BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1 Alat-alat
1. Gelas ukur 100 mL 10 mL
Pyrex 2. Gelas beaker
250 mL 1000 mL Pyrex
3. Gelas erlenmeyer 1000 mL 100 mL
Pyrex 4. Corong kaca
5. Corong pisah 500 mL
Pyrex 6. Ekstraktor
5000 mL Schoot Duran
7. Tabung reaksi Pyrex
8. Pipet tetes 9. Pipa kapiler
10. Spatula 11. Rotarievaporator
Bűchi R-114 12. Labu rotarievaporator
1000 mL 13. Labu didih
1000 mL Schoot Duran
14. Labu takar 250 mL
Pyrex 15. Kolom kromatografi
Pyrex 16. Botol vial
17. Neraca analitis Mettler AE 200
18. Lampu UV 254 nm 356 nm
UVGL 58 19. Statif dan klem
20. Penangas air 21. Alat destilasi
22. Bunsen 23. Bejana Kromatografi Lapis Tipis
24. Spektrofotometer FT-IR Shimadzu
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
25. Spektrofotometer UV-Visible 26. Spektrometer
1
H-NMR JeolDelta2NMR 500MHz
3.2 Bahan-bahan
1. Kulit Bawang Merah 2. Metanol
Destilasi 3. n-heksana
Teknis 4. Etilasetat
Teknis 5. Aquadest
6. Silika gel 40 70-230 mesh ASTM E.Merck. KGaA
7. FeCl
3
8. NaOH 10 5
9. Mg-HCl 10. H
2
SO 11. HCl 2N
4P
12. Plat KLT Merck Kieselgel 60 F
13. Pereaksi Benedict
254
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah kulit bawang merah yang diperoleh dari areal sekitar Marendal Medan Amplas, Sumatera Utara. Kulit bawang merah dikeringkan di udara
terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk kulit bawang merah sebanyak 2000 g.
3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Kulit Bawang Merah
Serbuk kulit bawang merah diidentifikasikan dengan menggunakan cara: 1. Skrining Fitokimia
2. Analisis Kromatografi Lapis Tipis
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
3.3.2.1 Skrining Fitokimia
Untuk mengetahui adanya senyawa flavonoida pada kulit bawang merah maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif sebagai berikut:
- Dimasukkan ± 10 gram serbuk kulit bawang merah yang telah dikeringkan dan dipotong kecil-kecil ke dalam erlenmeyer
- Ditambahkan metanol ± 100 mL - Didiamkan
- Disaring - Dibagi ekstrak metanol kedalam 4 tabung reaksi
- Ditambahkan masing-masing pereaksi: a. Tabung I : dengan FeCl
3
b. Tabung II : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan berwarna merah muda 5 menghasilkan larutan berwarna hitam
c. Tabung III : dengan NaOH 10 menghasilkan larutan biru violet d. Tabung IV : dengan H
2
SO
4p
menghasilkan larutan orange kekuningan
3.3.2.2 Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak metanol dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F
254
Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai didalam analisis kromatografi kolom. Pelarut yang
digunakan adalah campuran n-heksana:etilasetat. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran n-heksana:etilasetat dengan perbandingan 90:10
v v ⁄
, 80:20
v v ⁄
, 70:30
v v ⁄
, 60:40
v v
⁄
dan 50:50
v v
⁄
.
Dimasukkan 10 mL larutan fase gerak n-heksana:etilasetat 90:10
v v
⁄
kedalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat metanol pada
plat KLT yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat kedalam bejana yang telah berisi pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi
dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan dan difiksasi dengan pereaksi FeCl
3
5.
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n-heksana: etilasetat dengan
perbandingan 80:20
v v ⁄
, 70:30
v v ⁄ ,
60:40
v v
⁄
dan 50:50
v v
⁄
.
3.3.3 Ekstraksi Kulit Bawang Merah
Serbuk kulit bawang merah ditimbang sebanyak 2000 g, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 12 L sampai semua sampel terendam dan dibiarkan selama ± 72
jam dan diulangi sebanyak 3 kali. Maserat ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol.
Kemudian diuapkan hingga semua pelarut menguap. Lalu dilakukan pemblokan tanin dengan cara melarutkan fraksi metanol dengan etilasetat dan disaring. Filtrat
kemuadian dirotarievaporator lalu diuapkan hingga semua pelarut etilasetat menguap. Lalu fraksi etilasetat dilarutkan dengan metanol dan dipartisi berulang-ulang dengan n-
heksana. Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana lalu diuapkan hingga pekat sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol sebanyak 15 g.
3.3.4 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida secara kromatografi kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat metanol yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel dan
fasa gerak yaitu n-heksana 100, campuran pelarut n-heksana:etilasetat dengan perbandingan 90:10
v v ⁄
, 80:20
v v ⁄
, 70:30
v v ⁄ ,
60:40
v v
⁄
dan 50:50
v v
⁄
. Dirangkai alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan 175 g silika gel
dengan menggunakan n-heksana, diaduk hingga homogen lalu dimasukkan kedalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksana 100 hingga
silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 15 g ekstrak pekat metanol kulit bawang merah kedalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, lalu
ditambahkan fasa gerak n-heksana : etilasetat 90:10
v v
⁄
secara perlahan-lahan dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan
penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fase
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
gerak n-heksana : etilasetat dengan perbandingan 80:20
v v
⁄
, 70:30
v v
⁄
, 60:40
v v
⁄
dan 50:50
v v
⁄
. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 5 mL lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama.
