Konstruksi Vektor RNAi Untuk Pembungkaman Gen Toleran Aluminium pada Padi Varietas Hawara Bunar

KONSTRUKSI VEKTOR RNAi UNTUK PEMBUNGKAMAN
GEN TOLERAN ALUMINIUM PADA PADI VARIETAS
HAWARA BUNAR

WINDARTI WAHYUNINGTYAS

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Konstruksi Vektor
RNAi Untuk Pembungkaman Gen Toleran Aluminium pada Padi Varietas Hawara
Bunar” adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
terbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor, Februari 2015
Windarti Wahyuningtyas
NIM G353100071

RINGKASAN
WINDARTI WAHYUNINGTYAS. Konstruksi Vektor RNAi untuk
Pembungkaman Gen Toleran Aluminium pada Padi Varietas Hawara Bunar.
Dibimbing oleh MIFTAHUDIN dan UTUT WIDYASTUTI.
Tanaman padi merupakan salah satu tanaman pangan penting di Indonesia.
Meningkatnya kebutuhan pangan seiring bertambahnya jumlah penduduk
mendorong pemerintah berupaya untuk terus meningkatkan kemampuan produksi
pangan. Salah satunya melalui usaha ekstensifikasi ke lahan marginal seperti
tanah masam. Perbaikan genetik tanaman perlu dilakukan untuk menghasilkan
tanaman dengan karakter agronomis yang baik tetapi juga toleran terhadap
aluminium (Al) dan tanah masam. Perbaikan tanaman tersebut dapat dilakukan
melalui rekayasa genetika. Salah satu gen yang diduga berperan dalam toleransi
Al pada padi adalah gen B11 yang telah diisolasi dari padi varietas Hawara Bunar
yang toleran Al. Gen ini sudah ditransformasi ke tanaman tembakau dan

menunjukkan adanya peningkatan toleransi terhadap Al dibandingkan tanaman
kontrol.
Penelitian dilaksanakan pada bulan Mei 2013 sampai November 2014 di
Laboratorium Fisiologi dan Genetika Tumbuhan serta rumah kaca Departemen
Biologi FMIPA Institut Pertanian Bogor. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk
mengkonstruksi vektor pANDA rekombinan yang membawa fragmen 3’UTR dari
gen B11 dan mengintroduksi konstruk tersebut ke dalam padi varietas Hawara
Bunar secara in-planta. Hasil yang diperoleh dalam penelitian ini dapat digunakan
sebagai bahan untuk mempelajari fungsi kandidat gen toleran Al pada padi
varietas Hawara Bunar.
Salah satu cara untuk mempelajari peranan gen toleran Al adalah dengan
menekan ekspresi gen B11 melalui teknik RNAi. Konstruksi vektor RNAi
(pANDA-3’UTR_B11) dilakukan menggunakan teknologi Gateway®. Fragmen
3’UTR_B11 digunakan sebagai pemicu RNA utas ganda (dsRNA), pENTR™/DTOPO® sebagai entry vector dan vektor pANDA sebagai destination vector.
Evaluasi hasil konstruksi vektor RNAi dilakukan melalui uji keberadaan
fragmen sisipan dengan teknik PCR menggunakan kombinasi beberapa primer
dan pengurutan DNA pada daerah pengklonan. Hasil uji sisipan fragmen dan
sekuensing terhadap vektor pANDA-3’UTR_B11 menunjukkan bahwa fragmen
3’UTR_B11 telah tersisipkan ke dalam vektor pANDA dengan orientasi
3’UTR_B11 berulang terbalik dengan urutan: promotor ubiquitin1 – 3’UTR_B11

– GUS linker – 3’UTR_B11 – terminator nos (konstruksi RNAi).
Konstruksi RNAi kemudian diintroduksi ke tanaman padi varietas Hawara
Bunar melalui bakteri A. tumefaciens AgL0 dengan teknik in-planta. Hasil uji
tanaman transgenik menggunakan primer GUS dari 20 tanaman yang diuji
menunjukkan 8 tanaman dengan seluruh anakannya adalah transgenik, sedangkan
12 tanaman lainnya dengan seluruh anakannya adalah non-transgenik. Efisiensi
transformasi yang diperoleh sebesar 45.53% dari total 112 anakan padi dengan 51
anakan positif transgenik.
Key words : 3’UTR_B11, padi, toleran Al, vektor RNAi

SUMMARY
WINDARTI WAHYUNINGTYAS. Construction of RNAi Vector to
Silence Aluminium Tolerance Gene in Rice Var. Hawara Bunar. Supervised by
MIFTAHUDIN and UTUT WIDYASTUTI.
Rice is one of the important food crop in Indonesia. Increasing food needs
as population growth prompted the government to continuously improve food
production capabilities. One of the efforts is through the agriculture
extensification into marginal lands such as acid soil. Plant genetic improvement
needs to be done to produce plants with good agronomic characters including
aluminum (Al) and acid soil tolerance characters. Crop improvement can be

achieved through genetic engineering. One of the genes that is suggested to play a
role in Al tolerance in rice is B11 gene, which was isolated from Al-tolerant rice
var. Hawara Bunar. The gene has been transformed into tobacco plants and could
increased Al tolerance in transgenic tobacco than that of the wild type.
The experiment was conducted at the Laboratory of Plant Physiology and
Molecular Biology and Green House of the Department of Biology, Bogor
Agricultural University from May 2013 to November 2014. The objectives of the
research were to construct pANDA recombinant vector carrying 3’UTR fragment
of B11 gene and to introduce the 3’UTR fragmentinto rice var. Hawara Bunar
using in-planta technique. It was expected that the RNAi construct and the
transgenic plants can be used as material for studying the function of B11 gene in
rice var. Hawara Bunar.
One of the techniques that can be used to study the function of the gene is
by supressing the gene expression through RNAi technique. RNAi vector was
constructed using the Gateway® technology. The 3'UTR_B11 fragment was used
as a trigger for a double-stranded RNA (dsRNA), pENTR™/D-TOPO® and
pANDA were used as an entry and destination vectors, respectively.
Evaluation of the clone was carried out using PCR technique and
sequencing the insertion region. The results showed that the 3’UTR_B11 fragment
has been succesfully inserted into pANDA-3'UTR_B11 vector with the insertion

order was: promoter ubiquitin1 - 3'UTR_B11 - GUS linker - 3'UTR_B11 - nos
terminator (RNAi construct). Both 3’UTRs fragments were inversely oriented.
The RNAi construct was introduced into rice var. Hawara Bunar through A.
tumefaciens AgL0 mediated transformation using in-planta techniques. The
results of transgenic verification using PCR technique with GUS primers showed
that among 20 transformants, 8 plants were transgenic, whereas 12 others were
non-transgenic or we obtained 51 positive transgenic tillers among 112 tillers
tested. The transformation efficiency was 45.53%.
Key words : 3’UTR_B11, rice, RNAi vector, Al tolerant

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

KONSTRUKSI VEKTOR RNAi UNTUK PEMBUNGKAMAN
GEN TOLERAN ALUMINIUM PADA PADI VARIETAS
HAWARA BUNAR

WINDARTI WAHYUNINGTYAS

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biologi Tumbuhan

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Aris Tjahjoleksono, DEA

Judul Tesis

Nama
NIM

: Konstruksi Vektor RNAi Untuk Pembungkaman Gen Toleran
Aluminium pada Padi Varietas Hawara Bunar
: Windarti Wahyuningtyas
: G353100071

