Identifikasi, Profil Protein Dan Analisis Warna Filet Dori

IDENTIFIKASI, PROFIL PROTEIN DAN ANALISIS WARNA
FILET DORI

NURFAJRIN NISA

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Identifikasi, Profil
Protein dan Analisis Warna Filet Dori” adalah benar karya saya dengan arahan
dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2016

Nurfajrin Nisa
NIM C351130041

RINGKASAN
NURFAJRIN NISA. Identifikasi, Profil Protein dan Analisis Warna Filet
Dori. Dibimbing oleh TATI NURHAYATI, MALA NURILMALA DAN
NURLISA A BUTET.
Filet dori banyak beredar pada swalayan besar, namun kepastian ikan yang
digunakan dalam produk filet dori masih belum jelas. Spesies yang digunakan
untuk nama dagang dori menurut FDA merupakan Zeus faber, sedangkan pasar
Eropa juga memiliki persoalan nama dagang untuk pacific dory, vietnames sole
dan fresh water dory yang merupakan Pangasius. Informasi yang disediakan pada
label makanan laut sering tidak jelas atau tidak dapat dipertanggungjawabkan.
Konsumen sering disajikan ikan yang salah yaitu spesies yang berbeda dari yang
mereka bayar. Identifikasi spesies pada filet ikan sangat penting dalam
menghadapi kasus economic fraud. Metode analisis molekuler merupakan metode
yang akurat untuk identifikasi sehingga perlu diterapkan untuk memperoleh
kepastian spesies yang digunakan. DNA mitokondria (mtDNA) telah banyak
digunakan untuk identifikasi. Marka gen 16S rRNA dan COI merupakan marka
gen mitokondria yang banyak digunakan untuk identifikasi. Filet dori juga

memiliki penampakan warna yang berbeda. Warna tersebut mempengaruhi tingkat
penerimaan konsumen. Warna merupakan parameter penting yang digunakan
untuk mengetahui kualitas produk perikanan. Tujuan penelitian ini adalah (1)
mengidentifikasi filet dori secara molekuler menggunakan marka gen 16S rRNA
dan COI meliputi penentuan nukleotida spesifik yang menjadi penciri (barcode)
tiap filet dori, jarak genetik, dan pohon filogenetik, serta menyimpan runutan
nukleotida yang didapat berdasarkan marka gen 16S rRNA dan COI pada genbank,
(2) Mempelajari profil protein menggunakan SDS PAGE dan analisis warna yang
meliputi pengukuran warna menggunakan chromameter dan konsentrasi
mioglobin pada filet dori dan ikan patin.
Hasil identifikasi menunjukkan bahwa spesies yang digunakan adalah
Pangasianodon hypophthalmus (KC846907.1) dengan tingkat kesamaan sebesar
98-99%. Jarak genetik pada gen 16SrRNA dan COI antar sampel memiliki
kekerabatan yang erat. Marka gen 16S rRNA dan COI menunjukkan terdapat
variasi basa nukleotida antar sampel filet dori dan ikan patin. Marka gen 16S
rRNA mendapatkan 5 nomor akses dan marka gen COI mendapatkan 7 nomor
akses. Hasil penentuan profil protein didapatkan bahwa sampel DI, DM dan DG
terdapat pita tambahan pada berat molekul 44,6 kDa. Hasil analisis warna
menunjukkan bahwa filet DI dan DG masih baik dan belum mengalami
autooksidasi mioglobin.

Kata kunci: filet dori, identifikasi, profil protein, warna.

SUMMARY
NURFAJRIN NISA. Identification, Protein Profile and Color Measurement of
Dory Fillets. Supervised by TATI NURHAYATI, MALA NURILMALA and
NURLISA A BUTET.
Dory fillets commonly found in supermarkets, but the certainty of fishes are
used in product dory fillets still unclear. The species is used to the trade name of
dory fillets according to the FDA is Zeus faber, while the experience from
European market also occure issues of naming. Some names for pangasius species,
such as Pacific dory, Vietnamese sole and fresh water dory, have been misleading.
The information that is provided on seafood labels is frequently misleading or
fraudulent. Consumers are frequently served the wrong species a completely
different with the one they paid for. Species authentication on fish fillet is very
important to againts cases of economic fraud. Molecular analysis method is an
accurate method for identify, so it is used to the certainty of the species in the fish
fillet product. Mitochondrial DNA (mtDNA) has been applied on species
identification, genetic markers belong to mtDNA, i,e., 16S rRNA and COI are of
the one. Dory fillets has the appearance of a different color that affects the level of

consumer acceptance. Color is an important parameter used to know the quality of
fishery products. This study was aimed: (1) to identify dory fillet using molecular
markers 16S rRNA and COI gene includes determining specific nucleotide that
became identifier (barcode) each dory fish fillet, genetic distance, phylogenetic
tree and submit the sequence of nucleotides 16S rRNA and COI gene in GenBank,
(2) to study protein profile using SDS PAGE and color analysis includes color
determination using chromameter and myoglobin extractability of dory fillets and
catfish.
The results of identification showed that the samples used in dory fish fillet
products is Pangasianodon hypophthalmus (KC846907.1) and the degree of
similarity are 98-99%. The genetic distance using 16S rRNA and COI gene
between samples had a close relationship. Marka gene of 16S rRNA and COI
showed that there are nucleotide variations between samples fillet dori and catfish.
Marka gene of 16S rRNA obtain 5 accession numbers and marka gene of COI
obtain 7 accession numbers. Results showed at the protein profile determination
of sample DI, DM and DG there is an additional band at a molecular weight of
44.6 kDa. Results of the color measurement showed that the fillet of DI and DG
still good and has not experienced myoglobin autooxidation.
Key words: dory fish fillet, identification, protein profile, color.

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

IDENTIFIKASI, PROFIL PROTEIN DAN ANALISIS WARNA
FILET DORI

NURFAJRIN NISA

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Teknologi Hasil Perairan

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Asadatun Abdullah SPi MSM MSi

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah atas segala Rahmat dan
Karunia-Nya sehingga penulisan tesis ini dapat diselesaikan. Judul tesis ini
adalah ”Identifikasi, Profil Protein dan Analisis Warna Filet Dori”.
Penulis mengucapkan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada:
1. Dr Tati Nurhayati SPi MSi, Dr Mala Nurilmala SPi MSi dan Dr Ir Nurlisa A
Butet MSc selaku dosen pembimbing yang telah memberikan bimbingan,
arahan, dukungan, semangat kepada penulis sehingga penulis dapat
menyelesaikan tesis ini.
2. Dr Asadatun Abdullah SPi MSM MSi selaku dosen penguji luar komisi yang
telah memberikan bimbingan dan arahan sehingga penulis mampu
menyelesaikan tesis ini.

