Stabilitas Sisipan Kandidat Gen Toleran Aluminium pada Padi Situ Bagendit Hasil Transformasi secara In-Planta
STABILITAS SISIPAN KANDIDAT GEN TOLERAN
ALUMINIUM PADA PADI SITU BAGENDIT HASIL
TRANSFORMASI SECARA IN-PLANTA
FIRDHA JUNITA WIDIASTUTI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul “Stabilitas Sisipan
Kandidat Gen Toleran Aluminium pada Padi Situ Bagendit Hasil Transformasi
secara In-Planta” adalah benar karya saya dengan arahan dari pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, April 2014
Firdha Junita Widiastuti
NIM G34090053
i
ABSTRAK
FIRDHA JUNITA WIDIASTUTI. Stabilitas Sisipan Kandidat Gen Toleran
Aluminium pada Padi Situ Bagendit Hasil Transformasi secara In-Planta.
Dibimbing oleh MIFTAHUDIN dan ARIEF PAMBUDI.
Padi varietas Situ Bagendit (SB) merupakan padi sensitif aluminium (Al)
yang berpotensi untuk dikembangkan dalam usaha ekstensifikasi pertanian karena
dapat ditanam pada lahan kering maupun lahan sawah. Usaha perbaikan sifat
ketahanan terhadap Al dapat dilakukan dengan cara menyisipkan gen toleran
cekaman Al yang salah satunya adalah gen B11, ke genom varietas padi yang
sensitif Al. Transformasi gen B11 secara in-planta pada padi SB telah berhasil
dilakukan dan diperoleh generasi T1. Tujuan penelitian ini adalah mengevaluasi
stabilitas sisipan gen B11 pada generasi T1 dan T2 padi SB hasil infeksi in-planta.
Evaluasi dilakukan melalui penapisan biji padi dengan menggunakan antibiotik
higromisin dengan konsentrasi 20 mg/l, analisis molekuler dengan teknik
Polymerase Chain Reaction (PCR), dan pengamatan fenotipe tanaman. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa gen B11 telah terintegrasi pada tanaman
transgenik SB generasi T1 berdasarkan analisis molekuler dan pengamatan
fenotipe tanaman. Hasil penapisan biji menunjukkan bahwa generasi T2
heterozigot terhadap gen B11.
Kata kunci: Gen B11, Situ Bagendit, Padi transgenik, Toleran Aluminium.
ABSTRACT
FIRDHA JUNITA WIDIASTUTI. Stability of Aluminum Tolerance Gene
Candidate Insertion in Situ Bagendit Rice from In-Planta Transformation.
Supervised by MIFTAHUDIN and ARIEF PAMBUDI.
Situ Bagendit is one of the rice variety that sensitive to aluminum (Al)
toxicity. The variety can be developed to an Al-tolerant variety because it can be
planted in both dry and wet field. The effort to develop Al tolerant varieties could
be done by inserting Al tolerance genes. An Al-tolerance gene, called B11 gene
has been inserted to Situ Bagendit genome by in-planta technique and produced
T1 generation. The research objective was to evaluate the stability of B11 gene
insertion in T1 and T2 generation of rice transgenic SB-16. The evaluation was
done by rice seed selection using hygromycin antibiotic with concentration 20
mg/l, molecular analysis using polymerase chain reaction (PCR) technique, and
plant phenotype observation. The result of this research showed that B11 gene had
been integrated in T1 plant based on molecular analysis and plant phenotype
observation. The result of seed selection showed that T2 generation still
segregated for B11 gene.
Keywords: Aluminum Tolerance, B11 Gene, Situ Bagendit, Transgenic Rice.
ii
STABILITAS SISIPAN KANDIDAT GEN TOLERAN
ALUMINIUM PADA PADI SITU BAGENDIT HASIL
TRANSFORMASI SECARA IN-PLANTA
FIRDHA JUNITA WIDIASTUTI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
iii
iv
Judul Skripsi : Stabilitas Sisipan Kandidat Gen Toleran Aluminium pada Padi
Situ Bagendit Hasil Transformasi secara In-Planta
Nama
: Firdha Junita Widiastuti
NIM
: G34090053
Disetujui oleh
Dr Ir Miftahudin, MSi
Pembimbing I
Arief Pambudi, SSi, MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Iman Rusmana, MSi
Ketua Departemen
Tanggal lulus:
v
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala
rahmatNya sehingga penulisan karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Penelitian
berjudul “Stabilitas Sisipan Kandidat Gen Toleran Aluminium pada Padi Situ
Bagendit Hasil Transformasi secara In-Planta” ini dilaksanakan sejak bulan
Januari 2013 sampai dengan Januari 2014.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr Ir Miftahudin, MSi dan Arief
Pambudi, SSi, MSi selaku dosen pembimbing yang telah memberikan bimbingan
dan ilmu yang bermanfaat selama melaksanakan penelitian dan penulisan karya
ilmiah ini. Terima kasih kepada Dian, Mirna, Childa, Wulan, dan khususnya
Syasti Hastriani yang telah membantu kegiatan penelitian ini.
Semoga karya ilmiah ini dapat memberikan informasi yang berguna dan
bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.
Bogor, April 2014
Firdha Junita Widiastuti
vi
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
METODE
Waktu dan Tempat
Bahan dan Alat
Prosedur Penelitian
HASIL
Verifikasi Sisipan Gen pada Tanaman T0
Analisis Sisipan Gen pada Tanaman T1
Penapisan Biji T1 SB-16-6 dan T2 SB-16-6-1 dengan Antibiotik Higromisin
Segregasi Gen hpt dan Gen B11
Karakter Vegetatif dan Reproduktif Tanaman Generasi T1
PEMBAHASAN
SIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP
vii
vii
1
1
2
2
2
2
2
4
4
5
6
7
8
9
11
12
14
16
vii
DAFTAR TABEL
1 Data hasil penapisan biji Situ Bagendit (SB) transgenik menggunakan
antibiotik higromisin 20 mg/l
8
2 Karakter vegetatif dan reproduktif padi Situ Bagendit (SB) tipe liar dan SB
transgenik (SB-16-6-1)
8
DAFTAR GAMBAR
1
Hasil amplifikasi DNA tanaman T0 SB-16 dengan menggunakan primer yang
didesain dari sekuen promoter 35S CaMV dan gen B11
5
2
Hasil amplifikasi DNA tanaman T1 SB-16 dengan menggunakan primer yang
didesain dari sekuen gen hpt
5
3
Hasil amplifikasi DNA tanaman T2 SB-16-6-1 dengan menggunakan primer
yang didesain dari sekuen promoter 35S CaMV dan gen B11
6
4
Hasil amplifikasi DNA tanaman T1 SB-16-6-1 dengan menggunakan primer
yang didesain dari sekuen gen hpt
6
5
Perbedaan pertumbuhan biji padi SB tipe liar dan biji padi SB transgenik pada
hari ke-9 setelah perlakuan antibiotik higromisin
7
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Padi merupakan sumber makanan pokok bagi sebagian besar penduduk
dunia dan memiliki banyak varietas. Tanaman padi mudah beradaptasi terhadap
berbagai macam kondisi lingkungan, seperti tanah dengan tingkat salinitas tinggi,
tanah alkali atau asam. Tetapi, adaptasi ini bergantung pada varietas padi. Padi
(Oryza sativa L.) adalah tanaman pangan yang dapat ditanam di seluruh dunia,
kultivasi padi pertama kali dilakukan di daerah Asia (OECD 1999). Padi
subspesies indica merupakan padi yang secara umum ditanam di daerah tropis dan
memiliki bulir yang khas, yakni sedikit lonjong, yang membedakannya dengan
subspesies japonica yang berbulir bulat (OECD 1999). Di Indonesia, subspesies
padi yang ditanam didominasi oleh subspesies indica.
Indonesia, sebagai negara yang sebagian besar penduduknya mengonsumsi
nasi, perlu meningkatkan produksi padi sehingga kebutuhan penduduk dapat
terpenuhi. Salah satu usaha untuk meningkatkan produksi pertanian adalah dengan
melakukan ekstensifikasi pertanian dengan cara membuka lahan-lahan pertanian
baru. Akan tetapi, usaha ekstensifikasi ini terkendala karena sekitar 25% luas
daratan Indonesia didominasi tanah masam berupa tanah podzolik merah kuning.
Tanah masam menjadi kendala dalam pertanian karena pada pH kurang dari 5,
unsur Al3+ menjadi larut dan bersifat racun bagi perakaran. Selain itu, pada pH
rendah Al dapat mengikat unsur fosfor yang merupakan komponen penting dalam
pembentukan energi pada tumbuhan (Hock dan Elstner 2005).
Padi varietas Situ Bagendit (SB) merupakan padi gogo yang cocok ditanam
di lahan kering dan di lahan sawah. Padi SB berpotensi menghasilkan 6.0 ton padi
per hektar, dan memiliki kelebihan yakni agak tahan terhadap penyakit blas dan
hawar daun (Suprihatno et al. 2009). Akan tetapi, padi varietas SB sensitif
terhadap cekaman Al (Elvarelza 2013). Salah satu cara untuk mendapatkan
varietas padi yang tahan cekaman Al adalah dengan cara menyisipkan gen toleran
cekaman Al ke genom varietas padi yang sensitif Al. Penelitian Miftahudin (2005)
pada tanaman Rye menunjukkan adanya hubungan sinteni antara kromosom 4RL
Rye dan kromosom 3 padi terkait dengan toleransi terhadap cekaman Al. Studi
selanjutnya yang dilakukan oleh Roslim (2011) dengan menggunakan varietas
Hawara Bunar menunjukkan bahwa daerah B11 memiliki peningkatan ekspresi
saat diberi perlakuan Al.
Daerah B11 yang selanjutnya dinamakan gen B11 berhasil diisolasi dari
padi varietas Hawara Bunar oleh Roslim (2011). Gen B11 ini kemudian disisipkan
ke dalam plasmid pGWB5 dan ditransformasikan ke dalam genom padi.
Transformasi gen B11 melalui infeksi Agrobacterium tumefaciens secara inplanta pada varietas SB yang dilakukan oleh Pambudi (2012) menghasilkan
beberapa nomor tanaman yang positif. Salah satu nomor padi yang menunjukkan
hasil positif adalah SB-16. Karakter padi tersebut harus diuji lebih lanjut dalam
penelitian ini untuk mengetahui stabilitas gen dan pola segregasinya.
2
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mengamati stabilitas insersi gen B11 dan
karakteristik tanaman generasi T1 dari biji SB-16-6 hasil transformasi secara inplanta. Selain itu, penelitian juga dimaksudkan untuk mengetahui pola segregasi
gen B11 pada biji T1 SB-16-6 dan T2 SB-16-6-1.
METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan mulai Januari 2013 sampai dengan Januari 2014 di
Laboratorium Fisiologi dan Biologi Molekular Tumbuhan dan rumah kaca,
Departemen Biologi FMIPA, IPB.
