dibungkus
dengan kertas serta diikat menggunakan karet, kemudian disterilkan dengan
menggunakan autoklaf pada suhu 121

selama 20 menit [20].

3.4.8 Pembuatan Kultur Stok
Tempat pembuatan kultur stok terlebih dahulu disterilisasi dengan sinar UV
selama 30 menit. Kultur stok dibuat dengan mengambil kultur Enterobacter
aerogenes kemudian dimasukkan dalam media pertumbuhan, kemudian
diinkubasi dalam inkubator statis selama 3 hari pada temperatur 37 0C. Kultur
kemudian dapat digunakan dalam fermentasi [21].

3.4.9 Perhitungan Jumlah Bakteri
Untuk mengetahui jumlah bakteri yang tumbuh dapat dilakukan dengan cara
yaitu sebanyak 10 gr nutrien agar dilarutkan ke dalam 500 ml aquadest. Kemudian
dipanaskan hingga mendidih. Larutan nutrien agar yang terdapat didalam
erlenmeyer ditutup dengan kapas dan dibungkus dengan kertas serta diikat dengan
karet. Larutan yang sudah ditutup disterilkan di dalam autoklav pada suhu 121 0C
selama 20 menit. Kemudian larutan didinginkan hingga suhu 35 0C.
Untuk mengetahui jumlah bakteri yang tumbuh, dilakukan teknik
pengenceran 108 dengan cara yaitu 8 buah tabung reaksi diisi masing-masing

28
Universitas Sumatera Utara

sebanyak 9 ml aquadest steril lalu ditutup dengan kapas dan tabung reaksi sudah
ditandai dengan angka 1-8. Sebanyak 1 ml kultur stok yang sudah dibiakkan
selama 2 hari dimasukkan kedalam tabung reaksi no 1, dan dilakukan
pengadukkan vorteks, lalu 1 ml diambil dari tabung reaksi no 1 dan dimasukkan
kedalam tabung reaksi no 2 dan seterusnya hingga tabung no 8 berisi 1 ml dari
tabung no 7.
Perhitunggan jumlah bakteri dikakukan pada pengenceran ke 6,7, dan 8
dengan cara yaitu sebanyak 1 ml dari setiap pengenceran dimasukkan ke dalam
cawan petri secara dupplo lalu setiap cawan diisi dengan nutrien agar yang sudah
dingin sebanyak ½ dari tinggi cawan petri. Cawan petri yang sudah berisi
dibiarkan selama 2 hari. Setelah 2 hari, setiap cawan petri dilihat jumlah bakteri
yang ada dengan coloni counter sehingga diperoleh jumlah bakteri yang tumbuh
pada media pertumbuhan [17].

3.4.10 Prosedur Fermentasi
1. Diambil gliserol sesuai variabel yang sudah ada dan dimasukkan ke
fermentor
2. Kemudian ditambahkan bakteri Enterobacter aerogenes yang telah
diremajakan.
3. Gliserol yang sudah bercampur bakteri Enterobacter aerogenes
difermentasi selama selang waktu pada suhu 37 ℃ [21].
3.4.11 Analisa 1,3-Propanadiol dengan Kromatografi GC
Hasil fermentasi berupa 1,3 Propanadiol dianalisa dengan menggunakan
Kromatografi Gas sehingga didapat kemurnian 1,3-Propanadiol yang terbentuk.

29
Universitas Sumatera Utara

3.5 FLOWCHART PENELITIAN
3.5.1 Purifikasi Gliserol
Mulai
Crude Gliserol dimasukkan kedalam wadah dan
dipanaskan pada suhu 60 0C selama 1 jam

Ditambahkan H3PO4
Didiamkan selama 30 menit
Terbentuk 2 lapisan, lapisan bawah gliserol dan lapisan atas senyawa selain gliserol
Dipisahkan dengan corong pisah
Gliserol ditambahkan larutan NaOH hingga mencapai pH netral
Dipanaskan
Tidak
Apakah terbentuk
garam?
Ya
Disaring