Disetujui Oleh
Komisi Pembimbing

Dr Ir Miftahudin, MSi
Ketua

Dr Ir Utut Widyastuti, MSi
Anggota

Diketahui Oleh
Ketua Program Studi
Biologi Tumbuhan

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr Ir Miftahudin, MSi

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 5 Februari 2015

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat
dan karuniaNya, sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini dengan
judul Konstruksi Vektor RNAi Untuk Pembungkaman Gen Toleran Aluminium
pada Padi Varietas Hawara Bunar. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Mei
2013 sampai November 2014, di Laboratorium Fisiologi dan Genetika Tumbuhan
serta rumah kaca Departemen Biologi FMIPA Institut Pertanian Bogor.
Pada kesempatan ini, penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Ir.
Miftahudin, M.Si dan Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si selaku komisi pembimbing

yang telah memberikan bimbingan dan arahan serta dorongan semangat selama
proses penelitian sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan dengan baik. Selain
itu, penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Dr. Ir. Aris Tjahjoleksono,
DEA selaku penguji luar komisi yang telah memberikan saran dan masukan
sehingga karya ilmiah ini menjadi lebih baik. Ungkapan terima kasih juga penulis
ucapkan kepada seluruh dosen dan staf Program Studi Biologi Tumbuhan, rekan
kerja laboratorium Fisiologi dan Genetika Tumbuhan, dan seluruh rekan BOT
2010.
Penelitian ini dibiayai dari dana Hibah Penelitian Unggulan IPB dengan
dana DIPA BOPTN IPB tahun anggaran 2013 atas nama Dr. Ir. Miftahudin, M.Si.
Atas dana yang diberikan kami ucapkan terima kasih.
Ucapan terima kasih yang tak terhingga kepada daddy, mama, suami
Khamdan Kurniawan, dan anak tercinta Cantigi Kirana Maharani, serta seluruh
keluarga atas segala doa dan dukungan selama penulis menjalani program
Magister Sains di Institut Pertanian Bogor.
Akhir kata, semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Februari 2015
Windarti Wahyuningtyas
NIM G353100071

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
TINJAUAN PUSTAKA
Padi dan Cekaman Aluminium
Mekanisme Ketahanan Tanaman terhadap Cekaman Aluminium
Kontrol Genetik Tanaman terhadap Cekaman Aluminium
Teknik Introduksi Gen ke Tanaman
RNA Interference (RNAi)
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Bahan Penelitian
Metode
Amplifikasi fragmen 3'UTR_B11
Penyisipan fragmen 3'UTR_B11 ke dalam vektor pENTR™/D-TOPO®
Introduksi vektor pENTR™/D-TOPO®_3'UTR_B11 ke dalam bakteri E.
coli DH5α

Pengklonan 3'UTR_B11 ke vektor pANDA
Introduksi pANDA-3'UTR_B11 ke dalam bakteri E. coli DH5α
Introduksi pANDA-3'UTR_B11 ke dalam bakteri A. tumefaciens AgL0
Introduksi vektor RNAi ke tanaman padi
Identifikasi tanaman transgenik
HASIL DAN PEMBAHASAN
Konstruksi vektor RNAi
Tanaman Transgenik Hasil Transformasi RNAi
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
RIWAYAT HIDUP

vi
vi
1
1
2
2
2
3
4
6
7
8
8
8
10
10
10
11
11
11
12
12
13
13
13
17
19
19
20
20
24

DAFTAR TABEL
1
2
3

Primer yang digunakan dalam penelitian konstruksi vektor RNAi
Kombinasi primer yang digunakan untuk melihat susunan orientasi
gen target pada vektor pANDA-3’UTR_B11
Nilai efisiensi transformasi menggunakan teknik in-planta

9
12
19

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15

Homologi kromosom 4RL rye dengan kromosom 3 padi.
Lokasi penusukan jarum dalam infeksi in-planta pada padi
Mekanisme RNAi
Peta fisik vektor pENTR™/D-TOPO®
Vektor pANDA digunakan untuk konstruksi RNAi
Situs pengklonan pENTR™/D-TOPO®
Elektroforegram hasil PCR fragmen 3’UTR_B11 menggunakan primer
3’UTR_B11-F dan 3’UTR_B11-R
Elektroforegram hasil PCR fragmen 3’UTR_B11 yang sudah dipurifikasi
Elektroforegram hasil PCR koloni hasil transformasi vektor pENTR™/DTOPO®-3’UTR_B11 ke dalam bakteri E. coli DH5α
Elektroforegram hasil PCR koloni vektor pANDA-3’UTR_B11
menggunakan primer higromisin
Elektroforegram hasil PCR vektor pANDA-3’UTR_B11 menggunakan
primer GUS-F dan GUS-R
Elektroforegram hasil PCR vektor pANDA-3’UTR_B11 menggunakan
beberapa kombinasi primer
Hasil sekuensing vektor pANDA-3’UTR_B11 menggunakan primer
GUS-cek_F dan GUS-cek_R
Elektroforegram hasil PCR vektor pANDA-3’UTR_B11 menggunakan
beberapa kombinasi primer.
Elektroforegram hasil PCR tanaman transgenik menggunakan primer
GUS-F dan GUS-R

5
6
7
9
9
10
13
13
14
15
15
16
17
17
18

1

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tanaman padi (Oryza sativa L.) termasuk tanaman pangan penting di
Indonesia. Konsumsi beras sebagai makanan pokok bangsa Indonesia terus
meningkat sejalan dengan meningkatnya jumlah penduduk Indonesia. Upaya
pemenuhan permintaan yang meningkat tersebut cukup berat dilakukan dengan
terdapatnya sejumlah kendala, antara lain banyaknya sawah subur di Pulau Jawa
yang beralih fungsi menjadi kawasan industri maupun daerah pemukiman. Karena
itu, upaya mempertahankan dan meningkatkan produksi merupakan upaya yang
terus menerus dilakukan untuk memenuhi kebutuhan beras di Indonesia. Salah
satu upaya yang dilakukan adalah ekstensifikasi pertanian tanaman pangan ke
tanah masam.
Pertanian di tanah masam akan mengalami banyak kendala, diantaranya
kelarutan Aluminium (Al) yang tinggi akan menghambat pertumbuhan akar,
sehingga akar menjadi pendek dan tebal, percabangan tidak normal, dan tudung
akar rusak (Kochian 1995). Tanah masam ditandai dengan pH rendah, miskin
unsur hara makro, dan kelebihan unsur Al, Fe, dan Mn yang menjadi racun bagi
tanaman. Akibat yang sangat nyata dari keracunan Al pada tanaman adalah
terhambatnya pengambilan hara dan air oleh akar tanaman, sehingga dapat
menurunkan pertumbuhan dan produksi tanaman (Delhaize & Ryan 1995).
Perbaikan genetik tanaman yang mampu beradaptasi pada tanah masam
dengan kelarutan Al tinggi dapat dilakukan dengan perakitan tanaman melalui
persilangan konvensional dan seleksi sifat unggul yang diinginkan. Pendekatan
pemuliaan konvensional dihadapkan pada terbatasnya sumberdaya genetik,
sehingga perlu dilakukan pendekatan teknologi DNA rekombinan untuk merakit
tanaman transgenik yang toleran terhadap tanah masam dan Al tinggi. Pendekatan
yang perlu dilakukan adalah mengisolasi gen-gen yang terlibat dalam toleransi
tanaman terhadap tanah masam dan Al tinggi kemudian mengintroduksikan gen
tersebut ke tanaman target.
Sifat toleransi terhadap cekaman Al pada tanaman padi dikendalikan oleh
sejumlah lokus yang diantaranya terdapat pada kromosom 1 dan 3 (Wu et al.
2000; Nguyen et al. 2001; Mao et al. 2004). Miftahudin et al. (2005) melaporkan
bahwa daerah lokus pengendali sifat toleransi Al pada kromosom 4RL pada
tanaman rye (Secale cereale L.) memiliki hubungan sinteni dengan segmen
kromosom 3 tanaman padi. Melalui penapisan beberapa marka molekular yang
terdapat pada kromosom 3 tanaman padi telah ditemukan suatu daerah pada
kromosom 3 yang memiliki peningkatan ekspresi (up-regulated) saat diberi
perlakuan Al, yaitu gen B11. Peningkatan ekspresi daerah tersebut pada padi
toleran Al lebih tinggi dibandingkan dengan padi sensitif Al. Gen B11dari padi
var. Hawara Bunar telah berhasil diisolasi dan diklon ke dalam plasmid ekspresi
pGWB5 lalu dipelajari fungsinya pada tanaman tembakau. Tembakau transgenik
B11 mengalami peningkatan toleransi Al dibandingkan non-transgenik (Roslim
2011). Peran gen B11 pada padi perlu dikaji lebih lanjut untuk membuktikan
bahwa gen tersebut berperan dalam toleransi terhadap Al.
Perkembangan teknologi rekayasa genetika yang sangat pesat memberikan
harapan baru dalam memanipulasi tanaman agar dihasilkan varietas-varietas baru