Bahan dan Alat
Bahan tanaman yang digunakan adalah biji padi T1 SB-16-6 hasil
transformasi dengan infeksi Agrobacterium tumefaciens secara in-planta pada
Situ Bagendit (SB) yang dilakukan oleh Pambudi (2012), biji generasi T2 SB 166-1, dan padi Situbagendit tipe liar. Bahan-bahan yang digunakan antara lain
antibiotik higromisin, akuades steril, PCR kit KAPA 2G Fast Readymix, primer
35S Nakajima-F (5’-GAT-GTG-ATA-TCT-CCA-CTG-ACG-TAA-G-3’), primer
B11 check-R (5’-GAA-CGA-TTG-GGC-CTC-TGT-GA-3’), primer HPT-F (5’GAT-GTT-GGC-GAC-CTC-GTA-TT-3’), primer HPT-R (5’-GAT-GTA-GGAGGG-CGT-GGA-TA-3’), agarose (Thermo Scientific), dan etidium bromida
(Biotech). Alat-alat yang digunakan antara lain autoklaf, inkubator, sentrifuse,
waterbath, pipet mikro, mesin PCR (Esco Swift Maxi, Singapura), perangkat
elektroforesis (BIO-RAD, USA), WiseDoc gel-documentation system (Daihan
Scientific, Korea Selatan), dan alat-alat gelas.
Prosedur Penelitian
Verifikasi Sisipan Gen B11 pada Tanaman T0
Verifikasi sisipan gen dilakukan untuk memilih nomor padi yang akan
diseleksi dengan antibiotik higromisin. DNA hasil isolasi dari tanaman T0 yang
dilakukan oleh Pambudi (2012) pada padi SB diuji sisipan gen B11 dengan teknik
PCR menggunakan PCR kit KAPA 2G Fast Readymix, pasangan primer yang
digunakan adalah 35S Nakajima-F dan primer B11 check-R. Sisipan marka hpt
dilakukan dengan menggunakan primer HPT-F dan HPT-R. Nomor padi yang
menunjukkan hasil positif dipilih untuk diseleksi dengan menggunakan antibiotik
higromisin.
3
Penapisan Biji Padi Transgenik SB-16-6 dan SB-16-6-1 dengan Antibiotik
Penapisan biji dilakukan dengan menyeleksi padi menggunakan antibiotik
higromisin mengacu pada metode Yanagisawa et al. (2004) dengan beberapa
modifikasi. Biji padi diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Setelah itu, biji
padi dikupas dan disterilisasi di LAFC. Sterilisasi permukaan biji padi dilakukan
dengan merendam biji pada alkohol 70% selama 10 detik, kemudian direndam
dalam larutan NaOCl 1.5% selama 5 menit. Biji transgenik yang telah disterilisasi
dibilas dengan akuades steril dan diletakkan di dalam cawan petri berisi larutan
higromisin 20 mg/l selama 24 jam pada suhu 40C. Selanjutnya, biji diletakkan di
ruang gelap selama 48 jam. Setelah itu, biji diletakkan di ruang kultur dengan
pencahayaan 12 jam terang dan 12 jam gelap. Biji yang menunjukkan adanya
pertumbuhan hingga hari kelima setelah perlakuan higromisin dianggap sebaai biji
yang toleran.
Penanaman di Rumah Kaca
Padi yang lolos penapisan diaklimatisasi dan ditanam di rumah kaca dalam
pot berupa ember plastik yang berisi tanah dan pupuk kandang dengan
perbandingan 3:1 (v/v). Perawatan dilakukan dengan cara penyiraman pada pagi
atau sore hari secara rutin; pemupukan NPK (1:1:1) dengan dosis 0.8
gram/tanaman pada 1 minggu setelah tanam (MST), 3 MST, dan 7 MST;
pengendalian hama menggunakan insektisida.
Analisis Sisipan Gen
Isolasi DNA genom dari daun bendera tanaman generasi T2 dilakukan
dengan menggunakan buffer lisis SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) seperti yang
diuraikan Miftahudin et al. (2004). DNA hasil isolasi kemudian diamplifikasi
dengan teknik PCR menggunakan PCR kit KAPA 2G Fast Readymix yang per
12.5 µL mengandung 0.5 U DNA Polymerase, larutan penyangga PCR, 0.2 mM
dNTP, 1.5 mM MgCl2. Komposisi reaksi PCR untuk total volume reaksi 25 µL
adalah sebagai berikut: 100 ng DNA cetakan, 12.5 µl KAPA 2G Fast Readymix,
1.25 µL primer forward 10 µM, 1.25 µL primer reverse 10 µM, dan free nuclease
water. Program yang digunakan pada mesin PCR adalah sebagai berikut: pre
denaturasi 95oC selama 3 menit, 35 siklus yang terdiri atas denaturasi 95oC
selama 15 detik, penempelan primer 60oC selama 15 detik, polimerisasi 72oC
selama 15 detik, dan polimerisasi final pada 72oC selama 10 menit. Sisipan gen
B11 dianalisis menggunakan pasangan primer 35S Nakajima-F dan primer B11
check-R, menghasilkan sekitar 268 pasang basa (pb). Sisipan gen hpt diuji dengan
pasangan primer HPT-F dan HPT-R, hasil amplifikasinya sekitar 579 pb. Teknik
PCR juga dilakukan untuk ddH2O dan DNA tanaman SB tipe liar sebagai kontrol
negatif, serta plasmid pGWB5-B11 sebagai kontrol positif. DNA hasil PCR
divisualisasi dengan teknik elektroforesis pada tegangan 75 V selama 50 menit
menggunakan gel Agarose 1% dengan pewarna 5μg/ml etidium bromide dan
kemudian didokumentasi menggunakan WiseDoc Gel Documentation System
(Daihan Scientific, Korea Selatan).
4
Pengamatan Karakter Vegetatif
Karakter vegetatif yang diamati adalah tinggi tanaman dan jumlah anakan.
Tinggi tanaman diukur mulai dari pangkal rumpun hingga ujung daun tertinggi
ditangkup ke atas, dilakukan pada saat tanaman berumur 2 bulan. Penghitungan
jumlah anakan dilakukan pada saat tanaman padi berumur 2 bulan. Jumlah anakan
dihitung pada setiap rumpun dari tanaman.
Pengamatan Karakter Reproduktif
Karakter reproduktif yang diamati adalah umur berbunga, jumlah anakan
produktif, jumlah biji, dan bobot per 100 biji. Umur berbunga dihitung mulai
tanggal penanaman hingga muncul malai pertama. Jumlah anakan produktif
dihitung saat tanaman padi siap panen, anakan yang menghasilkan malai dihitung
sebagai anakan produktif. Malai yang menghasilkan biji dipotong dan
dikeringkan. Biji kemudian dirontokkan dan dipisahkan antara biji yang isi dan
hampa. Biji yang telah dirontokkan ditimbang setiap 100 biji. Biji yang ditimbang
adalah biji yang isi.
HASIL
Verifikasi Sisipan Gen pada Tanaman T0
Padi SB transgenik tanaman T0 hasil infeksi dengan A. tumefaciens secara
in-planta yang dilakukan oleh Pambudi (2012) menghasilkan beberapa nomor
padi yang menjadi kandidat untuk diuji lebih lanjut dalam penelitian ini.
Verifikasi dimaksudkan untuk memilih nomor padi yang akan diseleksi dengan
antibiotik higromisin. Hasil verifikasi terhadap tanaman T0 dengan nomor
tanaman SB-16 menunjukkan adanya amplifikasi gen B11 dengan ukuran sekitar
268 pb pada semua anakan (Gambar 1). Akan tetapi, verifikasi terhadap marka hpt
menunjukkan bahwa hanya anakan yang ke-2, ke-4, dan ke-6 yang memberikan
hasil yang positif (Gambar 2). Biji yang berasal dari anakan ke-6 dipilih untuk
diseleksi dengan antibiotik berdasarkan jumlah biji yang cukup banyak dibanding
anakan yang lain.
Hasil verifikasi mengindikasikan bahwa tanaman padi generasi T0 dengan
nomor SB-16 bersifat kimera. Hal ini disebabkan terdapat anakan yang tidak
positif terhadap marka hpt, tetapi positif terhadap gen B11. Berdasarkan hasil
tersebut, dapat diasumsikan bahwa insersi gen B11 secara in-planta pada nomor
padi SB-16 terjadi pada sel yang sudah terdiferensiasi.
5
T0 SB-16 anakan keM
D
A
TL
1
2
3
4
5
6
500 pb
Pita
target
300 pb
Gambar 1 Hasil amplifikasi DNA tanaman T0 SB-16 dengan menggunakan primer yang
didesain dari sekuen promoter 35S CaMV dan gen B11; M: DNA ladder 100
pb, D: ddH2O, A: plasmid pGWB5-B11, TL: DNA padi SB tipe liar.
T0 SB-16 anakan keD
M
A
TL
1
2
3
4
5
600 pb
500 pb
6
Pita
target
Gambar 2 Hasil amplifikasi DNA tanaman T0 SB-16 dengan menggunakan primer yang
didesain dari sekuen gen hpt; D: ddH2O, M: DNA ladder 100 pb, A: plasmid
pGWB5-B11, TL: DNA padi SB tipe liar.
Analisis Sisipan Gen pada Tanaman T1
Analisis Sisipan Gen B11 pada Tanaman Generasi T1
Analisis sisipan gen B11 dilakukan dengan menggunakan pasangan primer
35S Nakajima-F dan B11 check-R yang didesain berdasarkan sekuen penyandi
promoter 35S CaMV dan gen B11. Hasil amplifikasi DNA tanaman T1
menunjukkan adanya pita target yang berukuran sekitar 268 pb (Gambar 3).
6
M
D
A
TL SB-16-6-1
500 pb
Pita target
300 pb
Gambar 3 Hasil amplifikasi DNA tanaman T1 SB-16-6-1 dengan menggunakan primer
yang didesain dari sekuen promoter 35S CaMV dan gen B11; D: ddH2O, M:
DNA ladder 100 pb, A: plasmid pGWB5-B11, TL: DNA padi SB tipe liar.
Analisis Sisipan Gen hpt pada Tanaman Generasi T1
Verifikasi sisipan gen hpt dilakukan dengan menggunakan pasangan
primer HPT-F dan HPT-R berdasarkan sekuen penyandi gen hpt yang ada pada
plasmid pGWB5-B11. Amplifikasi DNA tanaman T1 menunjukkan adanya pita
target yang berukuran sekitar 579 pb (Gambar 4).
D
600 pb
M
A
TL SB-16-6-1
Pita target
500 pb
Gambar 4 Hasil amplifikasi DNA tanaman T1 SB-16-6-1 dengan menggunakan primer
yang didesain dari sekuen gen hpt; D: ddH2O, M: DNA ladder 100 pb, A:
plasmid pGWB5-B11, TL: DNA padi SB tipe liar.
Penapisan Biji T1 SB-16-6 dan T2 SB-16-6-1 dengan Antibiotik Higromisin
Penapisan biji dilakukan agar dapat diperoleh data biji yang transgenik dan
non-transgenik. Antibiotik higromisin digunakan sebagai agen penyeleksi
berdasarkan marka seleksi gen hpt. Konsentrasi antibiotik higromisin terendah
yang mampu menghambat pertumbuhan biji SB tipe liar adalah 20 mg/l.
