Isolat bakteri salmonella dan leukosit dari anak-anak penderita diare di puskesmas Sindang Barang Bogor
Dari Anak-Anak Penderita Diare di Puskesmas Sindang Barang Bogor.
Dibimbing oleh SRI BUDIARTI dan TRI HERU WIDARTO.
Diare merupakan penyakit yang menyebabkan kematian pada anak di
negara-negara berkembang. Salah satu bakteri penyebab diare adalah bakteri
Salmonella sp.
. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi
bakteri
Salmonella sp.
dari sampel feses anak-anak penderita diare di Puskesmas
Sindang Barang Bogor. Terdapat 100 sampel feses yang diambil dengan metode
rectal swab
dan disimpan di dalam cairan buffer saline steril sebanyak 1ml
kemudian di isolasi selama 24
–
48 jam pada media SSA (Salmonella Shigella
Agar) .Sampel darah diambil dari jari kemudian dihitung leukositnya dengan
metode Simmon. Dari hasil isolasi terdapat 8 isolat yang diduga bakteri
Salmonella sp..
Uji biokimia yang dilakukan diantaranya yaitu uji Methyl red, uji
Voges Proskauer, uji urease, uji H2S, uji KCN, uji indol dan pewarnaan gram
negatif. Hasil uji biokimia menunjukkan 5 isolat yang menunjukkan tanda-tanda
fisiologis bakteri
Salmonella sp.
Jumlah leukosit yang diperoleh bervariasi dari
leukopenia hingga normal.
ABSTRACT
LESTARI APRILIANTY HAKIM. Isolate of
Salmonella sp.
Bacteria and
Leucocyte in Patients With Diarrhea in Puskesmas Sindang Barang, Bogor.
Taught by SRI BUDIARTI and TRI HERU WIDARTO.
Diarrhea is a disease that can cause death to children in developing
countries. One of the bacteria which can cause diarrhea is
Salmonella
bacteria.
This research intend to isolate and identify
Salmonella sp.
bacteria from faeces
samples children diarrhea in Puskesmas Sindang Barang, Bogor. There are about
100 samples of faeces was taken with rectal swab method and saved in 1ml sterile
buffer saline then isolated 24
–
48 hours in SSA. Blood samples were taken from
finger then count the leucocytes with the Simmon method. From isolation method
there are about eight isolates of
Salmonella sp.
bacteria suspects. Biochemical
tests which are performed on this method are Metyl Red test, Voges Proskauer
test, Urea test, H2S test, KCN test, citrate test, Indole test and gram stain. From
biochemical test there are about five isolates which showed sign of physiological
of
Salmonella sp.
bacteria. The leucocytes count varied from leucopenia to
normal.
(2)
PENDAHULUAN Latar Belakang
Diare merupakan penyakit yang masih menjadi masalah kesehatan di dunia khususnya negara berkembang. Masalah tersebut dapat terlihat dengan meningkatnya angka penderita dan kematian akibat diare (Adisasmito 2007). Kejadian diare di Indonesia mulai dari tahun 2002 adalah sebesar 1,62% , tahun 2003 sebesar 2,77% , tahun 2004 sebesar 1,60%, tahun 2005 sebesar 2,51%, tahun 2006 sebesar 2,52% (DEPKES RI 2007) tahun 2007 sebesar 1,3% (DEPKES RI 2008). Kasus diare dinegara berkembang lainnya di Turki yaitu sebesar 1,6% (Al-Gallas et al. 2009). Data tersebut menunjukkan bahwa angka penderita diare di Indonesia masih tinggi khususnya untuk daerah kota Bogor. Tahun 2005 terdapat 98 anak meninggal dan pada tahun 2007 sebanyak 23,416% dari jumlah 74.880 anak di kota Bogor meninggal akibat diare (Bappeda kota Bogor 2005). Hal tersebut menunjukkan masih lemahnya data mikrobiologi bagi penderita diare khususnya yang disebabkan oleh bakteri Salmonella, sehingga penelitian ini harus dilakukan.
Diare adalah buang air besar (defekasi) dengan tinja berbentuk cair atau setengah cair, kandungan air tinja lebih banyak dari biasanya lebih dari 200 g atau 200 ml. Buang air besar encer tersebut dapat atau tanpa disertai lendir dan darah (Eppy 2009). Bakteri Salmonella merupakan anggota famili Enterobacteriaceae, bakteri gram negatif, anaerob fakultatif, tidak berspora dan berbentuk batang. Habitat normalnya adalah didalam saluran pencernaan. Lebih dari 2000 serotip Salmonella adalah patogen, salah satunya yaitu penyebab gastroenteritis atau lebih dikenal dengan diare. Secara patologi, bakteri Salmonella
dibagi menjadi dua yaituSalmonellathypoid danSalmonellanon-thypoid (Madiganet al.
2009). Bakteri Salmonella memiliki dosis infektif 104 sampai 108 sel dengan lama inkubasi 5-72 jam, normal 12-36 jam (Sørensen 2006). Sebagian orang yang terinfeksi Salmonella enteritidis umumnya menderita diare (Blackburn & McClure 2003).
Infeksi bakteri Salmonella sp. pada manusia dapat mengakibatkan penyakit dengan gangguan pada bagian saluran pencernaan atau gastroenteritis dan penyakit akibat infeksiSalmonelladisebut
salmonellosis (Marriot 1999). Salmonellosis menyebabkan berbagai gejala seperti gastroenteritis, demam enterik, septikemia, dan infeksi fokal. BakteriSalmonellamasuk melalui makanan yang dicerna dalam lambung dan berkoloni di ileum dan kolon, kemudian masuk kedalam epitel usus dan terjadi proliferasi epitel (Gianella 2001).
Sifat metabolisme bakteri dalam uji biokimia biasanya dilihat dari interaksi metabolit-metabolit yang dihasilkan dengan reagen-reagen kimia. Selain itu dilihat kemampuannya menggunakan senyawa tertentu sebagai sumber karbon dan sumber energi (Waluyo 2004). Uji biokimia dilakukan dengan tujuan untuk identifikasi bakteri. Bakteri yang telah ditumbuhkan dalam media sfelektif dinyatakan
Salmonella sp. jika memberikan reaksi positif pada hasil uji H2S, uji Metil Red (MR), dan
memberikan reaksi negatif untuk uji Kalium Sianida (KCN), uji Indol, uji Voges Proskauer
(VP) dan uji Urea (Madigan et al. 2009). Infeksi dapat menyebabkan kenaikan jumlah leukosit. Leukosit berfungsi sebagai pertahanan tubuh melawan infeksi . Jumlah normal sel darah putih adalah 4000-10000/mm3(Aryoseto 2009).
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri Salmonella sp
pada penderita diare serta melihat jumlah sel darah putih di Puskesmas Sindang Barang, Bogor.
METODE Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Februari sampai dengan Oktober tahun 2010. Pengambilan sampel bertempat di Puskesmas Sindang Barang Bogor, kegiatan laboratorium dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi dan penghitungan darah dilakukan di laboratorium Biosistematika dan Ekologi Hewan Departemen Biologi IPB Bogor.
Probandus
Pengambilan sampel dilakukan mulai bulan Februari sampai Juni 2010. Sampel feses dan darah diambil dari 100 pasien diare anak-anak mulai usia 2 bulan sampai 11 tahun.
(3)
Diare merupakan penyakit yang masih menjadi masalah kesehatan di dunia khususnya negara berkembang. Masalah tersebut dapat terlihat dengan meningkatnya angka penderita dan kematian akibat diare (Adisasmito 2007). Kejadian diare di Indonesia mulai dari tahun 2002 adalah sebesar 1,62% , tahun 2003 sebesar 2,77% , tahun 2004 sebesar 1,60%, tahun 2005 sebesar 2,51%, tahun 2006 sebesar 2,52% (DEPKES RI 2007) tahun 2007 sebesar 1,3% (DEPKES RI 2008). Kasus diare dinegara berkembang lainnya di Turki yaitu sebesar 1,6% (Al-Gallas et al. 2009). Data tersebut menunjukkan bahwa angka penderita diare di Indonesia masih tinggi khususnya untuk daerah kota Bogor. Tahun 2005 terdapat 98 anak meninggal dan pada tahun 2007 sebanyak 23,416% dari jumlah 74.880 anak di kota Bogor meninggal akibat diare (Bappeda kota Bogor 2005). Hal tersebut menunjukkan masih lemahnya data mikrobiologi bagi penderita diare khususnya yang disebabkan oleh bakteri Salmonella, sehingga penelitian ini harus dilakukan.
Diare adalah buang air besar (defekasi) dengan tinja berbentuk cair atau setengah cair, kandungan air tinja lebih banyak dari biasanya lebih dari 200 g atau 200 ml. Buang air besar encer tersebut dapat atau tanpa disertai lendir dan darah (Eppy 2009). Bakteri Salmonella merupakan anggota famili Enterobacteriaceae, bakteri gram negatif, anaerob fakultatif, tidak berspora dan berbentuk batang. Habitat normalnya adalah didalam saluran pencernaan. Lebih dari 2000 serotip Salmonella adalah patogen, salah satunya yaitu penyebab gastroenteritis atau lebih dikenal dengan diare. Secara patologi, bakteri Salmonella
dibagi menjadi dua yaituSalmonellathypoid danSalmonellanon-thypoid (Madiganet al.
2009). Bakteri Salmonella memiliki dosis infektif 104 sampai 108 sel dengan lama inkubasi 5-72 jam, normal 12-36 jam (Sørensen 2006). Sebagian orang yang terinfeksi Salmonella enteritidis umumnya menderita diare (Blackburn & McClure 2003).
Infeksi bakteri Salmonella sp. pada manusia dapat mengakibatkan penyakit dengan gangguan pada bagian saluran pencernaan atau gastroenteritis dan penyakit akibat infeksiSalmonelladisebut
infeksi fokal. BakteriSalmonellamasuk melalui makanan yang dicerna dalam lambung dan berkoloni di ileum dan kolon, kemudian masuk kedalam epitel usus dan terjadi proliferasi epitel (Gianella 2001).
Sifat metabolisme bakteri dalam uji biokimia biasanya dilihat dari interaksi metabolit-metabolit yang dihasilkan dengan reagen-reagen kimia. Selain itu dilihat kemampuannya menggunakan senyawa tertentu sebagai sumber karbon dan sumber energi (Waluyo 2004). Uji biokimia dilakukan dengan tujuan untuk identifikasi bakteri. Bakteri yang telah ditumbuhkan dalam media sfelektif dinyatakan
Salmonella sp. jika memberikan reaksi positif pada hasil uji H2S, uji Metil Red (MR), dan
memberikan reaksi negatif untuk uji Kalium Sianida (KCN), uji Indol, uji Voges Proskauer
(VP) dan uji Urea (Madigan et al. 2009). Infeksi dapat menyebabkan kenaikan jumlah leukosit. Leukosit berfungsi sebagai pertahanan tubuh melawan infeksi . Jumlah normal sel darah putih adalah 4000-10000/mm3(Aryoseto 2009).
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri Salmonella sp
pada penderita diare serta melihat jumlah sel darah putih di Puskesmas Sindang Barang, Bogor.
METODE Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Februari sampai dengan Oktober tahun 2010. Pengambilan sampel bertempat di Puskesmas Sindang Barang Bogor, kegiatan laboratorium dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi dan penghitungan darah dilakukan di laboratorium Biosistematika dan Ekologi Hewan Departemen Biologi IPB Bogor.
Probandus
Pengambilan sampel dilakukan mulai bulan Februari sampai Juni 2010. Sampel feses dan darah diambil dari 100 pasien diare anak-anak mulai usia 2 bulan sampai 11 tahun.
(4)
2
Pengambilan Sampel A. Feses
Pengambilan sampel feses dilakukan dengan menggunakan metode rectal swab (Funk et al. 2000) yaitu mengambil feses dari anus pasien dengan cotton bud steril kemudian dimasukkan kedalam 0,9 ml larutan buffer saline steril (PBS) untuk dilakukan isolasi bakteriSalmonella. B. Darah
Pengambilan darah dilakukan dengan membersihkan jari tengah pasien dengan alkohol 70% kemudian ditusuk dengan lanset pen. Darah yang keluar ditampung oleh hematokrit (Marienfeld).