3.3.5 Kristalisasi
Amorf yang diperoleh dari isolasi dengan Kromatografi Kolom dilarutkan kembali dengan etilasetat. Kemudian ditambahkan metanol secara perlahan – lahan hingga
pembentukan kembali senyawa yang lebih murni dari sebelumnya dan jatuh di dasar wadah. Didekantasi larutan bagian atas wadah. Lalu diuapkan sisa pelarut dari amorf
hingga diperoleh kristal yang benar – benar bebas dari pelarut Jacobs, 1974.
3.3.6 Uji Kemurnian Hasil Isolasi
3.3.6.1. Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis
Uji kemurnian kristal dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F
254
Dimasukkan fasa gerak n-heksana : etilasetat 50:50
v v
⁄
dalam bejana kromatografi lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan dengan kloroform
pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut kedalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas atas plat KLT lalu plat
KLT dikeluarkan dari bejana kromatografi, dikeringkan dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl
dengan fasa gerak n-heksana : etilasetat 50:50
v v
⁄
, kloroform : metanol 80:20
v v
⁄
dan benzene : eter 80:20
v v
⁄
.
3
5. Diamati warna noda yang dihasilkan dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan pada fasa gerak kloroform :
metanol 80:20
v v
⁄
dan benzene : eter 80:20
v v
⁄
.
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
3.3.6.2 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Penentuan Titik Lebur
Kristal hasil isolasi yang telah murni dimasukkan kedalam melting point apparatus lalu diamati pada suhu berapa kristal melebur.
3.3.8 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.8.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analisis dengan alat spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong Tangerang dengan
menggunakan metanol sebagai pelarut.
3.3.8.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah FT-IR
Analisis dengan alat spektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong Tangerang dengan
menggunakan KBr sebagai pelarut.
3.3.8.3 Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H- NMR
Analisa dengan alat spektrometer
1
H-NMR diperoleh dari Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong Tangerang dengan menggunakan Aseton sebagai
pelarut.
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
3.4 Bagan Skrining Fitokimia
10 g serbuk kulit bawang merah
Allium cepa L.
diekstraksi maserasi dengan metanol disaring
dipekatkan dibagi kedalam 4 tabung reaksi
Tabung I Tabung II
ditambahkan pereksi
FeCl
3
5 diamati
perubahan warna
Larutan hitam ditambahkan
pereaksi NaOH 10
diamati perubahan
warna
Larutan biru violet
Tabung III ditambahkan
pereksi Mg-HCl
diamati perubahan
warna Tabung IV
ditambahkan pereksi
H
2
SO
4p
diamati perubahan
warna
Larutan merah muda
Larutan orange kekuningan
positif flavonoida
positif flavonoida
positif flavonoida
positif flavonoida
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
3.5 Bagan Penelitian
2000 g serbuk kulit Bawang Merah
Allium cepa L.
Ekstrak metanol Residu
diskrining fitokimia + dipekatkan dengan rotarievaporator
Ekstrak pekat metanol diuapkan hingga semua metanol menguap
dilarutkan dengan etil asetat disaring
Filtrat Residu
dipekatkan dengan rotarievaporator diuapkan hingga semua etil asetat menguap
dilarutkan dengan metanol diekstraksi partisi dengan n-heksana sampai bening
Lapisan metanol Lapisan n - heksana
diskrining fitokimia + dipekatkan dengan rotarievaporator
Ekstrak pekat metanol di-KLT untuk mengetahui sistem eluen yang sesuai pada kromatografi kolom
dipisahkan tiap fraksi melalui kromatografi kolom dengan fase gerak yaitu campuran pelarut n-heksana:etil asetat dengan
perbandingan 90:10 vv; 80:20 vv; 70:30 vv; 60:40 vv dan 50:50 vv ditampung tiap fraksi sebanyak 5 mL dalam botol vial
di-KLT untuk mengetahui harga Rf digabung fraksi dengan harga Rf yang sama
Fraksi 605 - 862 50:50
diuji dengan FeCl
3
5 Hasil positif
Senyawa murni dianalisis KLT
dikristalisasi diukur massanya
diuji titik leburnya dianalisis dengan
spektrofotometer UV-Visibel, FT-IR dan spektrometer
1
H-NMR Hasil analisis
diskrining fitokimima diekstraksi maserasi dengan metanol selama ± 72 jam
dilakukan sebanyak 3 kali disaring
Fraksi 101 - 240 80:20
diuji dengan FeCl
3
5 Hasil negatif
Fraksi 241 - 385 70:30
diuji dengan FeCl
3
5 Hasil negatif
Fraksi 386 - 604 60:40
diuji dengan FeCl
3
5 Hasil positif
Fraksi 1 - 100 90:10
diuji dengan FeCl
3
5 Hasil negatif
diskrining fitokimia + diskrining fitokimia
negatif negatif
negatif diskrining fitokimia
diskrining fitokimia
dianalisis KLT
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil Penelitian
Kategori