2

dengan sifat unggul, termasuk tanaman yang tahan terhadap cekaman Al. Langkah
awal dalam rekayasa genetika adalah mempelajari peranan gen tertentu. Peranan
suatu gen dalam tanaman dapat dipelajari melalui pendekatan dua arah, yaitu
meningkatkan ekspresi gen dengan mengkonstruksi vektor over expression serta
menghentikan atau menurunkan ekspresi gen antara lain dengan mengkonstruksi
RNAi (RNA interference).
Teknik RNAi merupakan salah satu cara yang efektif untuk menguji fungsi
biologi mRNA target pada tanaman. Perkembangan terkini mengenai vektor
RNAi yang menggunakan promotor konstitutif dan teknik pengklonan secara
Gateway® memudahkan untuk mengkonstruksi vektor RNAi yang mempunyai
sekuen pemicu dsRNA dan memudahkan pula untuk menganalisis fungsi gen
target. RNAi dapat menyebabkan mRNA terdegradasi sehingga gen menjadi tidak
berfungsi. Dengan mengkonstruksi RNAi dari gen B11 diharapkan hasil yang
diperoleh dalam penelitian ini dapat digunakan sebagai bahan untuk mempelajari
fungsi kandidat gen toleran Al pada padi var. Hawara Bunar.

Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengkonstruksi vektor rekombinan pANDA
yang membawa fragmen 3’UTR dari gen B11 dan mengintroduksi konstruk RNAi
tersebut ke dalam padi var. Hawara Bunar secara in-planta.

TINJAUAN PUSTAKA
Padi dan CekamanAluminium
Padi secara taksonomi termasuk dalam Divisi Angiospermae, Kelas
Monocotiledonae, Ordo Poales atau Graminae, serta Genus Oryza. Padi
merupakan tanaman serealia sumber karbohidrat utama. Padi memiliki beragam
genotipe dalam hal toleransi terhadap cekaman Al. Beberapa genotipe sensitif dan
beberapa genotipe lainnya toleran. Beberapa contoh genotipe toleran Al antara
lain IRAT 144, IRAT 303, Hawara Bunar, IAC-1246, Azucena, IRAT 351, IRAT
352, IRAT 379, Grogol, Danau Gaung (Silitonga 2008; Roslim 2011), sedangkan
contoh genotipe padi sensitif Al antara lain IR64, Krowal (Roslim 2011),
Ciherang, dan Situ Bagendit. Penggunaan genotipe padi toleran dapat menjadi
solusi dalam ekstensifikasi pada tanah masam. Namun karena umumnya
produktivitas varietas-varietas toleran Al rendah, penggunaan varietas toleran
kurang disukai petani.
Peningkatan produksi padi dapat dilakukan dengan menerapkan intensifikasi
dan ekstensifikasi pertanian. Penerapan ekstensifikasi pertanian terkendala oleh
berkurangnya lahan pertanian, sehingga ekstensifikasi dapat diarahkan ke lahanlahan marginal, seprti tanah masam. Toksisitas Al merupakan salah satu kendala
dalam produktivitas pertanian pada tanah masam. Pada kondisi ini Al akan terlarut
menjadi bentuk Al3+ yang toksik bagi tanaman (Delhaize & Ryan 1995).
Pemberian kapur dapat dilakukan untuk memperbaiki sifat fisik dan kimia tanah

3

dengan kandungan Al yang tinggi, namun cara ini kurang efisien dan sulit
dilakukan terutama untuk tanah lapisan bawah, selain itu juga memerlukan biaya
yang mahal.
Respon yang terlihat pada tanaman yang tercekam Al adalah terhambatnya
pertumbuhan ujung akar (Hossain et al. 2005). Pada sel tudung akar dan
meristem, Al akan menyebabkan membesarnya vakuola. Efek cekaman Al yang
terlihat pada daun beberapa jenis tumbuhan adalah seperti defisiensi fosfor yang
secara umum akan terlihat kerdil, daun pendek dan berwarna hijau tua,
pembungaan terlambat, tulang daun berwarna keunguan, dan ujung daun berwarna
kekuningan. Cekaman Al akan mengurangi jumlah klorofil dan laju fotosintesis
akan menurun, namun laju transpirasi akan meningkat. Pada tingkat kejenuhan Al
yang tinggi, tanaman padi yang peka mempunyai ukuran lebih pendek dengan
jumlah anakan lebih sedikit dan daun-daun bagian bawah menguning, serta hasil
gabah yang rendah (de Lima & Copeland 1994).
Tanaman yang peka akan mengakumulasi Al lebih cepat dan lebih banyak
dibandingkan dengan tanaman yang toleran (Rincon & Gonzales 1992; Delhaize
& Ryan 1995). Pengaruh buruk keracunan Al pada tanaman ditandai oleh
sempitnya daerah perakaran sehingga kemampuan akar menyerap air dan hara
menjadi berkurang. Mekanisme toleransi berupa pengaktifan sekresi asam organik
berupa anion malat, sitrat, maupun oksalat ditemukan pada tanaman sorgum
(Sorghum bicolor L.), jagung (Zea mays L.), rye, barley (Hordeum vulgare L.),
dan gandum (Triticum aestivum L.) (Li et al. 2000; Furukawa et al. 2007; Ryan et
al. 2009). Respon lain pada tanaman padi var. Hawara Bunar dan Grogol (toleran
Al) menunjukkan adanya pengaktifan sekresi asam malat dan sitrat dibandingkan
padi var. IR64 (peka Al) saat diberi cekaman Al (Miftahudin & Chikmawati
2008).
Toksisitas Al juga terlihat seperti tanaman yang kekurangan kalsium atau
berkurangnya transport Ca2+ di dalam tanaman, seperti daun muda yang
menggulung, terhambatnya pertumbuhan batang lateral, atau terhambatnya titik
tumbuh petiola. Ujung akar (tudung akar, meristem, dan zona pemanjangan)
mengakumulasi Al lebih banyak dan pengaruhnya sangat besar terhadap
kerusakan fisiologis bila dibandingkan dengan jaringan akar dewasa (Ryan et al.
2011).
Tanah masam dengan kandungan Al tinggi merupakan faktor penting yang
membatasi pertumbuhan tanaman. Pengaruh Al terhadap pengambilan hara oleh
tanaman adalah menurunkan pengambilan kation bivalen oleh akar terutama Ca
dan Mg dan menurunkan pengambilan anion SO4, PO4, dan Cl. Pada tanaman
yang tercekam, Al ditemukan dalam sitoplasma sehingga merusak membran sel
dan terganggunya aktivitas beberapa enzim (Ryan et al. 1993).

