Pengaruh Salinitas Terhadap Aktivitas Enzim Lipase Dari Bacillus cereus DA 5.2.3 Dalam Degradasi Pakan Udang

PENGARUH SALINITAS TERHADAP AKTIVITAS ENZIM LIPASE DARI Bacillus cereus DA 5.2.3 DALAM DEGRADASI PAKAN UDANG

SKRIPSI

ANDERSON J SILALAHI 090805040

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN 2014

PENGARUH SALINITAS TERHADAP AKTIVITAS ENZIM LIPASE DARI Bacillus cereus DA 5.2.3 DALAM DEGRADASI PAKAN UDANG

SKRIPSI

ANDERSON J SILALAHI 090805040

Diajukan untuk melengkapi tugas dan memenuhi syarat mencapai gelar Sarjana Sains

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN 2014

PERSETUJUAN

Judul : Pengaruh Salinitas Terhadap Aktivitas Enzim Lipase Dari Bacillus cereus DA 5.2.3 Dalam Degradasi Pakan Udang

Kategori : Skripsi

Nama : Anderson Jonathan Silalahi

Nomor Induk Mahasiswa : 090805040

Program Studi : Sarjana (S1) Biologi

Departemen : Biologi

Fakultas : Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Sumatera Utara

Disetujui di Medan, April 2014 Komisi Pembimbing :

Pembimbing 2 Pembimbing 1

Dra. Nunuk Priyani, M.Sc Dr. It Jamilah, M.Sc

NIP. 196404281999032002 NIP:196310121991032003

Disetujui Oleh

Departemen Biologi FMIPA USU Ketua,

Dr. Nursahara Pasaribu, M. Sc NIP. 19630123 199003 2001

ii

PERNYATAAN

PENGARUH SALINITAS TERHADAP AKTIVITAS ENZIM

LIPASE DARI

Bacillus cereus

DA 5.2.3

DALAM DEGRADASI

PAKAN UDANG

SKRIPSI

Saya mengakui bahwa skripsi ini adalah hasil karya sendiri kecuali beberapa kutipan dan ringkasan yang masing-masing disebutkan sumbernya.

Medan, April 2014

Anderson Jonathan Silalahi 090805040

PENGHARGAAN

Puji dan syukur penulis ucapkan kepada Tuhan Yang Maha Esa sebagai sumber kekuatan dan pengharapan. Karena Dia telah memberikan anugerah sehingga penulis diizinkan untuk menyelesaikan penelitian ini yang berjudul “Pengaruh Salinitas Terhadap Aktivitas Enzim Lipase Dari Bacillus cereus DA 5.2.3 Dalam Degradasi Pakan Udang” yang disusun sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana Sains Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara, Medan.

Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dosen Pembimbing 1, yaitu Ibu Dr. It Jamilah, M.Sc, dan kepada Ibu Dra. Nunuk Priyani, M.Sc. selaku Dosen Pembimbing 2 yang dengan sabar membimbing penulis dalam menyelesaikan penelitian ini dan memberikan panduan penuh kepercayaan kepada penulis untuk menyempurnakan kajian ini. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada para Dosen Penguji, kepada Bapak Prof. Dr. Dwi Suryanto, M.Sc. dan Ibu Dr. Hesti Wahyuningsih, M.Si. yang telah memberikan ujian-ujian mengenai penelitian penulis. Tidak lupa penulis mengucapkan terima kasih kepada bu Ipit dan Kepala Laboratorium Mikrobiologi USU, Medan yang banyak membantu dalam menyediakan peralatan dan bahan untuk penelitian ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Kepala instalasi Biologi Lingkungan serta staf pegawai di Balai Teknik Kesehatan dan Lingkungan Perlindungan Penyakit yang selama ini telah banyak membantu dalam memfasilitasi penelitian ini..

Terimakasih kepada orangtuaku tercinta, Bapak Drs. B. Silalahi dan Ibu RA. Simbolon, S.pd. yang selalu mendukung, mencukupi dan mendoakan penulis dalam menyelesaikan pendidikan. Kepada abang dan kakak saya bang Fernando, kakak Yosi dan Melani serta terkhusus buat Grace Lumbantoruan yang selalu mendukung penulis dalam menyelesaikan skripsi ini serta seluruh keluarga besar penulis.

Penulis juga berterima kasih kepada rekan-rekan seperjuangan stambuk 2009 (Octopus), Adrian, Raymon, Sahat, Hans, Febrin, Agustina, Ubasori, Boy, Hotman, Silvia, Laura, Venny, Astri, Sepwin, dan lain-lain. Kakak abang angkatan 2008, adik-adik angkatan 2010, 2011 (adik asuhku Natanail Jawak), 2012 serta PKBKB yang selama ini memberikan bantuan dan dorongan yang diperlukan. Semoga Tuhan Yang Maha Esa senantiasa selalu memberikan berkat-Nya. Amin.

iv

PENGARUH SALINITAS TERHADAP AKTIVITAS ENZIM LIPASE DARI Bacillus cereus DA 5.2.3 DALAM DEGRADASI PAKAN UDANG

ABSTRAK

Salah satu permasalahan pada budi daya tambak udang intensif yaitu akumulasi pakan udang di dasar perairan tambak. Salah satu kandungan pakan udang yaitu lipid. Bacillus cereus DA 5.2.3 mampu mendegradasi kandungan lipid di pakan udang dalam konsentrasi dan salinitas berbeda. Uji deteksi awal enzim lipase dilakukan pada media minyak ikan dengan penambahan Methyl red. Lalu dilanjutkan dengan uji aktivitas enzim lipase yang diukur berdasarkan kadar asam lemak bebas dengan metode titimetri. Didapatkan hasil bahwa adanya aktivitas enzim lipase di media minyak ikan dan aktivitas tertinggi enzim lipase terdapat pada salinitas 0‰ dan pakan 1 g dengan nilai kadar asam lemak bebas sebesar 0,25%. Namun demikian lipase dari Bacillus cereus DA 5.2.3 aktif pada kisaran salinitas tambak yaitu 15-25‰ dengan kadar asam lemak bebas sebesar 0,1%. Kata kunci: pakan udang, enzim lipase, kadar asam lemak bebas

EFFECT OF SALINITY ON LIPASE ACTIVITY OF Bacillus cereus DA 5.2.3 IN DEGRADATION OF SHRIMP FEED

ABSTRACT

One of the serious problems of intensive shrimp of aquaculture is the accumulation of shrimp feed at the bottom of shrimp farms. One content of shrimp feed is lipid. Bacillus cereus DA 5.2.3 was expected to degrade lipids in shrimp feed at different concentrations and salinities. Early detection of lipase was conducted by the addition of fish oil and methyl red. It was then continued by the test of lipase activity which was measured by the levels of free fatty acids by the method titimetri. Lipase activity was detected in medium of fish oil and the highest activity of lipase was found at 0‰ salinity and shrimp feed with a value of 1 g/ 5 ml with the free fatty acid content of 0.25%. However, lipase from Bacillus cereus 5.2.3 DA was active in the range of salinity of shrimp aquaculture with the free fatty acid level around 0.1%.

vi

DAFTAR ISI

LEMBAR PERSETUJUAN i

LEMBAR PERNYATAAN ii

PENGHARGAAN iii

ABSTRAK iv

ABSTRACT v

DAFTAR ISI vi

DAFTAR TABEL vii

DAFTAR GAMBAR viii

DAFTAR LAMPIRAN ix

BAB 1 PENDAHULUAN 1

1.1 Latar Belakang 1

1.2 Permasalahan 3

1.3 Tujuan Penelitian 4

1.4 Manfaat 4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 5

2.1 Enzim Lipase 5

2.2 Bacillus 6

2.2.1 Karakteristik Bacillus sp. 6

2.2.2 Ciri-Ciri Morfologi dan Fisiologi Bacillus sp. DA 5.2.3 7

2.2.3 Pemanfaatan Bacillus sp. 7

2.3 Kandungan Lemak dalam Pakan Udang 8

2.4 Permasalahan Pakan Udang di Perairan Tambak 9

BAB 3 BAHAN DAN METODE 10

3.1 Waktu dan Tempat 10

3.2 Alat Dan Bahan 10

3.3 Deteksi Aktivitas Enzim Lipase di Media Lipid 10

3.4Kemampuan Pertumbuhan Koloni dengan Konsentrasi 11

Pakan yang Berbeda 3.5 Produksi dan Isolasi Enzim Lipase 11

3.6 Penentuan Kadar Asam Lemak Bebas 12

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 13

4.1 Deteksi Aktivitas Enzim Lipase di Media Lipid 13

4.2 Kemampuan Pertumbuhan Koloni Bacillus cereus DA 5.2.3 15

di Media Pakan Udang 4.3 Rata-rata Pertumbuhan Bacillus cereus DA5.2.3 di Media Pakan 16

Udang Dalam Konsentrasi Berbeda 4.4 Analisis Kadar Asam Lemak Bebas dengan Metode Uji Titimetri 19

4.4.1 Grafik Kadar Asam Lemak Bebas Metode Titimetri 20

4.4.2 Pengaruh Lama Penyimpanan Enzim Lipase Terhadap 24 Aktivitasnya Metode Titimetri

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan 26

5.2 Saran 26

viii

DAFTAR TABEL

Halaman Tabel 1. Rata-rata Diameter Koloni Bacillus cereus DA 5.2.3 pada Media 18

Pakan Udang

Tabel 2. Kadar Asam Lemak Bebas dengan Metode Titimetri 20 Tabel 3. Kadar Asam Lemak Bebas Pada Pakan 1 g, Salinitas 0‰ dan 24

DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 1. (A) Media lipid tanpa inokulasi koloni bakteri 13

(B) Media lipid yang diinokulasi dengan Bacillus cereus DA 5.2.3 (C) Media lipid yang diinokulasi dengan Pseudomonas aeruginosa

Gambar 2. Pertumbuhan Bacillus cereus DA 5.2.3 Pada Media Pakan 15 Udang Pada suhu 30 0C

Gambar 3. (A) Koloni Bacillus cereus DA 5.2.3 pada media pakan udang,` 17 suhu 30 0C dan waktu inkubasi 2 hari (A1) 1%, (A2) 2%, (A3) 3%

dan (B) Koloni Pseudomonas aeruginosa di media pakan udang: (B1) 1%, (B2) 2%, (B3) 3%

x

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1. Bagan Kerja Uji Kualitatif Enzim Lipase 32 Lampiran 2. Bagan Kerja Uji Kuantitatif Enzim Lipase 32 Lampiran 3. Bagan Kerja Produksi Enzim Lipase dari Bacillus cereus 33

DA 5.2.3

Lampiran 4. Bagan Kerja Penentuan Kadar Asam Lemak Bebas pada 34 Konsentrasi dan Salinitas berbeda

Lampiran 5. Tabel Volume Titrasi Kadar Asam Lemak Bebas 35 Lampiran 6. Perhitungan % Kadar Asam Lemak Bebas 36 Lampiran 7. Tabel % Kadar Asam Lemak Bebas Pengaruh Lama 38

Penyimpanan Enzim Lipase Terhadap Aktivitasnya

Lampiran 8. Perhitungan % Kadar Asam Lemak Bebas Pengaruh Lama 38 Penyimpanan Enzim Lipase Terhadap Aktivitasnya

