Metode Analisis Vitamin
Beberapa metode pengukur vitamin secara langsung dan memberikan pengukuran kuantitatif. Ini direkomendasikan untuk digunakan terutama untuk vitamin yang berguna
secara klinis. Namun ini mahal dan tidak semua laboratorium dapat memberikan tes tersebut. Metode ini meliputi:
• HPLC metode referensi • Immunoassays ELISA, RIA, FIA
• Colorimetric dan Spektrofotometri tes • Fluorometric assay Chemiluminescence assay
• amperometri assay Karena vitamin berfungsi sebagai ko-faktor dan substrat dalam berbagai reaksi tubuh,
beberapa metode memanfaatkan properti ini dan secara tidak langsung mengukur vitamin dengan mengukur aktivitas enzim di bawah pengaruh. Metode ini relatif lebih murah dan bisa
menjadi semi-kuantitatif atau kualitatif. Namun beberapa metode ini digunakan saat ini untuk penelitian saja dan ini termasuk:
• Tes Metabolit pemuatan • enzim aktivasi eritrosit assay
• Tes kerapuhan Eryhtrocyte • Waktu Prothrombin
• metode mikrobiologi • Bioassay in-vivo in-vitro
II.3 Metode Langsung untuk Penentuan Vitamin
II.3.1 High Performance Liquid Chromatography HPLC
Kromatografi adalah metode suatu proses fisik yang digunakan untuk memisahkan komponen-komponen dari suatu campuran senyawa kimia. Dalam kromatografi, campuran
tersebut dibuat sebagi zona yang sempit kecil pada salah satu ujung media porus seperti adsorben, yang disebut alas atau landasan kromatografi. Zona campuran kemudian digerakan
dengan larutan suatu cairan atau gas yang bergerak sebagai pembawa, melaui media porus tersebut, yang berupa partikel-partikel yang ”diam“ tidak bergerak, statisiones. Sehingga
akibatnya masing-masing komponen dari campuran tersebut akan terbagi terdistribusi secara tidak merata antara alas yang “diam” dan cairan atau gas yang membawanya. Akibat
selanjutnya, masing-masing komponen akan bergerak bermigrasi pada kecepatan yang berbeda differential migration dan dengan demikian, akan sampai pada ujung lain dari alas
tersebut pada waktu yang berlainan, dan dengan demikian terjadilah pemisahan diantara komponen-komponen yang ada.
Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen-komponen campuran yang berdasarkan distribusi diferensial dari komponen-komponen sampel diantara
dua fasa, yaitu fasa gerak dan fasa diam. Salah satu teknik kromatografi yang dimana fasa gerak dan fasa diamnya menggunakan zat cair adalah HPLC High Performance Liquid
Chromatography atau didalam bahasa Indonesia disebut KCKT Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.
Teknik HPLC merupakan suatu metode kromatografi cair-cair, yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kualitatif dengan teknik
HPLC didasarkan pada pengukuran luas area standar. Pada prakteknya, metode pembandingan area standar dan sampel kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya
melibatkan suatu konsentrasi standar. Oleh karena itu, dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi.
HPLC yang modern telah mucul akibat pertemuan dari kebutuhan, keinginan manusia untuk meminimalis pekerjaan, kemampuan teknologi, dan teori untuk memandu
pengembangan pada jalur yang rasional. Jelas sebelum era peralatan yang modern bahwa LC Liquid Chromatography memiliki kekuatan pemisahan yang sangat ampuh, bahkan untuk
komponen-komponen yang berhubungan sangat erat. LC harus ditingkatkan kecepatannya, diotomasasi, dan harus disesuaikan dengan sampel-sampel yang lebih kecil, waktu elusi yang
beberapa jam Underwood, Day. 2002 : 553. HPLC berbeda dari kromatografi kolom cairan konvensional dalam hal digunakan
bahan pengisi kolom berupa partikel yang sangat kecil berukuran sampai 3-5 μm 1μm = 10
- 6
m. Sehingga mengharuskan digunakannya tekanan tinggi sampai 20.000 Kpa 200 atmosfir untuk mengalirkan fasa gerak melalui kolom tersebut.