Garam

Diukur volume gliserol
Larutan yang didapat ditambahkan dengan karbon aktif 2 % dari
massa total gliserol
Dipanaskan pada suhu 60 0C dan dibiarkan selama 12 jam
Disaring

Karbon aktif

A
30
Universitas Sumatera Utara

A
Air pada gliserol diuapkan

Air

Gliserol dianalisa
Selesai
Gambar 3.1 Flowchart Purifikasi Gliserol

3.5.2 Penentuan Kadar Gliserol
Mulai
Sampel 0,5 gram di tambahkan 50 ml aquadest
Ditambahkan 5 tetes indikator biru bromtimol
Ditambahkan H2SO4 0,2 N hingga berwarna kuning kehijauan
Dinetralkan dengan NaOH 0,05 N hingga berwarna biru
Ditambahkan NaIO4 sebanyak 50 ml dan diaduk
Ditutup dan didiamkan di tempat gelap pada suhu kamar 30 menit
Ditambahkan etilena glikol sebanyak 10 ml dan
Ditutup dan didiamkan di tempat gelap pada suhu kamar 20 menit
Ditambahkan 300 ml aquadest
Ditambahkan 3 tetes indikator biru bromtimol

A
31
Universitas Sumatera Utara

A

Dititrassi dengan NaOH 0,5 N

Tidak

Apakah warna
larutan biru?
Ya
Ya
Hitung kadar gliserol
Selesai
Gambar 3.2 Flowchart Penentuan Kadar Gliserol

3.5.3 Penentuan Kadar Free Fatty Acid (FFA)
Mulai

Gliserol sebanyak 20 gram dimasukkan ke dalam erlenmeyer

Ditambahkan 100 mL etanol 95 %
Dikocok hingga rata
Diambil 10 ml
Ditambahkan 3 tetes phenolpthalein

A

32
Universitas Sumatera Utara

A

Dititrasi dengan 0,1 N NaOH

Apakah warna
larutan merah muda
?

Ya
Presentase FFA dihitung

Selesai
Gambar 3.3 Flowchart Penentuan Kadar FFA

3.5.4 Penentuan Densitas Gliserol
Mulai

Piknometer kosong terlebih dahulu ditimbang
Piknometer dikalibrasi dengan air

Piknometer diisi dengan air hingga penuh,
lalu ditimbang
Dihitung Volume piknometer

Piknometer diisi dengan sampel hingga
penuh
A
33
Universitas Sumatera Utara

A

Ditimbang dan dicatat berat sampelnya
Densitas gliserol dihitung
Selesai
Gambar 3.4 Flowchart Penentuan Densitas Gliserol

3.5.5 Penentuan Kadar Air Gliserol
Mulai
Cawan penguap dipanaskan selama 30 menit
Dimasukkan kedalam desikator selama 30 menit
Cawan penguap ditimbang
Diisi dengan 10 gram gliserol
Dipanaskan pada suhu 105 0C selama 2 jam
Dimasukkan ke dalam desikator dan ditunggu selama 30 menit
Ditimbang
Dicatat berat gliserol gliserol + abu
Dihitung kadar air

Selesai
Gambar 3.5 Flowchart Penentuan Kadar Air Gliserol

34
Universitas Sumatera Utara

3.5.6 Penentuan Kadar Abu Gliserol

Mulai

Cawan porselin dipanaskan selama 30 menitdi dalam oven
Didinginkan selama 30 menit di dalam desikator
Cawan porselin ditimbang
Cawan porselin diisi dengan 10 gram gliserol
Dipanaskan di dalam furnace pada suhu 550-600 0C selama 3 jam
Didinginkan selama 30 menit dalam desikator
Ditimbang berat cawan + abu
Dihitung kadar abu
Selesai
Gambar 3.6 Flowchart Penentuan Kadar Abu Gliserol

35
Universitas Sumatera Utara

3.5.7 Pembuatan Media Pertumbuhan
Mulai

Sebanyak 1 liter aquadest dimasukkan ke dalam erlenmeyer

Dimasukkan unsur makro (20 gr FeCl3.6
H2O, 10 gr CaCl2 H2O, 0,03 gr CuSO4.5
H2O, 0,05 gr MnSO4.4 H2O, 0,1
ZnSO4.7H2O)