Lampiran 9. Komposisi Nutrisi Di Dalam Pakan Udang 39

PENGARUH SALINITAS TERHADAP AKTIVITAS ENZIM LIPASE DARI Bacillus cereus DA 5.2.3 DALAM DEGRADASI PAKAN UDANG

ABSTRAK

Salah satu permasalahan pada budi daya tambak udang intensif yaitu akumulasi pakan udang di dasar perairan tambak. Salah satu kandungan pakan udang yaitu lipid. Bacillus cereus DA 5.2.3 mampu mendegradasi kandungan lipid di pakan udang dalam konsentrasi dan salinitas berbeda. Uji deteksi awal enzim lipase dilakukan pada media minyak ikan dengan penambahan Methyl red. Lalu dilanjutkan dengan uji aktivitas enzim lipase yang diukur berdasarkan kadar asam lemak bebas dengan metode titimetri. Didapatkan hasil bahwa adanya aktivitas enzim lipase di media minyak ikan dan aktivitas tertinggi enzim lipase terdapat pada salinitas 0‰ dan pakan 1 g dengan nilai kadar asam lemak bebas sebesar 0,25%. Namun demikian lipase dari Bacillus cereus DA 5.2.3 aktif pada kisaran salinitas tambak yaitu 15-25‰ dengan kadar asam lemak bebas sebesar 0,1%. Kata kunci: pakan udang, enzim lipase, kadar asam lemak bebas

v

EFFECT OF SALINITY ON LIPASE ACTIVITY OF Bacillus cereus DA 5.2.3 IN DEGRADATION OF SHRIMP FEED

ABSTRACT

One of the serious problems of intensive shrimp of aquaculture is the accumulation of shrimp feed at the bottom of shrimp farms. One content of shrimp feed is lipid. Bacillus cereus DA 5.2.3 was expected to degrade lipids in shrimp feed at different concentrations and salinities. Early detection of lipase was conducted by the addition of fish oil and methyl red. It was then continued by the test of lipase activity which was measured by the levels of free fatty acids by the method titimetri. Lipase activity was detected in medium of fish oil and the highest activity of lipase was found at 0‰ salinity and shrimp feed with a value of 1 g/ 5 ml with the free fatty acid content of 0.25%. However, lipase from Bacillus cereus 5.2.3 DA was active in the range of salinity of shrimp aquaculture with the free fatty acid level around 0.1%.

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1Latar Belakang

Produksi enzim saat ini semakin meningkat dan teknologinya dapat dikatakan sudah sangat maju. Selama ini diketahui enzim berasal dari hewan, tumbuhan maupun mikroorganisme yang mampu menghasilkan berbagai enzim untuk kebutuhan industri. Salah satu enzim yang penting dalam perkembangan industri khususnya bioteknologi yaitu enzim lipase (E.C.3.1.1.3). Lipase adalah enzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis ester asam karboksilat dalam lemak atau minyak dan sintesis monoester, ester asam karboksilat atau reaksi sintesis monoester secara stereoselektif dan enantioselektif (Snellman dan Colwell, 2004). Lipase merupakan enzim yang paling banyak digunakan sebagai katalis berbagai reaksi senyawa organik serta biokatalis yang berperan besar dalam aplikasi bioteknologi, seperti dalam sintesis biopolimer, biodiesel, produksi obat, dan produksi flavor (Joseph et al., 2007; Reetz, 2002).

Faktor lingkungan yang mempengaruhi aktivitas enzim lipase ialah faktor suhu, pH dan salinitas (kandungan garam) di dalam perairan. Kadar garam di perairan akan selalu berubah. Hal ini disebabkan salinitas di perairan dipengaruhi oleh lingkungan yaitu penguapan oleh sinar matahari, curah hujan dan sungai yang bermuara ke suatu perairan. Kadar garam yang selalu berubah ini akan mempengaruhi kerja enzim lipase di perairan. Pada konsentrasi NaCl 7,0 mM lipase menunjukkan aktivitas yang maksimum, tetapi kemudian menurun. Garam kalsium juga meningkatkan aktivitas lipase dan membantu meningkatkan daya tahan enzim tersebut terhadap panas (Winarno, 1986). Berdasarkan hasil penelitian Lestari dan Handayani (2009), suhu optimum lipase adalah 40°C dengan nilai aktivitas sebesar 40 U/ml. Enzim lipase yang diperoleh dari Bacillus subtilis mempunyai suhu optimum pada suhu 40 0C dengan aktivitas sebesar 5,98

2

pada temperatur antara 30 dan 40 °C (Handayani dan Sulistyo, 2005; Volk dan Wheeler 1988). Nilai pH optimum dari lipase pada umumnya adalah 7 dengan nilai aktivitas sebesar 50 U/ml dimana lipase yang diproduksi dari Pseudomonas aerogenes dan B. substilis mempunyai pH optimum pada pH 7 dengan aktivitas masing-masing sebesar 5,81 μmol/menit dan 5,85 μmol/menit (Volk dan Wheeler 1988; Handayani dan Sulistyo 2005). Secara umum aktivitas optimum lipase terjadi pada kisaran pH 6 sampai 8 (Faiz et al., 2007). Menurut penelitian yang dilakukan oleh Mohan dan Palavesam (2012), Bacillus cereus yang diisolasi dari saluran pencernaan ikan menunjukkan aktivitas tertinggi pada kisaran pH 7 dan pada temperatur 37 0C sedangkan berdasarkan kandungan lipid di dalam substrat yang menunjukkan aktivitas tertinggi yaitu pada konsentrasi 1%.

Perairan tambak udang di Indonesia saat ini terancam oleh limbah yang diakibatkan pakan udang yang tidak dimanfaatkan seluruhnya dan terakumulasi di dasar perairan tambak. Jumlah pemberian pakan udang dengan kemampuan udang dalam mengkonsumsi makanannya tidak seimbang. Pada pemberian pakan kepada udang di perairan tambak, sekitar 85% dimanfaatkan oleh udang untuk proses metabolisme tubuhnya sementara 15% dari pakan udang yang tidak dimakan akan mengendap di dasar perairan tambak (Edhy et al., 2010). Hal ini menyebabkan pakan yang mengandung komposisi bahan organik yang cukup tinggi dapat mencemari perairan tambak udang tersebut. Menurut Widiyanto (2006), tingginya akumulasi bahan organik di tambak udang dapat menimbulkan beberapa dampak yang merugikan yaitu memacu pertumbuhan mikroorganisme heterotrofik, eutrofikasi, terbentuknya senyawa toksik (amonia dan nitrit), dan menurunnya konsentrasi oksigen terlarut.

Pakan udang memiliki kandungan nutrisi yang bervariasi dimana salah satu nutrisi yang paling penting adalah protein dan lemak. Kandungan pakan udang yang diberikan pada udang dengan berat antara 0,01-0,5 gram memiliki kadar protein sebesar 45% dan lemak sebesar 7,5%. Pada udang dengan berat antara 0,5 - 3,0 gram memiliki kadar protein sebesar 40% dan lemak sebesar 6,7% dan pada udang dengan berat antara 15,0- 40 gram memiliki kadar protein sebesar 36% dan kadar lemak sebesar 6,0% (Edhy et al., 2010).

3

Mikroorganisme penghasil lipase ditemukan dalam bermacam-macam habitat seperti limbah industri, pabrik pengolahan minyak sayur, perusahaan susu, tanah yang terkontaminasi dengan minyak, makanan yang membusuk dan timbunan kompos (Sharma et al., 2001). Salah satu mikroorganisme penghasil enzim lipase adalah bakteri Bacillus spp. (Effendi, 2003). Menurut Atlas & Bartha (1987), Bacillus spp. sangat potensial untuk dikembangkan dalam industri bioteknologi karena mempunyai sifat-sifat seperti, memiliki kisaran suhu pertumbuhan yang luas, pembentuk spora, kosmopolit, tahan terhadap senyawa-senyawa antiseptik, bersifat aerob atau fakultatif anaerob, memiliki kemampuan enzimatik yang beragam, dan beberapa diantaranya mampu melakukan biodegradasi terhadap banyak senyawa rekalsitran dan xenobiotik. Selain itu yang utama adalah Bacillus spp. tidak membutuhkan faktor tumbuh yang relatif mahal. Menurut penelitian yang telah dilakukan oleh Jamilah (2011), isolat Bacillus sp. DA 5.2.3 yang diisolasi dari saluran pencernaan Penaeus vannamae mampu menurunkan kandungan senyawa organik seperti protein dan karbohidrat media pakan udang cair tambak udang. Kemampuan bakteri Bacillus spp. yang mampu menghasilkan enzim lipase ini dapat dimanfaatkan dalam proses penguraian lemak atau minyak di perairan sehingga dapat dijadikan agen bioremidiasi di perairan khususnya dalam pendegradasian minyak atau lemak.

1.2Permasalahan

Pemberian pakan udang secara berlebihan dapat menyebabkan pencemaran air. Pencemaran tersebut dapat disebabkan oleh pakan udang yang terakumulasi di dalam perairan dan salah satu kandungan di dalam pakan udang yaitu lemak. Bakteri Bacillus spp. telah dilaporkan mampu menghasilkan enzim lipase. Enzim lipase mampu menguraikan lemak menjadi senyawa yang lebih sederhana yaitu asam lemak dan gliserol. Maka diharapkan dari penelitian ini bakteri Bacillus cereus DA 5.2.3 yang diisolasi dari saluran pencernaan Penaeus vannamae mampu menjadi agen bioremidiasi untuk perairan yang tercemar pakan udang khususnya dari kandungan lemaknya.

4

1.3 Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini ialah:

1. untuk mendeteksi adanya aktivitas enzim lipase dari bakteri Bacillus cereus DA 5.2.3 yang diperoleh dari perairan tambak udang.

2. untuk menguji kemampuan bakteri Bacillus cereus DA 5.2.3 dalam mendegradasi pakan udang pada konsentrasi yang berbeda.

3. untuk mengetahui aktivitas enzim lipase pada konsentrasi pakan dan kadar salinitas yang berbeda (0, 5, 10, 15, 20 dan 25‰).

1.4 Manfaat Penelitian

Penelitian ini dilakukan untuk memperoleh isolat Bacillus cereus DA 5.2.3 sebagai agen bioremediasi dan juga sebagai kandidat probiotik dalam budidaya udang di perairan tambak.

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Enzim Lipase

Enzim merupakan suatu protein yang bertindak sebagai katalisator reaksi biologis (biokatalisator) (Muchtadi et al., 1992). Menurut Suhartono (1989) enzim memiliki sifat yang khas yaitu sangat aktif walaupun konsentrasinya amat rendah, sangat selektif, bekerja pada keadaan reaksi yang ringan (tanpa suhu atau tekanan tinggi dan tanpa logam yang umumnya beracun).

Enzim lipase dapat diperoleh dari hewan, tanaman dan mikroorganisme. Menurut Svendsen (1994) enzim lipase yang bersumber dari hewan dikelompokkan berdasarkan sumbernya yaitu: lipase pada sistem pencernaan, lipase yang terdapat pada jaringan seperti hati, paru-paru dan ginjal serta lipase dalam air susu. Menurut Mukherjee dan Hills (1994) enzim lipase dari tanaman dikelompokkan menjadi lipase triasilgliserol, asilhidrolase, fosfolipase dan lisofosfolipase. Sedangkan enzim lipase yang bersumber dari mikroorganisme menurut Svendsen (1994) dibagi menjadi lipase yang berasal dari bakteri, kapang dan khamir.