Biji padi transgenik menunjukkan pertumbuhan yang baik dalam larutan
higromisin 20 mg/l. Akan tetapi, biji padi tersebut tidak menunjukkan
penampakan yang lebih baik dibandingkan dengan biji SB tipe liar tanpa
7
perlakuan higromisin. Beberapa biji transgenik menunjukkan pertumbuhan tajuk
dan akar yang lebih baik dibandingkan biji transgenik yang lain (Gambar 5A),
sedangkan biji SB tipe liar yang direndam dalam larutan higromisin 20 mg/l tidak
menunjukkan adanya pembengkakan embrio dan pertumbuhan akar dan tajuk
(Gambar 5B). Pertumbuhan padi SB tipe liar yang direndam dalam 0 mg/l
higromisin menunjukkan pertumbuhan yang baik, ditunjukkan dengan panjang
tajuk dan akar yang lebih baik dibandingkan dengan padi SB transgenik. Selain
itu, warna tajuk SB tipe liar lebih hijau dibandingkan dengan tajuk biji padi
transgenik (Gambar 5C).
A
C
D
B
Gambar 5 Perbedaan pertumbuhan biji padi SB tipe liar dan biji padi T2 SB-16-6-1 pada
hari ke-9 setelah perlakuan; A: Kecambah transgenik pada perlakuan
higromisin 20 mg/l, B: Biji SB tipe liar pada perlakuan higromisin 20 mg/l, C:
Pertumbuhan kecambah tipe liar pada perlakuan higromisin 0 mg/l, D:
Pertumbuhan kecambah padi transgenik pada perlakuan higromisin 20 mg/l.
Segregasi Gen hpt dan Gen B11
Analisis sisipan gen B11 dilakukan secara tidak langsung dengan
menggunakan hasil seleksi biji yang direndam dalam larutan antibiotik higromisin
20 mg/l. Gen hpt yang terintegrasi pada kromosom padi transgenik menyebabkan
padi bersifat toleran saat diberi cekaman antibiotik higromisin. Apabila sisipan
gen-gen tersebut hanya ada satu copy pada kromosom tanaman, maka pola
segregasi gen mengikuti model pewarisan gen tunggal dengan perbandingan padi
bersifat toleran dan sensitif sebesar 3:1 (dengan nilai χ2 hitung lebih kecil dari χ2
tabel). Generasi T1 SB transgenik diharapkan memiliki perbandingan 3:1, dan
generasi T2 diharapkan telah memiliki gen yang homozigot dominan. Hasil uji
khi-kuadrat (Tabel 1) menunjukkan bahwa biji generasi T1 yang berasal dari
nomor padi SB-16 anakan ke-6 tidak memenuhi perbandingan 3:1. Biji generasi
T2 dengan nomor SB-16-6-1 masih menunjukkan adanya biji yang sensitif
cekaman higromisin. Hasil uji khi-kuadrat generasi T2 menunjukkan bahwa χ2
hitung lebih kecil dari χ2 tabel. Artinya, generasi T2 memiliki pola pewarisan gen
8
tunggal dengan rasio 3:1. Hasil seleksi biji SB transgenik generasi T1 pada
perlakuan higromisin 20 mg/l menunjukkan bahwa dari 20 biji yang diseleksi
terdapat 8 biji yang toleran. Biji-biji yang toleran tersebut dapat berkecambah dan
menunjukkan pertumbuhan akar dan tajuk yang baik.
Tabel 1 Data hasil penapisan biji Situ Bagendit (SB) transgenik menggunakan
antibiotik higromisin 20 mg/l
Nomor
Padi
Generasi
T1
T2
SB-16-6
SB-16-6-1
Jumlah Biji
yang
Diseleksi
20
140
Jumlah Biji
Toleran
Jumlah Biji
Sensitif
χ2 (3:1)
8
114
12
26
13.067
3.087
χ2 tabel = 3.841
Karakter Vegetatif dan Reproduktif Tanaman Generasi T1
Karakter vegetatif dan reproduktif padi transgenik diamati untuk
mengetahui pengaruh sisipan gen B11 terhadap fenotipe tanaman. Karakter
vegetatif yang diamati adalah tinggi tanaman dan jumlah anakan; dan karakter
reproduktif yang diamati adalah umur berbunga, jumlah anakan produktif, jumlah
biji, dan bobot per 100 biji. Hasil pengamatan karakter vegetatif dan reproduktif
pada tanaman padi transgenik generasi T1 dengan nomor padi SB-16-6-1
menunjukkan karakter yang hampir sama dengan SB tipe liar (Tabel 2).
Tabel 2 Karakter vegetatif dan reproduktif padi Situ Bagendit (SB) tipe liar dan
SB transgenik (SB-16-6-1)
Karakter
Vegetatif
Reproduktif
Peubah
Tinggi Tanaman (cm)
Jumlah Anakan
Umur Berbunga (hari)
Jumlah Anakan Produktif
Jumlah Biji
Bobot per 100 Biji (gram)
SB tipe liar
92.6
8
71
7
581
2.1882
SB-16-6-1
95
7
72
7
528
2.2606
Hasil seleksi antibiotik menunjukkan bahwa dari 8 kecambah hanya dua
kecambah yang berhasil tumbuh baik saat diaklimatisasi. Tanaman dengan nomor
SB-16-6-2 menunjukkan penampakkan yang kurang baik bila dibandingkan
dengan kontrol sehingga biji generasi T2 yang dihasilkan dari tanaman nomor
tersebut tidak diseleksi lebih lanjut untuk melihat pola segregasinya. Hasil
pengamatan karakter fenotipe tanaman SB-16-6-1 mengindikasikan bahwa
introduksi gen B11 ke dalam genom padi tidak mengubah fenotipe tanaman secara
signifikan. Tanaman SB-16-6-1 lebih tinggi 2.4 cm dibandingkan dengan SB tipe
liar. Jumlah anakan SB-16-6-1 lebih sedikit dibandingkan anakan tipe liar, tetapi
semua anakannya produktif. Umur berbunga padi SB transgenik hanya berbeda 1
hari lebih lambat dibandingkan kontrol. Jumlah biji yang dihasilkan oleh tanaman
SB transgenik lebih sedikit dibandingkan kontrol, tetapi memiliki bobot per 100
biji lebih besar.
9
PEMBAHASAN
Introduksi gen B11 dalam konstruksi plasmid rekombinan pGWB5-B11
pada padi Situ Bagendit (SB) dimaksudkan untuk meningkatkan ketahanan
terhadap cekaman Al. Uji sisipan gen B11 pada tanaman padi dengan
menggunakan primer yang didesain dari gen B11 saja memungkinkan gen B11
indigeneous ikut teramplifikasi. Dari hasil penelitian transformasi gen B11 pada
padi, Pambudi (2012) menyarankan agar uji sisipan gen B11 pada tanaman padi
tidak hanya dilakukan dengan menggunakan primer B11 saja, tetapi juga perlu
menyertakan primer yang didesain dari promoter 35S CaMV karena promoter
tersebut tidak memiliki homologi dengan urutan DNA padi.
Verifikasi sisipan gen B11 dan hpt pada genom tanaman SB generasi T0
dimaksudkan untuk memilih biji padi yang akan diseleksi dengan menggunakan
antibiotik higromisin. Tanaman SB nomor 16 hasil transformasi secara in-planta
memiliki 6 anakan. Hasil verifikasi dengan menggunakan pasangan primer 35S
Nakajima-F dan B11 check-R menunjukkan pita target berukuran sekitar 268
pasang basa (pb) pada semua anakan (Gambar 1). Tetapi, hasil amplifikasi dari
marka hpt hanya positif pada anakan nomor 2, 4, dan 6 (Gambar 2). Hal ini
menunjukkan bahwa tanaman T0 SB-16 mengalami kimera. Kimera
mengindikasikan bahwa integrasi gen B11 pada nomor padi SB-16 secara inplanta terjadi pada sel yang sudah terdiferensiasi. Keberhasilan integrasi gen B11
ke dalam genom padi dengan metode transformasi secara in-planta bergantung
pada lokasi penusukan jarum yang telah dilumuri oleh suspensi Agrobacterium
tumefaciens pada biji padi. Penusukan pada bagian meristem daerah plumula akan
memberikan hasil transformasi yang baik dan mencegah kegagalan
perkecambahan, tetapi jika jarum melukai sel yang telah terdiferensiasi akan
dihasilkan tanaman kimera, sebagian transgenik dan sebagian lainnya nontransgenik (Lin et al. 2009).
Transformasi menggunakan Agrobacterium merupakan metode yang
umum digunakan untuk menyisipkan gen interest ke dalam genom tanaman.
Integrasi sebagian sekuen dari daerah T-DNA di antara left border dan right
border dapat disebabkan oleh tiga faktor, yaitu gen virulen kromosom, gen
virulen plasmid Ti, dan daerah T-DNA. Proses transformasi dimulai dengan
pelekatan Agrobacterium pada sel tanaman. Pelekatan tersebut menginduksi gengen virulen (vir) memproses T-DNA dan mentransfer kompleks T-DNA matang
ke sel tanaman. Pembentukan T-kompleks menjaga T-DNA menuju inti sel inang
(Rahmawati 2006). Daerah T-DNA yang dibatasi oleh left border (LB) dan right
border (RB) kemudian dapat terintegrasi ke dalam genom inang. Akan tetapi,
integrasi T-DNA ini tidak selalu berhasil. Studi yang dilakukan oleh Tzfira dan
Citovsky (2006) menunjukkan bahwa integrasi molekul T-DNA tidak hanya
dipengaruhi oleh gen virulen dari Agrobacterium, tetapi dipengaruhi juga oleh
faktor seluler inang seperti karyopherin α, CAK2M (Cyclin-dependent kinaseactivating kinase), VIP1 (VirE2-interacting protein), histon H2A-1 (core histone),
ASK1 (protease VirE2), DSBs (double-strand breaks), dan KU80. Selain itu,
delesi dan atau substitusi pada bagian T-DNA dapat terjadi pada proses
pemindahan T-DNA dari A. tumefaciens ke tanaman inang (Nester et al. 2005),
sehingga hasil amplifikasi tanaman T0 yang positif terhadap gen B11 namun tidak
10
positif terhadap gen hpt dapat terjadi. Berdasarkan peta linier T-DNA plasid
rekombinan pGWB5-B11, terlihat bahwa gen hpt berada di dekat LB, sedangkan
gen B11 dekat dengan RB (Lampiran 1). Zambryski (1988) menyatakan bahwa
insersi T-DNA lebih presisi pada daerah RB dibandingkan LB. Berdasarkan
beberapa pernyataan di atas, kemungkinan gen B11 terintegrasi tetapi gen hpt
tidak terintegrasi cukup besar, seperti yang terjadi pada anakan nomor 1, 3, dan 5.
Verifikasi sisipan gen B11 dan gen hpt pada generasi T1 SB-16-6-1
menunjukkan bahwa gen B11 berhasil terintegrasi ke dalam genom padi SB
dengan baik. Hasil amplifikasi menunjukkan bahwa pita target dari masingmasing primer yang digunakan menunjukkan pita yang diharapkan, walaupun
terdapat pita yang bukan pita target. Pita selain pita target yang muncul pada hasil
amplifikasi DNA dari SB-16-6-1 diduga muncul karena penempelan primer yang
tidak spesifik.
Transformasi gen B11 ke dalam genom padi secara in-planta oleh
Pambudi (2012) dilakukan dengan menggunakan plasmid pGWB5 yang memiliki
marka hpt (hygromycin phosphotransferase). Marka hpt yang merupakan marka
negatif memungkinkan seleksi biji padi transgenik dengan menggunakan
antibiotik higromisin. Marka negatif merupakan marka seleksi yang menyebabkan
penghambatan pertumbuhan atau bahkan kematian pada regeneran nontransgenik. Mekanisme penghambatan resistensi terhadap antibiotik higromisin
dilakukan dengan cara memfosforilasi higromisin (Kavanagh 2006). Konsentrasi
minimum hasil percobaan yang dapat menghambat perkecambahan biji padi SB
tipe liar adalah 20 mg/l.