Ditambahkan ekstrak sapi 3 gr, pepton 3 gr,
margarine 10 gr, 10 gr glukosa, (NH4)2SO4
0,5 gr, MgSO4.7H2O 0,4, Na2SO3 9,65 gr,
KH2PO4 2,65 gr

Dipanaskan hingga mendidih dan
didinginkan sampai suhu kamar
Dimasukkan ke dalam autoklaf pada suhu
121 selama 20 menit
Disimpan dalam kulkas
Selesai
Gambar 3.7 Flowchart Pembuatan Media Pertumbuhan

36
Universitas Sumatera Utara

3.5.8 Prosedur Pembuatan Kultur Stok
Mulai
Tempat pembuatan kultur stok disterilisasi
dengan sinar UV selama 30 menit
Kedalam media pertumbuhan dimasukkan
kultur bakteri Enterobacter aerogenes

Diinkubasi selama 2 hari pada suhu 37
Disimpan dalam cool chamber
Selesai
Gambar 3.8 Flowchart Pembuatan Kultur Stok
3.5.9 Perhitungan Jumlah Bakteri
Mulai

Nutrien agar sebanyak 10 gr
larutkan dengan aquadest 500 ml

Sediakan 8 buah tabung reaksi yang
berisi dengan 9 ml aquadest steril
Dimasukkan 1 ml kultur stok
yang sudah dibiakkan selama 2
hari kedalam tabung reaksi no 1

Campuran dipanaskan hingga
mendidih dan didinginkan
hingga suhu 35 0C

Diambil 1 ml campuran dari tabung
reaksi no 1 dan dimasukkan ke
tabung reaksi no 2, dilakukan
seterusnya hingga tabung reaksi no 8
yang berisi 1 ml campuran dari
tabung reaski no 7.

B

A

37
Universitas Sumatera Utara

B

A

Diambil 0,1 ml campuran dari
tabung reaksi no 6,7,8 dan
dimasukkan ke masing-masing
cawan petri secara dupplo
Dibiarkan selama 2 hari
Dilihat dibawah coloni counter
Dihitung jumlah koloninya
Selesai
Gambar 3.9 Flowchart Perhitungan Jumlah Bakteri
3.5.10 Fermentasi Gliserol
Mulai

Diambil gliserol sesuai variabel yang sudah ada dan
dimasukkan ke fermentor
Bakteri dengan jumlah tertentu dimasukkan ke dalam
fermentor dan ditutup rapat

Gliserol yang sudah bercampur bakteri difermentasi
selama selang waktu tertentu pada suhu 37 0C.

Apakah masih
ada variasi lain?

Ya

Tidak
Selesai
Gambar 3.10 Flowchart Fermentasi Gliserol
38
Universitas Sumatera Utara

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1

PEMURNIAN GLISEROL
Pada pembuatan 1,3-Propanadiol digunakan crude gliserol yang merupakan

limbah pabrik biodiesel yang berasal dari Dumai, yang terlebih dahulu dianalisa
kandungan yang terdapat didalamnya, yaitu densitas 1,24 gr/ml ; kadar FFA 26,22
% ; kadar air 2,64 % ; kadar abu 11% ; dan kadar gliserol sebesar 29,306%.
Pembuatan 1,3-Propanadiol dalam penelitian ini dimulai dengan tahap pemurnian
crude gliserol menggunakan asam phospat (H3PO4). Untuk mendapatkan kadar
gliserol yang tinggi, pemurnian ini dilakukan dengan 4 tahap yaitu asidifikasi
(pengasaman), penetralan, bleaching, dan penguapan air.
Pada tahap pengasaman, dilakukan penambahan asam phospat ke dalam
crude gliserol sehingga menghasilkan pH 2. Dimana pada tahap pengasaman ini
terbentuk 2 lapisan, yaitu lapisan atas yang merupakan lapisan asam lemak dan
lapisan bawah berupa gliserol, seperti yang terlihat pada Gambar 4.1.