Ternyata, penggunaan bahan pengisi kolom yang lebih kecil ini bukan saja telah memperbaiki kecepatan analisis, tapi dari ini yang lebih penting ialah telah menghasilkan
suatu teknik dengan daya pisah yang tinggi. HPLC mempunyai kelemahan- kelemahan yang diantaranya, peralatannya lebih rumit, tidak murah, dan perlu pengalaman. Untuk beberapa
jenis zat, metode ini kurang sensitif. Selain itu sampel disyaratkan harus stabil dalam larutan.
Berdasarkan kepolaran fasa geraknya, HPLC dibagi menjadi 2 macam yaitu : a Fase Normal HPLC
HPLC jenis ini secara esensial sama dengan kromatografi kolom. Meskipun disebut normal, ini bukan bentuk biasa dari HPLC. Kolom ini diisi dengan partikel silika yang sangat
kecil dan pelarut nonpolar seperti heksan sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4,6 mm dan kemungkinan kurang dari nilai ini dengan panjang 120 nm-250 nm. Senyawa-
senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding dengan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non
polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom. Apabila pasangan fasa diam lebih polar daripada fasa geraknya maka sistem ini disebut HPLC fase normal.
b Fase Balik HPLC Pada HPLC jenis ini, ukuran kolomnya sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non
polar melalui pelekatan hidrokarbon dengna rantai panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Dalam kasus ini, akan terdapat interaksi yang
kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Interaksi yang terjadi tidak sekuat interaksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada
silika fasa diam dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu molekul-molekul polar akan lebih cepat bergerak melalui kolom. Sedangkan molekul-molekul non polar akan
bergerak lambat karena interaksi dengan gugus hidrokarbon. Prinsip kerja instumentasi HPLC
HPLC menggunakan fasa gerak untuk memisahkan komponen dari sebuah campuran komponen analit. Prinsip keja HPLC adalah pemisahan setiaap komponen dalam
sampel berdasarkan kepolarannya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Fasa diam
yang biasa digunakan pada kolom HPLC jenis fasa terbalik adalah RMe
2
SiCl, dimana R adalah rantai alkana C-18 atau C8. Sementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur
komposisinya gradien elusi, misalnya : air:asetonitril 80:20, hal ini bergantung pada kepolaran analit yang akan dipisahkan. Campuran analit akan terpisah berdasarkan
kepolarannya, dan waktu retensinya akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang punsak-puncaknya terpisah.
Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan komponen-komponen terjadi karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Keunggulan
menggunakan HPLC dibandingkan kromatografi gas yaitu terletak pada kemampuannya untuk menganalisis cuplikan yang tidak menguap dan labil pada suhu tinggi. HPLC tidak
terbatas pada senyawa organik tapi mampu menganalisis senyawa anorganik, mampu menganalisis cuplikan yang mempunyai molekul tinggi beratnya, mampu menganalisis
cuplik yang mempunyai titik didih yang sangat tinggi seperti polimer. Cara kerja instumentasi HPLC
Prinsip kerja alat HPLC adalah pertama fasa gerak dialirkan melalui kolom kedetektor dengan bantuan pompa. Kemudian cuplikan dimasukan ke dalam aliran fasa gerak
dengan cara penyuntikan. Didalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran karena perbedan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang
kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu. Sebaliknya solut-solut yang interaksinya kuat dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih
lama. Setiap komponen yang campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.
Keuntungan menggunakan metode HPLC - Langsung
- kuantitatif - Precise akurat
- Sensitif dan spesifik - Otomatis
- Tinggi melalui put Kerugian dalam menggunakan metode ini adalah
- Membutuhkan pretreatment sampel seperti ekstraksi filtrasi - Membutuhkan perhatian untuk memilih fase gerak sampel laju pemompaan
- Awalnya membutuhkan optimasi. Dalam rangka untuk mendapatkan resolusi tinggi dasar rendah dan kembali ketingkat noise yang rendah harus dipertahankan
- Membutuhkan standar internal, kalibrator dan reagen HPLC kelas - Mahal untuk membeli dan biaya pemeliharaan yang tinggi
II.3.2 Immunoassays