Lipase merupakan biokatalisator yang mempunyai kemampuan mengkatalisis reaksi hidrolisis lipid menjadi asam lemak dan gliserol. Oleh karena kemampuannya dalam menghidrolisis lipid, lipase dapat dimanfaatkan sebagai aditif dalam industri detergen. Lipase yang digunakan dalam industri detergen mempunyai sifat seperti rentang pH antara 8-10,5, serta tetap aktif pada suhu 300C-600C (Zusfahair et al., 2008).

Enzim lipase merupakan enzim yang dapat menghidrolisis trigliserida menjadi asam lemak bebas (ALB), gliserida (digliserida dan monogliserida) serta gliserol (Winarno, 1995). Reaksi enzim lipase merupakan reaksi yang terjadi secara bertahap yang menghasikan digliserida dan monogliserida sebagai senyawa antara (Brockman, 1984). Reaksi hidrolisis ini dapat dilihat pada Gambar 1. Digliserida dan monogliserida yang merupakan senyawa antara mempunyai sifat

6

aktif permukaan atau penurunan tegangan permukaan yang lebih baik dibandingkan trigliserida..

lipase

Trigliserida + H2O Digliserida + ALB lipase

Digliserida + H2O Monogliserida + ALB lipase

Monogliserida + H2O Gliserol + ALB lipase

Trigliserida + 3H2O Gliserol + 3ALB Keterangan: ALB = Asam Lemak Bebas (Macrae, 1983)

Pada berbagai produk, enzim lipase sudah banyak digunakan terutama dalam pengolahan susu, pembuatan keju, pembuatan mentega, serta dalam pembuatan produk-produk pangan yang lain (Muchtadi et al, 1992).

2.2 Bacillus

2.2.1 Karakteristik Bacillus sp.

Marga Bacillus merupakan salah satu dari enam bakteri penghasil endospora, yaitu Bacillus, Sporolactobacillus, Clostridium, Desulfotomaculum, Sporo- sarcina, Thermo actinomy cetes. Endospora tersebut berbentuk bulat, oval, elips atau silinder, yang terbentuk di dalam sel vegetatif. Endospora tersebut membedakan Bacillus dari tipe-tipe bakteri pembentuk eksospora. Spora Bacillus pertama kali dideskripsikan oleh Cohn pada tahun 1872 pada B. subtilis yang semula disebut Vibrio subtilis oleh Ehrenberg pada 1835. Cohn menunjukkan bahwa spora tersebut mempunyai resistensi yang lebih dibandingkan sel vegetatifnya ( Hemphill, 2006).

Bacillus spp asal laut telah diteliti oleh ahli-ahli peneliti kelautan dan terbukti mempunyai beberapa kemampuan, diantaranya adalah mampu menghasilkan zat antibiotik yang dapat melawan bakteri patogen Vibrio cholerae, sebagai penghasil enzim pemecah senyawa glukan yaitu Bacillus circulans No. MT-G2, mampu menguraikan minyak mentah dan hidrokarbon lain (Effendi 1998), sebagai bakteri pemecah minyak (Thayib, 1982). Bacillus sp. merupakan bakteri gram positif dengan sel berbentuk batang. Ujung sel persegi, bundar,

7

meruncing, atau lancip seperti ujung cerutu. Ujung sel terpisah dan adakalanya tetap saling melekat dengan yang lainnya (Pelczar dan Chan, 1986). Bacillus sp. sangat resisten terhadap kondisi yang kurang baik seperti suhu, pH, dan salinitas sehingga distribusinya di alam sangatluas.

Bacillus cereus merupakan bakteri Gram-positif dan fakultatif aerob. Ukuran dari sel vegetatifnya sekitar 1.0- 1.2 μm atau 3.0-5.0 μm. Spora terletak di tengah atau tepi sel. Organisme ini tidak menghasilkan manitol dan memiliki phospolipase (lecithinase) yang sangat aktif (Wong, 2010). Bacillus sp. berbentuk batang, 0,3 – 2,2 µ x 127 – 7,0 µm. Sebagian besar motil, flagelum lateral, membentuk endospora, tidak lebih dari satu dalam satu sel sporangium serta bersifat kemoorganotrof (Pelczar dan Chan, 2005).

2.2.2 Ciri-Ciri Morfologi dan Fisiologi Bacillus sp. DA 5.2.3.

Bacillus sp. DA 5.2.3 memiliki warna koloni krem keputihan, bentuk koloni bulat, pinggiran tidak rata. Pada bagian pusat koloni terbentuk titik seperti inti yang dikelilingi garis halus melingkar menuju inti. Isolat ini merupakan bakteri Gram positif berbentuk batang tunggal maupun rantai. Endospora dihasilkan pada pewarnaan menurut Schaefer-Fulton. Isolat DA 5.2.3 menghasilkan enzim katalase, nitrat reduktase, arginin dehidrolase serta menghidrolisis gelatin, kasein dan pati. Isolat ini menggunakan natrium malonat sebagai sumber nitrogen, salisin sebagai sumber karbon, tetapi tidak menggunakan glukosa, sukrosa ataupun laktosa. Ketika ditumbuhkan pada suhu 50 0C ataupun pada NaCl 7%, isolat ini tidak tumbuh (Jamilah, 2011).

2.2.3 Pemanfaatan Bacillus sp.

Bacillus sp. telah banyak digunakan baik dalam industri maupun lingkungan salah satunya merupakan untuk teknik bioremediasi. Bioremediasi merupakan proses degradasi bahan organik menjadi senyawa lain misalnya CO2, CH4, H2O, garam anorganik, biomassa, dan hasil samping yang sedikit lebih sederhana dari senyawa semula secara biologis. Proses bioremediasi bergantung pada kemampuan organisme yang digunakan dan sistem yang dioperasikan pada jangka waktu tertentu. Proses ini didasari oleh dekomposisi bahan organik yang

8

dilakukan misalnya oleh bakteri atau jamur heterotropik. Proses bioremediasi akan berjalan optimal pada suhu dan pH tertentu serta harus tersedia nutrisi dan oksigen yang cukup bagi organisme yang digunakan (Citroreksoko, 1996).

2.3 Kandungan Lemak dalam Pakan Udang

Lemak merupakan komponen nutrisi penting yang dibutuhkan untuk perkembangan ovarium, terutama asam lemak tidak jenuh tinggi (n-3 HUFA) dan fosfolipid. Konsentrasi lemak dalam pakan komersial untuk induk udang berkisar 10% dan ini 3% lebih tinggi dari pakan komersial untuk jenis grower. Total kandungan lemak dalam pakan dilaporkan tidak begitu penting berpengaruh, namun diyakini bahwa pakan yang kaya akan kandungan n-3 HUFA (Asam Aicosapentanoat = EPA dan Asam Docosaheksanoat = DHA) ditemukan mempunyai pengaruh positif terhadap perkembangan ovarium, fekunditas, dan kualitas telur (Tacon, 1987).

Lemak diperlukan oleh udang tidak hanya sebagai sumber energi saja. Oleh karena lemak juga terdapat asam lemak essensial dan vitamin-vitamin yang larut dalam lemak seperti vitamin A, D, E, K maka lemak juga berfungsi sebagai pembawa dan mempertinggi penyerapan vitamin yang larut dalam lemak serta mempengaruhi aroma dan tekstur pakan (Edhy, et al., 2010).

Asam lemak penting bagi udang adalah asam linolenat, asam lemak ini banyak terdapat pada bagian kepala udang, didalam tubuh udang kelebihan lemak disimpan dalam bentuk trigliserida. Disamping asam lemak essensial udang juga membutuhkan kolesterol dalam makanannya, sebab udang tak mampu mensintesa nutrien itu dalam tubuh udang. Kolesterol berperan dalam proses moulting. Penambahan kolesterol di dalam tubuh udang melalui makanan akan sangat berpengaruh pada kadar kolesterol, kebutuhan kolesterol diperkirakan sebanyak 0,5%. Asam lemak n-6 HUFAs sebagai prekursor hormon prostaglandin dan memainkan peranan penting dalam proses reproduksi dan vitellogenesis. Namun pada kenyataannya banyak dijumpai bahwa pakan komersial yang diformulasikan khusus untuk induk udang masih nampak defisiensi asam arachidonat dan EPA. Rasio (n-3: n-6) HUFA sekitar 3:1 dilaporkan menghasilkan tingkat kematangan

9

reproduksi udang yang optimum. Sumber lemak dalam bentuk trigliserida selama proses pematangan gonad juga meningkat dalam telur, dan diyakini nutrisi ini berperan sebagai sumber energi utama dalam reproduksi dan penentu kualitas telur. Lemak mengandung kalori hampir dua kali lebih banyak dibandingkan dengan protein maupun karbohidrat, karena perannya sebagai sumber energi sangat besar meskipun kadarnya dalam makanannya relatif kecil (Tacon, 1987).

2.4 Permasalahan Pakan Udang di Perairan Tambak

Pakan udang yang diberikan kepada udang secara berlebihan mampu menimbulkan masalah terhadap lingkungan perairan tambak. Senyawa organik yang terkandung di dalam pakan udang akan terkumpul di dalam perairan tambak dan mempengaruhi pertumbuhan udang. Salah satu faktor yang berpengaruh langsung terhadap pencemaran pakan udang yaitu kandungan oksigen di dalam air (Dissolved Oxygen/ DO). Kandungan DO dalam perairan tambak sangat berpengaruh terhadap fisiologi udang. Kadar oksigen merupakan faktor lingkungan yang terpenting pada tambak udang. Apabila terjadi penurunan kandungan oksigen terlarut (DO) dalam air (merupakan variabel kualitas air pembatas utama dalam budidaya), akan mengakibatkan mudah terserang penyakit dan memiliki pertumbuhan yang lambat, laju konsumsi pakan dan kelulusan kehidupan yang rendah (Boyd, 1982). Dalam perairan berkadar oksigen 1,0 mg/l udang akan berhenti makan, tidak menunjukkan perbedaan laju konsumsi pakan pada konsentrasi 1,5 mg/l, tidak tumbuh pada 1,0 -1,4 mg/l, memiliki pertumbuhan terbatas di bawah 5 mg/l dan normal pada konsentrasi di atas 5,9 mg/l. Dengan demikian DO harus dipertahankan di atas 2,0 mg/l (Yang, 1990 dan Law, 1988).

Pada tambak semi-intensif dan tambak intensif sejalan dengan masa pemeliharaan jumlah bahan organik yang berasal dari kotoran sisa pakan dan jasad mati dapat terakumulasi di dasar tambak dari waktu ke waktu. Menumpuknya bahan organik secara berlebihan di dasar tambak (lumpur) akan menurunkan daya dukung lingkungan tambak (carrying capacity) dan dapat mengakibatkan terbentuknya kondisi anaerobik pada dasar tambak akibat aktivitas mikroorganisme (Boyd, 1992 dan Cholik, 1993).

BAB 3

BAHAN DAN METODA

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan Agustus 2013 sampai dengan Desember 2013 di Instalasi Biologi Lingkungan Balai Teknik Kesehatan dan Lingkungan Pengendalian Penyakit, Medan dan Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara, Medan.

3.2 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan ialah timbangan analitik, cawan petri, blender, erlenmeyer, shaker, oven, vortex, propipet, bunsen, jarum, ose bengkok, cotton swab, pipet serologi, autoklaf, penangas air, spektrofotometer, Bio Hazard Safety, pipet mikro, hot plate, sentrifuse, buret, kertas cakram, statif dan klem.