Perhitungan Sel Darah Putih
Darah yang berada dalam tabung hematokrit dikeluarkan dengan menggunakan kikir dan ditempatkan dalam tabung ependof. Darah diambil dengan pipet leukosit sampai sampai batas kurang lebih 0,5 dan dicampur dengan larutan Turk sampai batas 11. Kocok dengan gerakan membentuk angka delapan selama 12 kali kemudian diteteskan pada kaca hemasitometer dan tutup dengan kaca penutup. Sel leukosit yang dihitung dengan
counter pada hemasitometer yaitu empat kotak terbesar terletak pada tiap sudut hemasitometer. Penentuan jumlah total leukosit dilakukan dengan menggunakan rumus sebagai berikut :
V= p l t V= 1 * 1 * 1/10
V untuk 4 kotak = 4 * 1/10mm3 1 mm3= 10/4 *Σbutir darah yang dihitung
Faktor pengenceran = 20 * 10/4 * Σ butir darah yang dihitung
(Simmon 1976) Isolasi bakteri
Sampel yang diduga bakteri Salmonella sp. diinkubasi pada media cawan SSA (Criterion) selama 24 jam didalam inkubator (Gemmyco IN-010). Koloni yang telah murni dipindahkan kedalam media SSA miring.
Identifikasi Bakteri
Sampel yang diduga bakteri Salmonella sp.dilakukan dua tahap uji yaitu pewarnaan gram dan uji biokimia.
A. Pewarnaan gram
Pewarnaan gram dimulai dengan mengambil satu ose biakan yang didugaSalmonella sp.lalu dicampur dengan air steril kemudian dilakukan fiksasi panas. Kaca objek yang telah berisi bakteri Salmonella sp. diberikan kristal violet sampai menggenangi kaca objek dan dibiarkan selama satu menit lalu dibilas dengan air akuades. Pewarna selanjutnya yaitu iodin selama dua menit kemudian bilas dengan air akuades. Proses dekolorisasi dilakukan dengan menambahkan alkohol 90% beberapa saat kemudian dibersihkan dengan air akuades. Tahap terakhir yaitu pemberian safranin selama 30 detik, dibilas kembali dengan air akuades. Kelebihan air diserap oleh kertas serap. Pewarnaan selesai dan diamati di mikroskop cahaya perbesaran 1000 x menggunakan minyak imersi.
B. Uji Biokimia (Madiganet al. 2009) Uji biokimia untuk bakteri yang diduga
Salmonella sp. dilakukan uji Metil Red (MR), uji Voges Proskauer (VP), uji Urease, uji H2S,
uji KCN, uji Indol dan uji Sitrat. Media yang digunakan pada uji MR dan VP adalah sama yaitu dengan memakai media MRVP.
1. Uji MR (Metil Red)
Bakteri yang diduga Salmonella sp.
diinokulasikan pada media MRVP (Difco) dan inkubasi (Gemmyco IN-010) selama 24 jam pada suhu 370C. Uji MR dilakukan dengan menambahkan 10 tetes indikator metil red. Hasil positif dinyatakan dengan berubahnya warna media menjadi warna merah setelah ditetesi indikator merah metil. Medium yang tidak berubah warna dinyatakan negatif. 2. Uji VP
Sebanyak satu lup bakteri dimasukkan kedalam media MRVP (Difco) kemudian dilakukan inkubasi selama 96 jam. Uji VP dilakukan penambahan indikator α-naphtol 5% sebanyak 5 tetes dan larutan KOH 40% 5 tetes dan dibiarkan selama dua jam untuk dilihat perubahan warna media dari warna kuning menjadi warna kemerahan. Hasil negatif tidak merubah warna media.
2.Uji Urease
Bakteri yang didugaSalmonella sp.diisolasi kedalam media urea (Difco) secara aseptik lalu diinkubasi selama 96 jam dengan pengamatan tiap 24 jam pada suhu 370C. Warna merah violet akan ditunjukkan jika reaksinya positif dan tidak terjadi perubahan warna media.
(5)
3.Uji KCN
Dua lup bakteri yang didugaSalmonella sp. diisolasi pada media KCN kemudian diinkubasi selama 96 jam dengan pengamatan tiap 24 jam pada suhu 370C . Warna keruh pada media dinyatakan reaksi positif, warna bening dinyatakan hasil negatif.
4.Uji Indol
Bakteri yang diduga Salmonella sp.
diisolasi pada media tripton (Oxoid) dan dilakukan inkubasi selama 24 jam pada suhu 370C. Bakteri Salmonella sp. pada media tripton ditambahkan reagen Kovac sebanyak 3 tetes sampai berubah menjadi warna merah pada permukaan media, hasil tersebut dinyatakan positif. Hasil negatif dinyatakan dengan tidak timbulnya warna merah pada permukaan media.
5.Uji Sitrat
Media yang digunakan adalah media agar Simmons sitrat (Oxoid) . Bakteri yang diduga Salmonella sp. diisolasi dan diinkubasi selama 24 jam. Warna hijau pada media akan dirubah menjadi warna biru dengan adanya indikator warna bromtimol blue(BTB). Warna biru adalah reaksi positif dari uji ini.
6. Uji H2S
Bakteri yang didugaSalmonella diisolasi dalam media TSIA (Triple Sugar Iron Agar) selama 24 jam pada suhu 370C. Reaksi positif diberikanSalmonella sp.pada uji H2S
ini adalah terbentuknya gas disertai dengan berubahnya media menjadi warna hitam atau berubahnya warna media menjadi kuning pada bagian dasar media dan permukaan miring media yang menunjukkan adanya proses fermentasi yang terjadi.
HASIL
Dari 100 sampel feses penderita diare di Puskesmas Sindang Barang Bogor terdapat 43 sampel perempuan dan 57 sampel laki-laki (Lampiran 1). Sampel tersebut terdapat delapan isolat (8%) yang menunjukkan koloni hitam pada media SSA (Tabel 1). Koloni bakteri Salmonella sp. ditunjukkan oleh warna hitam pada pusatnya dan warna kusam pada pinggirannya (Gambar 1).
Delapan isolat yang menunjukkan koloni hitam pada media SSA telah dilakukan pewarnaan gram. Hasil yang ditunjukkan setelah isolat bakteri Salmonella sp diwarnai adalah warna merah muda dan tiap sel berbentuk batang (Gambar 2).
Uji biokimia dilakukan untuk mengidentifikasi dugaan isolat bakteri
Salmonella sp.. Delapan sampel bakteri yang didugaSalmonella sp. yaitu nomor 15, 19, 33, 38, 43, 58, 84, dan 87 (Tabel 2) dilakukan uji biokimia dengan mengacu pada metode dalam buku Brock Biology of Microorganism (2009). Hasil uji MR pada delapan isolat yang diduga
Salmonella ditunjukkan dengan reaksi positif (Gambar 3).
Hasil uji VP pada delapan isolat menunjukkan hasil yang negatif karena tidak terbentuk warna merah pada media MRVP. (Gambar 4).
Gambar 2 Hasil pewarnaan gram perbesaran 1000x
Gambar 3 Uji Meti Red A : reaksi negatif B : reaksi positif
Gambar 4 Uji Voges Proskauer A : reaksi negatif B : reaksi positif Gambar 1 Biakan murniSalmonella sp.
(6)
4
Uji Urea menunjukkan reaksi yang negatif pada isolat nomor 15, 19, 43, 84, dan 87 karena tidak terjadi perubahan pada warna media (Gambar 5A). Tiga isolat lainnya yaitu nomor 33, 58 dan 87 menunjukkan reaksi yang positif dengan berubahnya warna media menjadi merah violet (Gambar 5B).
Hasil uji pada media TSIA (Triple Sugar Iron Agar) pada kedelapan isolat ditunjukkan dengan hasil positif.. Isolat yang menghasilkan gas H2S yaitu isolat nomor 33, 58 dan 87. Isolat
yang tidak menghasilkan gas H2S namun warna
media berubah menjadi kuning pada bagian dasar media dan permukaan miring media yaitu isolat nomor 15, 19, 38, 43 dan 84 (Gambar 6). Isolat 33, 58 dan 87 menunjukkan perubahan media menjadi warna hitam pada bagian dasar media dan merah pada bagian permukaan miring.
No
Isolat Usia
Jenis Kelamin
Lama diare
Jenis
Feses Demam
Jumlah Leukosit/ml
15 5 tahun L 2 hari Lunak - 1250
19 2 bulan P 3 hari Cair + 2150
33 5 bulan L 4 hari Lunak - 2250
38 1 tahun 1 bulan L 7 hari Cair + 8300
43 2 tahun 2 bulan P 7 hari Cair + 3600
58 5 tahun L 1 hari Cair + 4100
84 4 bulan L 4 hari Lunak - 5050
87 3 tahun P 3 hari Cair + 1850
UJI BIOKIMIA No
Isolat
Gram
Stain MR VP Urea TSIA KCN Indol Sitrat
15 -* + - - + kuning - - +
19 -* + - - + kuning - - +
33 -* + - + + H2S - - +
38 -* + - - + kuning - - +
43 -* + - - + kuning - - +
58 -* + - + +H2S - - +
84 -* + - - + kuning - - +
87 -* + - + +H2S - - +
Gambar 5 Uji Urease A : reaksi negatif B : reaksi positif
Tabel 1 Daftar keadaan pasien yang menunjukkan koloni hitam pada media SSA
Keterangan : L : Laki-laki ; P : Perempuan + : demam ; - : tidak demam
Tabel 2 Hasil Uji Biokimia Isolat-isolat yang didugaSalmonella
Keterangan : -* : gram negatif - : reaksi negatif, + : reaksi positif, MR : Metil Red VP : Voges Proskauer
(7)
Uji KCN yang telah dilakukan pada delapan sampel yang diduga bakteri
Salmonella sp. menunjukkan reaksi yang negatif pada semua isolat. Setelah dilakukan inkubasi selama 76 jam semua isolat tidak menunjukkan perubahan warna media (Gambar 7) .
Uji Indol yang telah dilakukan pada semua isolat menunjukkan reaksi yang negatif dengan tidak berubahnya warna media menjadi warna merah setelah ditetesi Reagen Kovac (Gambar 8).
Uji Sitrat yang telah dilakukan pada delapan isolat menunjukkan reaksi positif dengan perubahan warna agar dari hijau menjadi warna biru (Gambar 9).
PEMBAHASAN
Sampel yang berhasil diambil dari pasien diare anak menunjukkan jumlah lelaki lebih banyak dari jumlah perempuan. Menurut penelitian yang telah dilakukan sebelumnya, dari sampel sampel penderita diare anak menunjukkan persentase yang lebih besar pada laki-laki dibanding pada pasien perempuan (Rahaman et al. 1982 ; Molbak et al. 1997 ; Wilunda & Panza 2009). Jenis feses yang diambil dari pasien diare anak yaitu lunak dan cair. Pasien penyakit diare akan mengalami peningkatan frekuensi pengeluaran feses dan kekentalan feses yang abnormal, yaitu lebih encer (70%-95% air terkandung dalam feses dan berat feses >200 g). Enterotoksin yang dimiliki Salmonella dapat merusak mukosa yang dapat menyebabkan ulkus sehingga feses yang dihasilkan tidak hanya lebih encer tetapi disertai dengan darah (Eppy 2009). Beberapa pasien diare yang dicurigai terinfeksi bakteri
Salmonella mengalami demam. Hal ini disebabkan karena ketika PMN (polimorfonukleus) teraktivasi dan memfagosit bakteri Salmonella terjadi pelepasan beberapa mediator inflamasi yang menimbulkan gejala reaksi inflamasi seperti demam (Aulia & Widianto 2010)
Delapan isolat yang diduga bakteri
Salmonella dilakukan pewarnaan gram terlebih dahulu untuk mengetahui sifat dasar dari bakteri
Salmonella sp. yaitu bakteri gram negatif. Sel bakteri yang telah terwarnai dengan kristal violet dan iodin akan membentuk kompleks
crystal violet-iodine (CV-I). Tahap selanjutnya Gambar 6 Uji H2S
A: H2S positif , B: Fermentasi
glukosa, laktosa dFe an atau sukrosa, C : rmentasi glukosa, D: tidak ada reaksi fermentasi
Gambar 7 Uji KCN A: hasil positif B: hasil negatif
Gambar 8 Uji Indol A: hasil negatif B: hasil positif
Gambar 9 Uji Sitrat A: hasil negatif B: hasil positif
(8)
5
Uji KCN yang telah dilakukan pada delapan sampel yang diduga bakteri
Salmonella sp. menunjukkan reaksi yang negatif pada semua isolat. Setelah dilakukan inkubasi selama 76 jam semua isolat tidak menunjukkan perubahan warna media (Gambar 7) .