Mekanisme Ketahanan Tanaman terhadap Cekaman Aluminium
Mekanisme toleransi tanaman terhadap Al dapat dikelompokkan menjadi
dua, yaitu mekanisme eksternal dan internal. Mekanisme eksternal merupakan
bentuk pencegahan Al untuk masuk ke dalam sel akar tanaman dengan cara
pengkelatan Al oleh asam organik, sedangkan mekanisme internal merupakan
proses akumulasi Al di dalam sel (Kochian 1995; Matsumoto 2000).

4

Tanaman gandum yang menghasilkan asam malat lebih toleran terhadap
cekaman Al dibandingkan tanaman yang tidak menghasilkan asam malat. Asam
malat yang dihasilkan akan mengkelat Al yang ada dalam larutan tanah sehingga
toksisitas Al akan berkurang (Delhaize et al. 1993). Tanaman toleran Al
mengeluarkan eksudat malat lebih banyak dibandingkan dengan tanaman yang
peka (Kochian 1995).
Mekanisme toleransi terhadap Al lebih ditentukan oleh kemampuan akar
tanaman mencegah masuknya Al ke membran sel dengan mengeksresikan asam
malat organik (Ryan et al. 2001). Beberapa senyawa organik yang dihasilkan oleh
ujung akar tanaman dan dapat mengkelat Al, antara lain sitrat, malat, dan
oksaloasetat (Zheng et al. 1998). Adanya keragaman sifat toleran yang berbeda
antar spesies tanaman menunjukkan adanya mekanisme yang berbeda dari setiap
tanaman dalam mengatasi kehadiran Al yang bersifat racun. Hal ini menunjukkan
bahwa mekanisme tersebut dikendalikan oleh faktor genetik yang berbeda pada
setiap genotipe tanaman.
Kriteria tanaman yang toleran Al antara lain akar sanggup tumbuh terus dan
ujung akar tidak rusak, sanggup menciptakan keadaan yang kurang masam di
daerah perakaran, dan translokasi ion Al ke bagian atas tanaman sedikit karena
sebagian besar ditahan oleh akar (Ryan et al. 2001).

Kontrol Genetik Tanaman terhadap Cekaman Aluminium
Sifat toleran tanaman terhadap cekaman lingkungan berhubungan dengan
faktor genetik dan lingkungan. Keragaman yang ada pada tanaman dapat
digunakan untuk menyeleksi sifat yang diinginkan. Mekanisme keracunan Al
pada tanaman belum diketahui secara pasti dan memiliki keragaman pada jenis
yang berbeda (Vitorello et al. 2005). Metode yang dapat dilakukan adalah dengan
menyeleksi dan menggunakan genotipe-genotipe yang bersifat toleran terhadap
cekaman Al di tanah masam.
Tanaman padi merupakan tumpuan untuk pengembangan galur tanaman
serealia yang toleran cekaman Al. Pendekatan yang dilakukan untuk menentukan
gen toleran cekaman Al tersebut meliputi studi genetika untuk mengidentifikasi
lokus toleran Al seperti pemetaan molekuler guna mengidentifikasi penanda DNA
toleran cekaman Al, isolasi dan karakterisasi gen-gen yang diinduksi selama
keracunan Al, produksi dan evaluasi tanaman mutan, dan penggunaan berbagai
tanaman transgenik dalam studi toleransi Al. Pendekatan tersebut berperan besar
untuk memahami mekanisme toleransi Al pada tanaman (Samac & Tesfaye 2003).
Mekanisme toleransi cekaman Al berbeda antar tanaman dan antar varietas dalam
spesies. Keanekaragaman genetika toleransi tanaman terhadap Al pada beberapa
jenis tanaman sereal dari famili Triticeae telah dilakukan (Vitorello et al. 2005).
Pada tanaman gandum dan rye, sifat toleransi Al ditentukan oleh satu atau
beberapa gen (Sasaki et al. 2004; Magalhaes et al. 2004), sedangkan pada
tanaman padi atau jagung, toleransi cekaman Al bersifat multigen dan kuantitatif
(Wu et al. 2000; Nguyen et al. 2001; Kochian et al. 2004).
Program pemuliaan tanaman pangan yang toleran terhadap cekaman Al
perlu dilakukan. Gen-gen yang terlibat dalam toleransi cekaman Al pada beberapa
tanaman telah berhasil diidentifikasi. Pada tanaman gandum gen penyandi

5

metallothionein-like proteins (WALI1), phenylalanine ammonialyase (WALI4),
putatif inhibitor proteinase (WALI3 dan WALI5), dan asparagine synthetase
merupakan beberapa gen yang ekspresinya diinduksi oleh cekaman Al (Snowden
et al. 1995). Mao et al. (2004) melaporkan 19 lokus gen pada tanaman padi yang
ekspresinya diinduksi dan diregulasi oleh cekaman Al. Terdapat tujuh gen
diantaranya terlibat dalam metabolism komponen dinding sel di akar, namun tidak
ditemukan gen yang terlibat dalam sintesis dan pelepasan asam organik. Pada
kondisi tercekam Al, tanaman padi baik yang toleran maupun yang peka Al
memberikan respon yang sama yaitu melepaskan asam sitrat dalam jumlah yang
sedikit (Ma et al. 2002, 2005).
Tanaman rye lebih toleran terhadap cekaman Al daripada gandum. Toleransi
Al pada tanaman rye dikendalikan oleh gen tunggal Alt3 yang terletak pada
kromosom 4RL (Miftahudin et al. 2005). Terdapat homologi antara daerah Alt3
tanaman rye dengan klon BAC kromosom 3 padi. Penapisan marka berdasarkan
sekuen BAC kromosom 3 padi pada rye menghasilkan 4 marka terpilih (B11,
B25, B26, B27) yang kemudian diuji pada populasi F2 silangan rye varietas peka
dan toleran Al. Dua dari keempat marka tersebut, yaitu B11 dan B26 mengalami
ko-segregasi dengan lokus Alt3 yang mengindikasikan bahwa gen Alt3 berjarak
sangat dekat dengan kedua marka tersebut. Hubungan homologi antara padi dan
rye ditampilkan oleh Gambar 1. Gen Alt3 terletak di antara interval B11 dan B26,
atau bahkan dapat merupakan B11 atau B26 itu sendiri (Miftahudin et al. 2005).

Gambar 1 Homologi kromosom 4RL rye dengan kromosom 3 padi. Gen Alt3
yang berperan terhadap toleransi terhadap Al pada rye berjarak sangat
dekat dengan marka B11 dan B26 (Miftahudin et al. 2005).
Penelitian selanjutnya dilakukan oleh Roslim (2011). Hasil penelitian
tersebut menunjukkan bahwa B11 mengalami peningkatan ekspresi saat diberi
cekaman Al. Tingkat ekspresi tersebut lebih tinggi pada genotipe toleran Al
dibandingkan genotipe sensitif Al. Berdasarkan hasil tersebut maka gen B11 dapat
dijadikan sebagai salah satu kandidat gen toleran Al. Gen B11 diisolasi dan diklon
ke dalam plasmid pGWB5. Pengujian gen B11 sebagai gen toleran Al telah
dilakukan pada tanaman tembakau. Hasil pengujian menunjukkan adanya
peningkatan toleransi Al pada tembakau transgenik dibandingkan tembakau
kontrol (Roslim 2011).