Bahan yang digunakan ialah isolat bakteri Bacillus cereus DA 5.2.3 yang diisolasi dari usus udang Penaeus vannamae asal tambak udang lokal di Jawa Barat dan Pseudomonas aeruginosa sebagai kontrol positif (Koleksi Laboratorium Mikrobiologi, FMIPA USU). Media yang digunakan ialah Sea Water Complex (SWC) dengan komposisi air laut 750 ml, akuades 250 ml, gliserol 1,5%, ekstrak yeast 0,5%, agar 20%, bacto pepton 2,5% dan campuran pakan udang merk pakan Global 850,870, minyak ikan serta media agar yang memiliki komposisi 2,5% agar, 2% Tween 80 dan 0,01% Methyl red. Reagen yang digunakan ialah, NaOH 0,01 N, NaCl, indikator phenolftalein.

3.3 Deteksi Enzim Lipase di Media Lipid

Sebelum melakukan uji pendugaan aktivitas enzim lipase, isolat bakteri Bacillus cereus DA 5.2.3 diremajakan terlebih dahulu untuk mendapatkan hasil yang maksimal di media SWC (Sea Water Complex) padat. Sebagai kontrol positif Pseudomonas aeruginosa diremajakan juga di media Nutrient Agar (NA)

11

Uji kualitatif ini dilakukan dengan 2 media berbeda yaitu media lipid (minyak ikan) dan media pakan (pakan udang). Setelah dilakukan peremajaan 1 koloni isolat bakteri Bacillus cereus DA 5.2.3 dan Pseudomonas aeruginosa lalu isolat ditotolkan di masing-masing media lipid dan pakan. Media lipid dan pakan yang telah ditotol koloni bakteri Bacillus cereus DA 5.2.3 dan Pseudomonas aeruginosa lalu diinkubasi selama 48 jam dan diamati perubahan warnanya.

3.4 Kemampuan Pertumbuhan Koloni dengan Konsentrasi Pakan Berbeda

Media pakan dibuat dengan variasi konsentrasi yang berbeda, yaitu 1, 2 dan 3%. Pakan udang yang dipakai merupakan pakan udang komersial dengan merk pakan Global 850,870. Pakan udang ditimbang lalu dicampurkan dengan air dan agar. Pada uji ini digunakan 2 isolat bakteri yaitu Bacillus cereus DA 5.2.3 (sebagai isolat uji) dan Pseudomonas aeruginosa (sebagai kontrol positif). Satu koloni dari masing-masing bakteri ditotolkan di atas media pakan. Media pakan yang telah ditotolkan koloni bakteri Bacillus cereus DA 5.2.3 dan Pseudomonas aeruginosa lalu diinkubasi selama 48 jam dan diukur diameter koloni bakteri yang paling besar.

3.5 Produksi dan Isolasi Enzim Lipase

Sebanyak 2 ml inokulum bakteri Bacillus cereus DA 5.2.3 diinokulasikan ke dalam 20 ml medium NB (sebagai medium fermentasi) dalam Labu Erlenmeyer yang diperkaya dengan minyak ikan sebanyak 0,6 ml (Siregar, 2006). Medium produksi yang mengandung inokulum diinkubasi dalam shaker incubator dengan kecepatan 150 rpm pada suhu ruang selama 72 jam. Dari medium produksi lalu dipipet sebanyak 10 ml media hasil penanaman dan dimasukkan ke dalam tabung sentrifuse, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 6000 x g selama 15 menit pada suhu 4 0C. Medium produksi yang telah disentrifugasi lalu didekantasi dan peletnya dibuang. Supernatan mengandung ekstrak enzim lipase kasar akan digunakan pada uji selanjutnya.

12

3.6 Penentuan Kadar Asam Lemak Bebas

Untuk menentukan aktivitas enzim lipase maka dilakukan penentuan kadar asam lemak bebas pada konsentrasi pakan dan kadar garam yang berbeda. Setelah didapatkan kondisi konsentrasi pakan dan kadar garam yang maksimum lalu dilanjutkan dengan lama penyimpanan enzim lipase terhadap degradasi pakan udang. Konsentrasi pakan yang digunakan yaitu 1, 2 dan 3 g. Sementara konsentrasi garam yang digunakan yaitu 0‰ (kontrol) dan 5, 10, 15, 20 dan 25‰. Pakan udang ditimbang masing-masing 1, 2 dan 3 g lalu dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang telah berisi air dengan kadar garam yang berbeda. Setelah 1 ml Buffer pospat ditambahkan ke dalam erlenmeyer lalu digoyang. Setelah beberapa menit 2 ml ekstrak kasar enzim ditambahkan ke dalam erlenmeyer lalu dibiarkan selama 30 menit. 20 ml alkohol 96% ditambahkan ke erlenmeyer dengan tujuan untuk menghentikan reaksi. Setelah reaksi berhenti erlenmeyer uji lalu dipanaskan hingga mendidih lalu dibiarkan dingin dan diuji dengan metode titimetri. Untuk lama penyimpanan dilakukan dengan penyimpanan enzim lipase pada suhu 4 0C dalam interval waktu 0, 1, 2, 3, 4 dan 5 jam dan diuji dengan metode titimetri.

Rumus yang dipakai untuk menghitung kadar asam lemak yang bebas terurai, yaitu:

% ALB = x 100 Dimana:

V = Volume NaOH (ml)

N = Normalitas NaOH (0,01 N)

BM = Berat molekul asam lemak bebas (asam linolenat 278) G = Berat sampel pakan udang (gram)

BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Deteksi Enzim Lipase di Media Lipid

Setelah dilakukan inokulasi 1 koloni bakteri Bacillus cereus DA 5.2.3 dan Pseudomonas aeruginosa yang dijadikan kontrol positif di media lipid yang mengandung minyak ikan dan diinkubasi selama 2 hari. Pseudomonas aeruginosa digunakan sebagai bakteri pembanding karena bakteri ini telah dikenal dalam kemampuannya menghasilkan enzim lipase. Setelah dilakukan percobaan didapatkan hasil bahwa adanya perubahan warna pada media yang ditunjukkan pada gambar berikut.

Gambar 1. (A) Media lipid tanpa inokulasi koloni bakteri (B) Media lipid yang diinokulasi dengan Bacillus cereus DA 5.2.3 (C) Media lipid yang diinokulasi dengan Pseudomonas aeruginosa

Gambar 1 menunjukkan adanya perubahan warna pada media lipid yang diinokulasikan dengan Bacillus cereus DA 5.2.3 (Gambar B) dan Pseudomonas aeruginosa (Gambar C) bila dibandingkan dengan media lipid yang tidak diinokulasikan dengan Bacillus cereus DA 5.2.3 dan Pseudomonas aeruginosa (Gambar A). Hal ini terjadi akibat perubahan warna indikator Methyl red yang diteteskan pada media lipid dari berwarna merah menjadi kuning. Adanya perubahan pH yang terjadi di media lipid yang bersifat asam menjadi netral akibat aktivitas enzim lipase memungkinkan perubahan warna dari Methyl red dimana rentang pH dari indikator ini berkisar antara 4,4 - 6,5 (Braun, 1982) dengan

14

perubahan warna yang terjadi dari merah menjadi kuning (Solano dan Soto, 2011). Berdasarkan penelitian yang dilakukan Mohan dan Palavesam (2012) enzim lipase yang dihasilkan Bacillus cereus yang diisolasi dari saluran pencernaan udang memiliki aktivitas yang paling tinggi pada pH 7. Hal ini mengindikasikan adanya enzim lipase yang dihasilkan Bacillus cereus DA 5.2.3 untuk mendegrasikan minyak ikan yang terkandung di dalam media lipid menjadi asam lemak dan memungkinkan terjadinya perubahan pH yang terjadi. Menurut Sulistiyo dan Handayani (2000), reaksi pemecahan trigliserida pada suatu substrat lipid mampu menghasilkan asam lemak jenuh maupun tak jenuh seperti olaet, linoleat dan linolenat serta gliserol yang mampu dimanfaatkan pada tahap pembuatan sabun. Asam lemak dan gliserol yang terurai dimanfaatkan oleh bakteri sebagai sumber karbon sehingga media yang bersifat asam karena adanya kandungan lipid mengalami perubahan pH sehingga pH menjadi naik.

Enzim lipase mampu melakukan reaksi penguraian trigliserida menjadi senyawa monogliserida tidak hanya berdampak pada pemecahan molekul gugus fungsinya tetapi juga terjadi perubahan pH sebagai hasil produk dari hasil reaksi tersebut. Ketika proses penyesuaian kondisi media bagi aktivitas enzimatik menjadi optimal, sehingga terjadi proses penguraian trigliserida yang diikuti pembentukan asam lemak yang diperlukan untuk sintesis ester asam lemak (Sulistyo, et al., 2000; Herawan dan Eka, 1996).

Media dengan substrat minyak ikan dalam beberapa penelitian merupakan nutrisi yang paling sesuai sebagai sumber nutrisi bagi kelompok Bacillus.. Selvamohan et al. (2012) menguji kemampuan enzim lipase yang dihasilkan Bacillus amyloliquefaciens di media dengan kandungan berbeda, yaitu: glicerol, minyak zaitun, minyak kelapa dan minyak ikan. Kemampuan aktivitas enzim yang paling tinggi didapatkan pada media dengan substrat minyak ikan dengan nilai aktivitas sebesar 0.10 μg/ml/min selama inkubasi 48 jam. Menurut Abraham (2003), minyak ikan merupakan penyusun utama dan sumber lemak paling penting di pakan udang. Minyak ikan diekstrak dari minyak sarden, limfa hiu, dan ikan yang lain digunakan sebagai polyunsaturated fatty acids (PUFA) yang baik. Beberapa penelitian pernah dilakukan untuk menguji subtrat yang paling baik digunakan oleh Bacillus untuk memproduksi enzim lipase. Berdasarkan penelitian

15

yang dilakukan Mohan dan Palavesam (2012), enzim lipase yang diisolasi dari Bacillus cereus asal saluran pencernaan udang memiliki aktivitas tertinggi pada media dengan substrat minyak kelapa dan minyak ikan.

4.2 Kemampuan Pertumbuhan Bacillus cereus DA 5.2.3 Pada Media Pakan Udang

Bacillus cereus DA 5.2.3 mampu menghasilkan enzim lipase yang diujikan di media lipid sehingga dilanjutkan dengan uji kualitatif di media pakan udang. Bacillus cereus DA 5.2.3 yang diinokulasikan ke media pakan dan diinkubasi selama 2 hari mampu tumbuh yang ditunjukkan pada gambar berikut.

Gambar 2. Pertumbuhan Bacillus cereus DA 5.2.3 Pada Media Pakan Udang Pada suhu 30 0C, selama 2 hari

Dari gambar 2 dapat dilihat adanya pertumbuhan koloni bakteri Bacillus cereus DA 5.2.3 di media pakan udang. Pertumbuhan koloni bakteri tersebut terjadi dengan cukup padat dikarenakan sumber nutrisi untuk pertumbuhan dari bakteri Bacillus cereus DA 5.2.3 telah terpenuhi dari pakan udang tersebut. Uji awal ini dilakukan untuk memastikan bahwa Bacillus cereus DA 5.2.3 mampu tumbuh di media pakan udang juga sekaligus menjadi indikasi bahwa bakteri ini mampu memanfaatkan pakan udang sebagai sumber nutrisinya. Pakan udang tersusun atas senyawa organik diantaranya protein sebagai penyusun paling besar serta lemak dan karbohidrat. Lemak merupakan penyusun kedua terbesar di pakan udang (Patawi, 1996). Berdasarkan kandungan nutrisi yang terkandung di dalam pakan udang tersebut maka pertumbuhan koloni bakteri akan besar.