Biji SB-16 yang digunakan dalam penapisan adalah biji yang berasal dari
anakan ke-6. Pemilihan biji dari anakan ini didasarkan pada jumlah biji yang
cukup banyak dibandingkan yang lain. Hasil penapisan biji T1 SB-16-6 dan T2
SB-16-6-1 dengan menggunakan antibiotik higromisin menunjukkan pertumbuhan yang sedikit berbeda dengan SB tipe liar yang dikecambahkan dalam akuades
steril tanpa higromisin. Munculnya tajuk SB transgenik lebih cepat dibandingkan
SB tipe liar, tetapi pada hari ke-10, panjang tajuk SB transgenik umumnya lebih
pendek dibandingkan tipe liarnya. Selain itu, tajuk SB transgenik berwarna hijau
kekuningan, sedangkan SB tipe liar berwarna hijau cerah. Perbedaan lainnya
dapat dilihat dari morfologi akar. Akar SB transgenik tidak memiliki banyak
rambut akar dan pada beberapa kecambah terdapat akar yang menggulung. Hal ini
diduga merupakan efek dari cekaman higromisin, bukan bawaan genotipe SB
transgenik tersebut. Pernyataan ini juga diperkuat oleh fenotipe tanaman SB-16-61 yang tidak berbeda dengan SB tipe liar saat ditanam di rumah kaca.
Higromisin tergolong antibiotik yang sangat toksik bagi tanaman.
Higromisin termasuk antibiotik aminosiklitol yang dapat menghambat sintesis
protein dengan spektrum yang luas (Stewart 2008). Fosforilasi higromisin yang
dilakukan oleh tanaman yang telah tersisipi gen hpt menyebabkan tanaman
kekurangan unsur fosfor yang sangat penting untuk pembentukan ATP. Fosfor
berperan penting dalam pertumbuhan sel dan pembentukan rambut akar. Selain
itu, fosfor berperan dalam sintesis protein, terutama pada jaringan hijau (Osman
2012). Higromisin secara tidak langsung mengurangi penggunaan unsur fosfor
untuk pertumbuhan kecambah, sehingga SB-16-6-1 yang direndam dalam larutan
higromisin 20 mg/l memiliki akar dan tajuk yang lebih pendek, serta warna
11
tajuknya lebih pucat dibandingkan SB tipe liar yang ditumbuhkan pada larutan
higromisin 0 mg/l.
Uji khi-kuadrat dari hasil penapisan biji generasi T1 SB transgenik tidak
menunjukkan pola pewarisan 3:1, sedangkan biji generasi T2 menunjukkan pola
pewarisan tersebut. Seleksi biji umumnya menggunakan semua biji dari satu
rumpun, sedangkan pada penelitian ini seleksi biji yang dilakukan pada generasi
T1 hanya menggunakan biji dari satu malai. Biji T1 berasal dari tanaman T0 SB16 yang mengalami kimera. Hasil studi yang dilakukan oleh Hiei et al. (1994)
menunjukkan bahwa beberapa keturunan yang berasal dari R0 yang kimera
menunjukkan pola segregasi yang tidak mengikuti model Mendelian. Hal ini
mengindikasikan bahwa kimera pada tanaman dapat berpengaruh terhadap rasio
segregasi.
Biji generasi T2 yang diharapkan telah memiliki sisipan gen yang
homozigot ternyata masih menunjukkan pola pewarisan 3:1. Akan tetapi, hasil ini
mengindikasikan bahwa sisipan gen B11 hanya ada satu copy dalam genom padi
transgenik dan dalam kondisi heterozigot. Karakter yang dikendalikan oleh satu
gen akan menunjukkan segregasi fenotipe sesuai dengan model monohibrid
mendel (3:1) (Campbell et al. 2003).
Hasil pengamatan tanaman SB-16-6-1 dan tipe liar yang ditanam di rumah
kaca memberikan hasil yang hampir sama. Artinya, padi transgenik tersebut dapat
melakukan proses fisiologi yang tidak berbeda dengan padi non-transgenik.
Tinggi tanaman dan jumlah anakan diamati untuk melihat pengaruh sisipan gen
B11 terhadap pertumbuhan tanaman. Tinggi tanaman SB-16-6-1 sedikit lebih
tinggi dibandingkan SB tipe liar, tetapi jumlah anakan SB tipe liar lebih banyak
dibandingkan SB-16-6-1. Karakter reproduktif, terutama parameter jumlah dan
bobot biji, diamati untuk mengetahui potensi produksi padi dari tanaman SB-166-1. Hasil pengamatan karakter reproduktif menunjukkan bahwa SB-16-6-1
memproduksi jumlah biji yang lebih sedikit namun bobotnya lebih berat
dibandingkan SB tipe liar. Hal ini mengindikasikan bahwa SB-16-6-1 berpotensi
dikembangkan sebagai salah satu varietas padi yang dapat ditanam di lahan
masam dengan produksi yang cukup baik.
SIMPULAN
Uji stabilitas sisipan gen B11 dengan menggunakan padangan primer
promoter 35S CaMV dan gen B11 menunjukkan bahwa pada tanaman padi
generasi transgenik Situ Bagendit (SB) generasi T0 SB-16-6 dan T1 SB-16-6-1
mengandung sisipan gen B11. Pada generasi T0, gen hpt yang terdapat pada
plasmid pGWB5-B11 terintegrasi hanya pada anakan nomor 2, 4, dan 6. Gen hpt
pada generasi T1 dari anakan ke-6 (SB-16-6-1) tetap terintegrasi di dalam genom
tanaman. Marka hpt penyandi ketahanan terhadap higromisin pada plasmid
pGWB5-B11 yang digunakan dalam transformasi secara in-planta efektif
digunakan sebagai agen seleksi biji transgenik. Hasil seleksi menunjukkan bahwa
gen B11 pada padi SB generasi T2 masih diturunkan dari individu yang
heterozigot dengan pola pewarisan 3:1. Pertumbuhan tanaman SB-16-6-1 tidak
berbeda jauh dengan SB tipe liar berdasarkan karakter vegetatif dan reproduktif
yang diamati.
12
DAFTAR PUSTAKA
Campbell NA, Reece JB, Mitchell LG. 2002. Biologi. Lestari R, penerjemah;
Safitri A, Simarmata L, Hardani HW, editor. Jakarta (ID): Erlangga.
Terjemahan dari: Biology.
Elvarelza U. 2013. Karakter Pertumbuhan Akar sebagai Parameter Toleransi
Tanaman Padi terhadap Cekaman Aluminium [skripsi]. Bogor (ID): Institut
Pertanian Bogor.
Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumashiro T. 1994. Efficient transformation of rice
(Oryza sativa L.) medited by Agrobacterium and sequence analysis of the
boundaries of the T-DNA. The Plant Journal. 6:268-282.
Hock B, Elstner EF. 2005. Plant Toxicology. New York (US): Marcel Dekker.
Kavanagh K. 2006. Medical Mycology: Cellular and Molecular Technique.
Chichester (GB): J Wiley.
Lin Z, Zhou B, Yang Y, Mei J, Zhao X, Guo X, Huang X, Tan D, Liu X. 2009.
Piercing and vacuum infiltration of the mature embryo: a simplified method
for Agrobacterium-mediated transformation of indica rice. Plant Cell Rep.
28:1065-1074. Doi:10.1007/s00299-009-07-06-2.
Miftahudin, Scoles GJ, Gustafson JP. 2004. Development of PCR-based
codominant markers flanking the Alt3 gene in rye. Genome. 47:231-238.
Doi: 10.1139/G03-093.
Miftahudin, Chikmawati T, Ross K, Scoles GJ, Gustafson JP. 2005. Targeting the
aluminum tolerance gene Alt3 region in rye, using rice/rye microcoliniearity. Theor Appl Genet. 110:906-913. Doi: 10.1007/s00122-0041909-0.
Nester G, Wood D, Lu P. 2005. Global analysisis of Agrobacterium-plant
interaction. Di dalam: Tsuyumu S, Leach JE, Shiraishi T, Wolpert, editor.
Genomic and Genetic Analysis of Plant Parasitism and Defence. Minnesota
(US): The American Phytopathological Society. hlm 1-10.
[OECD] Organisation for Economic Co-operation and Development (FR). 1999.
Consensus document on the biology of Oryza sativa (rice). Paris (FR):
OECD.
Osman KT. 2012. Soils: Principles, Properties, and Management. London (GB):
Springer. doi: 10.1007/978-94-007-5663-2.
Pambudi A. 2012. Transformasi genetik padi (Oryza sativa L.) dengan kandidat
gen toleran aluminium [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Rahmawati H. 2006. Status Perkembangan Perbaikan Sifat Genetik Padi
Menggunakan Transformasi Agrobacterium. Jurnal Agro Biogen 2:36-44.
Roslim DI. 2011. Isolasi dan karakterisasi gen toleran aluminium pada padi
[Disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Suprihatno B, Daradjat AA, Satoto, Baehaki SE, Widiarta IN, Setyono A,
Indrasari SD, Lesmana OS, Sembiring H. 2009. Deskripsi Varietas Padi.
Subang (ID): Balai Besar Penelitian Tanaman Padi.
Stewart CN. 2008. Plant Biotechnology and Genetics: Principles, Technique, and
Application. New Jersey (US): J Wiley.
Tzfira T, Citovsky V. 2006. Agrobacterium-mediated genetic transformation of
plants: biology and biotechnology. Curr Opin Biotech. 17:147-154.
13
Yanagisawa S, Akiyama A, Kisaka H, Uchimiya H, Miwa T. 2004. Metabolic
engineering with Dof1 transcription factor in plants: improved nitrogen
assimilation and growth under low-nitrogen conditions. PNAS. 101:78337838.doi: 10.1073/pnas.0402267101.
Zambryski P. 1988. Basic process underlying Agrobacterium-mediated DNA
transfer to cell. Annu Rev Genet. 22:1-30.
LAMPIRAN
Lampiran 1 Peta linier daerah T-DNA pembawa gen B11 plasmid pGWB5-B11 (Roslim 2011).
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Tangerang pada tanggal 2 Juni 1991 sebagai anak
sulung dari pasangan Bapak Surmadi dan Ibu Lizana. Penulis lulus dari SMA
Negeri 7 Tangerang pada tahun 2009. Pada tahun yang sama, penulis diterima di
Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB
melalui jalur Ujian Seleksi Masuk Mahasiswa IPB (USMI).
Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten praktikum
Sistematika Tumbuhan Berpembuluh, Genetika Dasar, Biologi Dasar, dan
Fisiologi Tumbuhan pada tahun ajaran 2012/2013. Penulis melaksanakan kegiatan
studi lapangan di Hutan Pendidikan Gunung Walat (HPGW), Sukabumi dengan
judul Keragaman Epifit di Hutan Pendidikan Gunung Walat, Sukabumi, Jawa
Barat pada tahun 2011 yang dibimbing oleh Prof Alex Hartana. Penulis
melaksanakan kegiatan praktik lapangan di Kabupaten Tangerang dengan judul
Pengolahan Karet Compound di PT. Industri Karet Wijaya yang dibimbing oleh
Ir Sri Listiyowati, MSi.