6

Teknik Introduksi Gen ke Tanaman
Introduksi gen target ke dalam genom tanaman dapat dilakukan
menggunakan Agrobacterium tumefaciens. Introduksi gen dengan cara ini relatif
lebih mudah dan peluang mendapatkan sisipan gen tunggal lebih tinggi
dibandingkan dengan teknik particle bombardment, sehingga stabilitas ekspresi
gen lebih tinggi (Hansen & Chilton 1996; Dai et al. 2001; Rahmawati 2006).
Regulasi proses transfer dan integrasi DNA ke dalam genom inang dilakukan oleh
plasmid Ti pada A. tumefaciens yang mempunyai 6-8 operon (tergantung strain
bakteri) (Rahmawati 2006). Daerah yang akan ditransfer ke dalam genom inang
adalah daerah T-DNA yang dibatasi oleh Left Border (LB) dan Right Border (RB)
(Glick & Pasternak 1998).
Infeksi in-planta merupakan teknik transformasi sederhana yang pertama
kali dikembangkan oleh Kojima et al. (2000). Teknik ini memiliki kelebihan
dibandingkan dengan teknik kultur jaringan. Kelebihan dari teknik ini adalah tidak
membutuhkan kondisi aseptik, tidak terjadi variasi somaklonal, tidak ada masalah
dalam hal regenerasi sehingga proses pengerjaan dapat diprediksi. Awalnya teknik
ini dilakukan pada tanaman Arabidopsis melalui infeksi pada organ bunga (Bent
2000). Kojima et al. (2000) melakukan modifikasi menggunakan sel meristem
kecambah sebagai objek infeksi melalui penusukkan jarum yang dilumuri
suspensi A. tumefaciens pada tanaman buckwheat (Fagophyrum esculentum).
Teknik ini juga dilakukan pada tanaman kenaf (Hibiscus cannabinus) dengan
memberikan efisiensi transformasi 85% (Kojima et al. 2004).
Teknik in-planta pada padi indica pertama kali dilakukan oleh Lin et al.
(2009). Lokasi penusukan yang tepat pada embrio untuk memberikan hasil
terbaik, yaitu pada meristem daerah plumula (Gambar 2).

Gambar 2 Lokasi penusukan jarum dalam infeksi in-planta pada padi (Lin et al.
2009)
Kelemahan dari teknik in-planta adalah terjadinya kimera karena lokasi
bagian meristem tidak dapat dipastikan terkena tusukan jarum. Apabila bagian
embrio yang terkena tusukan jarum maka akan dihasilkan tanaman kimera
(sebagian transgenik, sebagian lainnya non-transgenik). Hal tersebut disebabkan
karena embrio merupakan primordia organ yang sudah terdiferensiasi. Teknik inplanta sudah banyak dilakukan pada beberapa tanaman seperti padi dan gandum
(Supartana et al. 2006; Risacher et al. 2009), kaktus (Notocactus scopa cv.

7

Soonjung) (Seol et al. 2008), alfalfa (Weeks et al. 2008), jagung (Chumakov et al.
2006), Medicago truncatula (Trieu et al. 2000), kacang tanah (Rohini &Rao
2000), dan kapas (Keshamma et al. 2008).

RNA Interference (RNAi)
RNAi merupakan potongan kecil RNA yang dapat menginduksi
penghancuran mRNA tertentu sebelum proses transkripsi di dalam sitoplasma.
Prinsip dasarnya adalah bahwa masuknya RNA utas ganda (dsRNA) ke dalam
sitoplasma akan membungkam ekspresi suatu gen di tingkat pasca-transkripsi.
Adanya RNAi menyebabkan RNA yang ada di dalam sel dapat diikat oleh RNAi
untuk membentuk RNA utas ganda (dsRNA). RNA utas ganda dipotong oleh
enzim Dicer di sitoplasma menjadi fragmen dsRNA pendek berukuran 21-26
nukleotida dengan 2 nukleotida ujung 3’ tidak berpasangan. Fragmen pendek
tersebut disebut small interfering RNAs (siRNAs) (Waterhouse et al. 2001;
Hannon 2002; Pickford & Cogoni 2003). RNA utas ganda terdiri atas utas sense
dan utas antisense. Utas antisense yang diketahui sebagai utas pemandu (guide
strand) bergabung dengan RISC (RNA-induced silencing complex) dan berasosiasi
dengan mRNA target (Hammond et al. 2000). Asosiasi tersebut mengaktivasi
fungsi RISC untuk mendegradasi mRNA target dan menginduksi pemotongan
mRNA oleh Argonaute, yaitu komponen katalitik dari kompleks RISC (Ahlquist
2002). Degradasi mRNA akan menekan ekspresi gen pada berbagai tingkat l
(Meister & Tuschl 2004). Mekanisme RNAi ditunjukkan pada Gambar 3.

Gambar 3. Mekanisme pembungkaman ekspresi gen oleh RNAi
Berdasarkan mekanisme selulernya, pembentukan dsRNA dapat terjadi
melalui dua cara, yaitu secara eksogen dan endogen (Bagasra & Priliman 2004).
Secara eksogen, dsRNA dapatberasal dari infeksi virus dengan sebuah genom

8

RNA atau dari manipulasi laboratorium yang secara langsung masuk ke dalam
sitoplasma dan dipotong menjadi fragmen kecil oleh enzim Dicer. Secara
endogen, dsRNA berasal dari dalam sel sebagai pre-microRNA yang
diekspresikan dari gen penyandi RNA dalam genom. Transkrip dari gen tersebut
membentuk struktur jepit rambut (stem-loop) yang kemudian dikeluarkan ke
sitoplasma untuk dipotong oleh enzim Dicer.
Salah satu vektor RNAi yang dapat digunakan untuk mempelajari fungsi
gen target adalah vektor pANDA (Miki & Shimamoto 2004). Vektor ini
menggunakan promotor Ubiquitin1 dari jagung yang mengontrol ekspresi mRNA
berulang terbalik dari sekuen gen target. Orientasi mRNA berulang terbalik
merupakan pemicu pembentukan siRNA. Aplikasi vektor ini dengan gen penyandi
green fluorescent protein (GFP) dan ohytoene desaturase (PDS) dapat menekan
ekspresi kedua gen tersebut pada tanaman padi (Miki et al. 2005). Telah
dikembangkan vektor RNAi yang indusibel dan spesifik jaringan yang sesuai
untuk analisis fungsi gen (Islam et al. 2005).
Telah dilakukan penggabungan sekuen unik berulang terbalik dari 3’UTR
(untranslated region) yang diperoleh dari famili gen OsRac padi dengan promotor
stabil yang kemudian diintroduksikan ke dalam padi. Ekspresi dari masing-masing
sembilan anggota famili gen OsRac ditekan oleh konstruksi berulang terbalik
tersebut. Ekspresi mutan berulang terbalik menggunakan gabungan dari beberapa
3’UTR membungkam ekspresi tiga anggota famili gen OsRac (Miki et al. 2005).
Selanjutnya dengan menggunakan daerah yang terkonservasi tinggi dari famili
gen OsRac, ekspresi dari semua anggota famili gen OsRac juga berhasil ditekan
dengan efisiensi yang berbeda-beda. Hasil tersebut menunjukkan bahwa RNAi
merupakan metode yang bermanfaat untuk menganalisis fungsi famili gen pada
padi dan tanaman lain (Miki et al. 2005).

BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Fisiologi dan Genetika Tumbuhan
serta rumah kaca Departemen Biologi FMIPA Institut Pertanian Bogor dari bulan
Mei 2013 sampai November 2014.

Bahan Penelitian
Bahan tanaman yang digunakan adalah biji padi var. Hawara Bunar (toleran
Al) dan IR64 (peka Al). Bakteri E. coli DH5α dan A. tumefaciens AgL0
digunakan sebagai inang vektor rekombinan dan inang vektor biner. Primer yang
digunakan dalam penelitian ini disajikan pada Tabel 1.