16

Pakan udang tersusun atas beberapa senyawa organik. Protein merupakan komponen nutrisi terbesar di pakan udang pada umumnya dengan kandungan sebesar 30-45% dan umumnya kaya akan asam amino esensial. Lemak memiliki kandungan sebesar 6-10% yang kaya akan polyunsaturated fatty acids (PUFA). Kandungan lipid di dalamnya juga terdapat phospolipid, lecitin dan kolestrol. Karbohidrat seperti disakarida (sukrosa) dan polisakarida (pati) merupakan komponen pelengkap di pakan udang. Selulosa memiliki kandungan kurang dari 6% (Abraham, 2003).

Menurut Mongkolthanaruk dan Dhamsthiti (2002), kombinasi dari Bacillus sp. dan Pseudomonas aeruginosa mampu menurunkan kandungan lemak di dalam air dari 20.000 mg/L menjadi < 20 mg/ml dalam waktu 12 hari. Masing-masing bakteri ini telah dikenal mampu menjadi agen bioremidiasi di perairan (Badjoeri et al., 2008). Sharma et al. (1999) menyatakan bahwa genus Bacillus mampu berkompetisi dengan flora yang ada di perairan tambak serta mampu mendegradasikan pakan udang secara efektif.

Bacillus cereus mampu menghasilkan enzim lipase pada beberapa substrat media. Berdasarkan penelitian Mohan dan Palavesam (2012) media dengan subtrat minyak kacang tanah, minyak dari pembuatan kue, minyak kelapa dan minyak ikan memiliki aktivitas enzim lipase yang berbeda. Berdasarkan nilai aktivitasnya, enzim lipase menunjukkan nilai yang cukup tinggi dimana nilai aktivitas tertingginya terdapat pada minyak ikan sebesar 0,063 U/ml

4.3 Rata-rata Pertumbuhan Koloni Bacillus cereus DA 5.2.3 di Media Pakan Udang Pada Konsentrasi yang Berbeda

Bacillus cereus DA 5.2.3 lalu diuji pertumbuhannya di media pakan udang dengan konsentrasi yang berbeda. Bacillus cereus DA 5.2.3 yang ditotolkan di media pakan menunjukkan pertumbuhan koloni yang berbeda. Pertumbuhan koloni tersebut dapat dilihat pada gambar berikut.

17

Gambar 2. (A) Koloni Bacillus cereus DA 5.2.3 pada suhu 300 C dan waktu inkubasi 2 hari pada media pakan udang: (A1) 1%, (A2) 2%, (A3) 3% dan (B) Koloni Pseudomonas aeruginosa: (B1) 1%, (B2) 2%, (B3) 3%

Gambar 3 menunjukkan pertumbuhan koloni dari 2 bakteri, yaitu: Bacillus cereus DA 5.2.3 dalam konsentrasi yang berbeda, yaitu: 1%, 2% dan 3%. Pertumbuhan Bacillus cereus DA 5.2.3 di media pakan yang paling besar yaitu pada konsentrasi 3%, 2% dan paling kecil 1%. Pertumbuhan Pseudomonas aeruginosa yang dijadikan kontrol positif juga memiliki pertumbuhan maksimal yang sama dengan Bacillus cereus DA 5.2.3 yaitu pada konsentrasi 3%. Uji ini dilakukan dengan perlakuan yang sama yaitu pada temperatur 300C selama inkubasi 48 jam. Berdasarkan hasil yang diperoleh isolat bakteri Bacillus cereus DA 5.2.3 mampu menghasilkan enzim degradasi yang dapat menguraikan pakan udang yang terkadung di dalam media sebagai sumber nutrisinya.

A1

B1 B2 B3

18

Tabel 1. Rata-rata Diameter Koloni Bacillus cereus DA 5.2.3 pada Media Pakan Udang

Konsentrasi Pakan (%)

Diameter Koloni yang Terbentuk (cm)

Bacillus cereus DA 5.2.3 Pseudomonas aeruginosa (Kontrol Positif)

1 1,6 0,96

2 3,4 1,34

3 4,7 5,53

Dari Tabel 1 dapat dilihat pertumbuhan maksimal dari Bacillus cereus DA 5.2.3 di media pakan dalam konsentrasi yang berbeda. Pertumbuhan Bacillus cereus DA 5.2.3 paling besar terdapat di media pakan konsentrasi 3% dengan diameter koloni 4,7 cm sementara pertumbuhan yang paling kecil terdapat di media pakan 1% dan 2% dengan diameter koloni 1,6 dan 3,4 cm. Pertumbuhan Pseudomonas aeruginosa yang paling besar terdapat di media pakan udang dengan konsentrasi 3%. Bila dibandingkan pertumbuhan antara Bacillus cereus DA 5.2.3 dan Pseudomonas aeruginosa maka pertumbuhan yang paling baik yaitu terdapat pada bakteri Bacillus cereus DA 5.2.3 . Hal ini menunjukkan bahwa media dengan konsentrasi lebih besar sampai konsentrasi tertentu mampu menyediakan nutrisi untuk pertumbuhan koloni bakteri sehingga pertumbuhan Bacillus cereus DA 5.2.3 lebih cepat. Adanya kandungan lipid di dalam media pakan mampu memicu koloni bakteri menghasilkan enzim pemecah molekul senyawa organik di media pakan sehingga bakteri mampu memanfaatkannya dengan lebih mudah dalam hal ini yaitu enzim lipase.

Beberapa penelitian tentang pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas enzim lipase pernah dilakukan. Solano dan Sato (2011) melakukan penelitian terhadap konsentrasi substrat lipid maksimum dalam menghasilkan enzim lipase. Penelitian tersebut menggunakan 3 isolat bakteri yaitu Bacillus sp., Pseudomonas dan Staphylococcus pada media minyak ikan dengan konsentrasi 6, 7,5 dan 10% dan enzim lipase yang paling maksimum dihasilkan pada media lipid dengan kandungan 10%. Ghori, et al. (2011) melaporkan bahwa konsentrasi p-nitrophenyl laurate (pNPL) 3,5 - 5,05 mM merupakan konsentrasi optimum untuk lipase dengan nilai nilai 0.416 µM/ml. Menurut penelitian yang dilakukan Mohan dan Palavesam (2012), konsentrasi substrat yang divariasikan yaitu: 0,5, 1,

19

1,5 dan 2% memiliki aktivitas tertinggi di konsentrasi 1%. Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi substrat yang maksimum terkadang tidak selalu mendukung pertumbuhan bakteri dimana untuk menguraikan nutrisi di dalam substrat tersebut bakteri menghasilkan enzim. Hal ini dikarenakan faktor-faktor lingkungan misalnya: suhu, pH dan salinitas yang mempengaruhi aktivitas enzim tersebut.

Subtrat memiliki beberapa fungsi yang akan berubah sesuai lingkungan dan akan mempengaruhi kerja mikroorganisme dalam menghasilkan enzim. Scopes (2002) menyatakan konsentrasi suatu substrat merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi aktivitas suatu enzim. Selain konsentrasi substrat faktor lain yang mempengaruhi aktivitas enzim yaitu pH, ikatan ion, dan kehadiran garam serta temperatur.

Penelitian tentang pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas enzim lipase dari bakteri lain juga pernah dilakukan. Anggiani (2008) melakukan penelitian terhadap pengaruh konsentrasi enzim lipase yang diisolasi dari Pseudomonas aeruginosa terhadap kandungan subtrat minyak zaitun sebesar 2,5 g. Hasil yang didapatkan yaitu enzim lipase yang semakin besar akan lebih mempercepat reaksi terhadap degradasi minyak zaitun dimana hal ini sebanding dengan pertumbuhan koloni di suatu substrat. Pertambahan koloni di suatu substrat dapat berakibat dengan bertambahnya enzim degradatif suatu mikroba sehingga substrat akan lebih mudah dijadikan sebagai nutrisi.

4.4 Analisis Kadar Asam Lemak Bebas dengan Metode Uji Titimetri

Uji aktivitas enzim lipase dapat dilakukan dengan mengukur kadar asam lemak bebas sebagai produk reaksi enzim terhadap substrat. Setelah didapatkan ekstrak kasar enzim lipase maka dilanjutkan dengan metode perhitungan kadar asam lemak bebas metode titrasi. Titrasi dilakukan dengan menggunakan larutan NaOH 0,01N setelah diteteskan indikator phenolftalein. Volume titrasi yang terpakai lalu dihitung dengan rumus kadar asam lemak bebas dengan hasil sebagai berikut.

20

Tabel 2. Kadar Asam Lemak Bebas dengan Metode Titimetri

Kandungan Pakan (g/ 5

ml)

Kadar Asam Lemak Bebas Salinitas

0 ‰ 5 ‰ 10 ‰ 15 ‰ 20 ‰ 25‰

1 0,25% 0,17% 0,13% 0,11% 0,11% 0,11%

2 0,08% 0,06% 0,05% 0,04% 0,03% 0,03%

3 0,03% 0,04% 0,03% 0,03% 0,02% 0,02%

Tabel 2 memperlihatkan persentase asam lemak bebas yang dihasilkan selama proses titrasi. Hasil tersebut didapatkan dari hasil konversi volume titrasi yang didapatkan (volume titrasi dilihat di Lampiran 5) sehingga didapatkan hasil dalam bentuk persen kadar asam lemak bebas (hasil perhitungan dapat dilihat di Lampiran 6). Hasil yang didapatkan yaitu konsentrasi asam lemak bebas yang terbesar terdapat pada perlakuan kontrol yaitu 0‰ dan pada konsentrasi pakan sebesar 1 g/ 5 ml sebesar 0,25% sedangkan pada kandungan pakan udang yang meningkat yaitu 2 dan 3 g/ 5 ml kadar asam lemak bebas menurun yaitu sebesar 0,08 dan 0,03%. Kadar asam lemak bebas pada perlakuan salinitas terbesar terdapat pada konsentrasi salinitas 5‰ dimana pada kandungan pakan udang 1 g/ 5 ml kadar asam lemak bebas yang didapat sebesar 0,17 sedangkan pada pakan udang 2 dan 3 g/ 5 ml sebesar 0,06 dan 0,04%. Kadar asam lemak bebas terkecil terdapat pada konsentrasi salinitas 20 dan 25‰ dimana kadar asam lemak bebas yang terurai yaitu pada pakan 1 g/ 5 ml sebesar 0,11% sedangkan pada pakan udang 2 dan 3 g/ 5 ml yaitu sebesar 0,03 dan 0,02%.

Terdapatnya asam lemak bebas menunjukkan bahwa enzim lipase mampu menguraikan lemak di dalam pakan udang dalam besaran tertentu. Enzim lipase yang dihasilkan bakteri Bacillus cereus DA 5.2.3 memiliki aktivitas enzim yang rendah pada kadar salinitas yang tinggi. Hal ini menunjukkan bahawa enzim lipase tersebut lebih baik digunakan pada kondisi konsentrasi salinitas yang rendah.