ALUMINIUM PADA PADI SITU BAGENDIT HASIL
TRANSFORMASI SECARA IN-PLANTA
FIRDHA JUNITA WIDIASTUTI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul “Stabilitas Sisipan
Kandidat Gen Toleran Aluminium pada Padi Situ Bagendit Hasil Transformasi
secara In-Planta” adalah benar karya saya dengan arahan dari pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, April 2014
Firdha Junita Widiastuti
NIM G34090053
i
ABSTRAK
FIRDHA JUNITA WIDIASTUTI. Stabilitas Sisipan Kandidat Gen Toleran
Aluminium pada Padi Situ Bagendit Hasil Transformasi secara In-Planta.
Dibimbing oleh MIFTAHUDIN dan ARIEF PAMBUDI.
Padi varietas Situ Bagendit (SB) merupakan padi sensitif aluminium (Al)
yang berpotensi untuk dikembangkan dalam usaha ekstensifikasi pertanian karena
dapat ditanam pada lahan kering maupun lahan sawah. Usaha perbaikan sifat
ketahanan terhadap Al dapat dilakukan dengan cara menyisipkan gen toleran
cekaman Al yang salah satunya adalah gen B11, ke genom varietas padi yang
sensitif Al. Transformasi gen B11 secara in-planta pada padi SB telah berhasil
dilakukan dan diperoleh generasi T1. Tujuan penelitian ini adalah mengevaluasi
stabilitas sisipan gen B11 pada generasi T1 dan T2 padi SB hasil infeksi in-planta.
Evaluasi dilakukan melalui penapisan biji padi dengan menggunakan antibiotik
higromisin dengan konsentrasi 20 mg/l, analisis molekuler dengan teknik
Polymerase Chain Reaction (PCR), dan pengamatan fenotipe tanaman. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa gen B11 telah terintegrasi pada tanaman
transgenik SB generasi T1 berdasarkan analisis molekuler dan pengamatan
fenotipe tanaman. Hasil penapisan biji menunjukkan bahwa generasi T2
heterozigot terhadap gen B11.
Kata kunci: Gen B11, Situ Bagendit, Padi transgenik, Toleran Aluminium.
ABSTRACT
FIRDHA JUNITA WIDIASTUTI. Stability of Aluminum Tolerance Gene
Candidate Insertion in Situ Bagendit Rice from In-Planta Transformation.
Supervised by MIFTAHUDIN and ARIEF PAMBUDI.
Situ Bagendit is one of the rice variety that sensitive to aluminum (Al)
toxicity. The variety can be developed to an Al-tolerant variety because it can be
planted in both dry and wet field. The effort to develop Al tolerant varieties could
be done by inserting Al tolerance genes. An Al-tolerance gene, called B11 gene
has been inserted to Situ Bagendit genome by in-planta technique and produced
T1 generation. The research objective was to evaluate the stability of B11 gene
insertion in T1 and T2 generation of rice transgenic SB-16. The evaluation was
done by rice seed selection using hygromycin antibiotic with concentration 20
mg/l, molecular analysis using polymerase chain reaction (PCR) technique, and
plant phenotype observation. The result of this research showed that B11 gene had
been integrated in T1 plant based on molecular analysis and plant phenotype
observation. The result of seed selection showed that T2 generation still
segregated for B11 gene.
Keywords: Aluminum Tolerance, B11 Gene, Situ Bagendit, Transgenic Rice.
ii
STABILITAS SISIPAN KANDIDAT GEN TOLERAN
ALUMINIUM PADA PADI SITU BAGENDIT HASIL
TRANSFORMASI SECARA IN-PLANTA
FIRDHA JUNITA WIDIASTUTI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
iii
iv
Judul Skripsi : Stabilitas Sisipan Kandidat Gen Toleran Aluminium pada Padi
Situ Bagendit Hasil Transformasi secara In-Planta
Nama
: Firdha Junita Widiastuti
NIM
: G34090053
Disetujui oleh
Dr Ir Miftahudin, MSi
Pembimbing I
Arief Pambudi, SSi, MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Iman Rusmana, MSi
Ketua Departemen
Tanggal lulus:
v
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala
rahmatNya sehingga penulisan karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Penelitian
berjudul “Stabilitas Sisipan Kandidat Gen Toleran Aluminium pada Padi Situ
Bagendit Hasil Transformasi secara In-Planta” ini dilaksanakan sejak bulan
Januari 2013 sampai dengan Januari 2014.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr Ir Miftahudin, MSi dan Arief
Pambudi, SSi, MSi selaku dosen pembimbing yang telah memberikan bimbingan
dan ilmu yang bermanfaat selama melaksanakan penelitian dan penulisan karya
ilmiah ini. Terima kasih kepada Dian, Mirna, Childa, Wulan, dan khususnya
Syasti Hastriani yang telah membantu kegiatan penelitian ini.
Semoga karya ilmiah ini dapat memberikan informasi yang berguna dan
bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.
Bogor, April 2014
Firdha Junita Widiastuti
vi
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
METODE
Waktu dan Tempat
Bahan dan Alat
Prosedur Penelitian
HASIL
Verifikasi Sisipan Gen pada Tanaman T0
Analisis Sisipan Gen pada Tanaman T1
Penapisan Biji T1 SB-16-6 dan T2 SB-16-6-1 dengan Antibiotik Higromisin
Segregasi Gen hpt dan Gen B11
Karakter Vegetatif dan Reproduktif Tanaman Generasi T1
PEMBAHASAN
SIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP
vii
vii
1
1
2
2
2
2
2
4
4
5
6
7
8
9
11
12
14
16
vii
DAFTAR TABEL
1 Data hasil penapisan biji Situ Bagendit (SB) transgenik menggunakan
antibiotik higromisin 20 mg/l
8
2 Karakter vegetatif dan reproduktif padi Situ Bagendit (SB) tipe liar dan SB
transgenik (SB-16-6-1)
8
DAFTAR GAMBAR
1
Hasil amplifikasi DNA tanaman T0 SB-16 dengan menggunakan primer yang
didesain dari sekuen promoter 35S CaMV dan gen B11
5
2
Hasil amplifikasi DNA tanaman T1 SB-16 dengan menggunakan primer yang
didesain dari sekuen gen hpt
5
3
Hasil amplifikasi DNA tanaman T2 SB-16-6-1 dengan menggunakan primer
yang didesain dari sekuen promoter 35S CaMV dan gen B11
6
4
Hasil amplifikasi DNA tanaman T1 SB-16-6-1 dengan menggunakan primer
yang didesain dari sekuen gen hpt
6
5
Perbedaan pertumbuhan biji padi SB tipe liar dan biji padi SB transgenik pada
hari ke-9 setelah perlakuan antibiotik higromisin
7
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Padi merupakan sumber makanan pokok bagi sebagian besar penduduk
dunia dan memiliki banyak varietas. Tanaman padi mudah beradaptasi terhadap
berbagai macam kondisi lingkungan, seperti tanah dengan tingkat salinitas tinggi,
tanah alkali atau asam. Tetapi, adaptasi ini bergantung pada varietas padi. Padi
(Oryza sativa L.) adalah tanaman pangan yang dapat ditanam di seluruh dunia,
kultivasi padi pertama kali dilakukan di daerah Asia (OECD 1999). Padi
subspesies indica merupakan padi yang secara umum ditanam di daerah tropis dan
memiliki bulir yang khas, yakni sedikit lonjong, yang membedakannya dengan
subspesies japonica yang berbulir bulat (OECD 1999). Di Indonesia, subspesies
padi yang ditanam didominasi oleh subspesies indica.
Indonesia, sebagai negara yang sebagian besar penduduknya mengonsumsi
nasi, perlu meningkatkan produksi padi sehingga kebutuhan penduduk dapat
terpenuhi. Salah satu usaha untuk meningkatkan produksi pertanian adalah dengan
melakukan ekstensifikasi pertanian dengan cara membuka lahan-lahan pertanian
baru. Akan tetapi, usaha ekstensifikasi ini terkendala karena sekitar 25% luas
daratan Indonesia didominasi tanah masam berupa tanah podzolik merah kuning.
Tanah masam menjadi kendala dalam pertanian karena pada pH kurang dari 5,
unsur Al3+ menjadi larut dan bersifat racun bagi perakaran. Selain itu, pada pH
rendah Al dapat mengikat unsur fosfor yang merupakan komponen penting dalam
pembentukan energi pada tumbuhan (Hock dan Elstner 2005).
Padi varietas Situ Bagendit (SB) merupakan padi gogo yang cocok ditanam
di lahan kering dan di lahan sawah. Padi SB berpotensi menghasilkan 6.0 ton padi
per hektar, dan memiliki kelebihan yakni agak tahan terhadap penyakit blas dan
hawar daun (Suprihatno et al. 2009). Akan tetapi, padi varietas SB sensitif
terhadap cekaman Al (Elvarelza 2013). Salah satu cara untuk mendapatkan
varietas padi yang tahan cekaman Al adalah dengan cara menyisipkan gen toleran
cekaman Al ke genom varietas padi yang sensitif Al. Penelitian Miftahudin (2005)
pada tanaman Rye menunjukkan adanya hubungan sinteni antara kromosom 4RL
Rye dan kromosom 3 padi terkait dengan toleransi terhadap cekaman Al. Studi
selanjutnya yang dilakukan oleh Roslim (2011) dengan menggunakan varietas
Hawara Bunar menunjukkan bahwa daerah B11 memiliki peningkatan ekspresi
saat diberi perlakuan Al.
Daerah B11 yang selanjutnya dinamakan gen B11 berhasil diisolasi dari
padi varietas Hawara Bunar oleh Roslim (2011). Gen B11 ini kemudian disisipkan
ke dalam plasmid pGWB5 dan ditransformasikan ke dalam genom padi.
Transformasi gen B11 melalui infeksi Agrobacterium tumefaciens secara inplanta pada varietas SB yang dilakukan oleh Pambudi (2012) menghasilkan
beberapa nomor tanaman yang positif. Salah satu nomor padi yang menunjukkan
hasil positif adalah SB-16. Karakter padi tersebut harus diuji lebih lanjut dalam
penelitian ini untuk mengetahui stabilitas gen dan pola segregasinya.
2
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mengamati stabilitas insersi gen B11 dan
karakteristik tanaman generasi T1 dari biji SB-16-6 hasil transformasi secara inplanta. Selain itu, penelitian juga dimaksudkan untuk mengetahui pola segregasi
gen B11 pada biji T1 SB-16-6 dan T2 SB-16-6-1.
METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan mulai Januari 2013 sampai dengan Januari 2014 di
Laboratorium Fisiologi dan Biologi Molekular Tumbuhan dan rumah kaca,
Departemen Biologi FMIPA, IPB.