3. Dr Ir Wini Trilaksani MSc selaku perwakilan tim gugus kendali mutu atas
saran serta masukannya kepada penulis.
4. Keluarga: Kedua orang tua (Eva Fauziah dan Faruq Cahyono) beserta kakak
(Azwar Effendi) dan adik (Illiyin M Yazaka, M Alhakam Yazaka, Nur Fath
Aliyah) yang telah memberikan dukungan baik materil maupun spiritual kepada
penulis.
5. Teman-teman satu tim penelitian yang saya banggakan (Mbak Lita, Mbak
Yustin, Mbak Nuring, Mas Deden, Asya, Lela, Agus, Yuyun, Kak Findra, Kak
Panji, Kak Wahyu, Kak Samsul, Lusita, Feby, Dewi). Terimakasih atas bantuan
yang tulus. Laboran yang telah membantu penelitian saya (Paqih, Mas Ipul, Mba
Dila, Mba Dini dan Bu Ema).
6. Keluarga besar mahasiswa sekolah pascasarjana Teknologi Hasil Perairan, yang
telah memberikan dorongan semangat baik selama penelitian maupun saat
penyusunan tesis ini.
7. Teman-teman Jamilah yang banyak memberikan motivasi (Rosmely, Atika,
Nurma, Mbak Yani, Kak Rina, Teh Yeni, Teh Herly, Mila, Fifit, Anit, Risa,
Mbak Anty, Mbak Nurmi, Pei, Elis, Uni Iil, Teh Pera).
8. DIKTI yang telah membiayai pendidikan dan penelitian melalui beasiswa
BPPDN.
Penulis menyadari bahwa masih terdapat kekurangan dalam penyusunan

tesis ini. Oleh karena itu, jika terdapat kesalahan penulis memohon maaf yang
sebesar-besarnya. Penulis sangat mengharapkan kritik dan saran yang membangun
sehingga bermanfaat untuk penyelesaian tesis ini.
Akhirnya, semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Agustus 2016
Nurfajrin Nisa

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vi

DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan
Manfaat Penelitian

1
2
3
3

2 METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Bahan
Alat
Prosedur Penelitian
Prosedur Analisis
Identifikasi Secara Molekuler
Penentuan Profil Protein dengan SDS PAGE

Analisis Warna

4
4
4
5
6
6
9
10

3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Identifikasi Secara Molekuler
Penentuan Profil Protein dengan SDS PAGE
Analisis Warna

12
17
19

4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

22
22

DAFTAR PUSTAKA

22

LAMPIRAN

29

RIWAYAT HIDUP

43

DAFTAR TABEL
1 Komposisi PCR untuk amplifikasi gen 16S rRNA dan COI
2 Kuantitas isolasi DNA filet dori dan ikan patin
3 Hasil identifikasi spesies dari filet dori dan ikan patin menggunakan
BLASTn
4 Situs nukleotida gen 16S rRNA dan COI pada filet dori dan ikan patin
5 Pairwise distance pada gen 16S rRNA dan COI pada filet dori dan
ikan patin
6 Nomor akses pada marka gen 16S rRNA dan COI pada filet dori dan
ikan patin
7 Hasil pegukuran warna filet dori dan ikan patin
8 Indeks kemerahan filet dori dan ikan patin
9 Konsentrasi mioglobin (mg/100 g) daging merah dan daging putih
pada filet dori dan ikan patin

8
12
14
14
15
17
20
20
21

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4

Tahap identifikasi secara molekuler
Tahap penentuan profil protein dan analisis warna
Visualisasi DNA filet dori dan ikan patin menggunakan agarosa 1,2%
Amplifikasi DNA filet dori dan ikan patin marka menggunakan gen
16S rRNA dan COI
5 Konstruksi pohon filogenetik berdasarkan gen 16S rRNA
6 Konstruksi pohon filogenetik berdasarkan gen COI
7 Profil protein filet dori dan ikan patin

5
6
13
13
16
16
18

DAFTAR LAMPIRAN
1 Dokumentasi sampel filet dori
2 Pensejajaran nukleotida gen 16S rRNA antar sampel filet dori dan
ikan patin berdasarkan sekuen 602 pb yang dibandingkan dengan P.
hypophthalmus dan Z. faber dari NCBI
3 Situs nukleotida spesifik gen 16S rRNA antar sampel filet dori dan
ikan patin berdasarkan sekuen 602 pb yang dibandingkan dengan P.
hypophthalmus dan Z. faber dari NCBI
4 Situs nukleotida spesifik gen 16S rRNA antar sampel filet dori dan
ikan patin berdasarkan sekuen 602 pb yang dibandingkan dengan P.
hypophthalmus dari NCBI
5 Situs nukleotida spesifik gen 16S rRNA antar sampel filet dori dan
ikan patin berdasarkan sekuen 602 pb

31
32
33

35
35

6 Pensejajaran nukleotida gen COI antar sampel filet dori dan ikan patin
berdasarkan sekuen 598 pb yang dibandingkan dengan P.
hypophthalmus dan Z. faber dari NCBI
7 Situs nukleotida spesifik gen COI antar sampel filet dori dan ikan
patin berdasarkan sekuen 598 pb yang dibandingkan dengan P.
hypophthalmus dan Z. faber dari NCBI
8 Situs nukleotida spesifik gen COI antar sampel filet dori dan ikan
patin berdasarkan sekuen 598 pb yang dibandingkan dengan P.
hypophthalmus dari NCBI
9 Situs nukleotida spesifik gen COI antar sampel filet dori dan ikan
patin berdasarkan sekuen 598 pb
8 Perhitungan berat molekul

36
37
39
40
41

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Filet dori banyak beredar pada swalayan besar, namun kepastian ikan yang
digunakan dalam produk filet dori masih belum jelas. Spesies yang digunakan
untuk nama dagang dori menurut FDA merupakan Zeus faber (Yanci et al. 2008),
sedangkan di Eropa nama dagang untuk pacific dory, vietnames sole dan fresh
water dory yang merupakan pangasius masih menjadi persoalan karena nama
dagang tersebut menyesatkan (Lee 2006). Ikan dori merupakan ikan air laut yang
memiliki nilai ekonomi tinggi, sedangkan ikan patin merupakan ikan air tawar
yang memiliki ekonomi rendah (Kuan et al. 2015). Ikan patin sering diubah nama
dagangnya menjadi ikan cajun delight catfish, ikan delta fresh catfish, ikan white
roughy, ikan pacific dory, dan ikan grouper (Jacquet dan Pauly 2008).
Produk perikanan merupakan salah satu makanan yang paling diminati
namun konsumen sering diberikan sedikit atau tidak ada informasi mengenai label
spesies. Informasi yang disediakan pada label produk perikanan juga sering tidak
dapat dipertanggungjawabkan. Konsumen sering diberikan ikan yang salah, yaitu
spesies yang berbeda dari yang mereka bayar (Stiles et al. 2011).
Ikan patin Vietnam yang biasa dikenal sebagai basa atau tra, dijual sebagai
ikan grouper di Kansas, Baltimore dan Tampa. Di Amerika ikan patin tersebut
juga dijual sebagai ikan grouper untuk menghindari tarif lebih pada tahun 2010
(NOAA 2007). Ikan dengan nama dagang atlantic cod telah diganti dengan
escolar. Ikan tersebut dapat menyebabkan gejala diare berat, mual, muntah, dan
kram perut (Lam 2007). Mislabeling juga terjadi pada ikan monkfish yang ternyata
merupakan ikan buntal beracun dan hanya dapat dimakan dengan pengolahan
khusus. Ikan beku tersebut diimpor dari California, diproses di Cina, berlabel di
Korea dengan lokasi penangkapan yang tidak diketahui (Cohen et al. 2009).
Identifikasi spesies pada filet ikan sangat penting dalam menghadapi kasus
commercial fraud, yaitu mengganti spesies yang memiliki nilai komersial tinggi
dengan spesies bernilai komersial rendah yang sering dilakukan oleh para
produsen. Menurut Jacquet dan Pauly (2008) dorongan finansial merupakan
motivasi kuat untuk mengubah nama ikan dengan nama yang lebih menarik.
Banyak ikan yang diberi nama baru dan sering mirip dengan ikan yang telah
populer. Hal ini tentu saja sangat merugikan konsumen. Pelabelan spesies yang
salah tersebut menyebabkan masalah serius dalam hal kesehatan, ekologi, dan
ekonomi (Gomes et al. 2014).
Identifikasi spesies yang digunakan dalam produk filet dori belum
diketahui secara pasti dan identifikasi secara morfologi masih belum dapat
menghasilkan identifikasi yang akurat sehingga pengembangan metode analisis
molekuler perlu dilakukan. Metode ini merupakan salah satu metode yang paling
banyak digunakan dan akurat untuk penelusuran keaslian spesies (Teletchea et al.
2005). Marka genetik yang bersumber dari mitokondria yang diwariskan secara
maternal telah banyak dieksplorasi untuk membantu memecahkan permasalahan
identifikasi dan kepastian pada tingkat spesies, bahkan sampai tingkat populasi
pada spesies yang sama (Brown et al. 1996; Arif et al. 2011; Chiu et al. 2012).
Beberapa marka gen mitokondria yang sering digunakan adalah marka gen
cytochrome oxidase I (COI) (Hebert et al. 2003; Hajibabei et al. 2006),