Asam Lemak
Bebas
Gliserol

Gambar 4.1 Proses Pengasaman Crude Gliserol dengan Asam Phospat
Lapisan asam lemak yang terbentuk pada bagian atas merupakan hasil reaksi
penguraian sabun yang terkandung dalam crude gliserol dengan adanya
penambahan asam phospat. Rekasi penguraian sabun dengan bantuan asam
phospat menjadi asam lemak dapat dilihat sebagai berikut :

39
Universitas Sumatera Utara

3RCOOK +

H3PO4

(sabun)

3RCOOH + K3PO4 + H3PO4 sisa

(asam phospat)

(asam lemak)

Selain terjadinya reaksi penguraian sabun menjadi asam lemak, terjadi
pemisahan katalis bersifat basa yang terkandung dalam crude gliserol. Katalis
basa KOH akan bereaksi dengan asam phospat membentuk garam-garam berupa
kalium phospat yang sifatnya terlarut, dimana rekasinya dapat dilihat sebagai
berikut :
3KOH

+

H3PO4

K3PO4 + 3H2O +

H3PO4
(katalis basa)

(asam phospat)

(kalium phospat)

Kelebihan asam phospat pada proses asidifikasi kemudian dinetralisasi
dengan menggunakan basa, karena pada proses asidifikasi digunakan asam kuat
maka pada proses netralisasi digunakan juga basa kuat, dimana reaksinya dapat
dilihat sebagai berikut :
K3PO4 + H3PO4 sisa + 3NaOH

K3PO4 + Na3PO4 + 3H2O

Dari reaksi diatas diperoleh endapan garam yaitu berupa natrium phospat
dan kalium phospat yang sifatnya larut dalam gliserol yang telah netral. Oleh
karena itu dilakukan pemanasan untuk mempercepat pembentukan garam
sehingga dpat dipisahkan dari gliserol. Garam yang terbentuk dapat dilihat pada
Gambar 4.2 berikut ini.

Endapan
Garam

Gambar 4.2 Garam Yang Terbentuk setelah Pemanasan
Gliserol yang murni memiliki warna bening seperti air [37]. Gliserol yang
diperoleh dari tahap penetralan masih memiliki warna merah kecoklatan yang
belum sesuai dengan standar gliserol yang ada. Oleh karena itu dilakukan proses
40
Universitas Sumatera Utara

bleaching menggunakan karbon aktif. Hasil penambahan karbon aktif pada
gliserol dalam penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 4.3 berikut.

Gambar 4.3 Gliserol Hasil Pemurnian
Dari gambar diatas dapat disimpulkan bahwa hasil pemurnian yang
dilakukan peneliti telah sesuai dengan standar gliserol murni. Tetapi gliserol
tersebut masih mengandung air, sehingga untuk meningkatkan kemurniannya
dilakukan pemisahan uap air dengan cara memanaskan gliserol pada oven dengan
suhu 110 ℃ selama 5 jam.

Gliserol akhir yang diperoleh dianalisa warnanya, densitas, kadar Free Fatty

Acid, kadar air, kadar abu, serta kadar gliserol.

4.2

ANALISA GLISEROL
Crude gliserol yang diperoleh dari hasil samping pembuatan biodiesel

dianalisa terlebih dahulu sifat fisikanya. Selain itu, gliserol hasil pretreatment juga
dilakukan analisa. Hasil analisa dapat dilihat pada Tabel 4.1 di bawah ini.