4.4.1 Grafik Kadar Asam Lemak Bebas Metode Titimetri

Enzim lipase yang dihasilkan Bacillus cereus DA 5.2.3 memiliki aktivitas yang menurun pada kondisi substrat dan salinitas yang berbeda. Berikut merupakan

21

grafik yang menunjukkan perbedaan asam lemak yang dibebaskan oleh enzim lipase pada konsentrasi substrat dan salinitas yang berbeda.

Gambar. Penentuan Kadar Asam Lemak Bebas Metode Titimetri Gambar 4. Grafik Aktivitas Enzim Lipase Metode Titimetri

Berdasarkan Gambar 4 persen kadar asam lemak bebas yang terbesar terdapat pada perlakuan kontrol/ tanpa penambahan garam sementara pada perlakuan salinitas, persen kadar asam lemak bebas paling besar terdapat pada salinitas 5‰. Anggriani (2008) menyatakan bahwa kadar asam lemak bebas tertinggi dari Pseudomonas aeruginosa pada substrat 2,5 g dengan volume 2 ml yaitu sebesar 0,0959%. Enzim lipase yang dihasilkan oleh Bacillus cereus DA 5.2.3 bila dibandingkan dengan penelitian tersebut pada substrat dan kondisi yang sama memiliki kemampuan yang baik dalam mendegradasi pakan udang. Persen kadar asam lemak bebas yang paling kecil terdapat pada konsentrasi salinitas 20‰. Mohan dan Palavesam (2012) melaporkan bahwa enzim lipase yang dihasilkan oleh Bacillus cereus yang berasal dari saluran pencernaan udang memiliki aktivitas tertinggi pada media substrat minyak ikan sebesar 0,062 U/ml/menit sedangkan di media substrat minyak kelapa sebesar 0,057 U/ml/menit. Enzim lipase yang dihasilkan oleh bakteri Bacillus cereus DA 5.2.3 cenderung memiliki aktivitas tertinggi pada kondisi tidak adanya garam. Hal ini menunjukkan bahwa enzim lipase tersebut kurang baik digunakan pada perairan tambak dengan kadar

%

K

ada

r A

sam

L

em

ak

B

eba

s

0‰ 5‰ 10‰ 15‰ 20‰ 25‰ Konsentrasi Salinitas

22

salinitas yang tinggi. Sehingga enzim lipase ini sebaiknya digunakan pada perairan tambak yang memiliki kadar salinitas yang mendekati normal pada kisaran 0-5‰. Hal ini diduga bahwa kadar garam yang terkandung di dalam air terionisasi sehingga mampu mengikat enzim yang tersusun atas asam amino yang bersifat polar dan non polar yang mengakibatkan terganggunya aktivitas enzim tersebut. Berdasarkan penelitian yang dilakukan Gaur et al. (2012), enzim lipase dari Bacillus sp. yang diidolasi dari tanah memiliki aktivitas enzim tertinggi di kadar salinitas 0,5% sedangkan pada salinitas 0,7% aktivitas enzim lipase mengalami penurunan yang cukup besar. Sedangkan penurunan aktivitas pada penambahan pakan udang 1, 2 dan 3 g/ 5 ml diduga bahwa kandungan mineral yang terkandung di dalam pakan udang tersebut. Kandungan di dalam mineral di pakan udang tersebut akan terurai menjadi ion logam yang bermuatan positif yang dapat menghambat aktivitas enzim lipase.

Muatan positif ion logam akan menetralkan muatan-muatan negatif pada seluruh permukaan enzim, dan kelebihan muatan positif akan mengakibatkan saling tolak menolak antarmuatan sejenis. Muatan positif logam yang berlebih, akan memasuki sisi aktif enzim dan berikatan dengan residu-residu asam amino yang ada. Muatan-muatan positif ion logam cenderung terikat pada sisi aktif, karena residu asam amino pada sisi aktif bersifat lebih nukleofilik. Ion logam akan menetralkan residu asam amino pada sisi aktif dengan membentuk ikatan kovalen koordinasi. Sifat nukleofilik sisi aktif akan berkurang, sehingga hanya ada beberapa sisi aktif yang dapat berikatan dengan substrat, yaitu sisi aktif yang tidak terinhibisi oleh ion logam. Hal ini menyebabkan pembentukan kompleks enzim substrat (ES) menjadi lambat dan berkurang, sehingga produk yang dihasilkan sedikit dan aktivitasnya menurun. Penghambatan ini termasuk jenis penghambatan kompetitif, maka akan terbentuk dua kompleks yang terjadi yaitu kompleks enzim substrat (ES) dan enzim inhibitor (EI), disatu pihak aktif dan di lain pihak tidak aktif (Shahib, 1992).

Enzim membutuhkan cairan yang seimbang di sekitar molekulnya. Ketika adanya perubahan di sekitar struktur enzim misalnya adanya protein yang rusak akibat tekanan osmotik di lingkungan yang tinggi maka aktivitasnya akan

23

berkurang hingga mampu merusak enzim itu sendiri, menghilangkan bagian sisi aktif dari enzim hingga menghilangkan aktivitasnya (Ventura et al., 2012),

Efek penghambatan pada kadar salinitas NaCl di atas 2,4% w/v ditemukan lebih besar pada biodegradasi senyawa aromatik dan fraksi polar daripada fraksi sejenis dari hidrokarbon petroleum. Berdasarkan penelitian yang dilakukan Kapley et al. (1991), enzim lipase yang diisolasi dari bakteri heterothrofil mampu menunjukkan aktivitas yang tinggi pada kadar garam yang tinggi. Salah satu bakteri heterothrofil yang didapatkan yaitu dari genus Pseudomonas mampu menghasilkan enzim lipase yang memiliki aktivitas tinggi pada kadar salinitas sebesar 6% w/v (Mille et al., 1991)

Kadar garam (salinitas) yang selalu berubah ini akan mempengaruhi kerja enzim lipase di perairan. Pada konsentrasi NaCl 7,0 mM lipase menunjukkan aktivitas yang maksimum, tetapi kemudian menurun. Garam kalsium juga meningkatkan aktivitas lipase dan membantu meningkatkan daya tahan enzim tersebut terhadap panas (Winarno, 1986).

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan Tehrani et al. (2006), pada perlakuan beberapa konsentrasi salinitas, yaitu:0, 1, 2, 3 dan 5% aktivitas enzim lipase tertinggi terdapat pada salinitas 0% dan 1% sementara yang terendah pada salinitas 5%. Salameh dan Wiegel (2007) menyatakan kebanyakan enzim lipase yang dihasilkan bakteri halofilik tidak memiliki nilai aktivitas tinggi pada kadar salinitas yang tinggi. Menurut Scopes (2012) ada hubungan yang kompleks antara respon enzim terhadap suatu kadar salinitas. Beberapa enzim memiliki aktivitas yang tinggi pada salinitas yang rendah, sementara enzim yang lain membutuhkan kadar tertentu dari salinitas untuk mencapai aktivitasnya yang maksimum. Kebanyakan enzim mengalami hambatan pada kadar salinitas tinggi (> 0,5 mol/l). Kebanyakan enzim memiliki aktivitas yang berbeda terhadap kadar salinitas tertentu, sehingga tingkat nilai yang berubah harus selalu diingat. Kadar salinitas yang umum ada di intraseluler sel mikroba yaitu 0,15 sampai 0,2 mol/l .

24

4.4.2 Pengaruh Lama Penyimpanan Enzim Lipase Terhadap Aktivitasnya Metode Titimetri

Persen kadar asam lemak bebas terbesar terdapat di konsentrasi salinitas 0‰ (kontrol) dan pada pakan 1 g/ 5 ml dan dilanjutkan dengan pengaruh lama penyimpanan enzim lipase terhadap aktivitasnya. Enzim lipase yang telah disimpan selama interval 0, 1, 2, 3, 4 dan 5 jam lalu diuji kemampuannya dalam menguraikan asam lemak bebas.

Tabel 3. Kadar Asam Lemak Bebas Pada Pakan 1 g, Salinitas 0‰ dan Suhu 4 0C dengan Metode Titimetri

Kadar Asam Lemak Bebas Interval (Jam)

0 (awal inkubasi) 1 2 3 4 5

0,25% 0,28% 0,28% 0,31% 0,31% 0,31%

Tabel 3 menunjukkan bahwa aktivitas enzim lipase setelah penyimpanan selama interval waktu 0, 1, 2, 3, 4 dan 5 jam pada suhu 4 0C tidak terlalu menunjukkan perubahan. Pada awal inkubasi kadar asam lemak bebas yang didapatkan yaitu 0,21%, jam ke-1 0,28%, jam ke-2 0,28%, jam ke-3, ke-4 dan ke-5 sebesar 0,31%. Aktivitas enzim lipase setelah penyimpanan 24 jam juga tidak menunjukkan penurunan (data tidak dilampirkan). Berdasarkan hasil ini maka dapat disimpulkan bahwa enzim lipase yang dihasilkan oleh bakteri Bacillus cereus DA 5.2.3 relatif stabil. Hal ini dapat disebabkan bila enzim lipase disimpan pada suhu rendah dalam waktu tertentu maka akan tetap mempertahankan kondisi enzim dari perubahan suhu yang dapat berakibat pada kerusakan struktur enzim. Sehingga diharapkan enzim ini tidak akan rusak apabila disimpan dalam waktu yang lama apabila disimpan dalam temperatur yang rendah (dalam penelitian ini menggunakan suhu penyimpanan 4 0C selama 5 jam).

Penyimpanan enzim dalam suhu rendah selama ini diketahui mampu mempertahankan aktivitasnya. Menurut penelitian yang dilakukan oleh Utarti, et al. (2009) lama penyimpanan dari enzim lipase yang dihasilkan oleh Bacillus sp. 31 pada suhu 60 0C adalah 4 jam. Setelah 6 jam aktivitas menunjukkan penurunan yang drastis. Lipase dari Bacillus sp. 31 juga diuji pada penyimpanan di suhu pendingin dimana hasil yang didapatkan yaitu enzim lipase tidak menunjukkan

25

perubahan aktivitas setelah penyimpanan selama 12 jam. Dvya dan Jayavardhanan (2010) melakukan penelitian terhadap bakteri yang diisolasi di lambung kambing. Mereka mengisolasi enzim lipase yang dihasilkan oleh bakteri dari kambing tersebut lalu diuji dengan perlakuan pengaruh lama penyimpanan serta pada perbedaan suhu 25, 4 dan -20 0C. Didapatkan hasil bahwa enzim dari bakteri lambung kambing tersebut stabil pada suhu 4 dan -20 0C sementara pada suhu 25 0

C mengalami penurunan. Hal ini diduga enzim tersebut dinonaktifkan pada suhu rendah dan mengalami kerusakan pada temperatur normal (25 0C).

26

BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Kesimpulan dari penelitian ini, yaitu:

1. Berdasarkan pertumbuhan Bacillus cereus DA 5.2.3 di media pakan udang dengan konsentrasi berbeda, pertumbuhan yang paling besar terdapat pada pakan udang 3 gram.

2. Aktivitas enzim lipase yang paling maksimum terdapat pada perlakuan salinitas kontrol (0‰) dan pakan udang 1 g/ 5 ml dengan nilai kadar asam lemak bebas yang didapat yaitu 0,25%.