2
cytochrome b (Cyt b) (Pepe et al. 2005), 16S rRNA (Mane et al. 2013), dan
control region (Johnson dan O’Brien 1997).
Laju mutasi yang cepat pada gen COI dapat mengidentifikasi spesies yang
berbeda (Solihin 1994). Gen tersebut banyak digunakan untuk identifikasi spesies,
beberapa peneliti melaporkan bahwa COI mengandung cukup variasi sehingga
mampu mengidentifikasi secara akurat berbagai macam hewan, termasuk
organisme air tawar (Hubert et al. 2008) dan organisme air laut (Ward et al. 2005;
Spies et al. 2006). Gen ini juga telah berhasil digunakan dalam identifikasi olahan
ikan dan kasus commercial fraud (Cawthorn et al. 2012).
Gen 16S rRNA sering dipakai untuk identifikasi spesies bahkan populasi,
baik untuk organisme eukariot dan prokariot (Devereux dan Wilkinson 2004).
Pemalsuan olahan ikan pada restoran di Jerman berhasil dideteksi menggunakan
16S rRNA(Kappel dan Schrőder 2016), juga berhasil mendeteksi beberapa produk
fish maw (Wen et al. 2015). Gen 16S rRNA dapat digunakan untuk
mengidentifikasi hewan laut, tumbuhan, dan bakteri (Baharum dan Nurdalila
2012).
Filet dori yang terdapat di Indonesia berasal dari produksi lokal dan impor
yang memiliki karakteristik penampakan daging yang berbeda. Filet dori impor
lebih disukai konsumen karena memiliki warna yang lebih putih dibandingkan
dori lokal, sedangkan filet dori lokal memiliki warna yang lebih merah. Warna
merah tersebut disebabkan oleh adanya protein pigmen mioglobin. Mioglobin
diketahui memberikan warna merah pada otot, tergantung turunan dan
konsentrasinya (Faustman et al. 1992; postnikova et al. 1999). Stabilitas
mioglobin juga mempengaruhi warna daging (Chantai et al. 1998; Chen 2003;
Suzuki dan Kisamori 1984). Proses penanganan, penyimpanan ikan, kandungan
biokimia, dan mikrobiologi dapat menyebabkan perubahan warna daging
(Faustman et al. 1992; O’Grady et al. 2001; Pacheco-Aguilar et al. 2000),
penambahan asam dan basa pada perlakuan awal juga mempengaruhi perubahan
warna daging (Ochiai et al. 2009). Perubahan warna tersebut dapat dipengaruhi
oleh banyak faktor seperti pH, suhu, kekuatan ion dan reaksi oksigen (Renerre dan
Labas 1987). Karakteristik penampakan warna filet yang berbeda tersebut perlu
dipelajari menggunakan profil protein, pengukuran warna dan konsentrasi
mioglobin (Chaijan et al. 2007; Thiansilakul et al. 2011; Nurilmala dan Ochiai
2013).
Perumusan Masalah
Identifikasi spesies ikan menjadi penting untuk mendeteksi dan mencegah
mislabeling di pasar. Identifikasi secara morfologi tidak dapat dilakukan ketika
ikan telah dilakukan proses pengolahan misalnya filet ikan dan makanan olahan
lainnya, sehingga diperlukan identifikasi secara molekuler. Identifikasi secara
molekuler merupakan metode yang efektif dan banyak digunakan dalam
ketelusuran bahan baku pembuatan produk makanan. Hal ini didasarkan pada
keragaman urutan daerah DNA pendek (barcode DNA) pada genom yang
memiliki sebuah interspesifik tinggi, namun antar jenis rendah (Galimberti et al.
2013). Beberapa penanda telah digunakan untuk identifikasi ikan (Wen et al.
2010). Fragmen gen COI dan 16S rRNA sering digunakan untuk memecahkan

3
permasalahan identifikasi dan kepastian pada tingkat spesies bahkan sampai
tingkat populasi pada spesies yang sama.
Penipuan dengan mislabeling pada produk olahan berbahan dasar ikan
menjadi masalah penting pada industri produk perikanan ditingkat Internasional
dan Regional. Mislabeling terjadi ketika salah satu spesies digantikan oleh spesies
yang lain (Rasmussen dan Morrissey 2008). Efek merugikan dari mislabeling
pada produk berbahan baku ikan yaitu ekonomi dan bahaya kesehatan (Galimberti
et al. 2013). Umumnya penyebab terjadinya mislabeling adalah ingin
meningkatkan nilai jual dari produk (Von der Heyden et al. 2010). Motif penipuan
ekonomi didalam industri makanan laut, telah diungkap berdasarkan pada
penggantian spesies dari ikan mahal diganti dengan menggunakan spesies yang
lebih murah (Rasmussen dan Morrissey 2008).
Warna daging dari filet dori sangat mempengaruhi tingkat penerimaan
konsumen dan harga dari filet tersebut, hal ini merupakan tantangan utama dalam
industri pengolahan filet ikan. Warna daging filet yang tidak putih (merah muda
atau kuning) menyebabkan harga filet menjadi lebih rendah di pasar (Sørensen
2005), sehingga warna yang tidak diinginkan tersebut umumnya dihilangkan
dengan metode fisik misalnya dengan pencucian (Chaijan et al. 2006), pendarahan
(bleeding) (Richards dan Hultin 2002; Sakai et al. 2006) dan metode kimia yang
bertujuan untuk memutihkan filet yaitu dengan menambahkan hidroperoksida
(Huges et al. 1979) dan titanium dioksida (Benjakul et al. 2004). Proses perlakuan
pemfiletan yang beragam tersebut menyebabkan karakteristik penampakan yang
berbeda, sehingga perlu dipelajari menggunakan profil protein, pengukuran warna
dan konsentrasi mioglobin (Chaijan et al. 2007; Thiansilakul et al. 2011;
Nurilmala dan Ochiai 2013).
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk :
1. Mengidentifikasi filet dori secara molekuler menggunakan marka gen 16S
rRNA dan COI meliputi penentuan urutan nukleotida spesifik yang menjadi
penciri (barcode) tiap filet dori, jarak genetik dan filogenetik, serta
menyimpan runutan nukleotida yang didapat berdasarkan marka gen 16S
rRNA dan COI pada genbank.
2. Mempelajari profil protein menggunakan SDS PAGE dan analisis warna
yang meliputi pengukuran warna menggunakan chromameter dan
konsentrasi mioglobin pada filet dori dan ikan patin.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada pemerintah
dan masyarakat mengenai spesies yang digunakan pada filet dori lokal dan impor
menggunakan analisis molekuler berdasarkan marka gen 16S rRNA dan COI,
meliputi urutan nukleotida spesifik yang menjadi penciri (barcode) filet dori, jarak
genetik dan pengelompokan filet dori melalui analisis filogenetik. Hasil penelitian
ini juga diharapkan dapat memberikan informasi mengenai profil protein dan
analisis warna yang meliputi pengukuran warna menggunakan chromameter dan
konsentrasi mioglobin dari filet dori lokal maupun impor.