Tabel 4.1 Sifat Fisika Crude Gliserol dan Gliserol Hasil Pemurnian
Satuan

Coklat Kemerahan

Gliserol Hasil
Pemurnian
Bening

Densitas

1,24

1,2777

gr/ml

3

FFA

26,22

7,83

%

4

Kadar Air

2,64

1,298

%

5

Kadar Abu

11

6

%

6

Kadar Gliserol

29,306

83,2572

%

No

Sifat Fisika

Crude gliserol

1

Warna

2

41
Universitas Sumatera Utara

Dari sifat fisika diatas diperoleh densitas gliserol murni sebesar 1,2777
gr/ml, dimana pada teori bahwa densitas gliserol umumnya sebesar 1,2613 gr/ml
[38]. Oleh karena itu, bahwa densitas gliserol hasil pemurnian yang didapatkan
oleh peneliti tidak jauh berbeda dengan densitas gliserol sebenarnya.
Dalam crude gliserol terdapat kadar gliserol sebesar 29,306 % dan setelah
dilakukan proses pemurnian didapat kadar gliserol sebesar 83,2572. Farobie
(2009) juga melakukan pemurnian crude gliserol hasil samping biodiesel dengan
menggunakan asam phospat (H3PO4), dimana kadar crude gliserol yang akan
dimurnikan sebesar 40,19 % dan menghasilkan kadar gliserol murni sebesar 82,15
% [33]. Rahmi (2006) melakukan pemurnian crude gliserol dengan penambahan
asam phospat (H3PO4) pada crude gliserol dan mendapatkan kadar gliserol murni
dengan kadar 89,2246 % [39].

4.3

FERMENTASI GLISEROL
Dalam menghasilkan 1,3-Propanadiol maka dilakukan fermentasi gliserol

dengan bantuan bakteri Enterobacter aerogenes. Pada tahap fermentasi gliserol
ini terlebih dahulu dibiakkan bakteri yang merupakan alat sebagai pemecah ikatan
karbon yang ada pada gliserol menjadi 1,3-Propanadiol. Bakteri Enterobacter
aerogenes dibiakan dengan menggunakan unsur makro dan mikro sebagai sumber
energi sehingga mengalami pembiakan. Terjadinya pembiakan bakteri dapat
diindikasi secara visual dengan perubahan warna pada media yaitu dari hitam
kecoklatan menjadi merah kecoklatan seperti Gambar 4.4 berikut.

(a)

(b)

Gambar 4.4 (a) Kultur Stok Sebelum Pembiakan (b) Setelah Pembiakan
Enterobacter aerogenes siap diaplikasikan ke dalam fermentor, yang mana
dilakukan perhitungan jumlah bakteri terlebih dahulu menggunakan counter
42
Universitas Sumatera Utara

coloni dengan teknik pengenceran 108 untuk mengetahui koloni yang tumbuh
dalam media, seperti pada Gambar 4.5 berikut.

Gambar 4.5 Perhitungan Jumlah Enterobacter aerogenes
dengan counter coloni
Jumlah koloni bakteri Enterobacter aerogenes yang diperoleh adalah sekitar
123 x 108 / ml.
Fermentasi gliserol menjadi 1,3-Propandiol dilakukan dengan melakukan
variasi suhu (25 dan 37 0C), waktu fermentasi (1,2, dan 3 hari) dan volume bakteri
(5,7,dan 10 %). Hal ini bertujuan untuk mengetahui pada kondisi mana yang
paling baik untuk menghasilkan 1,3-Propanadiol dengan kadar yang tinggi.

4.3.1 Konversi Gliserol
Sebelum mengetahui variasi mana yang paling baik untuk menghasilkan
1,3-Propandiol, terlebih dahulu dilakukan pengujian apakah fermentasi gliserol
dengan bakteri Enterobacter aerogenes berlangsung atau tidak dengan cara
melihat berkurangnya kadar gliserol terhadap variasi waktu dan volume bakteri
pada saat fermentasi, seperti pada gambar 4.6.

43
Universitas Sumatera Utara

Kadar Gliserol (%)

Volume Bakteri
100

5%

7%

10%

80
60
40
20
0
0

1

2
3
Waktu Fermentasi (hari)
Gambar 4.6 Kadar Gliserol Terhadap Variasi Waktu dan Volume Bakteri
Pada Fermentasi Suhu 25 Maupun 37 0C