Uji Indol yang telah dilakukan pada semua isolat menunjukkan reaksi yang negatif dengan tidak berubahnya warna media menjadi warna merah setelah ditetesi Reagen Kovac (Gambar 8).
Uji Sitrat yang telah dilakukan pada delapan isolat menunjukkan reaksi positif dengan perubahan warna agar dari hijau menjadi warna biru (Gambar 9).
PEMBAHASAN
Sampel yang berhasil diambil dari pasien diare anak menunjukkan jumlah lelaki lebih banyak dari jumlah perempuan. Menurut penelitian yang telah dilakukan sebelumnya, dari sampel sampel penderita diare anak menunjukkan persentase yang lebih besar pada laki-laki dibanding pada pasien perempuan (Rahaman et al. 1982 ; Molbak et al. 1997 ; Wilunda & Panza 2009). Jenis feses yang diambil dari pasien diare anak yaitu lunak dan cair. Pasien penyakit diare akan mengalami peningkatan frekuensi pengeluaran feses dan kekentalan feses yang abnormal, yaitu lebih encer (70%-95% air terkandung dalam feses dan berat feses >200 g). Enterotoksin yang dimiliki Salmonella dapat merusak mukosa yang dapat menyebabkan ulkus sehingga feses yang dihasilkan tidak hanya lebih encer tetapi disertai dengan darah (Eppy 2009). Beberapa pasien diare yang dicurigai terinfeksi bakteri
Salmonella mengalami demam. Hal ini disebabkan karena ketika PMN (polimorfonukleus) teraktivasi dan memfagosit bakteri Salmonella terjadi pelepasan beberapa mediator inflamasi yang menimbulkan gejala reaksi inflamasi seperti demam (Aulia & Widianto 2010)
Delapan isolat yang diduga bakteri
Salmonella dilakukan pewarnaan gram terlebih dahulu untuk mengetahui sifat dasar dari bakteri
Salmonella sp. yaitu bakteri gram negatif. Sel bakteri yang telah terwarnai dengan kristal violet dan iodin akan membentuk kompleks
crystal violet-iodine (CV-I). Tahap selanjutnya Gambar 6 Uji H2S
A: H2S positif , B: Fermentasi
glukosa, laktosa dFe an atau sukrosa, C : rmentasi glukosa, D: tidak ada reaksi fermentasi
Gambar 7 Uji KCN A: hasil positif B: hasil negatif
Gambar 8 Uji Indol A: hasil negatif B: hasil positif
Gambar 9 Uji Sitrat A: hasil negatif B: hasil positif
(9)
adalah pemberian alkohol 95% pada bakteri yang dimaksudkan untuk menghilangkan zat warna yang telah diberikan. Bakteri gram positif memiliki peptidoglikan yang lebih tebal dibanding gram negatif. Ketika diberikan kristal violet dan iodine maka sel akan bergabung dengan kompleks CV-I sehingga bakteri gram positif yang mempunyai lapisan peptidoglikan yang lebih tebal akan sulit dihilangkan dengan alkohol 95% dan bakteri gram negatif yang dinding selnya hanya terdiri dari lipopolisakarida akan kehilangan zat warnanya. Tahap dekolorisasi membuat bakteri gram negatif menjadi tak berwarna, oleh karena itu diberikan zat pewarna tandingan yaitu safranin agar lebih mudah diamati dibawah mikroskop (Tortora 2007).
Uji yang pertama dilakukan adalah uji MR dan uji VP. Uji MR dan VP ini menggunakan medium yang sama yaitu media MRVP. Kedua uji ini dilakukan pada dasarnya untuk melihat kemampuan bakteri dalam memfermentasikan asam campuran yang merupakan karakteristik dari
Enterobacteriaceae. Uji MR (Metil Red) yang dilakukan pada kedelapan isolat menunjukkan hasil yang positif. Medium MRVP memiliki pH 6,9 (Difco), ketika indikator metil red diberikan maka akan terjadi perubahan pH menjadi lebih rendah yaitu sekitar 4,4. Bakteri Salmonella sp.
berkemampuan untuk memfermentasikan glukosa yang akan menghasilkan produk berupa asam. Metil red merupakan zat warna yang akan aktif pada suasana asam sehingga warna medium glukosa yang telah ditetesi metil red akan berubah menjadi merah (Madiganet al.2009).
Uji selanjutnya yaitu uji VP (Voges Proskauer). Uji ini dilakukan untuk melihat kemampuan bakteri dalam melakukan fermentasi dengan hasil akhir 2,3 butanadiol. Penambahan 5% α-naphtol dan 40% KOH
dilakukan untuk menentukan adanya acetoin (asetil metil karbinol) yang merupakan senyawa dalam sintesis 2,3 butanadiol. Keberadaan oksigen dan penambahan 40% KOH akan merubah acetoin menjadi diasetil. Penambahan 5% α-naphtol
membuat kompleks warna merah terbentuk dalam media yang menunjukkan reaksi yang positif (Brynet al. 1973).
Kemampuan bakteri dalam memecah urea menjadi amoniak dan CO2dengan aksi
enzim urease dapat dilakukan uji Urease. Urease menunjukkan reaksi positif jika produksi amoniak mengarah ke alkalinitas
dalam media dan akan menyebabkan media berubah merah violet karena adanya phenol red. Bakteri Salmonella sp.dalam media urea tidak dapat memecah urea menjadi amonia dan karbon dioksida oleh aksi dari enzim urease (Gohet al.1994). Hasil penelitian Farmeret al
(1975) telah ditemukan bakteriSalmonellayang menunjukkan reaksi yang positif pada uji Urease yaitu Salmonella cubana. Hal ini berhubungan dengan penelitian sebelumnya dari Lewis & Rosen (1973) yang menyebutkan bahwa Proteus rettgeri dapat memproduksi urease kedalam plasmid bakteri Salmonella typhi dan S.typhimurium. Media SSA yang dipakai dapat menumbuhkan berbagai bakteri dari famili Enterobacteriaceae sehingga dimungkinkan terjadi pertumbuhan Proteus rettgerididalamnya.
Uji H2S dilakukan untuk menentukan adanya
fermentasi karbohidrat dan produksi H2S dalam
media TSIA (Triple Sugar Iron Agar). Hasil yang diberikan pada kedelapan isolat tiga diantaranya menghasilkan gas H2S yaitu isolat
nomor 33, 58 dan 87. Kerberadaan gas H2S
dilihat dari berubahnya warna media menjadi warna hitam pada bagian dasar media. Warna hitam terjadi karena media TSIA mengandung komposisi sulfur sehingga hanya bakteri yang mengandung sulfur yang dapat memecah asam-asam amino seperti lisin dan metionin. Sulfur dilepaskan dari asam amino tersebut kemudian bereaksi dengan air membentuk gas H2S dengan
adanya logam Fe maka H2S akan bereaksi
membentuk garam FeS yang mengendap. Bakteri yang berada dalam medium kemudian menghidrolisis garam FeS yang mengakibatkan warna hitam terbentuk didalam media. Produksi H2S merupakan karakteristik dari kebanyakan
bakteri Salmonella. Lima isolat lain menunjukkan warna kuning pada bagian dasar dan bagian permukaan miring asam.Salmonella
dapat memfermentasikan glukosa tetapi tidak membentuk gas, umumnya tidak memfermentasikan laktosa (Labbe & Gracia 2001). Terdapat spesies Salmonella yang tidak menghasilkan H2S yaitu Salmonella tuebingen
(Dube 1983), S. typhi dan S. paratyphi B . Reaksi lain yang ditunjukkan pada media TSIA yaitu perubahan warna menjadi warna merah pada bagian permukaan media dan warna kuning pada permukaan dasar. Hal ini dapat diartikan bahwa hanya terjadi fermentasi glukosa saja didalamnya. Media TSIA mengandung tiga jenis gula yaitu glukosa, sukrosa dan laktosa. Konsentrasi glukosa pada media TSIA adalah satu per sepuluh dari konsentrasi sukrosa dan laktosa sehingga asam yang dihasilkan hanya sedikit pada bagian dasar
(10)
7
media, sedangkan bagian permukaan miring media tetap berwarna merah.
Uji KCN dilakukan untuk membedakan bakteri Salmonella dengan bakteri
Citrobacter freundii karena semua uji biokimia pada kedua bakteri ini menunjukkan hasil yang hampir sama. Satu perbedaan yang dapat ditunjukkan pada kedua bakteri ini adalah ketahanan terhadap larutan potassium sianida. Citrobacter freundii dapat hidup dalam media kaldu KCN, sedangkan Salmonella tidak dapat bertahan hidup pada larutan potassium sianida. Penelitian sebelumnya menyebutkan bahwa tidak semua bakteri Salmonella sp.
menunjukkan reaksi negatif terhadap uji KCN (Munson 1974). Berdasarkan penelitian Edwards & Mary (1955) menyebutkan bahwa terdapat sampel bakteri
Salmonella yang ditunjukkan dengan reaksi positif pada media KCN yaitu S. glostrup
danS. kralendyk.
Uji Indol dilakukan untuk melihat kemampuan organisme khususnya
Enterobacteriaceae dalam memecah indol (benzoyrrole) dari molekul triptopan oleh aksi dari enzim triptopanase. Indol adalah senyawa yang mengandung nitrogen yang dapat dibentuk dari degradasi oleh bakteri tertentu. Tripton digunakan sebagai substrat karena mengandung banyak senyawa triptopan (Akhtar 2008). Hasil uji indol negatif apabila tidak terbentuk lapisan berwarna merah muda pada permukaan media, artinya bakteri tidak membentuk indol dari triptopan sebagai sumber karbon yang dapat diketahui dengan menambahkan larutan Kovac. Asam amino triptopan merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga asam amino ini dengan mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme akibat penguraian protein. Indol yang terbentuk akan berwarna merah dengan penambahan reagen Kovac yang mengandung p-dimetilbenzaldehid. Reaksi positif ditunjukkan dengan warna merah apabila p-dimetilbenzaldehid menghasilkan senyawa para amino benzaldehid yang tidak larut dalam air. Uji Indol yang telah dilakukan pada delapan isolat menunjukkan reaksi yang negatif dengan tidak terbentuknya cincin merah dipermukaan media.
Simmons sitrat merupakan media yang telah dimodifikasi dari Koser sitrat agar untuk uji sitrat bakteri gram negatif. Media ini mengandung Na sitrat sebagai sumber karbon, NH4+ sebagai sumber nitrogen dan
indikator BTB (brom timol blue) sebagai indikator pH. Uji sitrat dilakukan untuk melihat kemampuan bakteri dalam menggunakan sitrat sebagai sumber karbon dan energi. Semua isolat menunjukkan perubahan warna menjadi biru. Warna biru yang terbentuk dan pertumbuhan bakteri menunjukkan bahwa bakteri dapat menggunakan sitrat sebagai sumber karbon. Warna tetap hijau seperti kontrol menunjukkan tidak terjadi penggunaan sitrat oleh bakteri (Chun & Vidaver 2001). Bromthymol blue
merupakan indikator pada media sitrat, sehingga pada keadaan basa indikator ini akan berubah dari warna hijau menjadi biru. Komponen sitrat dari media akan mengeluarkan ion basa bikarbonat yang menyebabkan kenaikan pH dalam media sampai diatas 7,4. BakteriSalmonella sp.merupakan bakteri yang dapat menggunakan sitrat sebagai sumber karbonnya. Isolat yang telah diuji menunjukkan hasil yang positif terhadap uji ini.