4

2 METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan September 2014 sampai Januari 2016
di Laboratorium Biologi Molekuler Departemen Pengelolaan Sumberdaya
Perairan, Laboratorium Karakteristik Bahan Baku, Laboratorium Bioteknologi
Hasil Perairan II, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Laboratorium Terpadu
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.
Bahan
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah empat sampel filet
dori lokal dan dua filet dori impor yang diambil dari beberapa supermarket yang
ada diwilayah Bogor menggunakan teknik random sampling, serta satu ikan patin
dari Desa Petir, Bogor, Jawa Barat sebagai kontrol positif karena ikan tersebut
diduga merupakan spesies yang digunakan dalam filet dori. Tiga filet dori dari
setiap sampel (DI, PU, DN, DL, DG, DS dan DM) digunakan untuk uji
pengukuran warna dan konsentrasi mioglobin. Sampel yang telah dikumpulkan
disimpan pada suhu -20 ºC sebelum dianalisis molekuler.
Bahan-bahan kimia yang digunakan adalah kit isolasi komersial Dneasy
Blood & Tissue Kit (Qiagen), gel agarose 1,2% (Vivantis Inc., US), buffer Tris
Acetic EDTA (TAE) 1x (Vivantis Inc., US), primer universal 16S rRNA dan COI,
PCR mix Kapa Taq Extra Hot Start Ready Mix PCR Kit (Kapa Biosystems),
loading buffer dan marker DNA (Vivantis Inc., US), Separating gel (12,5%),
stacking gel (3%), tetrametiletilendiamin (TEMED) dan O-ftatalaldehid (OPA),
akuabides, NaNO3, KCN, bufer potasium fosfat 1 N, SDS (Merck, Darmstadt,
Germany), glisin (Merck, Darmstadt, Germany), gliserol (Merck, Darmstadt,
Germany), ammonium persulfat (APS) (Sigma-Aldrich, Missouri, USA), βmerkaptoetanol (Merck, Darmstadt, Germany), coomassie brilliant blue (Merck,
Darmstadt, Germany), metanol (Merck, Darmstadt, Germany), asam asetat glasial
(Merck, Darmstadt, Germany), dan bromphenol blue (Merck, Darmstadt,
Germany), buffer laemmli 2x (Bio-Rad Laboratories, Inc. US), marker protein
8,8-192 kDa (Nacalai tesque, Inc. Kyoto-Japan). Bahan software yang dipakai
adalah CustalW program MEGA 5.05 (Molecular Evolutionary Genetic Analysis),
BLASTn (Basic Local Alignment Search Tool nucleotide).
Alat
Alat-alat yang digunakan adalah alat bedah, pinset, tube 1,5 mL (Axygen,
USA), vortex (Corning, USA), mikro tip (Axygen, USA), mikro pipet ((Thermo
Scientific Vantaa, Finland), inkubator (Corning, USA), sentrifuse (J2-21
BECKMAN, Germany), spin column (Axygen, USA), spektrofotometer UV
(NanoPhotometer P360, Implen GmbH, Schatzbogen, Germany), chamber
elektroforesis (Mupid-Exu Submarine Electrophoresis System Advance, Tokyo),
monitor UV (Ultraviolet Viewer Tipe UV-1 ExtraGene, Inc. Taiwan), mesin PCR
Termocycler (Biometra T1, Biometra GmbH, Gottingen, Jerman), gelas ukur,
stirrer, beaker glass, falcon, kuvet, eppendorf, mikropipet, timbangan analitik,
tabung reaksi, spektrofotometer (UV-VIS 2500, LaboMed, California, Amerika),

5
kromameter (minolta CR-310, Konika Minolta, Tokyo, Jepang), sentrifuse (Himac
CR 21G, Hitachi, Tokyo, Jepang).

Prosedur Penelitian
Tahapan penelitian ini meliputi identifikasi secara molekuler, profil protein
dan analisis warna pada filet dori. Identifikasi secara molekuler meliputi
penentuan nukleotida spesifik yang menjadi penciri (barcode) tiap filet dori, jarak
genetik, dan filogenetik berdasarkan marka gen 16S rRNA dan COI. Pengukuran
warna menggunakan chromameter dilakukan di Laboratorium Departemen Ilmu
dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Diagram alir penelitian dapat dilihat pada Gambar 1 dan 2.

Pengumpulan sampel
Isolasi DNA
(Dneasy ® blood and tissue protocol, 2011)
DNA sampel

Amplifikasi DNA dengan
marka gen 16S rRNA
(Kappa HotStart Protokol)

- Visualisasi DNA
(Elektroforesis)
-Kualitas DNA
(Spektrofotometer)

Amplifikasi DNA dengan
marka gen COI
(Kappa HotStart Protokol)

Produk PCR
Sekuensing
(Sanger et al. 1977)

Runutan
nukleotida

Visualisasi produk PCR
Elektroforesis
Analisis nukleotida
(Tamura et al. 2013):
- Identifikasi spesies (Blast n)
- Nukleotida spesifik
- Jarak genetik (kimura 2-parameter)
- Pohon filogenetik (Neighbor-Joining)

penyimpanan nukleotida
pada genbank
Nomor akses

Keterangan :

= input/output
= proses
= data
Gambar 1 Tahap identifikasi secara molekuler.

6

Pengumpulan sampel

Identifikasi profil protein
(Laemmli 1970)

Pembuatan separating
gel

Analisis warna

Pengukuran warna
menggunakan chromameter
(hutching 1999)

Konsentrasi mioglobin
(modifikasi dari Nurilmala et al. 2013)

Pembuatan stacking gel

Preparasi dan injeksi
sampel

Pengukuran dengan
chromameter
minolta

Pengukuran dengan
spektrofotometer
panjang gelombang
540 nm

Running SDS-PAGE

Pewarnaan gel

Nilai derajat
warna L*, a*, b*

Konsentrasi
mioglobin

Destaining gel

Penentuan berat
molekul protein
yang terpisahkan

profil protein

Keterangan :

= input/output
= proses
= data

Gambar 2 Tahap penentuan profil protein dan analisis warna.
Prosedur Analisis
Identifikasi Secara Molekuler
Isolasi DNA
Sebanyak 25 mg daging ikan dimasukkan ke dalam microtube, ditambahkan
180 μL buffer ATL dan 20 μL proteinase K, kemudian divortex selama 10 detik.