Dari gambar 4.6 di atas menunjukkan bahwa gliserol telah terkonversi atau
proses fermentasi berlangsung sempurna. Pada penelitian fermentasi gliserol yang
dilakukan oleh Ito,dkk (2005) dengan menggunakan bakteri Enterobacter
aeogenes didapatkan gliserol habis terkonversi saat waktu fermentasi 12 jam [40].
Fermentasi gliserol tidak hanya terkonversi menjadi 1,3-Propanadiol saja,
tetapi terbentuk juga senyawa lain seperti etanol, asam asetat, dan sebagainya.
Perhitungan

kadar

1,3-Propanadiol

yang

terbentuk

dilakukan

dengan

menggunakan Analisa GC (Gas Chromatography).
Pada penelitian ini dilakukan Analisa Kromatografi Gas untuk hasil
fermentasi gliserol dan larutan standar 1,3-propanadiol dengan kemurnian 98%,
menggunakan alat dan kondisi yang sama. Dari Analisa Kromatografi Gas
terhadap larutan standar 1,3-propanadiol kemurnian 98% ini akan didapatkan
retention time untuk mengetahui dimana senyawa tersebut berada, sehingga dapat
dijadikan tolak ukur untuk hasil penelitian yang telah didapatkan. Hasil Analisa
Kromatografi Gas untuk larutan standar 1,3-Propanadiol dapat dilihat pada
Gambar 4.7 berikut.

44
Universitas Sumatera Utara

Gambar 4.7 Hasil Analisa GC untuk 1,3-Propanadiol Standar

Pada gambar 4.7 diatas menunjukkan bahwa 1,3-Propanadiol berada pada
rentang waktu 2,885; 4,846; 32,028; dan 32,308 menit. Dengan rentang waktu
tersebut, maka dapat dijadikan tolak ukur untuk menetapkan keberadaan 1,3Propanadiol dari hasil fermentasi gliserol yang didapatkan.

4.3.2 Pengaruh Waktu Fermentasi Terhadap Konsentrasi 1,3-Propanadiol
Terbentuk
Hubungan waktu fermentasi terhadap konsentrasi 1,3-Propanadiol disajikan
pada gambar 4.8 berikut ini. Fermentasi dilakukan pada kondisi suhu fermentasi
37 °C dan volume bakteri 10 % dari volume gliserol yang difermentasi.

45
Universitas Sumatera Utara

Asam Laktat

7

3-Hidroksi
Propinaldehid
Asam Butirat

Konsentrasi (mol/ml)

6
5

2,3-Butanadiol

4

1,3-Propanadiol

3
2
1
0
0

1

2

3

Waktu Fermentasi (Hari)
Gambar 4.8 Hubungan Waktu Fermentasi terhadap Konsentrasi
1,3-Propanadiol

Dari grafik diatas dapat dilihat pada waktu fermentasi 1 hari didapatkan
konsentrasi 1,3-Propanadiol sebesar 6,196 mol/ml. Kemudian menurun pada
waktu fermentasi 2 hari dengan konsentrasi 1,3-Propanadiol yang terbentuk
sebesar 4,357 mol/ml. Lalu pada waktu fermentasi 3 hari konsentrasi 1,3Propanadiol semakin menurun menjadi 3,813 mol/ml. Gliserol tidak ditemukan
lagi pada waktu fermentasi 1 hari, 2 hari, dan 3 hari karena telah terkonversi
sempurna.
Faktor yang perlu diperhatikan dalam proses fermentasi adalah waktu
fermentasi, dimana waktu fermentasi tergantung pada beberapa hal yaitu jumlah
mikroorganisme yang digunakan, kondisi dan komposisi media, dan sebagainya
[41]. Semakin bertambahnya waktu fermentasi, maka bakteri terus bertumbuh dan
berkembang biak sehingga produksi enzim dari bakteri serta produk yang
dihasilkan terus meningkat [42].
Pada analisa Kromatografi Gas, keberadaan senyawa 1,3-Propanadiol dari
hasil fermentasi gliserol didapatkan pada saat retention time 4,906. Fermentasi
gliserol tidak hanya menghasilkan senyawa 1,3-Propanadiol saja, tetapi juga
menghasilkan senyawa-senyawa lain yaitu asam laktat, 3-hidroksipropionaldehid,
asam butirat, dan 2,3-butanadiol. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa
kosentrasi 1,3-Propanadiol yang tinggi terbentuk pada fermentasi gliserol dengan

