Produksi, Pemekatan, Dan Karakterisasi Enzim Protease Dari Lactobacillus Plantarum Sk(5)

PRODUKSI, PEMEKATAN, DAN KARAKTERISASI ENZIM
PROTEASE DARI Lactobacillus plantarum SK(5)

DIAN NOVITA DIA ANGGRAHINI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Produksi, Pemekatan,
dan Karakterisasi Enzim Protease dari Lactobacillus plantarum SK(5)” adalah
benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan
dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.

Bogor, Maret 2016
Dian Novita Dia Anggrahini
NIM G351130241

RINGKASAN
DIAN NOVITA DIA ANGGRAHINI. Produksi, Pemekatan, dan Karakterisasi
Enzim Protease dari Lactobacillus plantarum SK(5). Dibimbing oleh NISA
RACHMANIA MUBARIK dan DESNIAR.
Keberadaan bakteri asam laktat (BAL) pada makanan fermentasi dapat
meningkatkan nilai gizi dan daya tahan suatu makanan. Hal ini karena BAL
mampu menghasilkan berbagai senyawa antimikrob dan sumber berbagai macam
enzim, salah satunya yaitu enzim protease. Lactobacillus plantarum SK(5)
merupakan salah satu BAL yang berhasil diisolasi dari bekasam. Bakteri ini telah
diketahui mampu menghasilkan enzim protease pada media susu skim. Enzim
protease yang dihasilkan ini belum dikarakterisasi dan dimurnikan. Penelitian ini
bertujuan untuk melakukan produksi, pemekatan dan karakterisasi aktivitas
protease
L. plantarum SK(5).
Penelitian ini terdiri atas beberapa tahapan yaitu produksi enzim, pemekatan

enzim dengan amonium sulfat dan karakterisasi enzim. Produksi enzim dilakukan
dengan dua cara yaitu dengan dan tanpa pengocokan. Pemilihan kondisi produksi
ini bertujuan untuk mengetahui perbedaan aktivitas enzim yang dihasilkan oleh
bakteri L. plantarum SK(5) pada kondisi pertumbuhan yang berbeda.
Karakterisasi enzim terdiri atas penentuan pH, suhu, dan stabilitas enzim. pH yang
digunakan berkisar dari pH 4-10, suhu yang digunakan yaitu 30-80 oC dengan
rentang suhu 10 oC. Stabilitas enzim terhadap waktu pemanasan dilakukan dengan
menginkubasi enzim pada suhu maksimum selama 3 jam, dan tiap 30 menit sekali
aktivitas enzim diukur. Penentuan bobot molekul dilakukan dengan sodium
dodesil sulfat poliakrilamid gel elektroforesis (SDS-PAGE).
Hasil produksi enzim dengan dan tanpa pengocokan menghasilkan aktivitas
enzim yang berbeda. Aktivitas enzim tertinggi diperoleh pada kondisi tanpa
pengocokan. Hasil pemekatan enzim dengan amonium sulfat menunjukkan bahwa
protease mengendap secara sempurna pada konsentrasi amonium sulfat 60%, dan
kadar protein tertinggi diperoleh pada konsentrasi amonium sulfat 30% pada
kedua kondisi produksi enzim. Tingkat kemurnian enzim meningkat lebih dari
2 kali lipat pada kondisi dengan dan tanpa pengocokan, masing-masing sebesar
2.08 kali dan 2.29 kali. Protease memiliki aktivitas tertinggi pada pH 7 dan suhu
50 oC pada kedua kondisi produksi enzim. Enzim protease hanya stabil selama
1 jam pada suhu dan pH optimumnya. Bobot molekul enzim berkisar 30.88 kDa

dan 25.54 kDa. Berdasarkan hasil produksi enzim protease L. plantarum SK(5)
dengan dan tanpa pengocokan, dapat disimpulkan bahwa produksi dengan kondisi
tanpa pengocokan akan menghasilkan aktivitas enzim protease yang lebih baik
dibandingkan dengan kondisi pengocokan.
Kata kunci: Lactobacillus plantarum SK(5), pengocokan, protease