Bahan dan Alat
Bahan tanaman yang digunakan adalah biji padi T1 SB-16-6 hasil
transformasi dengan infeksi Agrobacterium tumefaciens secara in-planta pada
Situ Bagendit (SB) yang dilakukan oleh Pambudi (2012), biji generasi T2 SB 166-1, dan padi Situbagendit tipe liar. Bahan-bahan yang digunakan antara lain
antibiotik higromisin, akuades steril, PCR kit KAPA 2G Fast Readymix, primer
35S Nakajima-F (5’-GAT-GTG-ATA-TCT-CCA-CTG-ACG-TAA-G-3’), primer
B11 check-R (5’-GAA-CGA-TTG-GGC-CTC-TGT-GA-3’), primer HPT-F (5’GAT-GTT-GGC-GAC-CTC-GTA-TT-3’), primer HPT-R (5’-GAT-GTA-GGAGGG-CGT-GGA-TA-3’), agarose (Thermo Scientific), dan etidium bromida
(Biotech). Alat-alat yang digunakan antara lain autoklaf, inkubator, sentrifuse,
waterbath, pipet mikro, mesin PCR (Esco Swift Maxi, Singapura), perangkat
elektroforesis (BIO-RAD, USA), WiseDoc gel-documentation system (Daihan
Scientific, Korea Selatan), dan alat-alat gelas.
Prosedur Penelitian
Verifikasi Sisipan Gen B11 pada Tanaman T0
Verifikasi sisipan gen dilakukan untuk memilih nomor padi yang akan
diseleksi dengan antibiotik higromisin. DNA hasil isolasi dari tanaman T0 yang
dilakukan oleh Pambudi (2012) pada padi SB diuji sisipan gen B11 dengan teknik
PCR menggunakan PCR kit KAPA 2G Fast Readymix, pasangan primer yang
digunakan adalah 35S Nakajima-F dan primer B11 check-R. Sisipan marka hpt
dilakukan dengan menggunakan primer HPT-F dan HPT-R. Nomor padi yang
menunjukkan hasil positif dipilih untuk diseleksi dengan menggunakan antibiotik
higromisin.
3
Penapisan Biji Padi Transgenik SB-16-6 dan SB-16-6-1 dengan Antibiotik
Penapisan biji dilakukan dengan menyeleksi padi menggunakan antibiotik
higromisin mengacu pada metode Yanagisawa et al. (2004) dengan beberapa
modifikasi. Biji padi diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Setelah itu, biji
padi dikupas dan disterilisasi di LAFC. Sterilisasi permukaan biji padi dilakukan
dengan merendam biji pada alkohol 70% selama 10 detik, kemudian direndam
dalam larutan NaOCl 1.5% selama 5 menit. Biji transgenik yang telah disterilisasi
dibilas dengan akuades steril dan diletakkan di dalam cawan petri berisi larutan
higromisin 20 mg/l selama 24 jam pada suhu 40C. Selanjutnya, biji diletakkan di
ruang gelap selama 48 jam. Setelah itu, biji diletakkan di ruang kultur dengan
pencahayaan 12 jam terang dan 12 jam gelap. Biji yang menunjukkan adanya
pertumbuhan hingga hari kelima setelah perlakuan higromisin dianggap sebaai biji
yang toleran.
Penanaman di Rumah Kaca
Padi yang lolos penapisan diaklimatisasi dan ditanam di rumah kaca dalam
pot berupa ember plastik yang berisi tanah dan pupuk kandang dengan
perbandingan 3:1 (v/v). Perawatan dilakukan dengan cara penyiraman pada pagi
atau sore hari secara rutin; pemupukan NPK (1:1:1) dengan dosis 0.8
gram/tanaman pada 1 minggu setelah tanam (MST), 3 MST, dan 7 MST;
pengendalian hama menggunakan insektisida.
Analisis Sisipan Gen
Isolasi DNA genom dari daun bendera tanaman generasi T2 dilakukan
dengan menggunakan buffer lisis SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) seperti yang
diuraikan Miftahudin et al. (2004). DNA hasil isolasi kemudian diamplifikasi
dengan teknik PCR menggunakan PCR kit KAPA 2G Fast Readymix yang per
12.5 µL mengandung 0.5 U DNA Polymerase, larutan penyangga PCR, 0.2 mM
dNTP, 1.5 mM MgCl2. Komposisi reaksi PCR untuk total volume reaksi 25 µL
adalah sebagai berikut: 100 ng DNA cetakan, 12.5 µl KAPA 2G Fast Readymix,
1.25 µL primer forward 10 µM, 1.25 µL primer reverse 10 µM, dan free nuclease
water. Program yang digunakan pada mesin PCR adalah sebagai berikut: pre
denaturasi 95oC selama 3 menit, 35 siklus yang terdiri atas denaturasi 95oC
selama 15 detik, penempelan primer 60oC selama 15 detik, polimerisasi 72oC
selama 15 detik, dan polimerisasi final pada 72oC selama 10 menit. Sisipan gen
B11 dianalisis menggunakan pasangan primer 35S Nakajima-F dan primer B11
check-R, menghasilkan sekitar 268 pasang basa (pb). Sisipan gen hpt diuji dengan
pasangan primer HPT-F dan HPT-R, hasil amplifikasinya sekitar 579 pb. Teknik
PCR juga dilakukan untuk ddH2O dan DNA tanaman SB tipe liar sebagai kontrol
negatif, serta plasmid pGWB5-B11 sebagai kontrol positif. DNA hasil PCR
divisualisasi dengan teknik elektroforesis pada tegangan 75 V selama 50 menit
menggunakan gel Agarose 1% dengan pewarna 5μg/ml etidium bromide dan
kemudian didokumentasi menggunakan WiseDoc Gel Documentation System
(Daihan Scientific, Korea Selatan).
4
Pengamatan Karakter Vegetatif
Karakter vegetatif yang diamati adalah tinggi tanaman dan jumlah anakan.
Tinggi tanaman diukur mulai dari pangkal rumpun hingga ujung daun tertinggi
ditangkup ke atas, dilakukan pada saat tanaman berumur 2 bulan. Penghitungan
jumlah anakan dilakukan pada saat tanaman padi berumur 2 bulan. Jumlah anakan
dihitung pada setiap rumpun dari tanaman.
Pengamatan Karakter Reproduktif
Karakter reproduktif yang diamati adalah umur berbunga, jumlah anakan
produktif, jumlah biji, dan bobot per 100 biji. Umur berbunga dihitung mulai
tanggal penanaman hingga muncul malai pertama. Jumlah anakan produktif
dihitung saat tanaman padi siap panen, anakan yang menghasilkan malai dihitung
sebagai anakan produktif. Malai yang menghasilkan biji dipotong dan
dikeringkan. Biji kemudian dirontokkan dan dipisahkan antara biji yang isi dan
hampa. Biji yang telah dirontokkan ditimbang setiap 100 biji. Biji yang ditimbang
adalah biji yang isi.
HASIL
Verifikasi Sisipan Gen pada Tanaman T0
Padi SB transgenik tanaman T0 hasil infeksi dengan A. tumefaciens secara
in-planta yang dilakukan oleh Pambudi (2012) menghasilkan beberapa nomor
padi yang menjadi kandidat untuk diuji lebih lanjut dalam penelitian ini.
Verifikasi dimaksudkan untuk memilih nomor padi yang akan diseleksi dengan
antibiotik higromisin. Hasil verifikasi terhadap tanaman T0 dengan nomor
tanaman SB-16 menunjukkan adanya amplifikasi gen B11 dengan ukuran sekitar
268 pb pada semua anakan (Gambar 1). Akan tetapi, verifikasi terhadap marka hpt
menunjukkan bahwa hanya anakan yang ke-2, ke-4, dan ke-6 yang memberikan
hasil yang positif (Gambar 2). Biji yang berasal dari anakan ke-6 dipilih untuk
diseleksi dengan antibiotik berdasarkan jumlah biji yang cukup banyak dibanding
anakan yang lain.
Hasil verifikasi mengindikasikan bahwa tanaman padi generasi T0 dengan
nomor SB-16 bersifat kimera. Hal ini disebabkan terdapat anakan yang tidak
positif terhadap marka hpt, tetapi positif terhadap gen B11. Berdasarkan hasil
tersebut, dapat diasumsikan bahwa insersi gen B11 secara in-planta pada nomor
padi SB-16 terjadi pada sel yang sudah terdiferensiasi.
5
T0 SB-16 anakan keM
D
A
TL
1
2
3
4
5
6
500 pb
Pita
target
300 pb
Gambar 1 Hasil amplifikasi DNA tanaman T0 SB-16 dengan menggunakan primer yang
didesain dari sekuen promoter 35S CaMV dan gen B11; M: DNA ladder 100
pb, D: ddH2O, A: plasmid pGWB5-B11, TL: DNA padi SB tipe liar.
T0 SB-16 anakan keD
M
A
TL
1
2
3
4
5
600 pb
500 pb
6
Pita
target
Gambar 2 Hasil amplifikasi DNA tanaman T0 SB-16 dengan menggunakan primer yang
didesain dari sekuen gen hpt; D: ddH2O, M: DNA ladder 100 pb, A: plasmid
pGWB5-B11, TL: DNA padi SB tipe liar.
Analisis Sisipan Gen pada Tanaman T1
Analisis Sisipan Gen B11 pada Tanaman Generasi T1
Analisis sisipan gen B11 dilakukan dengan menggunakan pasangan primer
35S Nakajima-F dan B11 check-R yang didesain berdasarkan sekuen penyandi
promoter 35S CaMV dan gen B11. Hasil amplifikasi DNA tanaman T1
menunjukkan adanya pita target yang berukuran sekitar 268 pb (Gambar 3).
6
M
D
A
TL SB-16-6-1
500 pb
Pita target
300 pb
Gambar 3 Hasil amplifikasi DNA tanaman T1 SB-16-6-1 dengan menggunakan primer
yang didesain dari sekuen promoter 35S CaMV dan gen B11; D: ddH2O, M:
DNA ladder 100 pb, A: plasmid pGWB5-B11, TL: DNA padi SB tipe liar.
Analisis Sisipan Gen hpt pada Tanaman Generasi T1
Verifikasi sisipan gen hpt dilakukan dengan menggunakan pasangan
primer HPT-F dan HPT-R berdasarkan sekuen penyandi gen hpt yang ada pada
plasmid pGWB5-B11. Amplifikasi DNA tanaman T1 menunjukkan adanya pita
target yang berukuran sekitar 579 pb (Gambar 4).
D
600 pb
M
A
TL SB-16-6-1
Pita target
500 pb
Gambar 4 Hasil amplifikasi DNA tanaman T1 SB-16-6-1 dengan menggunakan primer
yang didesain dari sekuen gen hpt; D: ddH2O, M: DNA ladder 100 pb, A:
plasmid pGWB5-B11, TL: DNA padi SB tipe liar.
Penapisan Biji T1 SB-16-6 dan T2 SB-16-6-1 dengan Antibiotik Higromisin
Penapisan biji dilakukan agar dapat diperoleh data biji yang transgenik dan
non-transgenik. Antibiotik higromisin digunakan sebagai agen penyeleksi
berdasarkan marka seleksi gen hpt. Konsentrasi antibiotik higromisin terendah
yang mampu menghambat pertumbuhan biji SB tipe liar adalah 20 mg/l.
Biji padi transgenik menunjukkan pertumbuhan yang baik dalam larutan
higromisin 20 mg/l. Akan tetapi, biji padi tersebut tidak menunjukkan
penampakan yang lebih baik dibandingkan dengan biji SB tipe liar tanpa
7
perlakuan higromisin. Beberapa biji transgenik menunjukkan pertumbuhan tajuk
dan akar yang lebih baik dibandingkan biji transgenik yang lain (Gambar 5A),
sedangkan biji SB tipe liar yang direndam dalam larutan higromisin 20 mg/l tidak
menunjukkan adanya pembengkakan embrio dan pertumbuhan akar dan tajuk
(Gambar 5B). Pertumbuhan padi SB tipe liar yang direndam dalam 0 mg/l
higromisin menunjukkan pertumbuhan yang baik, ditunjukkan dengan panjang
tajuk dan akar yang lebih baik dibandingkan dengan padi SB transgenik. Selain
itu, warna tajuk SB tipe liar lebih hijau dibandingkan dengan tajuk biji padi
transgenik (Gambar 5C).