46
Universitas Sumatera Utara

waktu fermentasi 1 hari. Hal ini dapat disimpulkan bahwa konsentrasi 1,3Propanadiol yang didapatkan berbanding terbalik dengan semakin bertambahnya
waktu fermentasi. Senyawa 1,3-Propanadiol yang telah terbentuk dapat
terkonversi kembali menjadi senyawa lain, seperti etanol, 1,2-Propanadiol, asam
suksinat, dan sebagainya [43]. Penurunan konsentrasi 1,3-Propanadiol dari waktu
fermentasi 1 hari ke 2 hari hingga 3 hari dapat disebabkan senyawa 1,3Propanadiol yang terbentuk dikonversi kembali oleh Enterobacter Aerogenes
menjadi senyawa asam laktat, 3-hidroksipropionaldehid, asam butirat, dan 2,3butanadiol.
Nwachukwu, dkk (2013) dalam penelitiannya memperoleh 1,3-Propanadiol
deng konsentrasi tinggi pada saat waktu fermentasi 96 jam atau 4 hari dengan
menggunakan jenis bakteri yang berbeda, yaitu bakteri mutagenik Enterobacter
aerogenes SO12 [44]. Siregar (2008) dalam penelitiannya menggunakan bakteri
Enterobacter aerogenes memperoleh 1,3-Propanadiol dengan konsentrasi tinggi
dengan waktu fermentasi 20 jam [20].

4.3.3 Pengaruh Rasio Inokulum : Substrat Terhadap Konsentrasi 1,3Propanadiol Terbentuk
Hubungan rasio inokulum : substrat terhadap konsentrasi 1,3-Propanadiol
yang terbentuk disajikan pada gambar 4.9 berikut ini. Fermentasi dilakukan pada

Konsentrasi (mol/ml)

kondisi suhu fermentasi 37 °C dan waktu fermentasi 3 hari.
5

Asam Laktat

4

3-Hidroksi
Propinaldehid
Asam Butirat

3

2,3-Butanadiol
1,3-Propanadiol

2
1
0
0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

Rasio Inokulum : Substrat
Gambar 4.9 Hubungan Rasio Inokulum : Substrat Terhadap Konsentrasi
1,3-Propanadiol
47
Universitas Sumatera Utara

Dari grafik diatas dapat dilihat pada saat rasio inokulum : substrat sebesar
0,05, konsentrasi 1,3-Propanadiol yang terbentuk adalah 4,003 mol/ml. Pada saat
rasio inokulum : substrat sebesar 0,07, konsentrasi 1,3-Propanadiol meningkat
menjadi 4,251 mol/ml. Kemudian pada rasio inokulum : substrat sebesar 0,1,
konsentrasi 1,3-Propanadiol mengalami penurunan menjadi 3,813 mol/ml.
Jumlah inokulum yang sedikit dapat mengurangi pembentukan produk yang
diinginkan, sedangkan jumlah inokulum yang terlalu tinggi juga dapat mengarah
ke pembentukan produk yang rendah [45]. Hasil penelitian ini menunjukkan
konsentrasi 1,3-Propanadiol yang terbentuk mengalami fluktuasi seiring
meningkatnya rasio inokulum : substrat. Konsentrasi 1,3-Propanadiol yang cukup
tinggi terbentuk pada rasio inokulum : substrat sebesar 0,07. Senyawa 1,3Propanadiol yang telah terbentuk dapat terkonversi kembali menjadi senyawa lain,
seperti etanol, 1,2-Propanadiol, asam suksinat, dan sebagainya [43]. Penurunan
konsentrasi 1,3-Propanadiol dari rasio inokulum : substrat sebesar 0,07 hingga 0,1
dapat disebabkan senyawa 1,3-Propanadiol yang terbentuk dikonversi kembali
oleh

Enterobacter

Aerogenes

menjadi

senyawa

asam

laktat,

3-

hidroksipropionaldehid, asam butirat, dan 2,3-butanadiol.

4.3.4 Pengaruh Suhu Fermentasi Terhadap Konsentrasi 1,3-Propanadiol
Terbentuk
Hubungan suhu fermentasi

terhadap konsentrasi 1,3-Propanadiol yang

terbentuk disajikan gambar 4.10 ber