9

Tabel 1 Primer yang digunakan dalam penelitian konstruksi vektor RNAi
Primer
3’UTR_B11-F

3’UTR_B11-R
GUS – F
GUS – R
GUS_cek – F

UrutanBasa

Kegunaan
Amplifikasi fragmen
5’-CACCCTGTTTCTCCCCAAGTTCAG-3’ 3’UTR_B11 dan cek
orientasi insert
Amplifikasi fragmen
5’-GTCACGAGTGGCATTTGAG-3’
3’UTR_B11 dan cek
orientasi insert
Cek GUS linker dan cek
5’-CATGAAGATGCGGACTTACG-3’
insersi
Cek GUS linker dan cek
5’-ATCCACGCCGTATTCGG-3’
insersi
5’-CCGAATACGGCGTGGAT-3’

Cek orientasi insert

Kloning kit vektor pENTR™/D-TOPO® (Invitrogen™, USA) (Gambar 4)
dan vektor pANDA (koleksi Prof. Ko Shimamoto, NAIST, Japan) (Gambar 5)
masing-masing digunakan sebagai entry vector dan destination vector dalam
konstruksi vektor RNAi.

Gambar 4 Peta fisik vektor pENTR™/D-TOPO® (Invitrogen, USA)

Gambar 5. Vektor pANDA digunakan untuk konstruksi RNAi berukuran 20 kb
(Miki and Shimamoto 2004). LB, left border; RB, right border; NPT
II, gen resisten Kanamycin; HPT, gen resisten Hygromycin; Ubq pro.,
promoter ubiquitin1 jagung + intron pertama; attR, kaset rekombinasi
LR clonase; attR1 & attR2, situs rekombinasi LR clonase; CmR, gen
resisten Chloramphenicol; ccdB, gen ccdB; NOSt, terminator NOS.

10

Metode
Amplifikasi fragmen 3’UTR_B11
Fragmen 3’UTR_B11 diamplifikasi dari gen B11 yang telah diklon
sebelumnya oleh Roslim (2011). Agar fragmen 3’UTR_B11 dapat disisipkan pada
situs pengklonan vektor pENTR™/D-TOPO®, perlu ditambahkan sekuen spesifik
CACC pada ujung 5’ primer forward 3’UTR_B11 (Gambar 6). Amplifikasi
3’UTR_B11 dilakukan menggunakan PCR kit Dreamtaq (Fermentas, USA)
dengan primer 3’UTR_B11-F dan 3’UTR_B11-R. Komposisi reaksi PCR yang
digunakan adalah 100 ng DNA template, 1x buffer PCR (+Mg2+), 0.2 mM dNTPs,
0.4 µM primer 3’UTR_B11-F dan primer 3’UTR_B11-R, dan 1 unit Taq
polymerase dalam 20 µl total reaksi PCR. Program PCR yang digunakan adalah
pra-denaturasi 94ºC 5 menit; diikuti dengan 35 siklus denaturasi 94ºC 1 menit,
penempelan primer 56ºC 30 detik; pemanjangan 72ºC 30 detik; dan diakhiri
dengan pasca-PCR 72ºC 10 menit, dan penyimpanan 4ºC 30 menit. Produk PCR
dielektroforesis pada 1% gel agarosa (LE GQ Top Vision, Fermentas, Kanada)
dalam buffer 1x TBE dengan pewarnaan etidium bromida konsentrasi 10 mg/ml
(Biobasic, Kanada). Gel diamati dan didokumentasi menggunakan Wise Doc Gel
Documentation System (Daihan Scientific, Korea Selatan). Purifikasi terhadap
hasil PCR fragmen 3’UTR_B11 dilakukan dengan cara elusi dari gel agarosa
mengikuti prosedur kit Gel Extraction Tool (Geneaid, Taiwan).
Penyisipan fragmen 3’UTR_B11 ke dalam vektor pENTR™/D-TOPO®
Proses penyisipan fragmen 3’UTR_B11 dengan vektor pENTR™/DTOPO® menggunakan kloning kit pENTR™/D-TOPO® (Invitrogen, USA).
Ilustrasi situs pengklonan fragmen 3’UTR_B11 ditunjukkan oleh Gambar 6.
Komposisi reaksi ligasi yang digunakan adalah 2 µl (8 ng) produk PCR, 1 μl
larutan garam (1.2 M NaCl dan 0.06 M MgCl2), 1 μl (15-20 ng) vektor
pENTR™/D-TOPO®, dan 2 μl dH2O. Komponen reaksi tersebut diinkubasi pada
suhu 22.5°C selama 30 menit. Enzim Topoisomerase I akan meligasi vektor dan
insert selama proses inkubasi. Sebanyak 3 μl reaksi ligasi dicampur dengan
bakteri E. coli DH5α kompeten untuk proses introduksi vektor pENTR™/DTOPO®-3’UTR_B11 ke bakteri E. coli DH5α.

Gambar 6. Situs pengklonan pENTR™/D-TOPO® (Invitrogen, USA)

11

Introduksi vektor pENTR™/D-TOPO®-3’UTR_B11 ke dalam bakteri E. coli
DH5α
Proses introduksi vektor pENTR™/D-TOPO®-3’UTR_B11 ke dalam
bakteri E. coli DH5α dilakukan mengikuti metode heat shock (Sambrook et al.
1989). Bakteri transforman ditumbuhkan dalam media seleksi Luria Agar (LA)
yang mengandung 50 ppm kanamisin. Koloni bakteri yang tumbuh diambil untuk
PCR koloni mengikuti prosedur yang dilakukan Suharsono et al. (2008) dengan
pasangan primer 3’UTR_B11-F dan 3’UTR_B11-R. PCR menggunakan PCR kit
Dreamtaq (Fermentas, USA) dengan komposisi yang sama dengan proses
amplifikasi fragmen 3’UTR_B11, namun DNA template berasal dari totolan
koloni bakteri. Kondisi program lisis 96ºC 5 menit; 50ºC 1.5 menit; 96ºC 1.5
menit; 45ºC 1.5 menit, 96ºC 1 menit; dan 40ºC 1 menit (PCR di pause untuk
memasukkan mix PCR); kemudian diikuti dengan 35 siklus program PCR
denaturasi 94ºC 30 detik; penempelan primer 56ºC 30 detik; pemanjangan 72ºC
30 detik; dan diakhiri dengan pasca-PCR 72ºC 10 menit; dan penyimpanan 4ºC 30
menit. Berdasarkan PCR koloni, maka koloni yang positif membawa vektor
pENTR™/D-TOPO®-3’UTR_B11 diisolasi menggunakan Wizard Minicolumn
Plasmid Extraction kit (Promega, USA).
Pengklonan 3’UTR_B11 ke vektor pANDA
Pengklonan vektor 3’UTR_B11 ke vektor pANDA menggunakan Gateway®
LR Clonase® II enzyme mix (Invitrogen™, USA). Proses tersebut untuk
mendapatkan vektor RNAi rekombinan (pANDA-3’UTR_B11). Komposisi reaksi
adalah 50-150 ng entry clone (pENTR™/D-TOPO®-3’UTR_B11), 150 ng vektor
pANDA, dan buffer TE pH 8.0 (1 M Tris-HCl pH 8 dan 0.5 M EDTA pH 8)
hingga volume 8 µl. Selanjutnya 2 µl enzim LR klonase ditambahkan ke dalam
campuran reaksi tersebut lalu diinkubasi pada suhu 25°C selama semalam. Reaksi
tersebut dihentikan dengan ditambahkan larutan proteinase K (2 μg/µl) sebanyak
1 µl dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 10 menit. Sebanyak 3 μl reaksi ligasi
dicampur dengan bakteri E. coli DH5α kompeten untuk proses introduksi vektor
pANDA-3’UTR_B11 dengan bakteri E. coli DH5α.
Introduksi pANDA-3’UTR_B11 ke dalam bakteri E. coli DH5α
Introduksi vektor pANDA-3’UTR_B11 ke dalam bakteri E. coli DH5α
kompeten dilakukan sama seperti prosedur transformasi vektor pENTR™/DTOPO®-3’UTR_B11 di atas. Koloni bakteri E. coli DH5α transforman yang
tumbuh pada media seleksi LA yang mengandung 50 ppm kanamisin dan 50 ppm
higromisin diambil untuk PCR koloni mengikuti prosedur yang dilakukan
Suharsono et al. (2008). PCR koloni dilakukan menggunakan beberapa kombinasi
primer (Tabel 2). Komposisi, program, dan suhu penempelan PCR sama seperti
tahap introduksi vektor pENTR™/D-TOPO®-3’UTR_B11ke dalam bakteri E. coli
DH5α.