Hasil identifikasi menunjukkan, lima isolat yaitu nomor 15, 19, 38, 43 dan 84 memenuhi syarat uji biokimia untuk bakteri genus
Salmonella, tiga diantaranya yaitu nomor 33, 58, dan 87 belum dapat dipastikan karena terdapat hasil uji biokimia yang tidak lazim yang ditemukan pada kebanyakan Salmonella. Diperkirakan tiga isolat tersebut merupakan
Salmonella cubana (Farmer et al. 1975) dan
Citrobacter spp. Citrobacter spp. ditemukan didalam media SSA dengan membentuk koloni hitam dengan pinggiran kusam dan mengeluarkan gas H2S persis seperti
penampakan Salmonella pada media SSA (Milleret al.2010).
Jumlah leukosit pasien diare rata-rata pada Tabel 1 menunjukkan keadaan yang abnormal, yaitu jumlah leukosit dibawah 5000/mm3. Hal tersebut berarti pasien diare mengalami leukopenia. Leukopenia disebabkan oleh jumlah jenis keukosit yang menurun maupun meningkat. Biasanya leukopenia terjadi karena jumlah neutrofil yang menurun, sel agranulosit yang meningkat dan jumlah limfosit meningkat. Terdapat dua tipe leukosit yaitu granulosit polimorfonukleus dan agranulosit mononukleus. Tipe leukosit yang tergolong dalam granulosit polimorfonukleus adalah neutrofil, eosinofil dan basofil. Tipe leukosit yang tergolong dalam agranulosit mononukleus adalah limfosit dan monosit. Neutrofil memiliki jumlah 60 – 70% dari leukosit yang berperan
dalam memfagosit benda-benda asing yang berukuran kecil. Limfosit berfungsi membentuk antibodi dan sel plasma. Monosit berperan untuk memakan benda-benda asing yang berukuran besar. Monosit memiliki jumlah
(11)
2-7% dari leukosit. Faktor lain yang menyebabkan penurunan leukosit adalah infeksi virus (Gidaliet al.1964) atau karena kekurangan nutrisi makanan (Nassar et al. 2009)
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan
Bakteri Salmonella yang diisolasi dari feses diare anak di Puskesmas Sindang Barang Bogor diduga merupakan bakteri yang menyebabkan diare. Jumlah isolat bakteri Salmonella yang didapat dari 100 sampel feses adalah sebanyak 5%. Isolat tersebut memberikan reaksi positif terhadap uji MR, uji Sitrat, uji H2S serta memberikan
reaksi negatif terhadap uji VP, Indol, dan Urease dan uji KCN. Jumlah leukosit yang didapat bevariasi dari normal hingga leukopenia.
Saran
Perlu dilakukan identifikasi bakteri yang lebih spesifik dengan menggunakan teknik molekuler 16S rRNA.
DAFTAR PUSTAKA
Adisasmito, W. 2007. Faktor Resiko Diare Pada Bayi dan Balita di Indonesia : Systematic Review Penelitian Bidang Akademik Kesehatan Masyarakat. Makara, Kesehatan. 11(1): 1-12 Al-Gallas, Bahri O, Bouratbeen A, Assian
Ben Haasen, Ridha Ben Aissa. 2007. Etiology of acute diarrhea in children and adults in Tunis, Tunisia, with emphasis on diarrheagenic Escherichia coli: prevalence, phenotyping, and molecular epidemologi. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene77(3): 571-582.
Akhtar, F. 2008. Epidemiology and Immunoprophylaxis of Salmonella enteritidis in Laying Hens in Relation to Zoonis [disertasi]. Faisalabd : Departement of Microbiology. University of Agriculture Faisalabd. Aryoseto L. 2009.Hubungan antara Jumlah
Leukosit dengan Morfologi
Spermatozoa pada Pasien Infertilitas di Rumah Sakit Dokter Kariadi
[tesis]. Semarang : Universitas Diponegoro.
Aulia DD, Widiyanto T. 2010. Demam Tifoid
[terhubung berkala].
http://www.exomedindonesia.com/refere
nsi-kedokteran/artikel-ilmiah- kedokteran/penyakit-tropik-infeksi- penyakitdalam/2010/11/13/demam-tifoid/ [15 Desember 2010]
Bappeda kota Bogor. 2005. Profil Kesehatan kota Bogor [terhubung berkala]. www.bappeda.bogorcity.net [20 November 2010]
Blackburn CW, McClure PJ. 2003.Foodborne Pathogens-Hazards, Risk Analysis and Control. Cambridge England : Woodhead Publishing Limited
Bryn J, Ulstrup JC, Stormer FC. 1973. Effect of Acetate upon the Formation of Acetoin in Klebsiella and Enterobacter and its Possible Practical Application in a Rapid Voges-Proskauer Test. Appl Microbiol
25(3): 511-512
Chun W , Vidaver AK. 2001. Gram Positive Bacteria: Bacillus. In: Schaad, N. W., J. B. Jones. And W. Chun (Eds).
Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic BacteriaEd ke-3. APS Press. St. Paul. Minnesota. 250–260.
Depkes RI. 2007. Profil Kesehatan 2007 [terhubung berkala]. www.depkes.go.id (6 Juli 2010)
Depkes RI. 2008. Profil Kesehatan 2006 [terhubung berkala]. www.depkes.go.id (6 Juli 2010)
Dube. 1983. Outbreak of Food Poisoning Caused by Lactose Fermenting :
Salmonella tuebingen. J Clinical Microbiol 17(4) : 698-699
Edwards P R , Mary AF. 1955. Cyanide Media in the Differentiation of Enteric Bacteria.
Appl Microbiol.(4):46-48
Eppy. 2009. Diare Akut. Medicinus22(3): 91-98
Farmer J.J et al. 1975. Unsual
(12)
ISOLAT BAKTERI
Salmonella
DAN LEUKOSIT DARI ANAK-ANAK
PENDERITA DIARE DI PUSKESMAS SINDANG BARANG BOGOR
LESTARI APRILIANTY HAKIM
G34061696
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
(13)
7% dari leukosit. Faktor lain yang menyebabkan penurunan leukosit adalah infeksi virus (Gidaliet al.1964) atau karena kekurangan nutrisi makanan (Nassar et al. 2009)
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan
Bakteri Salmonella yang diisolasi dari feses diare anak di Puskesmas Sindang Barang Bogor diduga merupakan bakteri yang menyebabkan diare. Jumlah isolat bakteri Salmonella yang didapat dari 100 sampel feses adalah sebanyak 5%. Isolat tersebut memberikan reaksi positif terhadap uji MR, uji Sitrat, uji H2S serta memberikan
reaksi negatif terhadap uji VP, Indol, dan Urease dan uji KCN. Jumlah leukosit yang didapat bevariasi dari normal hingga leukopenia.
Saran
Perlu dilakukan identifikasi bakteri yang lebih spesifik dengan menggunakan teknik molekuler 16S rRNA.
DAFTAR PUSTAKA
Adisasmito, W. 2007. Faktor Resiko Diare Pada Bayi dan Balita di Indonesia : Systematic Review Penelitian Bidang Akademik Kesehatan Masyarakat. Makara, Kesehatan. 11(1): 1-12 Al-Gallas, Bahri O, Bouratbeen A, Assian
Ben Haasen, Ridha Ben Aissa. 2007. Etiology of acute diarrhea in children and adults in Tunis, Tunisia, with emphasis on diarrheagenic Escherichia coli: prevalence, phenotyping, and molecular epidemologi. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene77(3): 571-582.
Akhtar, F. 2008. Epidemiology and Immunoprophylaxis of Salmonella enteritidis in Laying Hens in Relation to Zoonis [disertasi]. Faisalabd : Departement of Microbiology. University of Agriculture Faisalabd. Aryoseto L. 2009.Hubungan antara Jumlah
Leukosit dengan Morfologi
Spermatozoa pada Pasien Infertilitas di Rumah Sakit Dokter Kariadi
[tesis]. Semarang : Universitas Diponegoro.
Aulia DD, Widiyanto T. 2010. Demam Tifoid
[terhubung berkala].
http://www.exomedindonesia.com/refere
nsi-kedokteran/artikel-ilmiah- kedokteran/penyakit-tropik-infeksi- penyakitdalam/2010/11/13/demam-tifoid/ [15 Desember 2010]
Bappeda kota Bogor. 2005. Profil Kesehatan kota Bogor [terhubung berkala]. www.bappeda.bogorcity.net [20 November 2010]
Blackburn CW, McClure PJ. 2003.Foodborne Pathogens-Hazards, Risk Analysis and Control. Cambridge England : Woodhead Publishing Limited
Bryn J, Ulstrup JC, Stormer FC. 1973. Effect of Acetate upon the Formation of Acetoin in Klebsiella and Enterobacter and its Possible Practical Application in a Rapid Voges-Proskauer Test. Appl Microbiol
25(3): 511-512
Chun W , Vidaver AK. 2001. Gram Positive Bacteria: Bacillus. In: Schaad, N. W., J. B. Jones. And W. Chun (Eds).
Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic BacteriaEd ke-3. APS Press. St. Paul. Minnesota. 250–260.
Depkes RI. 2007. Profil Kesehatan 2007 [terhubung berkala]. www.depkes.go.id (6 Juli 2010)
Depkes RI. 2008. Profil Kesehatan 2006 [terhubung berkala]. www.depkes.go.id (6 Juli 2010)
Dube. 1983. Outbreak of Food Poisoning Caused by Lactose Fermenting :
Salmonella tuebingen. J Clinical Microbiol 17(4) : 698-699
Edwards P R , Mary AF. 1955. Cyanide Media in the Differentiation of Enteric Bacteria.
Appl Microbiol.(4):46-48
Eppy. 2009. Diare Akut. Medicinus22(3): 91-98
Farmer J.J et al. 1975. Unsual
(14)
9
that is Urease Positive. Journal of Clinical Microbiology1(1) : 106-107 Funk JA, Davies PR, Nichols MA. 2000.
The effect of fecal sample weight on detection of Salmonella enterica in swine feces. J Vet Diagn Invest 12 (5):412–418
Gianella RA. 2001. Salmonella [terhubung berkala].
http:/gsbs.utmb.edu/microbook.ch200 1.html (21 Oktober 2010)
Gidali J, Imre F, dan Julia O. 1964. Some Data on Mechanism of Leukopenia and Leukocytosis Following Irradiation.Blood23(1):27-37 Goh KL, N Parasakhi, SC Peh, SD
Puthucheary, NW Wong. 1994. The rapid urease test in the diagnosis of
Helicobacter pylori infection.
Singapore Med J35:161-162
Labbe RG, Garcia S. 2001. Guide to Foodborne Pathogens. Canada : A. Jhon Wiley & Sons, Inc
Lewis AD, Rosen IG. 1973.
Characterization of aProteus rettgeri
that transfers genes for urease production and lactose fermentation [abstrak]. Di dalam : Annual Meeting of the American Society for
Microbiology, Miami Beach, Fla, 6-11 Mei. Washington: American Society for Microbiology. hlm 62, Abstr no G218
Madigan MT, Brock T. 2009. Biology of Miroorganism. Perason/ James Cummings. San Francisco : CA Marriot, NG. 1999. Principle of Food
Sanitation. Gaithersburg, Maryland : Aspen Publisher Inc.
Miller RG, Mallinson ET. 2010. An Improved Medium for the Detection of Salmonella and Shigella Species.
Clinical Microbiology Newsletter
32:5
Molbak K, Jensen H, Ingholt L, Aaby P. 1997. Risk Factors for Diarrheal Disease Incidence in Early Childhood: A Community Cohort
Study from Guinea-Bissau. American Journal of Epidemiology. 146(3):273-282
Munson ET. 1974. Improved KCN Medium.
Applied Microbiology. 27(1):262-263 Nassar MF, SR El-Batrawy, NM Nagy. 2009.
CD95 Expression in White Blood Cells of Malnourshed Infant During Hospitalization and Catch-up Growth.
