Biosin t e sis Kh it in pa da Ja m u r

 2002 digit ized by USU digit al library 2 paralel, sedangkan γ - k hit in fibrilny a m asing- m asing t ersusun dari t iga rant ai, dua rant ainy a t ersusun paralel dan rant ai k et iga ant iparalel Cabib, 1987 . Gam bar 1. Unit k hit in Cabib, 1987 . Khit in berbent uk padat , am orf, t idak berw arna, t idak larut dalam air, asam encer, alk ohol dan sem ua pelarut organik lainny a, t et api k hit in dapat larut dalam fluoroalk ohol dan asam m ineral pek at Richards, 1951 . Koloidal k hit in adalah k hit in y ang bany ak digunak an sebagai subst rat dalam m edium ferm ent asi. Seny aw a ini diperoleh dengan m enghidrolisis secara parsial khit in dengan larut an asam klorida HCl 10 N I nbar Chet , 1991 ; Chernin et al., 1995 ; Haran et al., 1995 . Khit in m erupakan polisakarida kedua t erbanyak di alam set elah selulosa dan di alam set iap t ahunnya dihasilkan sekit ar 108 t on khit in Muzzarelli, 1985 . Khit in dapat dit em uk an pada eksoskelet on serangga, m olusca, Coelent erat a, Nem at oda, Crust aceae dan dinding sel j am ur dan alga t ert ent u. Khit in pada j am ur berbent uk fibril yang m em iliki panj ang yang berbeda t ergant ung pada spesies dan lok asi selny a. Pada Saccharom yces cereviceae, m ikrofibril khit innya m em iliki panj ang 60 nm dan t erdapat khusus pada sekat prim er Cabib, 1987 . Pada serangga lebih dari 80 k om ponen k ut ik ulany a adalah k hit in Berk eley , 1979 . Pada Crust aceae, k hit in m elek at pada suat u m at riks dari CaCO 3 dan fosfat . Pada serangga m at riksny a adalah prot einaceous yait u suat u prot ein yang sudah m engalam i pent aninnan Cabib, 1987 .Khit in pada alga t erut am a dit em uk an pada diat om ae laut y ait u Thallassiosira fluv iat ilis dan Cyclot ella crypt ica dengan k andungan 10 – 15 berat k ering. Pada bak t eri, ak t inom iset es dan j am ur k las Oom y cet es t idak dit em uk an khit in. Tet api khit in m erupakan kom ponen ut am a penyusun dinding sel j am ur klas Basidiom ycet es, Phycom ycet es, Ascom ycet es dan Lichens. Meskipun sum ber khit in berm acam - m acam , nam un secara kom ersial khit in dieksplorasi dari cangkang udang- udangan dan Crst acea. Sebanyak 50 – 60 dari lim bah udang, dihasilkan 25 Khit in dari 32 berat k ering lim bah t ersebut . Kht in m erupakan bahan dasar uunt uk bahan- bahan kim ia yang diperlukan secara luas di berbagai bidang sepert i biokim ia, obat - obat an, pangan, gizi, enzim ologi, indust ri kert as, t ekst il dan film . Khit in j uga sebagai sum ber N- aset ilgluk osam in y ang dipak ai sebagai pengaw et dan ant ibiot ik. Khit osan sebagai derivat khit in dipakai dalam pengolahan lim bah dan pengikat an logam Muzarelli, 1985 .