SUMMARY
DIAN NOVITA DIA ANGGRAHINI. Production, Precipitation, and
Characterization of Protease from Lactobacillus plantarum SK(5). Supervised by
NISA RACHMANIA MUBARIK and DESNIAR.
The presence of lactic acid bacteria (LAB) in fermented food could increase
the nutritional value and durability of the food. This is because LAB has the
ability to produce various antimicrobial compounds and source of various
enzymes. One of the enzyme that was produced by LAB is protease. Lactobacillus
plantarum SK(5) is one of LAB that was isolated from bekasam. This bacteria has
been known to produce protease in skim milk media. This protease has not been
characterized and purified. This study aimed to produce, purified and
characterized protease from L. plantarum SK(5).
There are several stages in this study, i.e the production of enzyme,
precipitation with ammonium sulphate, and characterization. Enzyme production

was performed in two ways: with and without agitation. The selection of the
production condition was aimed to determine the difference of protease activity
which produced by L. plantarum SK(5). Enzyme characterization consists of the
determination of pH, temperature, and stability of the enzyme. The range of pH
was from pH 4 to 10, and temperature was from 30 °C to 80 °C with 10°C as the
temperature interval. Stability of the enzyme toward the heating was performed by
incubating the enzyme at maximum temperature for 3 hours, and every 30 minutes
the enzyme activity was measured. Determination of the molecular weight was
performed by sodium dodesil sulfat poliakrilamid gel elektroforesis (SDS-PAGE).
The enzyme product with and without agitation produced different enzyme
activity. The highest enzyme activity was obtained in without agitation condition.
The result of precipitation with ammonium sulphate showed that protease
precipitate perfectly in 60% ammonium sulfate, and the highest protein content
was obtained in 30% ammonium sulphate in both conditions of enzyme
production. Purification fold increasing more than 2 times in with and without
agitation conditions, 2.08 times and 2.29 times, respectively. Protease have the
highest activity at pH 7 and at temperature of 50 °C in both conditions of enzyme
production. Protease only stable for 1 hour at the optimum temperature and pH.
The range of molecular weight of enzyme are 30.88 kDa and 25.54 kDa. Based on
the results of the protease production of L. plantarum SK(5) with and without

agitation, it could be concluded that the production without agitation condition
produced a better protease activity compared to agitation condition.
Keywords: Agitation, Lactobacillus plantarum SK(5), protease

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

PRODUKSI, PEMEKATAN, DAN KARAKTERISASI ENZIM
PROTEASE DARI Lactobacillus plantarum SK(5)

DIAN NOVITA DIA ANGGRAHINI

Tesis

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Mikrobiologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Suryani, MSc

Judul Tesis : Produksi, Pemekatan, dan Karakterisasi Enzim Protease dari
Lactobacillus plantarum SK(5)
Nama
: Dian Novita Dia Anggrahini
NIM
: G351130241

Disetujui oleh

Komisi Pembimbing

Dr Nisa Rachmania Mubarik, MSi
Ketua

Dr Desniar, SPi MSi
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Mikrobiologi

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof Dr Anja Meryandini, MS

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 29 Januari 2016

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan April 2015 sampai Oktober 2015 ini
ialah Produksi, pemekatan, dan karakterisasi enzim protease dari Lactobacillus
plantarum SK(5).
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr Nisa Rachmania Mubarik, MSi
sebagai ketua komisi pembimbing dan Dr Desniar, SPi MSi sebagai anggota
komisi pembimbing, yang telah banyak memberikan nasehat, saran, motivasi,
waktu konsultasi, serta solusi dari setiap permasalahan yang dihadapi penulis
selama melaksanakan penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Selain itu
penulis ucapkan terima kasih kepada penguji Dr Suryani, MSc dan kepada
Prof Dr Anja Meryandini, MS selaku Ketua Program Studi Mikrobiologi IPB,
yang telah memberikan motivasi selama studi dan masukan pada saat ujian sidang
tesis. Terima kasih atas beasiswa pendidikan dan penelitian BPPDN DIKTI 2013
sehingga penelitian yang penulis lakukan dapat terlaksana dengan baik.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Ibu Heni dan Bapak Jaka
selaku teknisi Laboratorium Mikrobiologi IPB, Mikrotropisian 2013 serta seluruh