Eastern Mediterranean Heal Journal
15(3): 574-583
Rahaman MS, Azis KMS, Munshi MH, Patwari Y, Rahman M. 1982. A Diarrhea Clinic in Rural Bangladesh: Influence of Distance, Age, and Sex On Attendance and Diarrheal Mortality. American Journal of Public Health.72(10): 1124 -1128
Simmons A. 1976.Technical Hematology. Ed ke-2. Toronto : J.B Lippincott Co Sørensen. LB. 2006. Food Safety. [terhubung
berkala].
http://www.iifiir.org/en/doc/1071.pdf (11 november 2010)
Tortora GJ, Funke, Case. 2007. Microbiology
Ed ke-9. San Francisco: Pearson Education, Inc.
Waluyo. 2004. Mikrobiology Umum.
Universitas Muhammadiyah : Malang Wilunda C, Panza A. 2009. Factor Associated
With Diarrhea Among Children Less Than 5 Years Old In Thailand : A Secondary Analysis Thailand Multiple Indicator Cluster Survey 2006. J Health Res .23 : 17-22.
(15)
LESTARI APRILIANTY HAKIM
G34061696
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
(16)
ABSTRAK
LESTARI APRILIANTY HAKIM. Isolat Bakteri
Salmonella sp
. dan Leukosit
Dari Anak-Anak Penderita Diare di Puskesmas Sindang Barang Bogor.
Dibimbing oleh SRI BUDIARTI dan TRI HERU WIDARTO.
Diare merupakan penyakit yang menyebabkan kematian pada anak di
negara-negara berkembang. Salah satu bakteri penyebab diare adalah bakteri
Salmonella sp.
. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi
bakteri
Salmonella sp.
dari sampel feses anak-anak penderita diare di Puskesmas
Sindang Barang Bogor. Terdapat 100 sampel feses yang diambil dengan metode
rectal swab
dan disimpan di dalam cairan buffer saline steril sebanyak 1ml
kemudian di isolasi selama 24
–
48 jam pada media SSA (Salmonella Shigella
Agar) .Sampel darah diambil dari jari kemudian dihitung leukositnya dengan
metode Simmon. Dari hasil isolasi terdapat 8 isolat yang diduga bakteri
Salmonella sp..
Uji biokimia yang dilakukan diantaranya yaitu uji Methyl red, uji
Voges Proskauer, uji urease, uji H2S, uji KCN, uji indol dan pewarnaan gram
negatif. Hasil uji biokimia menunjukkan 5 isolat yang menunjukkan tanda-tanda
fisiologis bakteri
Salmonella sp.
Jumlah leukosit yang diperoleh bervariasi dari
leukopenia hingga normal.
ABSTRACT
LESTARI APRILIANTY HAKIM. Isolate of
Salmonella sp.
Bacteria and
Leucocyte in Patients With Diarrhea in Puskesmas Sindang Barang, Bogor.
Taught by SRI BUDIARTI and TRI HERU WIDARTO.
Diarrhea is a disease that can cause death to children in developing
countries. One of the bacteria which can cause diarrhea is
Salmonella
bacteria.
This research intend to isolate and identify
Salmonella sp.
bacteria from faeces
samples children diarrhea in Puskesmas Sindang Barang, Bogor. There are about
100 samples of faeces was taken with rectal swab method and saved in 1ml sterile
buffer saline then isolated 24
–
48 hours in SSA. Blood samples were taken from
finger then count the leucocytes with the Simmon method. From isolation method
there are about eight isolates of
Salmonella sp.
bacteria suspects. Biochemical
tests which are performed on this method are Metyl Red test, Voges Proskauer
test, Urea test, H2S test, KCN test, citrate test, Indole test and gram stain. From
biochemical test there are about five isolates which showed sign of physiological
of
Salmonella sp.
bacteria. The leucocytes count varied from leucopenia to
normal.
(17)
LESTARI APRILIANTY HAKIM
Skripsi
Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Memperoleh Gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
(18)
Judul Skripsi
: Isolat Bakteri
Salmonella
dan Leukosit dari Anak-anak
Penderita Diare di Puskesmas Sindang Barang Bogor
Nama
: Lestari Aprilianty Hakim
NIM
: G34061696
Menyetujui
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr.dr. Sri Budiarti
Ir. Tri Heru Widarto, M.Sc
NIP. 19580813 199303 2 001 NIP. 19620513 198703 1 002
Mengetahui
Ketua Departemen Bilologi
Tanggal lulus :
Dr.Ence Darmo Jaya Supena, M.S
NIP 196410021989031002
(19)
pertama dari Bapak Nasrul Hakim, BE dan Ibu Tuty Hartati, Amd.
Tingkat Pendidikan dimulai dari Taman Kanak-Kanak Kenari tahun 1994,
lulus SDN Cibatu 1 Kabupaten Sukabumi tahun 2000, lulus SLTPN 1 Kota
Sukabumi tahun 2003, dan lulus SMAN 1 Kota Sukabumi tahun 2006. Tahun
yang sama penulis diterima sebagai mahasiswa Institut Pertanian Bogor melalui
jalur USMI. Setahun kemudian penulis diterima di departemen Biologi, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Semasa kuliah di IPB, penulis pernah
menjadi asisten praktikum Mikrobiologi Dasar periode 2010.
(20)
KATA PENGANTAR
Syukur Alhamdulillah penulis panjatkan kepada Allah SWT atas
hidayahnya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berju
dul
”Isolasi
dan Identifikasi Bakteri
Salmonella sp.
Pada Penderita Diare di Puskesmas
Sindang Barang Bogor”.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr.dr.Sri Budiarti Poerwanto
sebagai pembimbing I yang selalu membimbing, memberikan nasehat dan
dorongan positif selama penelitian berlangsung. Ucapan terima kasih kepada Ir.
Tri Heru Widarto sebagai pembimbing kedua yang telah membantu dan
memberikan saran kepada penulis hingga skripsi ini berhasil disusun.
Kepada kepala Puskesmas Sindang Barang dr. Erna Nuraena dan Dian
Sapriani Mahbub, AmdAk yang telah memerikan izin dan membantu dalam
pengambilan sampel.
Tidak lupa penulis mengucapkan terima kasih kepada kedua orang tua
yang telah banyak berkorban dan memberikan doa yang tidak pernah putus selama
ini.
Ucapan terima kasih kepada Sira, Ega dan Firda sebagai rekan
sepenelitian. Bu Heni dan Pak Jaka sebagai laboran yang telah membantu penulis
dalam menyelesaikan penelitian ini. Terima kasih kepada seluruh teman-teman
yang tidak bisa saya sebutkan satu per satu.
Terima kasih kepada Bujas Hamzah yang telah setia dan banyak
memberikan motivasi hingga penulis dapat menyelesaikan skirpsi ini dengan baik.
Semoga skripsi ini bermanfaat.
Bogor, November 2010
(21)
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL
... viii
DAFTAR GAMBAR
... viii
PENDAHULUAN...1
Latar Belakang ... 1
Tujuan Penelitian... 1
Waktu dan Tempat Penelitian ... 1
METODE...1
Probandus... 1
Pengambilan Sampel ... 2
A. Feses... 2
B. Darah ... 2
Identifikasi ... 2
A. Pewarnaan gram... 2
B. Uji Biokimia ... 2
HASIL ...3
PEMBAHASAN ...5
SIMPULAN DAN SARAN...8
Simpulan ... 8
Saran ... 8
DAFTAR PUSTAKA...8
(22)
viii
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Daftar keadaan pasien yang menunjukkan koloni hitam pada SSA ...3
2 Hasil uji biokimia ...5
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Biakan murni
Salmonella sp.
...3
2 Hasil pewarnaan gram ...3
3 Uji MR ...3
4 Uji VP ...4
5 Uji urease ...4
6 Isolat hasil uji H2S pada delapan isolat ...4
7 Uji KCN ...4
8 Uji indol ...5
9 Uji sitrat ...5
DAFTAR LAMPIRAN
Daftar kondisi pasien diare ...12
(23)
Diare merupakan penyakit yang masih menjadi masalah kesehatan di dunia khususnya negara berkembang. Masalah tersebut dapat terlihat dengan meningkatnya angka penderita dan kematian akibat diare (Adisasmito 2007). Kejadian diare di Indonesia mulai dari tahun 2002 adalah sebesar 1,62% , tahun 2003 sebesar 2,77% , tahun 2004 sebesar 1,60%, tahun 2005 sebesar 2,51%, tahun 2006 sebesar 2,52% (DEPKES RI 2007) tahun 2007 sebesar 1,3% (DEPKES RI 2008). Kasus diare dinegara berkembang lainnya di Turki yaitu sebesar 1,6% (Al-Gallas et al. 2009). Data tersebut menunjukkan bahwa angka penderita diare di Indonesia masih tinggi khususnya untuk daerah kota Bogor. Tahun 2005 terdapat 98 anak meninggal dan pada tahun 2007 sebanyak 23,416% dari jumlah 74.880 anak di kota Bogor meninggal akibat diare (Bappeda kota Bogor 2005). Hal tersebut menunjukkan masih lemahnya data mikrobiologi bagi penderita diare khususnya yang disebabkan oleh bakteri Salmonella, sehingga penelitian ini harus dilakukan.
Diare adalah buang air besar (defekasi) dengan tinja berbentuk cair atau setengah cair, kandungan air tinja lebih banyak dari biasanya lebih dari 200 g atau 200 ml. Buang air besar encer tersebut dapat atau tanpa disertai lendir dan darah (Eppy 2009). Bakteri Salmonella merupakan anggota famili Enterobacteriaceae, bakteri gram negatif, anaerob fakultatif, tidak berspora dan berbentuk batang. Habitat normalnya adalah didalam saluran pencernaan. Lebih dari 2000 serotip Salmonella adalah patogen, salah satunya yaitu penyebab gastroenteritis atau lebih dikenal dengan diare. Secara patologi, bakteri Salmonella
dibagi menjadi dua yaituSalmonellathypoid danSalmonellanon-thypoid (Madiganet al.
2009). Bakteri Salmonella memiliki dosis infektif 104 sampai 108 sel dengan lama inkubasi 5-72 jam, normal 12-36 jam (Sørensen 2006). Sebagian orang yang terinfeksi Salmonella enteritidis umumnya menderita diare (Blackburn & McClure 2003).
Infeksi bakteri Salmonella sp. pada manusia dapat mengakibatkan penyakit dengan gangguan pada bagian saluran pencernaan atau gastroenteritis dan penyakit akibat infeksiSalmonelladisebut
infeksi fokal. BakteriSalmonellamasuk melalui makanan yang dicerna dalam lambung dan berkoloni di ileum dan kolon, kemudian masuk kedalam epitel usus dan terjadi proliferasi epitel (Gianella 2001).
Sifat metabolisme bakteri dalam uji biokimia biasanya dilihat dari interaksi metabolit-metabolit yang dihasilkan dengan reagen-reagen kimia. Selain itu dilihat kemampuannya menggunakan senyawa tertentu sebagai sumber karbon dan sumber energi (Waluyo 2004). Uji biokimia dilakukan dengan tujuan untuk identifikasi bakteri. Bakteri yang telah ditumbuhkan dalam media sfelektif dinyatakan
Salmonella sp. jika memberikan reaksi positif pada hasil uji H2S, uji Metil Red (MR), dan
memberikan reaksi negatif untuk uji Kalium Sianida (KCN), uji Indol, uji Voges Proskauer
(VP) dan uji Urea (Madigan et al. 2009). Infeksi dapat menyebabkan kenaikan jumlah leukosit. Leukosit berfungsi sebagai pertahanan tubuh melawan infeksi . Jumlah normal sel darah putih adalah 4000-10000/mm3(Aryoseto 2009).
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri Salmonella sp
pada penderita diare serta melihat jumlah sel darah putih di Puskesmas Sindang Barang, Bogor.
METODE Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Februari sampai dengan Oktober tahun 2010. Pengambilan sampel bertempat di Puskesmas Sindang Barang Bogor, kegiatan laboratorium dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi dan penghitungan darah dilakukan di laboratorium Biosistematika dan Ekologi Hewan Departemen Biologi IPB Bogor.