5.2 Saran

Sebaiknya dilakukan penelitian yang lebih lanjut tentang karakterisasi protein enzim yang diisolasi dari Bacillus cereus DA 5.2.3 dan aktivitas enzim lipase pada media lipid yang murni.

DAFTAR PUSTAKA

Abraham, M. 2003. Shrimp Nutrition and Feed Technology. Kakdwip Research Centre of CIBA: West Bengai: 55-56

Alford JA, Steinle E. 1966. Improved Plating Method for the Determination of Microbial Lipolysis. Abstrs. 66th Annual Meeting for Microbiology. California: Los Angels: 34

Anggriani, S. 2008. Pengaruh Konsentrasi Induser Dan Penambahan Kofaktor Enzim Terhadap Produksi Ekstrak Kasar Enzim Lipase Ekstraseluler Oleh Pseudomonas Aeruginosa. Skripsi: 17-20

Atlas, R.M. and Bartha, R. 1987. Micro-bial Ecology, Fundamentals and Appli-cation, 2nd edition. The Benjamin/ Cumming publishing Company, Inc. Menlo Par, California: 19-21

Braun, R. 1982. Introduction to Chemical Analysis. New York: McGraw-Hill Book Company: 12-13

Badjoeri, M., Haryani, G., Widiyanto, T., Riyanto, W., Rusmana, I. dan Indarwati, V. 2006. Pemanfaatan Bakteri Nitrifikasi dan Denitrifikasi untuk Bioremediasi Senyawa Metabolit Toksik di Tambak Udang. Laporan Tahunan. Program Penelitian dan Pengembangan Iptek - Riset Kompetitif LIPI. DIPA Biro Perencanaan dan Keuangan LIPI dan Puslit Biologi LIPI. Bogor: 22-24

Boyd, 1982. Water Quality Management for Pond Fish Culture. Development in Aquaculture and Fisheries Science.Elseioser. Journal of Fisherman.2(9): 7-8

Brockman, H. 1984. General Features of Lipolysis. In “Lipases”. Brogstrom B, Brockman H.L. Amsterdarm: Elsevier: 11-13

Cholik, F. 1997. Prospek Pengembangan Usaha Perikanan. Seminar Agribisnis Pembangunan Pertanian Menyongsong Era Globalisasi. Bogor: 15.

Citroreksoko, P. 1996. Pelatihan dan Lokakarya Peranan Bioremediasi dalam Pengelolaan Lingkungan. Pusat Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi-LIPI. Cibinong: 25-28

Divya, P dan Jayavardhanan, K. 2010. Effect Of Temperature And Storage Time On Hepatobiliary Enzyme Activities from Microorganism In Goat Serum. Journal of Veterinary World. 3(6): 277-279

28

Edhy, W.A., Azhary, K., Pribadi, J., Chaerudin, M. 2010. Budidaya Udang Putih. Jakarta: CV. Mulia Indah: 34-36

Effendi, H. 2003. Telaah Kualitas Air. Bagi Pengelolaan Sumberdaya dan Lingkungan Perairan. Kanisius. Yogyakarta: 26-27

Effendi, I. 1998. Prospek Bioteknologi Bakteri laut. Dalam : Strategi Pembangunan Perikanan dan Kelautan Nasional dalam meningkatkan Devisa Negara (FELIATRA, ed.) Universitas Riau Press, Riau, Indonesia: 225

Faiz, O., Saghlam, N., Colak, A., Canakci, S., and Belduz, A.O. 2007. Determination and Characterization of Thermostable Esterolytic Activity from a Novel Thermophilic Bacterium Anoxybacillus gonensis A4. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 2(5): 30-31

Gaur, D. Jain, P. Sisodia Y. Bajapai, V. Estimation Of Extracellular Lipolytic Enzyme Activity By Thermophilic Bacillus Sp. Isolated From Arid And Semi-Arid Region Of Rajasthan, India. Journal of Enviromental Microorganism. 2 (2): 32

Ghori, M., Iqbal, M., Hameed, A. 2011. Characterization Of A Novel Lipase From Bacillus Sp. Isolated From Tannery Wastes: Journal of Enzyme. 1(3): 42-44

Gupta, R., Gupta, N., and Rathi, P. 2004. Bacterial Lipases an Overview of Production, Purification and Biochemical Properties. Journal of Application Microbiology. Biotechnology. 6(4): 763-781.

Handayani R dan Sulistyo J. 2005. Transesterifikasi Ester Asam Lemak melalui Pemanfaatan Teknologi Lipase. Jurnal Biodiversitas. 6 (2): 34-35

Hemphill H. 2006. The Genus Bacillus-Nonmedical. Nucleotide sequence of the Bacillus subtilis tryptophon operon gene: 34

Herawan, T. dan N. Eka. 1996. Hidrolisis minyak sawit menggunakan lipozyme dari Mucor miehei. Jurnal Penelitian Kelapa Sawit. 4 (2): 35

Jamilah, I. 2011. Penapisan Bacillus dan Karakterisasi Protease dan Amilase Ekstraseluler yang Dihasilkan Untuk Degradasi Sisa Pakan. Disertasi. Sekolah Pasca Sarjana. Institut Pertanian Bogor: 40-42

Joseph, B. , P.W. Ramteke, G.Thomas, and N. Shrivastava. 2007. Standard Review Cold-active microbial Lipases: a versatile tool for industrial applications. Journal of Biotecnology and Molecular Biology Review. 2 (2): 38

29

Law A.T., 1988. Water quality requiremens for Penaeus monodon culture. In: Proceeding of the Seminar on Marine Prawn Farming in Malaysia. Malaysia Fisheries Sosiety, Malaysia: 48-50

Lestari P, Handayani S. 2009. Sifat-Sifat Biokimiawi Ekstrak Kasar Lipase Ekstraseluler Dari Bakteri Azospirillum Sp. Jg3. 4 (2): 30-32

Macrae A. 1983. Extracelluler Microbial Lipases. In W.M. Forgatty. Microbial Enzyme and Biotechnology. London: Appl. Scie. Publ: 25

Mille G, Almallah M, Bianchi M, Wambeke F van, Bertrand JC (1991) Effect of salinity on petroleum biodegradation. Journal of Analysis Chemistry. 3(4): 32

Mohan T dan Palavesam A. 2012. Optimization of Lipase by Bacillus Cereus Isolated From Fish Gut. International Conference on Biological and Life Sciences IPCBEE. Singapore. Journal of oceanology singapore. 3(4): 29 Mongkolthanaruk, W dan Dhamsthiti, S. 2002. Biodegradation of lipid-rich

wastewater by a mixed bacterial consortium, Mahidol University, Salaya: Thailand. Journal of Microbiology. 2 (3): 40-41

Muchtadi D, Palupi N, Astawan M.1992. Enzim Dalam Industri Pangan. Bogor: IPB, PAU: 37-38

Murkherjee K, Hills M. 1994. Lipases from Plant. In Lipases: Their structure, Biochemistry and Aplication. Whooley P, Petersen SB. Cambridge University. hlm: 43

Pelczar M dan Chan E. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI Press. hlm: 67-68

Pelczar M dan Reid R. 1958. Microbiolgy. MC Grawhill Book Company, Inc. London. hlm: 103

Poernomo, A. 1988. Pembuatan Tambak Udang di Indonesia, Departemen Pertanian, Balit. Perikanan Budidaya Pantai, Maros: 45-48

Reetz, M. 2002. Lipases as Practical Biocatalyst. Current Opinion in Chemical Biology. Jornal of Biochemistry. 2(6): 35

Salameh, M dan Wiegel, J. 2007. Advanced in Applied Microbiology. Georgia. Journal of Enviromental Diversity. 3 (6): 624

Scopes, R. 2000. Enzyme Activity and Assays. Macmillan Publishers Ltd, Nature Publishing Group. Australia. Hlm: 1

Selvamohan, T., Ramadas, V. dan Sathya, T. 2012. Optimization of Lipase Enzyme Activity Produced By Bacillus Amyloliquefaciens Isolated From Rock Lobster Panlirus Homarus. Tamil Nadu, India. Journal of Enviromental Biology. 6 (2): 30-32

30

Shahib, N. 1992, Pemahaman Seluk Beluk Biokimia dan Penerapan Enzim. P. T. Citra Aditya Bakti: Bandung. Hlm: 43

Sharma R, Chisti Y & Banerjee, U.C. 2001, Production, purification, characterization and applications of lipases. Biotech Adv: 19

Siregar, N. 2011. Penentuan pH dan Suhu Optimum Untuk Aktivitas Ekstrak Kasar Enzim Lipase dari Kecambah Biji Jarak Kepyar (Ricinus comumunis L) Terhadap Hidrolisis Minyak Wijen. Skripsi. Medan: Universitas Sumatera Utara: 23-24

Snellman, E.A and R.R. Colwell. 2004. Acinetobacter Lipases: Molecular Biology, Biochemical Properties and Biotechnological Potential. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. Review Paper: 26-28

Solano, J., Soto, J. 2011. The Functional Property Of Bacillus For Shrimp Feeds. Ensenada, Baja California, Mexico. Journal of schrimp. 1(2): 45

Suhartono, M. 1988. Pengantar Biokimia. Bogor: IPB, PAU: 56

Sulistyo, J.,Soeka, Y., and Handayani, R. 2000. Bioprocessing of fatty acid esters by application of enzymatic technology. Prosiding Seminar TTG. Journal of Biodiversitas. 3(6) : 24

Svendsen A. 1994. Sequence Comparison within The Lipase Family. In Lipases, Their structure, Biochemistry and Aplication. Whooley P, Petersen SB. Cambridge University: 15

Tacon, A. 1987. The Nutrition and Feeding of Farmed and Shrimp – A Training Manual 3. Feeding Methods. The Field Document N0. 7/B., FAO-Italy: 35-38

Tehrani, D., Herfatmanesh, A., Dehkordi, F. 2006. Effect of Salinity on Biodegradation of Aliphatic fraction on Crude Oil in Soil. Tehran: Iran. 9 (8): 16-18

Thayib, S. 1982. Mikrobiologi Laut. Lembaga Oseanologi Nasional - LIPI, Jakarta : 246

Utarti, E, Nurita, L, Arimurti, S. 2009. Karakterisasi Lipase Ekstrak Kasar Bacillus sp 31. Jurnal Ilmu Dasar. 1(10): 102 – 108

Ventura, M., Santos, L., Coutinho, J. 2012. Concentration effect of hydrophilic ionic liquids on the enzymatic activity of Candida antarctica lipase B. Journal of Biotechnology. 2 (8): 20

Volk, W. A dan Wheelar, M. 1988. Mikrobiologi Dasar. Erlangga: Jakarta. hlm: 56

31

Widiyanto, T. 2006. Seleksi Bakteri Nitrifikasi dun Denitrifikasi untuk Bioremediasi di tambak Udang. [disertasi]. Institut Pertanian Bogor. 25-26

Winarno, 1986. Enzim Pangan. Jakarta: PT. Gramedia Pustaka Utama. hlm: 42 Wong, H. 2010. Bacillus cereus. Inggris: Soochow University. hlm: 245

Yang, C.H., 1990. Effect of some environmental factors on the growth of the chinese shrimp, Penaeus chinensis. In: K.L. Main and W. Fulk (Eds): The culture of cold-toleran shrimp. Proceeding of an Asian- US Workshop on Shrimp Culture. The Oceanic Inteitut, Honolulu.: 92-101.