A
C
D
B
Gambar 5 Perbedaan pertumbuhan biji padi SB tipe liar dan biji padi T2 SB-16-6-1 pada
hari ke-9 setelah perlakuan; A: Kecambah transgenik pada perlakuan
higromisin 20 mg/l, B: Biji SB tipe liar pada perlakuan higromisin 20 mg/l, C:
Pertumbuhan kecambah tipe liar pada perlakuan higromisin 0 mg/l, D:
Pertumbuhan kecambah padi transgenik pada perlakuan higromisin 20 mg/l.
Segregasi Gen hpt dan Gen B11
Analisis sisipan gen B11 dilakukan secara tidak langsung dengan
menggunakan hasil seleksi biji yang direndam dalam larutan antibiotik higromisin
20 mg/l. Gen hpt yang terintegrasi pada kromosom padi transgenik menyebabkan
padi bersifat toleran saat diberi cekaman antibiotik higromisin. Apabila sisipan
gen-gen tersebut hanya ada satu copy pada kromosom tanaman, maka pola
segregasi gen mengikuti model pewarisan gen tunggal dengan perbandingan padi
bersifat toleran dan sensitif sebesar 3:1 (dengan nilai χ2 hitung lebih kecil dari χ2
tabel). Generasi T1 SB transgenik diharapkan memiliki perbandingan 3:1, dan
generasi T2 diharapkan telah memiliki gen yang homozigot dominan. Hasil uji
khi-kuadrat (Tabel 1) menunjukkan bahwa biji generasi T1 yang berasal dari
nomor padi SB-16 anakan ke-6 tidak memenuhi perbandingan 3:1. Biji generasi
T2 dengan nomor SB-16-6-1 masih menunjukkan adanya biji yang sensitif
cekaman higromisin. Hasil uji khi-kuadrat generasi T2 menunjukkan bahwa χ2
hitung lebih kecil dari χ2 tabel. Artinya, generasi T2 memiliki pola pewarisan gen
8
tunggal dengan rasio 3:1. Hasil seleksi biji SB transgenik generasi T1 pada
perlakuan higromisin 20 mg/l menunjukkan bahwa dari 20 biji yang diseleksi
terdapat 8 biji yang toleran. Biji-biji yang toleran tersebut dapat berkecambah dan
menunjukkan pertumbuhan akar dan tajuk yang baik.
Tabel 1 Data hasil penapisan biji Situ Bagendit (SB) transgenik menggunakan
antibiotik higromisin 20 mg/l
Nomor
Padi
Generasi
T1
T2
SB-16-6
SB-16-6-1
Jumlah Biji
yang
Diseleksi
20
140
Jumlah Biji
Toleran
Jumlah Biji
Sensitif
χ2 (3:1)
8
114
12
26
13.067
3.087
χ2 tabel = 3.841
Karakter Vegetatif dan Reproduktif Tanaman Generasi T1
Karakter vegetatif dan reproduktif padi transgenik diamati untuk
mengetahui pengaruh sisipan gen B11 terhadap fenotipe tanaman. Karakter
vegetatif yang diamati adalah tinggi tanaman dan jumlah anakan; dan karakter
reproduktif yang diamati adalah umur berbunga, jumlah anakan produktif, jumlah
biji, dan bobot per 100 biji. Hasil pengamatan karakter vegetatif dan reproduktif
pada tanaman padi transgenik generasi T1 dengan nomor padi SB-16-6-1
menunjukkan karakter yang hampir sama dengan SB tipe liar (Tabel 2).
Tabel 2 Karakter vegetatif dan reproduktif padi Situ Bagendit (SB) tipe liar dan
SB transgenik (SB-16-6-1)
Karakter
Vegetatif
Reproduktif
Peubah
Tinggi Tanaman (cm)
Jumlah Anakan
Umur Berbunga (hari)
Jumlah Anakan Produktif
Jumlah Biji
Bobot per 100 Biji (gram)
SB tipe liar
92.6
8
71
7
581
2.1882
SB-16-6-1
95
7
72
7
528
2.2606
Hasil seleksi antibiotik menunjukkan bahwa dari 8 kecambah hanya dua
kecambah yang berhasil tumbuh baik saat diaklimatisasi. Tanaman dengan nomor
SB-16-6-2 menunjukkan penampakkan yang kurang baik bila dibandingkan
dengan kontrol sehingga biji generasi T2 yang dihasilkan dari tanaman nomor
tersebut tidak diseleksi lebih lanjut untuk melihat pola segregasinya. Hasil
pengamatan karakter fenotipe tanaman SB-16-6-1 mengindikasikan bahwa
introduksi gen B11 ke dalam genom padi tidak mengubah fenotipe tanaman secara
signifikan. Tanaman SB-16-6-1 lebih tinggi 2.4 cm dibandingkan dengan SB tipe
liar. Jumlah anakan SB-16-6-1 lebih sedikit dibandingkan anakan tipe liar, tetapi
semua anakannya produktif. Umur berbunga padi SB transgenik hanya berbeda 1
hari lebih lambat dibandingkan kontrol. Jumlah biji yang dihasilkan oleh tanaman
SB transgenik lebih sedikit dibandingkan kontrol, tetapi memiliki bobot per 100
biji lebih besar.
9
PEMBAHASAN
Introduksi gen B11 dalam konstruksi plasmid rekombinan pGWB5-B11
pada padi Situ Bagendit (SB) dimaksudkan untuk meningkatkan ketahanan
terhadap cekaman Al. Uji sisipan gen B11 pada tanaman padi dengan
menggunakan primer yang didesain dari gen B11 saja memungkinkan gen B11
indigeneous ikut teramplifikasi. Dari hasil penelitian transformasi gen B11 pada
padi, Pambudi (2012) menyarankan agar uji sisipan gen B11 pada tanaman padi
tidak hanya dilakukan dengan menggunakan primer B11 saja, tetapi juga perlu
menyertakan primer yang didesain dari promoter 35S CaMV karena promoter
tersebut tidak memiliki homologi dengan urutan DNA padi.
Verifikasi sisipan gen B11 dan hpt pada genom tanaman SB generasi T0
dimaksudkan untuk memilih biji padi yang akan diseleksi dengan menggunakan
antibiotik higromisin. Tanaman SB nomor 16 hasil transformasi secara in-planta
memiliki 6 anakan. Hasil verifikasi dengan menggunakan pasangan primer 35S
Nakajima-F dan B11 check-R menunjukkan pita target berukuran sekitar 268
pasang basa (pb) pada semua anakan (Gambar 1). Tetapi, hasil amplifikasi dari
marka hpt hanya positif pada anakan nomor 2, 4, dan 6 (Gambar 2). Hal ini
menunjukkan bahwa tanaman T0 SB-16 mengalami kimera. Kimera
mengindikasikan bahwa integrasi gen B11 pada nomor padi SB-16 secara inplanta terjadi pada sel yang sudah terdiferensiasi. Keberhasilan integrasi gen B11
ke dalam genom padi dengan metode transformasi secara in-planta bergantung
pada lokasi penusukan jarum yang telah dilumuri oleh suspensi Agrobacterium
tumefaciens pada biji padi. Penusukan pada bagian meristem daerah plumula akan
memberikan hasil transformasi yang baik dan mencegah kegagalan
perkecambahan, tetapi jika jarum melukai sel yang telah terdiferensiasi akan
dihasilkan tanaman kimera, sebagian transgenik dan sebagian lainnya nontransgenik (Lin et al. 2009).
Transformasi menggunakan Agrobacterium merupakan metode yang
umum digunakan untuk menyisipkan gen interest ke dalam genom tanaman.
Integrasi sebagian sekuen dari daerah T-DNA di antara left border dan right
border dapat disebabkan oleh tiga faktor, yaitu gen virulen kromosom, gen
virulen plasmid Ti, dan daerah T-DNA. Proses transformasi dimulai dengan
pelekatan Agrobacterium pada sel tanaman. Pelekatan tersebut menginduksi gengen virulen (vir) memproses T-DNA dan mentransfer kompleks T-DNA matang
ke sel tanaman. Pembentukan T-kompleks menjaga T-DNA menuju inti sel inang
(Rahmawati 2006). Daerah T-DNA yang dibatasi oleh left border (LB) dan right
border (RB) kemudian dapat terintegrasi ke dalam genom inang. Akan tetapi,
integrasi T-DNA ini tidak selalu berhasil. Studi yang dilakukan oleh Tzfira dan
Citovsky (2006) menunjukkan bahwa integrasi molekul T-DNA tidak hanya
dipengaruhi oleh gen virulen dari Agrobacterium, tetapi dipengaruhi juga oleh
faktor seluler inang seperti karyopherin α, CAK2M (Cyclin-dependent kinaseactivating kinase), VIP1 (VirE2-interacting protein), histon H2A-1 (core histone),
ASK1 (protease VirE2), DSBs (double-strand breaks), dan KU80. Selain itu,
delesi dan atau substitusi pada bagian T-DNA dapat terjadi pada proses
pemindahan T-DNA dari A. tumefaciens ke tanaman inang (Nester et al. 2005),
sehingga hasil amplifikasi tanaman T0 yang positif terhadap gen B11 namun tidak
10
positif terhadap gen hpt dapat terjadi. Berdasarkan peta linier T-DNA plasid
rekombinan pGWB5-B11, terlihat bahwa gen hpt berada di dekat LB, sedangkan
gen B11 dekat dengan RB (Lampiran 1). Zambryski (1988) menyatakan bahwa
insersi T-DNA lebih presisi pada daerah RB dibandingkan LB. Berdasarkan
beberapa pernyataan di atas, kemungkinan gen B11 terintegrasi tetapi gen hpt
tidak terintegrasi cukup besar, seperti yang terjadi pada anakan nomor 1, 3, dan 5.
Verifikasi sisipan gen B11 dan gen hpt pada generasi T1 SB-16-6-1
menunjukkan bahwa gen B11 berhasil terintegrasi ke dalam genom padi SB
dengan baik. Hasil amplifikasi menunjukkan bahwa pita target dari masingmasing primer yang digunakan menunjukkan pita yang diharapkan, walaupun
terdapat pita yang bukan pita target. Pita selain pita target yang muncul pada hasil
amplifikasi DNA dari SB-16-6-1 diduga muncul karena penempelan primer yang
tidak spesifik.
Transformasi gen B11 ke dalam genom padi secara in-planta oleh
Pambudi (2012) dilakukan dengan menggunakan plasmid pGWB5 yang memiliki
marka hpt (hygromycin phosphotransferase). Marka hpt yang merupakan marka
negatif memungkinkan seleksi biji padi transgenik dengan menggunakan
antibiotik higromisin. Marka negatif merupakan marka seleksi yang menyebabkan
penghambatan pertumbuhan atau bahkan kematian pada regeneran nontransgenik. Mekanisme penghambatan resistensi terhadap antibiotik higromisin
dilakukan dengan cara memfosforilasi higromisin (Kavanagh 2006). Konsentrasi
minimum hasil percobaan yang dapat menghambat perkecambahan biji padi SB
tipe liar adalah 20 mg/l.