C. Biosin t e sis Kh it in pa da Ja m u r

Biosint esis khit in pada j am ur t erj adi karena pert um buhan hifa yang m eliput i pem anj angan dinding prim er dan k em udian dilanj ut k an dengan biosint esis  2002 digit ized by USU digit al library 3 k om ponen dinding sel. Langk ah- langk ah biosint esis k hit in diaw ali dengan perubahan glukosa- 6- fosfat m enj adi uridin difosfat N- aset ilglukosam in UDP- GlcNAc sebagai prekursor k hit in Gam bar 2 . Enzim y ang berperan dalam m engubah UDP- GlcNAc m enj adi m olekul khit in adalah khit in sint et ase yang t erdapat dalam vesikel sit oplasm ik sit osom Carlile dan Wat kinson, 1994 . Pada j am ur sebagaim ana organism e euk ariot ik lain, v esik el sit oplasm ik ny a berperan dalam pem bent uk an dinding sel. Vesik el ini m em baw a m at erial perm uk aan berupa prekursor, produk at au enzim y ang dibut uhk an unt uk pem bent uk an dinding. Ada dua v esik el y ang berperan pada pem bent uk an dinding sel j am ur y ait u 1 . Makrovesikel disebut j uga vesikel dinding at au vesikel sekret ori. Vesikel ini berperan dalam sint esis polim er polisakarida nonfibrilar. 2 . Mikrovesikel at au disebut j uga sit osom , berperan dalam sint esis polisakarida m ikrofibrl khit in . Khit in dibuat in- sit u y ait u pebent uk anny a t erj adi di luar sit oplasm a oleh enzim y ang dibaw a oleh sit osom . Khit in sint et ase y ang ada dalam sit osom adalah enzim y ang t idak ak t iv zim ogen dan prot ease y ang ada di perm uk aan sel periplasm a akan m engakt ivkan zim ogen ini dan dim ulai lagi pem bent ukan m ikrofibril khit in Bart nick i- Garcia, 1989 . Khit in pada j am ur berbent uk m ikrofibril yang m em iliki panj ang yang berbeda t ergant ung pada spesies dan lokasi selnya. Mikrofibril m erupakan st rukt ur ut am a dari st rukt ur dinding sel j am ur dan t erdiri at as j alinan rant ai- rant ai polisakarida y ang saling bersilangan m em bent uk any am an. Jalinan ini k uat berik at an pada m at riks. Kandungan k hit in pada j am ur bervariasi dari 4 – 9 berat k ering sel, t ergant ung spesies at au st rain j am urny a Raj arat hnam et al., 1998 . Khit in adalah kom ponen ut am a penyusun dinding sel j am ur kelas Ascom ycet es, Basidiom ycet es, dan Deut erom ycet es. Pada dinding sel j am ur Fusarium dari k elas Deut erom ycet es dij um pai sebany ak 39 k hit in dari berat k ering sel Griffin, 1981 . Khit in pada dinding sel j am ur Fusarium suk ar didegradasi k arena dinding selny a dilapisi oleh prot ein dan lipid, y ang m enghalangi ak t iv it as enzim hidrolit ik Sivan Chet , 1989 .  2002 digit ized by USU digit al library 4 Gam bar 2. Jalur sint esis khit in dan t eori siklus N- aset ilglukosam in - - 1 Enzim fosfo- gluko- isom erase; 2 glut am ine- frukt ose- 6- fosfat - am ino- t ransferase; 3 gluk osam ine- fosfat e- aset il- t ransferase; 4 aset il- glucosam ine fosfom ut ase; 5 UDP- aset il- gluk osam ine pirofosforilase 6 khit in sint et ase ; 7 khit inase; 8 N- aset il- glukosam ine kinase Carlile Wat kinson, 1994 .  2002 digit ized by USU digit al library 5 I I . EN ZI M KH I TI N ASE Khit inase [ Poli { 1,4- β 2 aset am ido–2–deok si–D- gluk osam inide } glikano hidrolase] adalah enzim y ang m enghidrolisis ikat an β - 1,4- aset am ido–2- deoksi- D- glikosida dari khit in dan khit odekst rin Bielka et al., 1984 . A. Ta t a n a m a e n z im k h it in a se . Sist im t at a nam a enzim khit inase m asih banyak m enim bulkan kerancuan. Harm an et al. 1993 sert a Sahai dan Manocha 1993 m em bagi k hit inase dalam t iga t ipe y ait u : a. Endok hit inase EC. 3.2.1.14 y ait u : enzim y ang m em ot ong secara acak ikat an β - 1,4 bagian int ernal m ikrofibril khit in Gam bar 3 . Produk akhir yang t erbent uk berupa oligom er pendek N- aset ilgluk osam in GlcNAc y ang m em puny ai berat m olek ul rendah sepert i k hit ot et raose, k hit ot riose dengan didom inasi oleh di- aset ilkhit obiose. Produk y ang dihasilkan bersifat m udah larut . b. Eksokhit inase belum m em iliki nom or ent ry dalam Enzy m e Nom enclat ure dinam ak an j uga k hit obiosidase at au k hit in–1,4- β - khit obiosidase, yait u enzim yang m engkat alisis secara akt iv pem bebasan unit - unit diaset ilkhit obiose t anpa ada unit - unit m onosakarida at