Zouaoi, A. 2012. Production, optimization and characterization of the lipase from Pseudomonas aeruginosa. Jurnal of Enzymology. 2(7): 20

LAMPIRAN

Lampiran 1. Bagan Kerja Uji Kualitatif Enzim Lipase

Diremajakan terlebih dahulu untuk mendapatkan hasil yang maksimal di media SWC (Sea Water Complex) padat

Diinokulasikan koloni bakteri Bacillus cereus DA 5.2.3 dan Pseudomonas aeruginosa (kontrol positif) di tengah media pakan lipid

Diinkubasi selama 48 jam

Terjadinya perubahan warna menjadi kuning menunjukkan keberadaan enzim lipase

Lampiran 2. Bagan Kerja Uji Kuantitatif Enzim Lipase

Diinokulasikan ke tengah media pakan udang dengan konsentrasi pakan masing-masing 1,2 dan 3%

Diinkubasi selama 48 jam

Diukur diameter pertumbuhan koloni Bacillus cereus DA 5.2.3 dan Pseudomonas aeruginosa

Hasil

Hasil

33

Lampiran 3. Bagan Kerja Produksi Enzim Lipase dari Bacillus cereus DA 5.2.3

Diinokulasikan ke dalam 20 ml medium NB (sebagai medium fermentasi) dalam Labu Erlenmeyer yang diperkaya dengan minyak ikan

Diinkubasi dalam shaker incubator dengan kecepatan 150 rpm pada suhu ruang selama 72 jam

Dipipet sebanyak 10 ml media hasil penanaman dimasukkan ke dalam tabung sentrifuse

Disentrifuse dengan kecepatan 6000 x g selama 15 menit pada suhu 4 0C.

Didekantasi supernatan yang terbentuk, pelet dibuang

Supernatan mengandung ekstrak enzim lipase kasar akan digunakan pada uji selanjutnya.

2 ml Bacillus cereus DA 5.2.3

Lampiran 4. Bagan Kerja Penentuan Kadar Asam Lemak Bebas pada Konsentrasi dan Salinitas berbeda

1 ml ekstrak kasar enzim lipase

Uji kontrol (salinitas 0‰)

Pakan 1 g + Pospat pH 7 +

Air

Pakan 2 g + Pospat pH 7

+ Air

Pakan 3 g + Pospat pH 7

+ Air

Uji Salinitas Berbeda (5‰, 10‰, 15‰, 20 dan 25‰)

Pakan 1 gr +Pospat pH 7 + Air (Salinitas 5, 10 , 15, 20 dan 25‰)

Pakan 2 gr +Pospat pH 7 + Air (Salinitas 5, 10, 15, 20 dan 25‰)

Pakan 1 gr +Pospat pH 7 + Air (Salinitas 5, 10, 15, 20 dan 25‰)

Didiamkan selama 30 menit

Ditambahkan 25 ml alkohol 96%

Dipanaskan hingga alkohol menguap dan didinginkan

Ditambahkan indikator penolptalein

35

Lampiran 5. Tabel Volume Titrasi Kadar Asam Lemak Bebas

Pakan

Salinitas

0 ‰ 5 ‰ 10 ‰ 15 ‰ 20 ‰ 25 ‰

U1 U2 Rata-rata U1 U2 Rata-rata U1 U2 Rata-rata U1 U2 Rata-rata U1 U2 Rata-rata U1 U2 Rata-rata

1 g 0,9 ml 0,9 ml 0,9 ml 0,6 ml 0,6 ml 0,6 ml 0,5 ml 0,4 ml 0,45 ml 0,4 ml 0,4 ml 0,4 ml 0,4 ml 0,4 ml 0,4 ml 0,4 ml 0,4 ml 0,4 ml

2 g 0,6 ml 0,6 ml 0,6 ml 0,4 ml 0,4 ml 0,4 ml 0,3 ml 0,4 ml 0,35 ml 0.3 ml 0,3 ml 0,3 ml 0,3 ml 0,2 ml 0,25 ml 0,2 ml 0,3 ml 0,25 ml

36

Lampiran 6. Perhitungan % Kadar Asam Lemak Bebas

Pakan 1 g Salinitas 0‰

% Asam Lemak Bebas = x 100% =

1.1000 0,9. 0,01.278 = 0,25%

Salinitas 5‰

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 0,6. 0,01.278 = 0,17%

Salinitas 10‰

% Asam Lemak Bebas = x 100% =

1.1000 0,45. 0,01.278 = 0,13%

Salinitas 15 ‰

% Asam Lemak Bebas = x 100% =

1.1000 0,4. 0,01.278 = 0,11%

Salinitas 20 ‰

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 0,4. 0,01.278 = 0,11%

Salinitas 25 ‰

% Asam Lemak Bebas = x 100% =

1.1000 0,4. 0,01.278 = 0,11%

Pakan 2 g Salinitas 0‰

% Asam Lemak Bebas = x 100% = 0,6. 0,01.278

37

1.1000 = 0,08% Salinitas 5‰

% Asam Lemak Bebas = x 100% =

1.1000 0,4. 0,01.278 = 0,06%

Salinitas 10‰

% Asam Lemak Bebas = x 100% =

1.1000 0,35. 0,01.278 = 0,05%

Salinitas 15‰

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 0,3. 0,01.278 = 0,04%

Salinitas 20‰

% Asam Lemak Bebas = x 100% =

1.1000 0,25. 0,01.278 = 0,03%

Salinitas 25‰

% Asam Lemak Bebas = x 100% =

1.1000 0,25. 0,01.278 = 0,03%

Pakan 3 g Salinitas 0‰

% Asam Lemak Bebas = x 100% =

1.1000 0,35. 0,01.278 = 0,08%

Salinitas 5‰

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 0,4. 0,01.278

38

= 0,04% Salinitas 10‰

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 0,3. 0,01.278 = 0,03%

Salinitas 15‰

% Asam Lemak Bebas = x 100% =

1.1000 0,3. 0,01.278 = 0,03%

Salinitas 20‰

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 0,25. 0,01.278 = 0,02%

Salinitas 25‰

% Asam Lemak Bebas = x 100% =

1.1000 0,25. 0,01.278 = 0,02%

Lampiran 7. Tabel % Kadar Asam Lemak Bebas Pengaruh Lama Penyimpanan Enzim Lipase Terhadap Aktivitasnya

Volume Titrasi Interval (Jam)

0 (waktu awal) 1 2 3 4 5

0,9 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml

Lampiran 8. Perhitungan% Kadar Asam Lemak Bebas Pengaruh Lama Penyimpanan Enzim Lipase Terhadap Aktivitasnya

Waktu awal (0 jam)

% Asam Lemak Bebas = x 100% =

1.1000 0,9. 0,01.278

39

= 0,25% Waktu 1 jam

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 1,0. 0,01.278 = 0,28%

Waktu 2 jam

% Asam Lemak Bebas = x 100% =

1.1000 01,0. 0,01.278 = 0,28%

Waktu 3 jam

% Asam Lemak Bebas = x 100% =

1.1000 1,1. 0,01.278 = 0,31%

Waktu 4 jam

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 1,1. 0,01.278 = 0,31%

Waktu 5 jam

% Asam Lemak Bebas = x 100% =

1.1000 1,1. 0,01.278 = 0,31%

Lampiran 9. Komposisi Nutrisi Di Dalam Pakan Udang

Komposisi Kandungan

Protein 40%

Lemak 15%

Karbohidrat 8%

Abu 30%

40

Lampiran 10. Foto Hasil Penelitian

Hasil uji titrasi pakan 1 g/ 5 ml Hasil uji titrasi pakan 2 g/ 5 ml

Lampiran 5. Tabel Volume Titrasi Kadar Asam Lemak Bebas

Pakan

Salinitas

0 ‰ 5 ‰ 10 ‰ 15 ‰ 20 ‰ 25 ‰

U1 U2 Rata-rata U1 U2 Rata-rata U1 U2 Rata-rata U1 U2 Rata-rata U1 U2 Rata-rata U1 U2 Rata-rata

1 g 0,9 ml 0,9 ml 0,9 ml 0,6 ml 0,6 ml 0,6 ml 0,5 ml 0,4 ml 0,45 ml 0,4 ml 0,4 ml 0,4 ml 0,4 ml 0,4 ml 0,4 ml 0,4 ml 0,4 ml 0,4 ml

2 g 0,6 ml 0,6 ml 0,6 ml 0,4 ml 0,4 ml 0,4 ml 0,3 ml 0,4 ml 0,35 ml 0.3 ml 0,3 ml 0,3 ml 0,3 ml 0,2 ml 0,25 ml 0,2 ml 0,3 ml 0,25 ml

Lampiran 6. Perhitungan % Kadar Asam Lemak Bebas Pakan 1 g

Salinitas 0‰

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 0,9. 0,01.278 = 0,25%

Salinitas 5‰

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 0,6. 0,01.278 = 0,17%

Salinitas 10‰

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 0,45. 0,01.278 = 0,13%

Salinitas 15 ‰

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 0,4. 0,01.278 = 0,11%

Salinitas 20 ‰

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 0,4. 0,01.278 = 0,11%

Salinitas 25 ‰

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 0,4. 0,01.278 = 0,11%

Pakan 2 g Salinitas 0‰

% Asam Lemak Bebas = x 100%

1.1000 = 0,08% Salinitas 5‰

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 0,4. 0,01.278 = 0,06%

Salinitas 10‰

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 0,35. 0,01.278 = 0,05%

Salinitas 15‰

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 0,3. 0,01.278 = 0,04%

Salinitas 20‰

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 0,25. 0,01.278 = 0,03%

Salinitas 25‰

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 0,25. 0,01.278 = 0,03%

Pakan 3 g Salinitas 0‰

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 0,35. 0,01.278 = 0,08%

Salinitas 5‰

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 0,4. 0,01.278

= 0,04% Salinitas 10‰

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 0,3. 0,01.278 = 0,03%

Salinitas 15‰

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 0,3. 0,01.278 = 0,03%

Salinitas 20‰

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 0,25. 0,01.278 = 0,02%

Salinitas 25‰

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 0,25. 0,01.278 = 0,02%

Lampiran 7. Tabel % Kadar Asam Lemak Bebas Pengaruh Lama Penyimpanan Enzim Lipase Terhadap Aktivitasnya

Volume Titrasi Interval (Jam)

0 (waktu awal) 1 2 3 4 5

0,9 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml

Lampiran 8. Perhitungan% Kadar Asam Lemak Bebas Pengaruh Lama Penyimpanan Enzim Lipase Terhadap Aktivitasnya

Waktu awal (0 jam)

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 0,9. 0,01.278

= 0,25% Waktu 1 jam

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 1,0. 0,01.278 = 0,28%

Waktu 2 jam

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 01,0. 0,01.278 = 0,28%

Waktu 3 jam

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 1,1. 0,01.278 = 0,31%

Waktu 4 jam

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 1,1. 0,01.278 = 0,31%

Waktu 5 jam

% Asam Lemak Bebas = x 100%

=

1.1000 1,1. 0,01.278 = 0,31%

Lampiran 9. Komposisi Nutrisi Di Dalam Pakan Udang

Komposisi Kandungan

Protein 40%

Lemak 15%

Karbohidrat 8%

Abu 30%

Lampiran 10. Foto Hasil Penelitian

Hasil uji titrasi pakan 1 g/ 5 ml Hasil uji titrasi pakan 2 g/ 5 ml