Probandus
Pengambilan sampel dilakukan mulai bulan Februari sampai Juni 2010. Sampel feses dan darah diambil dari 100 pasien diare anak-anak mulai usia 2 bulan sampai 11 tahun.
(24)
2
Pengambilan Sampel A. Feses
Pengambilan sampel feses dilakukan dengan menggunakan metode rectal swab (Funk et al. 2000) yaitu mengambil feses dari anus pasien dengan cotton bud steril kemudian dimasukkan kedalam 0,9 ml larutan buffer saline steril (PBS) untuk dilakukan isolasi bakteriSalmonella. B. Darah
Pengambilan darah dilakukan dengan membersihkan jari tengah pasien dengan alkohol 70% kemudian ditusuk dengan lanset pen. Darah yang keluar ditampung oleh hematokrit (Marienfeld).
Perhitungan Sel Darah Putih
Darah yang berada dalam tabung hematokrit dikeluarkan dengan menggunakan kikir dan ditempatkan dalam tabung ependof. Darah diambil dengan pipet leukosit sampai sampai batas kurang lebih 0,5 dan dicampur dengan larutan Turk sampai batas 11. Kocok dengan gerakan membentuk angka delapan selama 12 kali kemudian diteteskan pada kaca hemasitometer dan tutup dengan kaca penutup. Sel leukosit yang dihitung dengan
counter pada hemasitometer yaitu empat kotak terbesar terletak pada tiap sudut hemasitometer. Penentuan jumlah total leukosit dilakukan dengan menggunakan rumus sebagai berikut :
V= p l t V= 1 * 1 * 1/10
V untuk 4 kotak = 4 * 1/10mm3 1 mm3= 10/4 *Σbutir darah yang dihitung
Faktor pengenceran = 20 * 10/4 * Σ butir darah yang dihitung
(Simmon 1976) Isolasi bakteri
Sampel yang diduga bakteri Salmonella sp. diinkubasi pada media cawan SSA (Criterion) selama 24 jam didalam inkubator (Gemmyco IN-010). Koloni yang telah murni dipindahkan kedalam media SSA miring.
Identifikasi Bakteri
Sampel yang diduga bakteri Salmonella sp.dilakukan dua tahap uji yaitu pewarnaan gram dan uji biokimia.
A. Pewarnaan gram
Pewarnaan gram dimulai dengan mengambil satu ose biakan yang didugaSalmonella sp.lalu dicampur dengan air steril kemudian dilakukan fiksasi panas. Kaca objek yang telah berisi bakteri Salmonella sp. diberikan kristal violet sampai menggenangi kaca objek dan dibiarkan selama satu menit lalu dibilas dengan air akuades. Pewarna selanjutnya yaitu iodin selama dua menit kemudian bilas dengan air akuades. Proses dekolorisasi dilakukan dengan menambahkan alkohol 90% beberapa saat kemudian dibersihkan dengan air akuades. Tahap terakhir yaitu pemberian safranin selama 30 detik, dibilas kembali dengan air akuades. Kelebihan air diserap oleh kertas serap. Pewarnaan selesai dan diamati di mikroskop cahaya perbesaran 1000 x menggunakan minyak imersi.
B. Uji Biokimia (Madiganet al. 2009) Uji biokimia untuk bakteri yang diduga
Salmonella sp. dilakukan uji Metil Red (MR), uji Voges Proskauer (VP), uji Urease, uji H2S,
uji KCN, uji Indol dan uji Sitrat. Media yang digunakan pada uji MR dan VP adalah sama yaitu dengan memakai media MRVP.
1. Uji MR (Metil Red)
Bakteri yang diduga Salmonella sp.
diinokulasikan pada media MRVP (Difco) dan inkubasi (Gemmyco IN-010) selama 24 jam pada suhu 370C. Uji MR dilakukan dengan menambahkan 10 tetes indikator metil red. Hasil positif dinyatakan dengan berubahnya warna media menjadi warna merah setelah ditetesi indikator merah metil. Medium yang tidak berubah warna dinyatakan negatif. 2. Uji VP
Sebanyak satu lup bakteri dimasukkan kedalam media MRVP (Difco) kemudian dilakukan inkubasi selama 96 jam. Uji VP dilakukan penambahan indikator α-naphtol 5%
sebanyak 5 tetes dan larutan KOH 40% 5 tetes dan dibiarkan selama dua jam untuk dilihat perubahan warna media dari warna kuning menjadi warna kemerahan. Hasil negatif tidak merubah warna media.
2.Uji Urease
Bakteri yang didugaSalmonella sp.diisolasi kedalam media urea (Difco) secara aseptik lalu diinkubasi selama 96 jam dengan pengamatan tiap 24 jam pada suhu 370C. Warna merah violet akan ditunjukkan jika reaksinya positif dan tidak terjadi perubahan warna media.
(25)
3.Uji KCN
Dua lup bakteri yang didugaSalmonella sp. diisolasi pada media KCN kemudian diinkubasi selama 96 jam dengan pengamatan tiap 24 jam pada suhu 370C . Warna keruh pada media dinyatakan reaksi positif, warna bening dinyatakan hasil negatif.
4.Uji Indol
Bakteri yang diduga Salmonella sp.
diisolasi pada media tripton (Oxoid) dan dilakukan inkubasi selama 24 jam pada suhu 370C. Bakteri Salmonella sp. pada media tripton ditambahkan reagen Kovac sebanyak 3 tetes sampai berubah menjadi warna merah pada permukaan media, hasil tersebut dinyatakan positif. Hasil negatif dinyatakan dengan tidak timbulnya warna merah pada permukaan media.
5.Uji Sitrat
Media yang digunakan adalah media agar Simmons sitrat (Oxoid) . Bakteri yang diduga Salmonella sp. diisolasi dan diinkubasi selama 24 jam. Warna hijau pada media akan dirubah menjadi warna biru dengan adanya indikator warna bromtimol blue(BTB). Warna biru adalah reaksi positif dari uji ini.
6. Uji H2S
Bakteri yang didugaSalmonella diisolasi dalam media TSIA (Triple Sugar Iron Agar) selama 24 jam pada suhu 370C. Reaksi positif diberikanSalmonella sp.pada uji H2S
ini adalah terbentuknya gas disertai dengan berubahnya media menjadi warna hitam atau berubahnya warna media menjadi kuning pada bagian dasar media dan permukaan miring media yang menunjukkan adanya proses fermentasi yang terjadi.
HASIL
Dari 100 sampel feses penderita diare di Puskesmas Sindang Barang Bogor terdapat 43 sampel perempuan dan 57 sampel laki-laki (Lampiran 1). Sampel tersebut terdapat delapan isolat (8%) yang menunjukkan koloni hitam pada media SSA (Tabel 1). Koloni bakteri Salmonella sp. ditunjukkan oleh warna hitam pada pusatnya dan warna kusam pada pinggirannya (Gambar 1).
Delapan isolat yang menunjukkan koloni hitam pada media SSA telah dilakukan pewarnaan gram. Hasil yang ditunjukkan setelah isolat bakteri Salmonella sp diwarnai adalah warna merah muda dan tiap sel berbentuk batang (Gambar 2).
Uji biokimia dilakukan untuk mengidentifikasi dugaan isolat bakteri
Salmonella sp.. Delapan sampel bakteri yang didugaSalmonella sp. yaitu nomor 15, 19, 33, 38, 43, 58, 84, dan 87 (Tabel 2) dilakukan uji biokimia dengan mengacu pada metode dalam buku Brock Biology of Microorganism (2009). Hasil uji MR pada delapan isolat yang diduga
Salmonella ditunjukkan dengan reaksi positif (Gambar 3).
Hasil uji VP pada delapan isolat menunjukkan hasil yang negatif karena tidak terbentuk warna merah pada media MRVP. (Gambar 4).
Gambar 2 Hasil pewarnaan gram perbesaran 1000x
Gambar 3 Uji Meti Red A : reaksi negatif B : reaksi positif
Gambar 4 Uji Voges Proskauer A : reaksi negatif B : reaksi positif Gambar 1 Biakan murniSalmonella sp.
(26)
4
Uji Urea menunjukkan reaksi yang negatif pada isolat nomor 15, 19, 43, 84, dan 87 karena tidak terjadi perubahan pada warna media (Gambar 5A). Tiga isolat lainnya yaitu nomor 33, 58 dan 87 menunjukkan reaksi yang positif dengan berubahnya warna media menjadi merah violet (Gambar 5B).
Hasil uji pada media TSIA (Triple Sugar Iron Agar) pada kedelapan isolat ditunjukkan dengan hasil positif.. Isolat yang menghasilkan gas H2S yaitu isolat nomor 33, 58 dan 87. Isolat
yang tidak menghasilkan gas H2S namun warna
media berubah menjadi kuning pada bagian dasar media dan permukaan miring media yaitu isolat nomor 15, 19, 38, 43 dan 84 (Gambar 6). Isolat 33, 58 dan 87 menunjukkan perubahan media menjadi warna hitam pada bagian dasar media dan merah pada bagian permukaan miring.
No
Isolat Usia
Jenis Kelamin
Lama diare
Jenis
Feses Demam
Jumlah Leukosit/ml
15 5 tahun L 2 hari Lunak - 1250
19 2 bulan P 3 hari Cair + 2150
33 5 bulan L 4 hari Lunak - 2250
38 1 tahun 1 bulan L 7 hari Cair + 8300
43 2 tahun 2 bulan P 7 hari Cair + 3600
58 5 tahun L 1 hari Cair + 4100
84 4 bulan L 4 hari Lunak - 5050
87 3 tahun P 3 hari Cair + 1850
UJI BIOKIMIA No
Isolat
Gram
Stain MR VP Urea TSIA KCN Indol Sitrat
15 -* + - - + kuning - - +
19 -* + - - + kuning - - +
33 -* + - + + H2S - - +
38 -* + - - + kuning - - +
43 -* + - - + kuning - - +
58 -* + - + +H2S - - +
84 -* + - - + kuning - - +
87 -* + - + +H2S - - +
Gambar 5 Uji Urease A : reaksi negatif B : reaksi positif
Tabel 1 Daftar keadaan pasien yang menunjukkan koloni hitam pada media SSA
Keterangan : L : Laki-laki ; P : Perempuan + : demam ; - : tidak demam
Tabel 2 Hasil Uji Biokimia Isolat-isolat yang didugaSalmonella
Keterangan : -* : gram negatif - : reaksi negatif, + : reaksi positif, MR : Metil Red VP : Voges Proskauer
(27)
Uji KCN yang telah dilakukan pada delapan sampel yang diduga bakteri
Salmonella sp. menunjukkan reaksi yang negatif pada semua isolat. Setelah dilakukan inkubasi selama 76 jam semua isolat tidak menunjukkan perubahan warna media (Gambar 7) .
Uji Indol yang telah dilakukan pada semua isolat menunjukkan reaksi yang negatif dengan tidak berubahnya warna media menjadi warna merah setelah ditetesi Reagen Kovac (Gambar 8).
Uji Sitrat yang telah dilakukan pada delapan isolat menunjukkan reaksi positif dengan perubahan warna agar dari hijau menjadi warna biru (Gambar 9).