au oligosakarida yang dibent uk Gam bar 3 . Pem ot ongan hanya t erj adi pada uj ung non reduk si m ik rofibril k hit in dan t idak secara acak . Ak t iv it a s e n z im Gam bar 3. Mekanism e kerj a enzim eksokhit inase dan endokhit inase Sahai Manocha, 1993 c. β - 1,4–N aset ilglukosam idase EC. 3.2.1.30 adalah suat u enzim khit inolit ik y ang bek erj a pada pem ut usan diaset ilkhit obiose, k hit ot riose dan k hit ot et raose dengan m enghasilkan m onom er- m onom er GlcNAc. B. M e t ode pe m e k a t a n ca ir a n e n z im da n pe n gu k u r a n a k t ivit a s k h it in a se Enzim y ang berada pada cairan k ult ur belum 100 t erdiri at as prot ein enzim yang diinginkan, sehingga perlu pem urnian unt uk m em isahkannya dari senyaw a- seny aw a lain. Tahap aw al dalam pem urnian enzim adalah pem ek at an m edium  2002 digit ized by USU digit al library 6 k ult ivasi. Pem ek at an dapat dilak uk an dengan beberapa cara y ait u : ult rafilt rasi, liofiliasi dan m engendapk an prot ein dengan am m onium sulfat , aset on, et anol, at au poliet ilen glikol PEG Scopes, 1994 . Pem ek at an enzim k hit inase dari St rept om y ces dengan am m onium sulfat pada kej enuhan 70 dan et anol dingin, dapat m eningkat kan kem urnian enzim bert urut - t urut 5 dan 3,5 kali dibanding enzim kasarnya Lloyd et al., 1965 . Singh et al. 1999 m eny at ak an bahw a prot ein k hit inase dari St rept om y ces sp. 385 y ang dipek at k an dengan poliet ilen glikol PEG , k em urnianny a m eningk at sebany ak 11,9 k ali dibanding enzim k asarny a. Pengendapan prot ein dengan am m onium sulfat adalah cara yang paling bany ak digunak an. Hal ini disebabk an k arena am m onium sulfat m udah didapat k an, hargany a relat if m urah, bersifat m enst abilkan enzim sert a dapat m encegah ak t iv it as enzim prot eolit ik. Garam am m onium sulfat k onsent rasi 2 - 3 M dapat m enst abilkan enzim selam a beberapa t ahun. Kelem ahannya adalah t idak dapat m engendapkan seluruh prot ein y ang t elah larut dan bila m engandung logam m ak a ak an dapat m erusak enzim Scopes, 1994 . Penguk uran ak t iv it as k hit inase dalam m em ecah k hit in dapat dilak uk an dengan beberapa cara sepert i y ang disebut k an dalam Jeaniaux 1966 dan Cabib 1987 yait u : a. Berdasark an pengurangan subst rat . 1 . Met ode viskosim et ri yait u akt ivit as khit inase t erhadap khit osan, glikol khit in at au karboksim et ilkhit in yang dit unj ukkan oleh t erj adinya pengurangan v iskosit as subst rat . 2 . Met ode t urbidim et ri nephelom et ri yait u m engukur variasi t urbidit as suspensi koloidal khit in selam a khit inolisis. Pengukuran ini bersifat cepat dan ak urat t api t idak cocok unt uk enzim dengan ak t iv it as rendah. Cont oh pada penguk uran ak t iv it as enzin endok hit inase. Unit ak t iv it as enzim endok hit inase diuk ur sebagai persen pengurangan k erapat an at au t urbidit as relat if dari suspensi yang sam a ant ara yang berisi enzim dengan ak uades. Sat u unit endok hit inase didefinisik an sebagai j um lah enzim yang dibut uhkan unt uk m ereduksi t urbidit as suspensi khit in 5 Harm an et al., 1993 ; Chernin et al., 1995 . b. Berdasark an pem bent uk an produk ak hir y ait u GlcNAc Met ode Reissig, 1955 . GlcNAc yang dibebaskan dari khit in dit ent ukan secara kolorim et rik dengan p- dim et ilam inobenzaldehida. Sat u unit ak t iv it as k hit inase diny at ak an sebagai µ m ol GlcNAc y ang dibebaskan selam a 1 j am dalam k ondisi y ang dit et apk an. c. Spect rom et er Assay yait u m enggunakan krom ogen 3,4, dinit rophenil t et ra N- aset ilkhit ot et raose. d. Radiom et er Assay. I I I . M I KROORGAN I SM E PEN GH ASI L KH I TI N ASE Sebagian besar m ik roorganism e t anah dan air adalah pendegradsai k hit in yang baik. Di dalam t anah set iap gram nya m engandung 10 6 m ikr oor ganism e yang m am pu m engolah khit in. Sebanyak 90- 99 dari organism e t ersebut adalah ak t inom iset es dan selebihny a bak t eri dan j am ur. Genus ak t inom iset es y ang dapat m em anfaat kan khit in sebagai sum ber karbon dan nit rogennya yait u : St rept om yces, Nocardia, St rept osporangium , Microm onospora dan Act inoplanes Alex ander, 1977 . Di ant ara ke lim a genus akt inom iset es khit inolit ik t ersebut , kem am puan