12

Tabel 2 Kombinasi primer yang digunakan untuk melihat susunan orientasi gen
target pada vektor pANDA-3’UTR_B11
No

Kombinasi Primer
Forward

Reverse

1

GUS_cek-F

3’UTR_B11-R

2

GUS_cek-F

3’UTR_B11-F

3

GUS_cek-R

3’UTR_B11-F

4

GUS_cek-R

3’UTR_B11-R

Introduksi pANDA-3’UTR_B11 ke dalam bakteri A. tumefaciens AgL0
Introduksi vektor pANDA_3’UTR_B11 ke dalam bakteri A. tumefaciens
AgL0 dilakukan dengan metode freeze thaw mengikuti prosedur yang dilakukan
Xu dan Li (2008) dan diseleksi pada media LA yang mengandung 50 ppm
kanamisin, 50 ppm higromisin dan 25 ppm rifampisin. Koloni bakteri yang
tumbuh diambil untuk PCR koloni mengikuti prosedur yang dilakukan Suharsono
et al. (2008) menggunakan beberapa kombinasi primer (Tabel 2). Amplifikasi
PCR menggunakan kit KAPA2G™ Fast ReadyMix (2x) (Kapa Biosystems,
USA). Komposisi PCR yang digunakan adalah 100 ng DNA template, 0.50 µM
primer GUS-F dan GUS-R, KAPA2G™ Fast ReadyMix (2x), dan dH2O sampai
volume total 25 µl. Program PCR yang digunakan adalah pra-denaturasi 95°C 3
menit; diikuti dengan 35 siklus denaturasi 95°C 15 detik; penempelan primer
56°C 15 detik; pemanjangan 72°C 15 detik; dan diakhiri dengan pasca-PCR 72°C
10 menit; penyimpanan 4°C 30 menit.
Introduksi vektor RNAi ke tanaman padi
Infeksi in-planta dilakukan sesuai prosedur yang dipaparkan Supartana et al.
(2006) dengan modifikasi. Terlebih dahulu biji padi var. Hawara Bunar diinkubasi
pada suhu 37°C selama 24 jam. Setelah diinkubasi, kulit biji padi dikupas
kemudian disterilisasi permukaannya menggunakan larutan NaOCl 1% selama 15
menit dan dibilas 3x menggunakan akuades steril. Selanjutnya biji padi direndam
dalam akuades selama 24 jam hingga daerah embrio terlihat berwarna putih.
Bakteri A. tumefaciens yang digunakan untuk infeksi adalah suspensi A.
tumefaciens dengan OD660 = 1.0 (Hiei & Komari 2008) dalam akuades steril.
Embrio dari biji padi yang telah direndam kemudian ditusuk menggunakan jarum
(diameter 0.5 mm) sedalam kira-kira 1-1.5 mm yang sebelumnya dicelupkan ke
dalam suspensi A. tumefaciens.
Biji padi yang embrionya telah ditusuk kemudian diletakkan pada petri yang
sebelumnya diberi alas kapas dan kertas saring basah, lalu diinkubasi selama 7
hari di ruang gelap pada suhu 23ºC. Setelah itu kecambah padi yang tumbuh
dipindahkan ke dalam baki berisi tanah dan pupuk kandang yang telah
dilumpurkan terlebih dahulu. Kecambah ditumbuhan selama 2 minggu untuk
proses aklimatisasi. Tanaman padi tersebut kemudian dipindahkan ke dalam
ember berisi media yang sama dan diletakkan di dalam rumah kaca.

13

Identifikasi tanaman transgenik
Uji keberhasilan introduksi RNAi ke genom padi dilakukan dengan
mengisolasi DNA tanaman padi dengan metode isolasi cepat menggunakan buffer
lisis SDS (Miftahudin et al. 2004). Isolasi dilakukan pada daun tiap anakan. DNA
masing-masing anakan kemudian digunakan sebagai template untuk amplifikasi
fragmen GUS menggunakan PCR dengan primer GUS-F dan GUS-R dan kit
KAPA2G™ Fast ReadyMix (2x) (Kapa Biosystems, USA). Komposisi PCR yang
digunakan adalah 100 ng DNA template, 0.50 µM primer GUS-F dan GUS-R,
KAPA2G™ Fast ReadyMix (2x), dan dH2O sampai volume total 25 µl. Program
PCR yang digunakan adalah pra-denaturasi 95°C 3 menit; diikuti oleh 35 siklus
denaturasi 95°C 15 detik; penempelan primer 56°C 15 detik; pemanjangan 72°C
15 detik; dan diakhiri dengan pasca-PCR 72°C 10 menit; dan penyimpanan 4°C
30 menit.

HASIL DAN PEMBAHASAN
Konstruksi Vektor RNAi
Fragmen 3’UTR_B11 diisolasi dari fragmen utuh gen B11 yang telah diklon
pada penelitian sebelumnya (Roslim 2011). Amplifikasi fragmen 3’UTR_B11
dilakukan dengan PCR menggunakan pasangan primer 3’UTR_B11-F dan
3’UTR_B11-R. Fragmen 3’UTR_B11 yang berukuran 199 bp (195 bp fragmen
3’UTR_B11 + 4 bp sekuen CACC dan komplemennya) telah berhasil diperoleh
dari proses PCR (Gambar 7) dan telah dipurifikasi (Gambar 8).
M

A

UTR UTR

1

500 bp
200 bp

Gambar 7 Elektroforegram hasil PCR fragmen3’UTR_B11 menggunakan primer
3’UTR_B11-F dan 3’UTR_B11-R. M: marka 100 bp. A: kontrol
negatif (tanpa DNA)
M

500 bp

200 bp

A

UTR UTR

14

Gambar 8 Elekroforegram hasil PCR fragmen 3’UTR_B11 yang sudah
dipurifikasi. M: marka 100 bp. A: kontrol negatif (tanpa DNA)
Fragmen 3’UTR_B11 yang sudah dipurifikasi kemudian diklon ke dalam
vektor pENTR™/D-TOPO®. Hasil pengklonan tersebut adalah vektor pENTR™/DTOPO®-3’UTR_B11 yang kemudian dimasukkan melalui proses transformasi ke
dalam bakteri E. coli DH5α. Proses transformasi telah berhasil dilakukan yang
ditunjukkan dengan tumbuhnya koloni bakteri E. coli DH5α transforman pada
media seleksi LA yang mengandung antibiotik 50 ppm kanamisin. Seleksi melalui
PCR koloni juga menunjukkan proses transformasi ini telah berhasil dilakukan.
PCR koloni menggunakan primer 3’UTR_B11-F dan 3’UTR_B11-R dengan hasil
berupa fragmen DNA berukuran 199 bp (Gambar 9).
M