PEMBAHASAN
Sampel yang berhasil diambil dari pasien diare anak menunjukkan jumlah lelaki lebih banyak dari jumlah perempuan. Menurut penelitian yang telah dilakukan sebelumnya, dari sampel sampel penderita diare anak menunjukkan persentase yang lebih besar pada laki-laki dibanding pada pasien perempuan (Rahaman et al. 1982 ; Molbak et al. 1997 ; Wilunda & Panza 2009). Jenis feses yang diambil dari pasien diare anak yaitu lunak dan cair. Pasien penyakit diare akan mengalami peningkatan frekuensi pengeluaran feses dan kekentalan feses yang abnormal, yaitu lebih encer (70%-95% air terkandung dalam feses dan berat feses >200 g). Enterotoksin yang dimiliki Salmonella dapat merusak mukosa yang dapat menyebabkan ulkus sehingga feses yang dihasilkan tidak hanya lebih encer tetapi disertai dengan darah (Eppy 2009). Beberapa pasien diare yang dicurigai terinfeksi bakteri
Salmonella mengalami demam. Hal ini disebabkan karena ketika PMN (polimorfonukleus) teraktivasi dan memfagosit bakteri Salmonella terjadi pelepasan beberapa mediator inflamasi yang menimbulkan gejala reaksi inflamasi seperti demam (Aulia & Widianto 2010)
Delapan isolat yang diduga bakteri
Salmonella dilakukan pewarnaan gram terlebih dahulu untuk mengetahui sifat dasar dari bakteri
Salmonella sp. yaitu bakteri gram negatif. Sel bakteri yang telah terwarnai dengan kristal violet dan iodin akan membentuk kompleks
crystal violet-iodine (CV-I). Tahap selanjutnya Gambar 6 Uji H2S
A: H2S positif , B: Fermentasi
glukosa, laktosa dFe an atau sukrosa, C : rmentasi glukosa, D: tidak ada reaksi fermentasi
Gambar 7 Uji KCN A: hasil positif B: hasil negatif
Gambar 8 Uji Indol A: hasil negatif B: hasil positif
Gambar 9 Uji Sitrat A: hasil negatif B: hasil positif
(28)
6
adalah pemberian alkohol 95% pada bakteri yang dimaksudkan untuk menghilangkan zat warna yang telah diberikan. Bakteri gram positif memiliki peptidoglikan yang lebih tebal dibanding gram negatif. Ketika diberikan kristal violet dan iodine maka sel akan bergabung dengan kompleks CV-I sehingga bakteri gram positif yang mempunyai lapisan peptidoglikan yang lebih tebal akan sulit dihilangkan dengan alkohol 95% dan bakteri gram negatif yang dinding selnya hanya terdiri dari lipopolisakarida akan kehilangan zat warnanya. Tahap dekolorisasi membuat bakteri gram negatif menjadi tak berwarna, oleh karena itu diberikan zat pewarna tandingan yaitu safranin agar lebih mudah diamati dibawah mikroskop (Tortora 2007).
Uji yang pertama dilakukan adalah uji MR dan uji VP. Uji MR dan VP ini menggunakan medium yang sama yaitu media MRVP. Kedua uji ini dilakukan pada dasarnya untuk melihat kemampuan bakteri dalam memfermentasikan asam campuran yang merupakan karakteristik dari
Enterobacteriaceae. Uji MR (Metil Red) yang dilakukan pada kedelapan isolat menunjukkan hasil yang positif. Medium MRVP memiliki pH 6,9 (Difco), ketika indikator metil red diberikan maka akan terjadi perubahan pH menjadi lebih rendah yaitu sekitar 4,4. Bakteri Salmonella sp.
berkemampuan untuk memfermentasikan glukosa yang akan menghasilkan produk berupa asam. Metil red merupakan zat warna yang akan aktif pada suasana asam sehingga warna medium glukosa yang telah ditetesi metil red akan berubah menjadi merah (Madiganet al.2009).
Uji selanjutnya yaitu uji VP (Voges Proskauer). Uji ini dilakukan untuk melihat kemampuan bakteri dalam melakukan fermentasi dengan hasil akhir 2,3 butanadiol. Penambahan 5% α-naphtol dan 40% KOH
dilakukan untuk menentukan adanya acetoin (asetil metil karbinol) yang merupakan senyawa dalam sintesis 2,3 butanadiol. Keberadaan oksigen dan penambahan 40% KOH akan merubah acetoin menjadi diasetil. Penambahan 5% α-naphtol
membuat kompleks warna merah terbentuk dalam media yang menunjukkan reaksi yang positif (Brynet al. 1973).
Kemampuan bakteri dalam memecah urea menjadi amoniak dan CO2dengan aksi
enzim urease dapat dilakukan uji Urease. Urease menunjukkan reaksi positif jika produksi amoniak mengarah ke alkalinitas
dalam media dan akan menyebabkan media berubah merah violet karena adanya phenol red. Bakteri Salmonella sp.dalam media urea tidak dapat memecah urea menjadi amonia dan karbon dioksida oleh aksi dari enzim urease (Gohet al.1994). Hasil penelitian Farmeret al
(1975) telah ditemukan bakteriSalmonellayang menunjukkan reaksi yang positif pada uji Urease yaitu Salmonella cubana. Hal ini berhubungan dengan penelitian sebelumnya dari Lewis & Rosen (1973) yang menyebutkan bahwa Proteus rettgeri dapat memproduksi urease kedalam plasmid bakteri Salmonella typhi dan S.typhimurium. Media SSA yang dipakai dapat menumbuhkan berbagai bakteri dari famili Enterobacteriaceae sehingga dimungkinkan terjadi pertumbuhan Proteus rettgerididalamnya.
Uji H2S dilakukan untuk menentukan adanya
fermentasi karbohidrat dan produksi H2S dalam
media TSIA (Triple Sugar Iron Agar). Hasil yang diberikan pada kedelapan isolat tiga diantaranya menghasilkan gas H2S yaitu isolat
nomor 33, 58 dan 87. Kerberadaan gas H2S
dilihat dari berubahnya warna media menjadi warna hitam pada bagian dasar media. Warna hitam terjadi karena media TSIA mengandung komposisi sulfur sehingga hanya bakteri yang mengandung sulfur yang dapat memecah asam-asam amino seperti lisin dan metionin. Sulfur dilepaskan dari asam amino tersebut kemudian bereaksi dengan air membentuk gas H2S dengan
adanya logam Fe maka H2S akan bereaksi
membentuk garam FeS yang mengendap. Bakteri yang berada dalam medium kemudian menghidrolisis garam FeS yang mengakibatkan warna hitam terbentuk didalam media. Produksi H2S merupakan karakteristik dari kebanyakan
bakteri Salmonella. Lima isolat lain menunjukkan warna kuning pada bagian dasar dan bagian permukaan miring asam.Salmonella
dapat memfermentasikan glukosa tetapi tidak membentuk gas, umumnya tidak memfermentasikan laktosa (Labbe & Gracia 2001). Terdapat spesies Salmonella yang tidak menghasilkan H2S yaitu Salmonella tuebingen
(Dube 1983), S. typhi dan S. paratyphi B . Reaksi lain yang ditunjukkan pada media TSIA yaitu perubahan warna menjadi warna merah pada bagian permukaan media dan warna kuning pada permukaan dasar. Hal ini dapat diartikan bahwa hanya terjadi fermentasi glukosa saja didalamnya. Media TSIA mengandung tiga jenis gula yaitu glukosa, sukrosa dan laktosa. Konsentrasi glukosa pada media TSIA adalah satu per sepuluh dari konsentrasi sukrosa dan laktosa sehingga asam yang dihasilkan hanya sedikit pada bagian dasar
(29)
media, sedangkan bagian permukaan miring media tetap berwarna merah.
Uji KCN dilakukan untuk membedakan bakteri Salmonella dengan bakteri
Citrobacter freundii karena semua uji biokimia pada kedua bakteri ini menunjukkan hasil yang hampir sama. Satu perbedaan yang dapat ditunjukkan pada kedua bakteri ini adalah ketahanan terhadap larutan potassium sianida. Citrobacter freundii dapat hidup dalam media kaldu KCN, sedangkan Salmonella tidak dapat bertahan hidup pada larutan potassium sianida. Penelitian sebelumnya menyebutkan bahwa tidak semua bakteri Salmonella sp.
menunjukkan reaksi negatif terhadap uji KCN (Munson 1974). Berdasarkan penelitian Edwards & Mary (1955) menyebutkan bahwa terdapat sampel bakteri
Salmonella yang ditunjukkan dengan reaksi positif pada media KCN yaitu S. glostrup
danS. kralendyk.
Uji Indol dilakukan untuk melihat kemampuan organisme khususnya
Enterobacteriaceae dalam memecah indol (benzoyrrole) dari molekul triptopan oleh aksi dari enzim triptopanase. Indol adalah senyawa yang mengandung nitrogen yang dapat dibentuk dari degradasi oleh bakteri tertentu. Tripton digunakan sebagai substrat karena mengandung banyak senyawa triptopan (Akhtar 2008). Hasil uji indol negatif apabila tidak terbentuk lapisan berwarna merah muda pada permukaan media, artinya bakteri tidak membentuk indol dari triptopan sebagai sumber karbon yang dapat diketahui dengan menambahkan larutan Kovac. Asam amino triptopan merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga asam amino ini dengan mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme akibat penguraian protein. Indol yang terbentuk akan berwarna merah dengan penambahan reagen Kovac yang mengandung p-dimetilbenzaldehid. Reaksi positif ditunjukkan dengan warna merah apabila p-dimetilbenzaldehid menghasilkan senyawa para amino benzaldehid yang tidak larut dalam air. Uji Indol yang telah dilakukan pada delapan isolat menunjukkan reaksi yang negatif dengan tidak terbentuknya cincin merah dipermukaan media.
Simmons sitrat merupakan media yang telah dimodifikasi dari Koser sitrat agar untuk uji sitrat bakteri gram negatif. Media ini mengandung Na sitrat sebagai sumber karbon, NH4+ sebagai sumber nitrogen dan
indikator BTB (brom timol blue) sebagai indikator pH. Uji sitrat dilakukan untuk melihat kemampuan bakteri dalam menggunakan sitrat sebagai sumber karbon dan energi. Semua isolat menunjukkan perubahan warna menjadi biru. Warna biru yang terbentuk dan pertumbuhan bakteri menunjukkan bahwa bakteri dapat menggunakan sitrat sebagai sumber karbon. Warna tetap hijau seperti kontrol menunjukkan tidak terjadi penggunaan sitrat oleh bakteri (Chun & Vidaver 2001). Bromthymol blue
merupakan indikator pada media sitrat, sehingga pada keadaan basa indikator ini akan berubah dari warna hijau menjadi biru. Komponen sitrat dari media akan mengeluarkan ion basa bikarbonat yang menyebabkan kenaikan pH dalam media sampai diatas 7,4. BakteriSalmonella sp.merupakan bakteri yang dapat menggunakan sitrat sebagai sumber karbonnya. Isolat yang telah diuji menunjukkan hasil yang positif terhadap uji ini.
Hasil identifikasi menunjukkan, lima isolat yaitu nomor 15, 19, 38, 43 dan 84 memenuhi syarat uji biokimia untuk bakteri genus
Salmonella, tiga diantaranya yaitu nomor 33, 58, dan 87 belum dapat dipastikan karena terdapat hasil uji biokimia yang tidak lazim yang ditemukan pada kebanyakan Salmonella. Diperkirakan tiga isolat tersebut merupakan
Salmonella cubana (Farmer et al. 1975) dan
Citrobacter spp. Citrobacter spp. ditemukan didalam media SSA dengan membentuk koloni hitam dengan pinggiran kusam dan mengeluarkan gas H2S persis seperti
penampakan Salmonella pada media SSA (Milleret al.2010).