7
Sampel diinkubasi selama 1 jam pada suhu 56ºC (dishake setiap 15 menit).
Sampel ditambahkan 200 μL buffer AL dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu
56ºC kemudian ditambahkan 200 μL etanol 96% dan divortex. Sebanyak 600 μL
sampel dipindahkan ke dalam Dneasy Mini spin column yang telah ditempatkan
pada collection tube kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 8.000 rpm selama
1 menit, kemudian larutan dalam collection tube dibuang. Buffer AW1 sebanyak
500 μL ditambakan pada DNeasy Mini spin column, dilanjutkan sentrifugasi
dengan kecepatan 8.000 rpm selama 1 menit, kemudian larutan dalam collection
tube dibuang. Buffer AW2 sebanyak 500 μL ditambahkan pada DNeasy Mini spin
column kemudian disentrifugasi selama 3 menit pada kecepatan 14.000 rpm,
setelah proses sentrifugasi, collection tube beserta larutan yang berada didalamnya
dibuang. DNeasy Mini spin column ditempatkan pada microtube baru dengan
ukuran 1,5 mL dan ditambahkan 100-200 μL buffer AE ke dalam bagian DNeasy
membranes. Langkah ini dilanjutkan dengan inkubasi selama 1 menit pada suhu
ruang (15-25ºC), kemudian dilakukan sentrifugasi selama 1 menit pada kecepatan
8.000 rpm dan diambil cairannya. Hasil dari ektraksi DNA dilakukan visualisasi.
Pengukuran Konsentrasi dan Kemurnian DNA
Konsentrasi DNA dianalisis dengan spektrofotometer, didasarkan pada
prinsip iradiasi ultra violet yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam larutan.
Penyerapan maksimal oleh DNA dicapai pada panjang gelombang 260 nm,
sedangkan penyerapan maksimal oleh protein diperoleh pada panjang gelombang
280 nm (Muladno 2010). Pengukuran konsentrasi DNA adalah sebagai berikut:
Konsentrasi DNA (µg/mL) A260

50

faktor pengenceran

Kemurnian DNA ditentukan dengan cara menghitung rasio antara nilai OD
(optical density) 260 dan 280 pada sampel DNA yang diukur melalui
spektrofotometer. Kemurnian DNA didapatkan berdasarkan perbandingan nilai
absorbansi panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Absorbansi maksimal dari
nukleotida terjadi pada panjang gelombang 260 nm, sedangkan absorbansi
maksimal dari kontaminan protein berada pada panjang gelombang 280 nm
(Boyer dan Rodney 2005).
Visualisasi Isolat DNA
Visualisasi DNA dianalisis menggunakan elektroforesis, meliputi:
a. Pembuatan gel agarosa 1,2%
Pembuatannya adalah dengan cara melarutkan 1,2 gram bubuk agarosa
pada 100 mL buffer TAE 1x, larutan dipanaskan di atas hot plate selama beberapa
menit sampai mendidih dan warna larutan menjadi jernih. Larutan didiamkan
selama beberapa menit kemudian ditambahkan 0,5 μL ethidium bromide
kemudian larutan dituangkan dalam cetakan yang telah dipasang electrophoresis
comb.
b. Elektroforesis
Gel agarosa yang telah membentuk gel dilepaskan dari cetakannya dan
diambil electrophoresis combnya. Gel dipindahkan ke dalam casting tray yang
telah digenangi larutan buffer TAE sehingga gel agarosa terendam di dalam

8
larutan buffer. Sebanyak 2,5 μL hasil ekstraksi DNA ditambahkan 0,20 μL larutan
loading dye yang digunakan sebagai pemberat. Larutan tersebut dicampurkan
pada plastik steril dan dimasukkan ke dalam sumur gel agarosa. Sebanyak 2,5 μL
DNA marker dimasukkan ke dalam salah satu sumur. Alat casting tray kemudian
dihubungkan dengan seperangkat alat katoda-anoda. Bagian yang terdapat DNA
berada di sisi negatif, DNA bermuatan negatif sehingga ketika alat dijalankan
DNA akan bergerak dari kutub negatif ke positif. Alat dijalankan selama 30 menit
dan 100 V. Langkah terakhir adalah visualisasi DNA dengan menggunakan sinar
UV (elektroforsis DNA genom).
Amplifikasi fragmen gen 16S rRNA dan COI dengan PCR
Amplifikasi fragmen DNA untuk fragmen gen 16S rRNA dan COI
menggunakan primer universal untuk beberapa biota akuatik. Komposisi PCR
untuk amplifikasi menggunakan PCR mix Kapa Taq Extra Hot Start Ready Mix
PCR Kit (Kapa Biosystems) sebanyak 25 µL, komposisi yang digunakan terdapat
pada Tabel 1.
Amplifikasi ini menggunakan mesin PCR Termocycler dengan kondisi
amplifikasi untuk fragmen gen 16S rRNA dilakukan pada suhu predenaturasi
94ºC selama 3 menit, suhu denaturasi 94ºC selama 45 detik, suhu annealing 46ºC
selama 1 menit, suhu elongasi 72ºC selama 1 menit, suhu post PCR 72ºC selama 7
menit, dan suhu penyimpanan 15ºC selama 10 menit. Prosedur ini dilakukan
sebanyak 35 siklus.
Tabel 1 Komposisi PCR untuk amplifikasi gen 16S rRNA dan COI
No
1
2
3
4
5

Bahan
ddH2O
PCR mix
Primer Forward
Primer Reverse
DNA template

Jumlah (µL)
9
25
3
3
10

Kondisi amplifikasi untuk fragmen gen COI dilakukan pada suhu
predenaturasi 94ºC selama 3 menit, suhu denaturasi 94ºC selama 45 detik, suhu
annealing 54ºC selama 1 menit, suhu elongasi 72ºC selama 1 menit, suhu post
PCR 72ºC selama 7 menit dan suhu penyimpanan 15ºC selama 10 menit. Prosedur
ini dilakukan sebanyak 35 siklus.
Hasil PCR divisualisasi menggunakan elektroforesis. Sampel PCR
sebanyak 2,5 µL dimasukkan ke dalam electrophoresis chamber untuk
dimigrasikan selama 60 menit, kemudian divisualisasi di bawah monitor UV.
Sampel PCR yang menghasilkan pita yang tebal dan terang dikirimkan ke
perusahaan jasa sekuensing untuk dilakukan perunutan nukleotida.
Pensejajaran nukleotida
Runutan nukleotida sampel filet dori dari fragmen gen 16S rRNA dan COI
disejajarkan (alignment) menggunakan CustalW program MEGA 5.2 (Molecular
Evolutionary Genetic Analysis) (Tamura et al. 2011), kemudian dianalisis variasi