A 1

2

3

4

5

6

500 bp
200 bp

Gambar 9 Elektroforegram hasil PCR koloni hasil transformasi vektor
pENTR™/D-TOPO®-3’UTR_B11 ke dalam bakteri E. coli DH5α
berupa fragmen 3’UTR_B11 dengan ukuran 199 bp (No. 1-6). M:
marka 100 bp. A: kontrol negatif (tanpa DNA)
Koloni bakteri E. coli DH5α transforman hasil PCR koloni yang tumbuh
pada media seleksi LA yang mengandung 50 ppm kanamisin kemudian
ditumbuhkan pada media LB dengan 50 ppm kanamisin dan digunakan untuk
isolasi vektor pENTR™/D-TOPO®-3’UTR_B11.
Vektor pENTR™/D-TOPO®-3’UTR_B11 yang telah diisolasi selanjutnya
digunakan sebagai shuttle vector untuk mengklon 3’UTR_B11 ke dalam vektor
pANDA. Hasil rekombinasi antara attR1 dari vektor pANDA dan attL1 dari
vektor pENTR™/D-TOPO®-3’UTR_B11 dan attR2 dari vektor pANDA dan attL2
dari pENTR™/D-TOPO®_3’UTR_B11 menyebabkan terjadinya penyisipan
fragmen 3’UTR_B11 ke dalam vektor pANDA pada dua daerah yang orientasinya
terbalik (inverted), yang selanjutnya disebut sebagai pANDA-3’UTR_B11
(konstruk RNAi).
Proses introduksi vektor pANDA-3’UTR_B11 ke dalam bakteri E. Coli
DH5α telah berhasil dilakukan. Koloni bakteri E. coli DH5α transforman tumbuh
pada media seleksi LA yang mengandung 50 ppm kanamisin dan 50 ppm
higromisin. PCR koloni menggunakan primer higromisin menghasilkan fragmen
DNA berukuran 574 bp (Gambar 10). Selanjutnya vektor pANDA-3’UTR_B11
diisolasi dari koloni bakteri E. coli DH5α transforman.

15

M

1

2

3

4

500 bp

Gambar 10 Elektroforegram hasil PCR koloni vektor pANDA-3’UTR_B11
menggunakan primer higromisin dengan ukuran fragmen 574 bp
(No. 1-4). M: marka 100 bp
Insert dari vektor RNAi ini selanjutnya diamplifikasi menggunakan
beberapa kombinasi primer untuk memastikan bahwa gen 3’UTR_B11 telah
tersisip pada vektor pANDA-3’UTR_B11 dan dengan susunan orientasi yang
tepat. Primer yang digunakan untuk melihat keberadaan gen GUS linker adalah
primer GUS-F dan GUS-R (koleksi Prof. Ko Shimamoto, NAIST, Japan) dengan
hasil fragmen DNA berukuran 636 bp (Gambar 11).
M

500 bp

Gambar

11

1

4

636 bp

Elektroforegram hasil PCR vektor pANDA-3’UTR_B11
menggunakan primer GUS-F dan GUS-R (No. 1 dan 4). M:
marka 1 kbp

Salah satu vektor RNAi yang dapat digunakan untuk mempelajari fungsi
gen target adalah vektor pANDA yang dikembangkan oleh Miki dan Shimamoto
(2004). Prinsip kerja dari RNAi adalah mengganggu RNA yang ada di dalam sel
dan mengikatnya untuk membentuk RNA utas ganda (dsRNA). RNA utas ganda
akan dipotong oleh enzim Dicer di sitoplasma menjadi fragmen dsRNA pendek
berukuran 21–26 nukleotida (Pickford & Cogoni2003). Salah satu dari kedua utas
tersebut merupakan utas pemandu yang akan bergabung dengan RISC (RNAinduced silencing complex) dan berasosiasi dengan mRNA target (Hammond et
al. 2000). Gabungan kedua utas tersebut kemudian mengaktivasi fungsi RISC
untuk mendegradasi mRNA target dan menekan ekspresi gen (Meister & Tuschl
2004). Terdapat empat kombinasi primer yang digunakan untuk melihat orientasi
insert target dalam vektor pANDA (Tabel 2).
Pada vektor pANDA-3’UTR_B11, fragmen 3’UTR_B11 akan berada di
sebelah kiri dan kanan dari GUS linker dengan orientasi yang terbalik. Oleh

16

karena itu perlu dilakukan pemeriksaan orientasi insert target pada vektor
pANDA-3’UTR_B11. Hasil PCR dari kombinasi primer tersebut disajikan pada
Gambar 12.
M

1-1 1-2

4-1 4-2 1-3 1-4 4-3 4-4

500 bp

Gambar

12

Elektroforegram hasil PCR vektor pANDA-3’UTR_B11
menggunakan beberapa kombinasi primer. Angka pertama pada
nomor kolom adalah nomor koloni dan angka kedua adalah
kombinasi primer. M: marka 100 bp

Kombinasi primer nomor satu dan empat masing-masing mengidentifikasi
letak 3’UTR di sebelah kanan dan kiri GUS linker. Ukuran fragmen DNA hasil
PCR pada Gambar 11 untuk kombinasi primer nomor satu dan empat masingmasing berukuran ± 517 bp (195 bp 3’UTR_B11 + 322 bp GUS linker) dan ± 436
bp (195 bp 3’UTR_B11 + 241 bp GUS linker), sedangkan pada kombinasi primer
nomor dua dan tiga tidak terdapat fragmen DNA, karena kombinasi tersebut
dirancang untuk mengidentifikasi orientasi gen target apabila orientasinya tidak
terbalik. Berdasarkan hasil PCR pada Gambar 12, maka dapat diduga bahwa gen
insert telah tersisip pada vektor pANDA-3’UTR_B11 dengan orientasi yang
terbalik.
Orientasi fragmen 3’UTR_B11 selanjutnya diverifikasi dengan sekuensing
menggunakan primer GUS_cek–F untuk orientasi sense (3’UTR_B11 di sebelah
kanan GUS linker) dan GUS_cek–R untuk orientasi antisense (3’UTR_B11 di
sebelah kiri GUS linker). Hasil sekuensing menggunakan primer GUS_cek–F dan
GUS_cek–R diperoleh ujung 5’ fragmen 3’UTR_B11 yang membuktikan bahwa
orientasi fragmen tersebut sesuai yang diharapkan, yaitu berulang terbalik
(Gambar 13). Hasil tersebut juga menjelaskan bahwa fragmen 3’UTR_B11 telah
tersisip pada vektor pANDA-3’UTR_B11 dengan urutan: promotor ubiquitin1 –
3’UTR_B11 – GUS linker – 3’UTR_B11 – terminator nos.
Proses introduksi vektor pANDA-3’UTR_B11 ke dalam bakteri A.
tumefaciens AgL0 telah berhasil dilakukan. Koloni bakteri A. tumefaciens AgL0
transforman tumbuh pada media seleksi LA yang mengandung 50 ppm kanamisin,
50 ppm higromisin, dan 25 ppm rifampisin. PCR koloni dilakukan dengan
menggunakan kombinasi primer yang sama seperti yang dilakukan untuk
mengidentifikasi orientasi gen target pada vektor pANDA-3’UTR_B11 (Tabel 2).

17

>GUS – 3’UTR_B11 (primer GUS-cek_F)
NNNNNNNNNNNTCNTGTAACCGACATGTGGAGTGAAGAGTATCAGTGTGCATGGCTGGATA
TGTATCACCGCGTCTTTGATCGCGTCAGCGCCGTCGTCGGTGAACAGGTATGGAATTTC
GCCGATTTTGCGACCTCGCAAGGCATATTGCGCGTTGGCGGTAACAAGAAAGGGATCTT
CACTCGATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGATGCATGCTCGAGCGGCCGCC
AGTGTGATGGATATCTGCAGAATTCGCCCTTATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT
CTGTTTCTCCCCAAGTTCAGTCTGCACTCAGCACATCAAGCAATGTCTGAACACTATTC
CACCATGAACGTTTTCAGATCTCATTTTGTGTTCGGCCGCTGTTCTGTTTTCAAGCTTT
TTAATCAGTGTACACACTTTAAACCCAGCTTGGATTTCAAAACTCCCCTTGTCAAAAAC
TCAAATGCCACTCGTGACACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTCCCN
>3’UTR_B11 – GUS (primer GUS-cek_R)
AAAAAAAAAAGTAGACGGTTTGTGGTT