Biji SB-16 yang digunakan dalam penapisan adalah biji yang berasal dari
anakan ke-6. Pemilihan biji dari anakan ini didasarkan pada jumlah biji yang
cukup banyak dibandingkan yang lain. Hasil penapisan biji T1 SB-16-6 dan T2
SB-16-6-1 dengan menggunakan antibiotik higromisin menunjukkan pertumbuhan yang sedikit berbeda dengan SB tipe liar yang dikecambahkan dalam akuades
steril tanpa higromisin. Munculnya tajuk SB transgenik lebih cepat dibandingkan
SB tipe liar, tetapi pada hari ke-10, panjang tajuk SB transgenik umumnya lebih
pendek dibandingkan tipe liarnya. Selain itu, tajuk SB transgenik berwarna hijau
kekuningan, sedangkan SB tipe liar berwarna hijau cerah. Perbedaan lainnya
dapat dilihat dari morfologi akar. Akar SB transgenik tidak memiliki banyak
rambut akar dan pada beberapa kecambah terdapat akar yang menggulung. Hal ini
diduga merupakan efek dari cekaman higromisin, bukan bawaan genotipe SB
transgenik tersebut. Pernyataan ini juga diperkuat oleh fenotipe tanaman SB-16-61 yang tidak berbeda dengan SB tipe liar saat ditanam di rumah kaca.
Higromisin tergolong antibiotik yang sangat toksik bagi tanaman.
Higromisin termasuk antibiotik aminosiklitol yang dapat menghambat sintesis
protein dengan spektrum yang luas (Stewart 2008). Fosforilasi higromisin yang
dilakukan oleh tanaman yang telah tersisipi gen hpt menyebabkan tanaman
kekurangan unsur fosfor yang sangat penting untuk pembentukan ATP. Fosfor
berperan penting dalam pertumbuhan sel dan pembentukan rambut akar. Selain
itu, fosfor berperan dalam sintesis protein, terutama pada jaringan hijau (Osman
2012). Higromisin secara tidak langsung mengurangi penggunaan unsur fosfor
untuk pertumbuhan kecambah, sehingga SB-16-6-1 yang direndam dalam larutan
higromisin 20 mg/l memiliki akar dan tajuk yang lebih pendek, serta warna
11
tajuknya lebih pucat dibandingkan SB tipe liar yang ditumbuhkan pada larutan
higromisin 0 mg/l.
Uji khi-kuadrat dari hasil penapisan biji generasi T1 SB transgenik tidak
menunjukkan pola pewarisan 3:1, sedangkan biji generasi T2 menunjukkan pola
pewarisan tersebut. Seleksi biji umumnya menggunakan semua biji dari satu
rumpun, sedangkan pada penelitian ini seleksi biji yang dilakukan pada generasi
T1 hanya menggunakan biji dari satu malai. Biji T1 berasal dari tanaman T0 SB16 yang mengalami kimera. Hasil studi yang dilakukan oleh Hiei et al. (1994)
menunjukkan bahwa beberapa keturunan yang berasal dari R0 yang kimera
menunjukkan pola segregasi yang tidak mengikuti model Mendelian. Hal ini
mengindikasikan bahwa kimera pada tanaman dapat berpengaruh terhadap rasio
segregasi.
Biji generasi T2 yang diharapkan telah memiliki sisipan gen yang
homozigot ternyata masih menunjukkan pola pewarisan 3:1. Akan tetapi, hasil ini
mengindikasikan bahwa sisipan gen B11 hanya ada satu copy dalam genom padi
transgenik dan dalam kondisi heterozigot. Karakter yang dikendalikan oleh satu
gen akan menunjukkan segregasi fenotipe sesuai dengan model monohibrid
mendel (3:1) (Campbell et al. 2003).
Hasil pengamatan tanaman SB-16-6-1 dan tipe liar yang ditanam di rumah
kaca memberikan hasil yang hampir sama. Artinya, padi transgenik tersebut dapat
melakukan proses fisiologi yang tidak berbeda dengan padi non-transgenik.
Tinggi tanaman dan jumlah anakan diamati untuk melihat pengaruh sisipan gen
B11 terhadap pertumbuhan tanaman. Tinggi tanaman SB-16-6-1 sedikit lebih
tinggi dibandingkan SB tipe liar, tetapi jumlah anakan SB tipe liar lebih banyak
dibandingkan SB-16-6-1. Karakter reproduktif, terutama parameter jumlah dan
bobot biji, diamati untuk mengetahui potensi produksi padi dari tanaman SB-166-1. Hasil pengamatan karakter reproduktif menunjukkan bahwa SB-16-6-1
memproduksi jumlah biji yang lebih sedikit namun bobotnya lebih berat
dibandingkan SB tipe liar. Hal ini mengindikasikan bahwa SB-16-6-1 berpotensi
dikembangkan sebagai salah satu varietas padi yang dapat ditanam di lahan
masam dengan produksi yang cukup baik.
SIMPULAN
Uji stabilitas sisipan gen B11 dengan menggunakan padangan primer
promoter 35S CaMV dan gen B11 menunjukkan bahwa pada tanaman padi
generasi transgenik Situ Bagendit (SB) generasi T0 SB-16-6 dan T1 SB-16-6-1
mengandung sisipan gen B11. Pada generasi T0, gen hpt yang terdapat pada
plasmid pGWB5-B11 terintegrasi hanya pada anakan nomor 2, 4, dan 6. Gen hpt
pada generasi T1 dari anakan ke-6 (SB-16-6-1) tetap terintegrasi di dalam genom
tanaman. Marka hpt penyandi ketahanan terhadap higromisin pada plasmid
pGWB5-B11 yang digunakan dalam transformasi secara in-planta efektif
digunakan sebagai agen seleksi biji transgenik. Hasil seleksi menunjukkan bahwa
gen B11 pada padi SB generasi T2 masih diturunkan dari individu yang
heterozigot dengan pola pewarisan 3:1. Pertumbuhan tanaman SB-16-6-1 tidak
berbeda jauh dengan SB tipe liar berdasarkan karakter vegetatif dan reproduktif
yang diamati.
12
DAFTAR PUSTAKA
Campbell NA, Reece JB, Mitchell LG. 2002. Biologi. Lestari R, penerjemah;
Safitri A, Simarmata L, Hardani HW, editor. Jakarta (ID): Erlangga.
Terjemahan dari: Biology.
Elvarelza U. 2013. Karakter Pertumbuhan Akar sebagai Parameter Toleransi
Tanaman Padi terhadap Cekaman Aluminium [skripsi]. Bogor (ID): Institut
Pertanian Bogor.
Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumashiro T. 1994. Efficient transformation of rice
(Oryza sativa L.) medited by Agrobacterium and sequence analysis of the
boundaries of the T-DNA. The Plant Journal. 6:268-282.
Hock B, Elstner EF. 2005. Plant Toxicology. New York (US): Marcel Dekker.
Kavanagh K. 2006. Medical Mycology: Cellular and Molecular Technique.
Chichester (GB): J Wiley.
Lin Z, Zhou B, Yang Y, Mei J, Zhao X, Guo X, Huang X, Tan D, Liu X. 2009.
Piercing and vacuum infiltration of the mature embryo: a simplified method
for Agrobacterium-mediated transformation of indica rice. Plant Cell Rep.
28:1065-1074. Doi:10.1007/s00299-009-07-06-2.
Miftahudin, Scoles GJ, Gustafson JP. 2004. Development of PCR-based
codominant markers flanking the Alt3 gene in rye. Genome. 47:231-238.
Doi: 10.1139/G03-093.
Miftahudin, Chikmawati T, Ross K, Scoles GJ, Gustafson JP. 2005. Targeting the
aluminum tolerance gene Alt3 region in rye, using rice/rye microcoliniearity. Theor Appl Genet. 110:906-913. Doi: 10.1007/s00122-0041909-0.
Nester G, Wood D, Lu P. 2005. Global analysisis of Agrobacterium-plant
interaction. Di dalam: Tsuyumu S, Leach JE, Shiraishi T, Wolpert, editor.
Genomic and Genetic Analysis of Plant Parasitism and Defence. Minnesota
(US): The American Phytopathological Society. hlm 1-10.
[OECD] Organisation for Economic Co-operation and Development (FR). 1999.
Consensus document on the biology of Oryza sativa (rice). Paris (FR):
OECD.
Osman KT. 2012. Soils: Principles, Properties, and Management. London (GB):
Springer. doi: 10.1007/978-94-007-5663-2.
Pambudi A. 2012. Transformasi genetik padi (Oryza sativa L.) dengan kandidat
gen toleran aluminium [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Rahmawati H. 2006. Status Perkembangan Perbaikan Sifat Genetik Padi
Menggunakan Transformasi Agrobacterium. Jurnal Agro Biogen 2:36-44.
Roslim DI. 2011. Isolasi dan karakterisasi gen toleran aluminium pada padi
[Disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Suprihatno B, Daradjat AA, Satoto, Baehaki SE, Widiarta IN, Setyono A,
Indrasari SD, Lesmana OS, Sembiring H. 2009. Deskripsi Varietas Padi.
Subang (ID): Balai Besar Penelitian Tanaman Padi.
Stewart CN. 2008. Plant Biotechnology and Genetics: Principles, Technique, and
Application. New Jersey (US): J Wiley.
Tzfira T, Citovsky V. 2006. Agrobacterium-mediated genetic transformation of
plants: biology and biotechnology. Curr Opin Biotech. 17:147-154.
13
Yanagisawa S, Akiyama A, Kisaka H, Uchimiya H, Miwa T. 2004. Metabolic
engineering with Dof1 transcription factor in plants: improved nitrogen
assimilation and growth under low-nitrogen conditions. PNAS. 101:78337838.doi: 10.1073/pnas.0402267101.
Zambryski P. 1988. Basic process underlying Agrobacterium-mediated DNA
transfer to cell. Annu Rev Genet. 22:1-30.
LAMPIRAN
Lampiran 1 Peta linier daerah T-DNA pembawa gen B11 plasmid pGWB5-B11 (Roslim 2011).
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Tangerang pada tanggal 2 Juni 1991 sebagai anak
sulung dari pasangan Bapak Surmadi dan Ibu Lizana. Penulis lulus dari SMA
Negeri 7 Tangerang pada tahun 2009. Pada tahun yang sama, penulis diterima di
Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB
melalui jalur Ujian Seleksi Masuk Mahasiswa IPB (USMI).
Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten praktikum
Sistematika Tumbuhan Berpembuluh, Genetika Dasar, Biologi Dasar, dan
Fisiologi Tumbuhan pada tahun ajaran 2012/2013. Penulis melaksanakan kegiatan
studi lapangan di Hutan Pendidikan Gunung Walat (HPGW), Sukabumi dengan
judul Keragaman Epifit di Hutan Pendidikan Gunung Walat, Sukabumi, Jawa
Barat pada tahun 2011 yang dibimbing oleh Prof Alex Hartana. Penulis
melaksanakan kegiatan praktik lapangan di Kabupaten Tangerang dengan judul
Pengolahan Karet Compound di PT. Industri Karet Wijaya yang dibimbing oleh
Ir Sri Listiyowati, MSi.