khit inolit ik genus St rept om y ces banyak m endapat perhat ian penelit i. Hal ini karena St rept om yces adalah genus ak t inom iset es dengan j um lah t erbany ak di t anah. Ham pir sem ua anggot a genus St rept om yces m enghasilkan khit inase. Jenis- j enis St rept om yces yang t elah diket ahui m am pu m enghasilkan khit inase yait u S.  2002 digit ized by USU digit al library 7 ant ibiot icus Jeaniaux , 1966 , S. alboflav us, S. albus, S. rubriret iculi, S. griseus, S. scabies Wak sm an, 1967 , S. orient alis Tom inanga Tsuj isak a, 1976 , S. liv idans Miyashit a et al., 1991 , S. oliv aceov iridis Schrem pf, 1995 dan S. t endae Borm ann, 1999 . Jenis bakt eri dan j am ur penghasil khit inase dapat dilihat pada Tabel 1 . Ta be l 1 . M ik r oor ga n ism e pe n gh a sil k h it in a se Ba k t e r i Ja m u r Vibrio parahaem alut icus Vibrio alginoly t icus Flavobact erium indolt hecium Serrat ia m arcencens Ent erobact er liquefaciens Bacillus cereus Klebsiella sp Micrococcus colpogenes Bacillus cereus Clost ridium sp Pseudom onas sp Aerom onas sp Mort ierella sp Mucor subt illisim um Aspergillus fum igt us Trichoderm a viridae Pada j am ur berfilam en dan k am ir, k hit inase m erupak an bagian int egral dalam proses m orfogenesis dinding sel. Selain it u khit inase j uga m engaw ali perist iw a int erak si inang- parasit dari m ik oparasit biot rop dan nek rt ot rop, j am ur ent om opat ogen dan j am ur Vesik ular Arbuskular Mik orhiza VAM . Khit inase yang dihasilkan m ikroorganism em em iliki berat m olekull yang berkisar ant ara 20.000 – 120.000. Pada bak t eri berat m olek ulny a ant ara 60.000 – 110.000, sedangk an ak t inom iset es y ait u 30.000 at au lebih rendah. Pada j am ur berat m olek ulny a lebih t inggi dari 30.000. A. Biosin t e sis En z im Kh it in a se Pa da M ik r oor ga n ism e Pengat uran biosint esis enzim khit inase m elalui sist em represor- induser. Khit in dan produk hasil degradasiny a oligom er m onom er berperan sebagai induser sedangk an subst rat sepert i selulosa, x ilan, pek t in, lignin dan sebagainy a t idak dapat m enginduk si k hit inase Sahai Manocha, 1993 . Gluk osam in dapat m enginduk si k hit inase k arena pada k hit osan k hit in y ang m engalam i deaset ilasi m asih t erdapat sek it ar 10 – 20 residu aset il Sahai Manocha, 1993 . Pengat uran sint esis khit inase dipengaruhi j uga oleh produk akhir kat abolit berupa GlcNAc dan gluk osa. Kedua j enis gula sederhana ini m erupak an represor k at abolit bagi spesies Trichoderm a harzianum Ulhoa Peberdy , 1993 dan St achy bot ry s elegans Tw eddell et al., 1994 . Pada St rept om y ces liv idans kehadiran glukosa dalam m edium m engham bat sint esis enzim khit inase Sait o et al., 1998 . Khit in yang dipreparasi dengan hidrolisis parsial dengan HCl 10 N akan m enghasilkan koloidal khit in yang m am pu m enginduksi khit inase kom pleks sepert i N- aset ilglukosam inidase, endokhit inase dan khit obiosidase pada Aerom onas caviae I nbar Chet , 1991 , Ent erobact er agglom erans Chernin et al., 1995 dan Trichoderm a harzianum Haran et al., 1995 . Fakt or lain yang m enginduksi sint esis khit inase adalah kem am puan sel m ikroorganism e unt uk m engenal st rukt ur fisik khit in sepert i susunan rant ai, cont oh m ekanism e sint esis khit inase pada St rept om y ces oliv aceov iridis. Mikroorganism e ini m em produksi prot ein sepert i lekt in lect in- like prot ein yang m engikat secara khusus pada k rist al α - k hit in. Sel j uga dapat m engenal deraj at deaset ilasi dari j um lah  2002 digit ized by USU digit al library 8 gluk osam in dan GlcNAc relat if y ang dibebaskan selam a degradasi k hit in. Kehadiran k om ponen lain sepert i prot ein y ang berik at an k ov alen dengan part ikular k hit in dapat dikenal secara langsung oleh sensor prot ein m em bran paling luar. Unt uk m em isahkan enzim prot eolit ik ini, S. oliv aceov iridis m enghasilkan khit inase dengan dom ain enzim at ik t am bahan sepert i prot ease. S. oliv aceov iridis m enghasilkan 59 kDa prot ein dan t erdiri at as 47 kDa khit inase dan 12 kDa prot einase. Jadi efisiensi penggunaan k hit in j uga m em but uhk an beberapa enzim selain k hit inase Schrem pf, 1995 .

B. Sist im Kh it in olit ik Ak t in om ise t e s