9
nukleotida menggunakan program MEGA 5.2. Hasil pensejajaran dikomparasi
menggunakan Basic Local Alignment Search Tool nucleotide (BLASTn).
Jarak genetik dan kekerabatan
Jarak genetik antar sampel dianalisis menggunakan pairwise distance
dengan metode kimura 2-parameter menggunakan program MEGA 5.2, jarak
genetik antar sampel dan outgrup sampel yang diambil dari GenBank juga
dianalisis. Konstruksi pohon filogenetik dibuat berdasarkan jarak genetik yang
sudah dihitung dengan menggunakan metode Neighbor-Joining (NJ) pada
program MEGA 5.2.
Penyimpanan nukleotida pada genbank
Bank data nukleotida berupa pangkalan data primer yang digunakan untuk
menyimpan sekuen primer dari asam nukleat dan protein. Pangkalan data
Genbank dioperasikan oleh National Center for Biotechnology Information
(NCBI) yang mengakomodasi semua publikasi sekuen DNA dengan annotations
(penjelasan atau catatan) yang akan selalu berkembang dan diperbaharui. Sekuen
DNA filet dori berdasarkan marka gen 16S rRNA dan COI disimpan pada situs
web
Bankit-National
Center
for
Biotechnology
Information
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/WebSub/?tool=genbank)
dengan
mengisikan
penjelasan meliputi informasi pribadi, sequence authors, sequencing technology,
nucleotide, submission category, source modifiers, features, review & correct.
Penentuan profil protein dengan SDS PAGE (Laemmli 1970)
SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) dilakukan untuk
menentukan berat molekul protein. Analisis SDS-PAGE dilakukan menggunakan
gel akrilamid dengan konsentrasi separating gel 12,5% dan stacking gel 3%.
Sampel yang dielektroforesis adalah ekstrak protein larut air. Beberapa tahapan
utama yang harus dilakukan dalam melakukan elektroforesis SDS-PAGE adalah
a) pembuatan separating gel, b) pembuatan stacking gel, c) persiapan sampel, d)
running gel, e) pewarnaan gel, f) destaining gel, dan g) penentuan berat molekul
protein-protein yang terpisahkan.
a) Pembuatan separating gel
Dua lempengan kaca (mini slab) yang akan digunakan sebagai cetakan gel
dirangkai sesuai dengan petunjuk pemakaian. Bahan yang digunakan untuk
membuat separating gel adalah 4,8 mL ddH2O, 6,2 ml 30% acrilamid, 3,75 mL
1,5M Tris-HCl (pH 8,8), 150 µL 10% SDS, 150 µL 10% APS, 15 µL TEMED.
Bahan tersebut dicampurkan dengan penambahan APS dan TEMED secara urut
kemudian dimasukkan sebanyak ±5 mL campuran ke dalam lempengan kaca
(mini slab) tanpa menimbulkan gelembung udara dengan menggunakan mikro
pipet sampai sekitar 1 cm dari atas lempengan. Bagian yang tidak diisi gel diberi
akuades sebanyak ±1 mL untuk meratakan gel yang terbentuk. Gel kemudian
dibiarkan mengalami polimerisasi selama 30-60 menit.
b) Pembuatan stacking gel
Air dibuang dari atas separating gel dan dikeringkan dengan
menggunakan tissue. Bahan yang digunakan untuk membuat stacking gel adalah

10
3,7 mL ddH2O; 0,5 mL 30% acrilamid; 0,65 mL 1,5 M Tris-HCl (pH 6,8); 50 µL
10% SDS, 50 µL 10% APS, 5 µL TEMED. Campuran dimasukkan ke dalam
mini slab, kemudian sisir dimasukkan dengan cepat tanpa menimbulkan
gelembung udara. Stacking gel dibiarkan mengalami polimerisasi selama 30-60
menit. Sisir diangkat dari atas gel dengan perlahan dan slab ditempatkan ke dalam
wadah elektroforesis. Bufer elektroforesis dimasukkan ke dalam wadah
elektroforesis di bagian dalam dan luar agar gel terendam.
c) Preparasi dan injeksi sampel
Sampel diekstrak proteinnya dengan cara 1 g sampel ditambahkan 3 mL
akuades dikocok-kocok kemudian disentrifuse dengan kecepatan 5.000 rpm, suhu
4°C selama 30 menit dan diambil supernatannya. Volume yang sama dari sampel
dicampur dengan buffer sampel laemmli. Campuran sampel dan buffer diinkubasi
pada 95ºC selama 3 menit. Sampel siap diinjeksikan ke dalam sumur
menggunakan mikropipet sebanyak 5 μL. Salah satu sumur diinjeksikan protein
marker sebanyak 5 μL protein marker.
d) Running SDS-PAGE
Katup elektroda dipasang dengan arus mengalir ke anoda. Sumber listrik
dinyalakan dan dijaga konstan pada 13 mA dan voltase 150 V selama ±3 jam.
Setelah selesai, aliran listrik dimatikan dan katup elektroda dilepaskan, lalu plat
gel dipindahkan dari elektroda.
e) Pewarnaan gel
Gel diangkat dari slab dan dipindahkan ke dalam wadah tertutup yang
telah berisi pewarna coomasie briliant blue (kurang lebih 20 mL) dan didiamkan
selama 2 jam.
f) Destaining gel
Gel diangkat dan dicuci menggunakan akuades beberapa kali. Larutan
penghilang warna (destaining solution) ditambahkan dan digoyangkan hingga
latar belakang pita protein menjadi terang. Larutan penghilang warna dibuang dan
gel siap dianalisis. Gel hasil elektroforesis SDS-PAGE tersebut di
dokumentasikan dalam bentuk gambar.
g) Penentuan berat molekul protein yang terpisahkan
Berat molekul protein sampel dapat dihitung dari persamaan regresi antara
mobilitas relatif protein marker (penanda protein) dengan logaritma dari berat
molekul marker yang diketahui. Mobilitas relatif protein dihitung dengan
membandingkan jarak migrasi protein diukur dari garis awal separating gel
sampai ujung pita protein yang dibandingkan dengan jarak migrasi tracking dye.
Mobilitas relatif tersebut dirumuskan sebagai persamaan berikut :
Rf = jarak migrasi protein
jarak migrasi tracking dye
Analisis warna
Pengukuran warna menggunakan chromameter (Hutching 1999)
Warna diukur dengan menggunakan alat chromameter minolta cr-310.
Nilai L, a, dan b dikalibrasi sebelum dilakukan pengukuran menggunakan
pelat standar warna putih, setelah proses kalibrasi selesai, dilanjutkan dengan

11
pengukuran warna sampel. Sistem warna yang digunakan adalah sistem L, a,
dan b.
Sampel diletakkan pada tempat yang tersedia, kemudian tombol start
ditekan dan akan diperoleh nilai L, a dan b. Hasil pengukuran dikonversi ke dalam
sistem Hunter dengan L menyatakan parameter kecerahan (light) yang
mempunyai nilai 0 (hitam) sampai 100 (putih). Nilai L menyatakan cahaya pantul
yang menghasilkan warna kromatik putih, abu-abu, dan hitam. Semakin tinggi
nilai L maka semakin tinggi kecerahan warna. Notasi a menyatakan warna
kromatik campuran merah-hijau dengan nilai +a (positif) dari 0 sampai 80 untuk
warna merah dan –a (negatif) dari 0 sampai –80 untuk warna hijau. Notasi b
menyatakan warna kromatik campuran kuning-biru dengan nilai +b (positif) dari 0
sampai 70 untuk warna kuning dan nilai –b (negatif) dari 0 sampai –70 untuk
warna biru.
Konsentrasi mioglobin (modifikasi dari Nurilmala et al. 2013)
Sebanyak 3 gram sampel ditambahkan dengan 21 mL akuabides dingin (0 –
4ºC) kemudian dihomogenkan selama 1 menit. Setelah itu disentrifuse selama 15
menit dengan kecepatan 3.000 g pada suhu 4ºC. Sebanyak 1 mL ekstrak filet dori
dicampur dengan 0,5 mL buffer potasium phosphat (25 mM, pH 7), tambahkan
25 µL NaNO3 5% dan 25 µL KCN 1%. Absorbansi diukur menggunakan
spektrofotometer (540 nm). Konsentrasi Mb dihitung menggunakan rumus :
Konsentrasi (

mg
)
g

absorban 2

Keterangan :
11.300 = koefisien molekuler extinction
16.000 = berat molekul mioglobin
Analisis statistik (Steel dan Torrie 1993)
Analisis statistik dilakukan terhadap data yang diperoleh pada analisis
warna yang meliputi hasil pengukuran warna menggunakan chromameter dan
konsentrasi mioglobin dengan menggunakan perhitungan berdasarkan tingkat
kepercayaan 95%. Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak
lengkap (RAL), rancangan tersebut digunakan untuk membandingkan pengukuran
warna dan konsentrasi mioglobin filet dori yang terdiri dari satu faktor dan tujuh
taraf dengan tiga kali ulangan. Data yang diperoleh dianalisis menggunakan
analisis ragam, apabila pengaruhnya berbeda nyata maka dilanjutkan dengan uji
lanjut least significant difference (LSD). Hipotesis yang digunakan adalah sebagai
berikut :
H0:
H1:

Perbedaan produk filet dori tidak berpengaruh terhadap pengukuran warna
dan konsentrasi mioglobin filet dori.
Perbedaan produk filet dori berpengaruh terhadap pengukuran warna dan
konsentrasi mioglobin filet dori.

12
Rancangan yang digunakan adalah sebagai berikut :
Yij     i   ij

Keterangan :
Yij = Hasil pengukuran warna dan konsentrasi mioglobin ke-j dengan produk filet
dori ke-i
µ = Pengaruh rata-rata dari produk filet dori
τi = Pengaruh produk filet dori ke-i
εij = Galat percobaan
i = variasi produk filet dori
j = ulangan (1, 2 dan 3)

3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Identifikasi Secara Molekuler
Isolasi DNA
Kuantitas isolasi DNA filet dori dan ikan patin dapat dilihat pada Tabel 2.
Kemurnian DNA didapatkan berdasarkan perbandingan nilai absorbansi panjang
gelombang 260 nm dan 280 nm.
Tabel 2. Kuantitas isolasi DNA filet dori dan ikan patin
Nama sampel
Patin utuh
Filet dori produksi Jakarta 1
Filet dori produksi Jakarta 2
Filet dori impor 1
Filet dori produksi Medan
Filet dori impor 2
Filet dori produksi Sidoarjo

Kode sampel
PU
DN
DL
DI
DM
DG
DS

Konsentrasi (ng/µL)
13,25
15,05
26,70
7,15
8,6
4,5
5,75

260/280
2,17
1,97
2,06
2,60
1,96
1,81
2,28

Menurut Boyer dan Rodney (2005) kemurnian DNA terhadap protein
(A260/ A280) berkisar antara 1,8-2. Kemurnian DNA sampel berkisar antara
1,81-2,60. Sampel PU, DI dan DS memiliki nilai kemurnian lebih dari 2, hal ini
dapat terjadi karena adanya kontaminasi RNA. Menurut Santella (2006) rasio
absorbansi pada panjang gelombang 260 dan 280 yang berada diatas kisaran nilai
DNA murni menunjukkan terdapat kontaminasi RNA, sedangkan rasio dibawah
1,8 menunjukkan adanya kontaminasi protein. Hal ini diduga kurangnya
penambahan enzim RNAse, sehingga RNA belum terdegradasi secara sempurna.
Hasil visualisasi isolasi DNA sampel filet dori menunjukkan bahwa semua
hasil isolasi DNA memiliki pita yang tebal dan terang termasuk PU, DI dan DS
(Gambar 3), sehingga sampel tersebut masih layak dijadikan sebagai cetakan
untuk amplifikasi gen COI dan 16S rRNA.

13

PU= Patin utuh; DI= Filet dori impor 1; DS= Filet dori produksi Sidoarjo; DN= Filet dori produksi Jakarta 1;
DL= Filet dori produksi Jakarta 2; DM= Filet dori produksi Medan; DG= Filet dori Impor 2.

Gambar 3 Visualisasi DNA filet dori dan ikan patin menggunakan agarosa 1,2%.
Amplifikasi fragmen gen 16S rRNA dan COI dengan PCR
Hasil elektroforegram fragmen gen 16S rRNA dan COI (Gambar 4)
memperlihatkan bahwa semua sampel DNA filet dori dan ikan patin berhasil
teramplifikasi pada 640 bp untuk 16S rRNA dan 700 bp untuk COI, hal ini sesuai
dengan DNA target. Produk PCR tersebut dilanjutkan pada tahap pemurnian dan
sekuensing.

(a)

(b)

PU= Patin utuh; DI= Filet dori impor 1; DS= Filet dori produksi Sidoarjo; DN= Filet dori produksi Jakarta 1;
DL= Filet dori produksi Jakarta 2; DM= Filet dori produksi Medan; DG= Filet dori Impor 2.

Gambar 4 Amplifikasi DNA filet dori dan ikan patin (a) marka gen 16S rRNA
(b) marka gen COI.
Pensejajaran Nukleotida Gen 16S rRNA dan COI
Sekuen nukleotida gen 16S rRNA dan COI hasil pensejajaran diunggah
pada BLASTn untuk identifikasi keaslian spesies. Hasil analisis molekuler
menggunakan marka gen 16S rRNA dan COI menunjukkan bahwa semua filet
dori teridentifikasi sebagai Pangasianodon hypophthalmus (KC846907.1) dengan
tingkat kesamaan sebesar 98-99% (Tabel 3).

14

Tabel 3 Hasil identifikasi spesies filet dori dan ikan patin menggunakan BLAST n
kode Nama dagang

Komposisi

PU
DI

Hasil identifikasi

Kesamaan
Kode akses
16S COI 16S rRNA
COI
rRNA
P.hypophthalmus 99% 99% KC846907.1 KC846907.1
P.hypophthalmus 99% 99% KC846907.1 KC846907.1

Ikan patin
Ikan patin
Filet dory
super
DG
Fillet dory
P.hypophthalmus 98% 99% KC846907.1 KC846907.1
DS Golden dory
P.hypophthalmus 99% 99% KC846907.1 KC846907.1
fillet
DM Dory fish fillet
Ikan dori
P.hypophthalmus 99% 99% KC846907.1 KC846907.1
DL
Fillet dory
P.hypophthalmus 99% 99% KC846907.1 KC846907.1
local
DN Ikan dory fillet Pangasius sp. P.hypophthalmus 99% 99% KC846907.1 KC846907.1
*Keterangan : PU= Patin utuh; DI= Filet dori impor 1; DS= Filet dori produksi Sidoarjo; DN=
Filet dori produksi Jakarta 1; DL= Filet dori produksi Jakarta 2; DM= Filet dori produksi
Medan; DG= Filet dori Impor 2.