Jumlah leukosit pasien diare rata-rata pada Tabel 1 menunjukkan keadaan yang abnormal, yaitu jumlah leukosit dibawah 5000/mm3. Hal tersebut berarti pasien diare mengalami leukopenia. Leukopenia disebabkan oleh jumlah jenis keukosit yang menurun maupun meningkat. Biasanya leukopenia terjadi karena jumlah neutrofil yang menurun, sel agranulosit yang meningkat dan jumlah limfosit meningkat. Terdapat dua tipe leukosit yaitu granulosit polimorfonukleus dan agranulosit mononukleus. Tipe leukosit yang tergolong dalam granulosit polimorfonukleus adalah neutrofil, eosinofil dan basofil. Tipe leukosit yang tergolong dalam agranulosit mononukleus adalah limfosit dan monosit. Neutrofil memiliki jumlah 60 – 70% dari leukosit yang berperan dalam memfagosit benda-benda asing yang berukuran kecil. Limfosit berfungsi membentuk antibodi dan sel plasma. Monosit berperan untuk memakan benda-benda asing yang berukuran besar. Monosit memiliki jumlah
(1)
13
No
Sampel Usia Sex
Berat
badan (kg) Alamat (RT / RW) Demam Tipe diare
42 1 tahun L 9 Bubulak 3/1 + cair
43 2 tahun 2 bulan P 11 Sindang Barang 3/1 + cair 44 1 tahun 4 bulan L 10 Bubulak 7/1 + berlendir 45 1 tahun 7 bulan P 10 Sindang Barang 1/6 + cair
46 11 bulan L 7.5 Bubulak 3/1 + cair
47 3 tahun 6 bulan L 14 Marga Jaya 5/2 - cair
48 7 bulan L 7 Sindang Barang 3/8 + cair
49 5 bulan P 6 Sindang Barang 3/8 - cair
50 10 bulan L 8 Bubulak 4/9 + cair
51 1 tahun 2 bulan L 9 Situ Gede 1/6 - cair 52 3 tahun 4 bulan L 13 Situ Gede 3/2 + cair 53 1 tahun 9 bulan L 10 Marga Jaya 5/2 + cair
54 1 tahun 1 bulan P 8 Bubulak 2/5 + cair
55 6 bulan L 6 Sindang Barang 3/6 + berlendir 56 1 tahun 8 bulan P 11 Situ Gede 3/9 + cair
57 5 tahun L 20 Situ Gede 3/4 - cair
58 5 tahun P 23 Sindang Barang 1/3 + cair
59 3 tahun P 11 Situ Gede 2/3 + berlendir
60 11 Bulan P 6.5 Bubulak 3/5 - cair
61 2 tahun P 10 Sindang Barang 5/6 + berlendir 62 3 tahun 1 bulan L 12.5 Sindang Barang 5/6 - berlendir 63 1 tahun 1 bulan L 10 Sindang Barang 2/8 + cair 64 9 bulan L 8.5 Sindang Barang + berlendir 65 1 tahun 5 bulan P 9 Sindang Barang 2/6 + cair 66 6 tahun 5 bulan P 22 Sindang Barang 3/5 - berlendir
67 10 bulan L 6 Ciomas 2/10 + cair
68 2 tahun L 11.5 Situ Gede 2/3 - lunak
69 6 Bulan L 7.5 Sindang Barang 3/7 + cair 70 3 tahun 3 bulan L 12 Situ Gede 2/10 + berlendir
71 5 tahun L 19 Bubulak 3/1 + berlendir
72 5 bulan L 7 Sindang Barang 3/6 + cair
73 2 Tahun P 8.5 Marga Jaya 3/1 + cair
74 3 Bulan L 4 Bubulak 3/8 + cair
75 1 tahun 5 bulan L 10.5 Sindang Barang 4/5 - cair 76 1 tahun 6 bulan L 11 Sindang Barang 1/1 + cair
77 7 bulan L 5 Sindang Barang 3/8 + lunak
78 1 tahun 4bulan P 13 Loji 2/8 + berlendir 79 1 tahun 3 bulan P 14 Balumbang Jaya 4/5 - cair 80 8 bulan L 5 Sindang Barang 6/4 - berlendir
81 4 tahun P 10 Sindang Barang 6/4 + cair
82 1 tahun 8 bulan P 9 Balumbang Jaya 4/5 + berlendir 83 2 tahun 4 bulan P 9 Sindang Barang 4/4 + cair
84 4 bulan L 4 Sindang Barang 4/2 - lunak
(2)
14
No
Sampel Usia Sex
Berat
badan (kg) Alamat (RT / RW) Demam Tipe diare
85 3 tahun L 12.4 Bubulak 5/6 - cair
86 2 tahun L 10 Sindang Barang 4/4 - cair
87 3 tahun P 11 Bubulak 2/7 + cair
88 1 tahun 6 bulan L 12 Sindang Barang 3/1 + cair 89 1 tahun 6 bulan L 13 Sindang Barang 3/1 + berlendir
90 11 tahun L 30 Bubulak 1/6 - berlendir
91 1 tahun 9 bulan L 8 Sindang Barang 3/1 + cair 92 1.3 Tahun L 12.5 Sindang Barang 2/9 - berlendir 93 1.2 Tahun L 13 Sindang Barang 2/3 + cair
94 5 tahun L 18 Bubulak 4/7 + berlendir
95 2 Tahun L 9.5 Sindang Barang 2/5 + cair 96 1 Tahun 1 Bulan P 9 Situ Gede 3/4 - cair
97 2 tahun P 7 Marga Jaya 3/1 - cair
98 3 tahun 1 bulan L 11 Sindang Barang 4/5 - cair 99 4 tahun 5 bulan L 13 Sindang Barang 3/7 + cair
100 3 tahun P 9 Bubulak 2/8 - berlendir
(3)
(4)
No
Sampel Usia Sex
Berat
badan (kg) Alamat (RT / RW) Demam Tipe diare 1 3 tahun 6 bulan L 13 Sindang Barang 5/5 - cair 2 1 tahun 5 bulan P 8 Sindang Barang 3/6 - cair
3 7 Bulan L 7.5 Bubulak 3/2 - cair
4 6 tahun L 20 Sindang Barang 5/6 - cair
5 1 tahun 5 bulan L 10 Sindang Barang 3/1 - berlendir 6 1 tahun 2 bulan P 8.5 Situ Gede 1/3 - cair 7 1 tahun 1 bulan P 9 Situ Gede 4/7 + cair
8 2 tahun L 11 Sindang Barang 5/5 - cair
9 1 tahun 8 bulan P 10.5 Sindang Barang 1/5 - cair
10 11 bulan L 7.5 Bubulak 2/4 + cair
11 2 tahun 5 bulan P 12 Marga Jaya 5/2 - berlendir
12 7 bulan P 7 Situ Gede 3/9 - cari
13 5 bulan P 7.5 Sindang Barang 2/5 - berlendir
14 11 bulan L 8.5 Bubulak 3/9 - cair
15 5 tahun L 19 Bubulak 3/9 - lunak
16 1 tahun 6 bulan P 10.5 Situ Gede 3/2 - cair 17 3 tahun P 13 Sindang Barang 1/4 + berlendir
18 5 tahun P 20.5 Bubulak 3/5 + berlendir
19 2 bulan P 5 Sindang Barang 4/4 + cair
20 1 tahun 6 bulan L 10 Sindang Barang 4/4 - cair
21 2 tahun P 11 Sindang Barang 32 - cair
22 5 bulan P 7 Bubulak 2/7 + cair
23 1 tahun 3 bulan L 10.5 Bubulak + berlendir
24 1 tahun 6 bulan L 9 Bubulak 3/6 - cair
25 2 tahun L 12.5 Bubulak 4/4 - cair
26 8 tahun L 21 Situ Gede 1/4 + berlendir
27 4 tahun P 15 Sindang Barang 4/2 + cair
28 10 bulan P 7 Sindang Barang 2/7 - cair
29 1 tahun 5 bulan P 8.5 Sindang Barang 3/7 + berlendir 30 8 bulan L 7.5 Sindang Barang 3/6 - cair
31 2 bulan L 5 Bubulak 3/6 + berlendir
32 1 tahun P 8 Sindang Barang 4/4 - berlendir
33 5 bulan P 6.6 Situ Gede 2/3 - lunak
34 8 bulan L 8 Bubulak + cair
35 1 tahun 6 bulan P 10 Bubulak 1/9 - cair 36 1 tahun 2 bulan L 8 Bubulak 3/6 + berlendir 37 2 tahun 2 bulan P 11.5 Sindang Barang 6/4 + berlendir 38 1 tahun 1 bulan L 8 Bubulak 3/6 + cair 39 7 bulan L 7 Sindang Barang 5/5 + berlendir 40 2 tahun 4bulan P 11 Sindang Barang 1/6 + cair 41 10 tahun P 28 Sindang Barang 4/6 + berlendir Lampiran 1 Daftar kondisi pasien penderita diare
(5)
13
No
Sampel Usia Sex
Berat
badan (kg) Alamat (RT / RW) Demam Tipe diare
42 1 tahun L 9 Bubulak 3/1 + cair
43 2 tahun 2 bulan P 11 Sindang Barang 3/1 + cair 44 1 tahun 4 bulan L 10 Bubulak 7/1 + berlendir 45 1 tahun 7 bulan P 10 Sindang Barang 1/6 + cair
46 11 bulan L 7.5 Bubulak 3/1 + cair
47 3 tahun 6 bulan L 14 Marga Jaya 5/2 - cair
48 7 bulan L 7 Sindang Barang 3/8 + cair
49 5 bulan P 6 Sindang Barang 3/8 - cair
50 10 bulan L 8 Bubulak 4/9 + cair
51 1 tahun 2 bulan L 9 Situ Gede 1/6 - cair 52 3 tahun 4 bulan L 13 Situ Gede 3/2 + cair 53 1 tahun 9 bulan L 10 Marga Jaya 5/2 + cair
54 1 tahun 1 bulan P 8 Bubulak 2/5 + cair
55 6 bulan L 6 Sindang Barang 3/6 + berlendir 56 1 tahun 8 bulan P 11 Situ Gede 3/9 + cair
57 5 tahun L 20 Situ Gede 3/4 - cair
58 5 tahun P 23 Sindang Barang 1/3 + cair
59 3 tahun P 11 Situ Gede 2/3 + berlendir
60 11 Bulan P 6.5 Bubulak 3/5 - cair
61 2 tahun P 10 Sindang Barang 5/6 + berlendir 62 3 tahun 1 bulan L 12.5 Sindang Barang 5/6 - berlendir 63 1 tahun 1 bulan L 10 Sindang Barang 2/8 + cair 64 9 bulan L 8.5 Sindang Barang + berlendir 65 1 tahun 5 bulan P 9 Sindang Barang 2/6 + cair 66 6 tahun 5 bulan P 22 Sindang Barang 3/5 - berlendir
67 10 bulan L 6 Ciomas 2/10 + cair
68 2 tahun L 11.5 Situ Gede 2/3 - lunak
69 6 Bulan L 7.5 Sindang Barang 3/7 + cair 70 3 tahun 3 bulan L 12 Situ Gede 2/10 + berlendir
71 5 tahun L 19 Bubulak 3/1 + berlendir
72 5 bulan L 7 Sindang Barang 3/6 + cair
73 2 Tahun P 8.5 Marga Jaya 3/1 + cair
74 3 Bulan L 4 Bubulak 3/8 + cair
75 1 tahun 5 bulan L 10.5 Sindang Barang 4/5 - cair 76 1 tahun 6 bulan L 11 Sindang Barang 1/1 + cair
77 7 bulan L 5 Sindang Barang 3/8 + lunak
78 1 tahun 4bulan P 13 Loji 2/8 + berlendir 79 1 tahun 3 bulan P 14 Balumbang Jaya 4/5 - cair 80 8 bulan L 5 Sindang Barang 6/4 - berlendir
81 4 tahun P 10 Sindang Barang 6/4 + cair
82 1 tahun 8 bulan P 9 Balumbang Jaya 4/5 + berlendir 83 2 tahun 4 bulan P 9 Sindang Barang 4/4 + cair
84 4 bulan L 4 Sindang Barang 4/2 - lunak
(6)
14
No
Sampel Usia Sex
Berat
badan (kg) Alamat (RT / RW) Demam Tipe diare
85 3 tahun L 12.4 Bubulak 5/6 - cair
86 2 tahun L 10 Sindang Barang 4/4 - cair
87 3 tahun P 11 Bubulak 2/7 + cair
88 1 tahun 6 bulan L 12 Sindang Barang 3/1 + cair 89 1 tahun 6 bulan L 13 Sindang Barang 3/1 + berlendir
90 11 tahun L 30 Bubulak 1/6 - berlendir
91 1 tahun 9 bulan L 8 Sindang Barang 3/1 + cair 92 1.3 Tahun L 12.5 Sindang Barang 2/9 - berlendir 93 1.2 Tahun L 13 Sindang Barang 2/3 + cair
94 5 tahun L 18 Bubulak 4/7 + berlendir
95 2 Tahun L 9.5 Sindang Barang 2/5 + cair 96 1 Tahun 1 Bulan P 9 Situ Gede 3/4 - cair
97 2 tahun P 7 Marga Jaya 3/1 - cair
98 3 tahun 1 bulan L 11 Sindang Barang 4/5 - cair 99 4 tahun 5 bulan L 13 Sindang Barang 3/7 + cair
100 3 tahun P 9 Bubulak 2/8 - berlendir