Hasil analisis molekuler menunjukkan bahwa spesies yang digunakan pada
semua sampel (DI, PU, DN, DL, DG, DS dan DM) merupakan Pangasianodon
hypophthalmus. Sampel DI, DG, DS dan DL tidak mencantumkan komposisi atau
ikan yang digunakan, hal ini dapat menyebabkan asumsi yang salah pada
konsumen, sedangkan pada sampel DM terjadi mislabeling karena ikan yang
dicantumkan dalam komposisi adalah ikan dori, hal ini menunjukkan telah terjadi
kesengajaan oleh produsen dengan memakai ketidaktahuan konsumen sehingga
filet ikan patin lebih diminati dan nilai komersial dari ikan patin tersebut menjadi
naik. Menurut PP No. 69 tahun 1999 tentang label dan iklan pangan, produsen
seharusnya menuliskan daftar bahan yang digunakan dalam produk.
Pensejajaran nukleotida gen 16S rRNA dan COI sampel filet dori dengan
spesies Zeus faber dan Pangasianodon hypophthalmus yang berasal dari GenBank
(Lampiran 2 dan 6) menghasilkan nilai conserved, variable dan singleton (Tabel
4).
Tabel 4 Situs nukleotida gen 16S rRNA dan COI pada filet dori dan ikan patin
Antar sampel filet
Sampel filet
dengan P.
hypophthalmus
(KC846907.1)
Sampel filet
dengan Zeus faber
(AP002941.1)

Conserved
97,67%
(588/602)
97,51%
(587/602)

16S rRNA
variable
0,33%
(2/602)
0,5%
(3/602)

singleton
0,33%
(2/602)
0,5%
(3/602)

conserved
98,9%
(592/598)
98,8%
(591/598)

COI
variable
1%
(6/598)
1,2%
(7/598)

singleton
0,8%
(5/598)
1%
(6/598)

91,7%
(552/602)

14,6%
(88/602)

14,5%
(87/602)

79,9%
(478/598)

20,7%
(124/598)

20,4%
(122/598)

Nilai variable antar sampel filet dori berdasarkan marka gen 16S rRNA dan
COI menunjukkan bahwa terdapat variasi basa nukleotida antar sampel. Nilai
variable menunjukkan bahwa terdapat variasi basa nukleotida yang merupakan
karakteristik pembeda.

15
Menurut Hardjamulia et al. (1987) ikan patin jenis P. hypophthalmus yang
dalam beberapa tahun terakhir berkembang di Indonesia merupakan ikan yang
diintroduksi dari Thailand pada tahun 1972. Ikan patin ini banyak disebut dengan
nama patin siam (Sadili 1998). Setelah 40 tahun lebih diintroduksi, ikan patin
lokal tidak mengembangkan mutasi nukleotida yang signifikan dibanding ikan
patin impor, hal ini menunjukkan bahwa ikan patin mampu mengembangkan daya
adaptasi lokal yang tinggi.
Jarak genetik dan kekerabatan
Jarak genetik disajikan pada Tabel 5. Penentuan jarak genetik
menggambarkan kedekatan genetik antar spesies maupun intraspesies, persentase
jarak genetik dapat digunakan untuk mengetahui status spesies yaitu spesies yang
sama atau berbeda spesies (Sahara et al. 2015). Jarak genetik berdasarkan gen 16S
rRNA antar kelompok sampel filet dori dengan ikan patin (Pangasianodon
hypophthalmus) dari GenBank menunjukkan kesamaan spesies yang tinggi (00,3%), sedangkan antar kelompok sampel filet dori dengan ikan dori (Zeus faber)
dari GenBank memiliki jarak genetik antara 0-16,2%.
Tabel 5 Pairwise distance gen 16S rRNA dan COI pada filet dori dan ikan patin
COI

16S rRNA
1

2

3

4

5

6

7

8

1

2

3

4

5

6

7

8

PU
DI

0,002

0,003

DS

0,000 0,002

0,003 0,003

DN

0,000 0,002 0,000

0,002 0,002 0,002

DL

0,000 0,002 0,000 0,000

0,005 0,005 0,005 0,003

DM

0,002 0,003 0,002 0,002 0,002

DG
0,000 0,002 0,000 0,000 0,000
P.
hypophthalmus
0,002 0,003 0,002 0,002 0,002
KC846907.1
Z. faber
AP002941.1
0,160 0,158 0,160 0,160 0,160

0,002 0,002 0,002 0,000 0,003
0,002

0,005 0,005 0,005 0,003 0,003 0,003

0,003 0,002

0,003 0,003 0,003 0,002 0,005 0,002 0,005

0,162 0,160 0,162 0,240 0,240 0,242 0,240 0,235 0,240 0,240 0,240

Keterangan : PU= Patin utuh; DI= Filet dori impor; DS= Filet dori produksi Sidoarjo; DN= Filet
dori produksi Jakarta 1; DL= Filet dori produksi Jakarta 2; DM= Filet dori produksi
Medan; DG= Filet dori Impor.

Jarak genetik berdasarkan marka gen COI antar kelompok sampel filet dori
dengan ikan patin (Pangasianodon hypophthalmus) dari GenBank menunjukkan
kesamaan spesies yang tinggi sebesar 0,2-0,5%, sedangkan jarak genetik antar
kelompok sampel filet dori dengan ikan dori (Zeus faber) dari GenBank memiliki
jarak genetik antara 0,2-24,2%. Menurut Herbert et al. (2003), perbedaan jarak
genetik kurang atau sama dengan 3% menunjukkan spesies identik secara
molekuler. Menurut Zein dan Fitriana (2012), jarak genetik dalam satu spesies
yang rendah dan jarak genetik antar spesies yang tinggi pada COI menunjukkan
bahwa gen ini efektif untuk identifikasi pada tingkat spesies dan tepat digunakan
sebagai DNA barcode.
Pohon filogenetik dikonstruksi menggunakan metode neighbor joining tree
yaitu model Kimura 2-parameter dengan bootstrap 1.000 kali (Gambar 5 dan 6).
Pohon filogenetik dari 16S rRNA memperlihatkan keidentikan yang tinggi antar

16
sampel filet dan sampel dari GenBank kecuali sampel filet dori DI. Pohon
filogenetik dari 16S rRNA pada sampel lokal (PU, DL dan DN) dan sampel yang
diambil dari GenBank membentuk satu cluster dengan nilai bootstrap sebesar
68%, sedangkan filet impor DI membentuk cluster yang terpisah dari ketiga
sampel lokal.
DM

KC846907 Pangasianodon hypophthalmus
DN
68

DL
PU
DS
DG
DI
AP002941 Zeus faber

0.08

0.06

0.04

0.02

0.00

PU=Patin utuh; DI=Filet dori impor 1; DS=Filet dori produksi Sidoarjo; DN=Filet dori produksi Jakarta 1;
DL=Filet dori produksi Jakarta 2; DM=Filet dori produksi Medan; DG=Filet dori Impor 2.

Gambar 5 Konstruksi pohon filogenetik berdasarkan gen 16S rRNA.
Menurut Sahara et al. (2015), pengelompokan taksa dalam satu cluster
menggambarkan kedekatan kekerabatannya. Semakin tinggi kemiripan urutan
nukleotida maka semakin tinggi similiritasnya menyebabkan posisinya ada dalam
percabangan pohon filogenetik menjadi berdekatan.
Pohon filogenetik dari COI memperlihatkan cluster pertama dengan nilai
bootstrap sebesar 60% terdiri dari sampel DS, DM, DN, PU, sampel yang diambil
dari GenBank dan sampel DI, sedangkan sampel DG dan DL terpisah dari semua
sampel. Hasil konstruksi pohon filogenetik berdasarkan marka gen 16S rRNA dan
COI menunjukkan bahwa marka gen COI lebih mampu menunjukkan perbedaan
basa nukleotida dari tiap sampel. Bucklin et al. (2003) menyatakan bahwa COl
memiliki laju perubahan sekuens yang tinggi dan memperlihatkan adanya
divergensi sekuen intraspesies. Menurut Hebert et al. (2003), COI memiliki
rentang sinyal filogenetik yang lebih besar daripada gen mitokondria lainnya,
serta memiliki laj