teman-teman di Laboratorium Mikrobiologi IPB, atas dukungan, motivasi, dan
bantuannya selama penelitian ini. Ucapan terima kasih tak terhingga juga penulis
ucapkan kepada ayah Kusban, ibu Suparniati, dan seluruh anggota keluarga, atas
doa, dukungan, kasih sayang, dan semangat yang diberikan. Terima kasih untuk
teman-teman seperjuangan di Program Studi Mikrobiologi IPB angkatan 2013,
teman satu tesis satu fikiran serta seluruh pihak yang telah memberikan doa dan
dukungannya, penulis ucapkan terima kasih.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Maret 2016

Dian Novita Dia Anggrahini

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vi

DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian

1
1
2
2

2 TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri Asam Laktat
Enzim
Protease

Pemekatan Enzim Protease
3 BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Waktu dan Tempat Penelitian
Prosedur Percobaan
Peremajaan dan Verifikasi Bakteri Asam Laktat
Produksi Enzim
Pemekatan enzim
Uji Aktivitas Enzim
Uji Kadar Protein
Karakterisasi Enzim Protease
Penentuan Bobot Molekul

3
3
4
5
6
7
7
7
7
7
7
9
9
9
10
10

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pembahasan

11
11
15

5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

19
19
19

DAFTAR PUSTAKA

19

LAMPIRAN

23

RIWAYAT HIDUP

30

DAFTAR TABEL
1 Tipe enzim protease dan sumbernya
2 Perolehan enzim protease L. plantarum SK(5) yang diproduksi
dengan cara pengocokan dan tanpa pengocokan

5
13

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8

Diagram alir tahapan penelitian
Isolat Lactobacillus plantarum SK(5)
Aktivitas enzim protease L. plantarum SK(5)
Pemekatan enzim protease L. plantarum SK (5) menggunakan
amonium sulfat
Kadar protein hasil pemekatan dengan amonium sulfat pada
endapan dan supernatan
Hasil SDS-PAGE protease isolat L. plantarum SK(5)
.
Aktivitas enzim protease L. plantarum SK(5) hasil pemekatan
amonium sulfat
Stabilitas enzim protease L. plantarum SK(5) terhadap waktu
pemanasan

8
11
12
12
13
14
15
15

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8

Metode pengukuran aktivitas enzim protease
Kurva standar protein
Komposisi gel pemisah dan gel penahan untuk sepasang gel
Bahan-bahan elektroforesis gel poliakrilamida SDS
Aktivitas protease hasil pemekatan
Kadar protein hasil pemekatan enzim
Perhitungan bobot molekul protease L. plantarum SK(5)
Stabilitas enzim protease terhadap waktu pemanasan

25
25
26
26
27
27
28
29

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Enzim merupakan suatu biokatalis yang dapat mempercepat suatu reaksi
kimia. Pemanfaatan enzim sebagai katalis semakin meningkat, karena enzim
bekerja secara spesifik, memiliki akurasi yang tinggi sebagai biokatalis, dan juga
ramah lingkungan. Enzim dapat dihasilkan dari berbagai sumber, yaitu tanaman,
hewan, dan mikrob. Herdyastuti (2006) melaporkan bahwa batang nanas (Ananas
comusus L.merr) mampu menghasilkan enzim protease bromelin. Ram et al.
(1986) telah berhasil mengisolasi enzim protease dari endosperma jagung. Sharma
dan De (2011) juga telah berhasil mengisolasi enzim protease yang diperoleh dari
Aspergillus tamarii asal tanah di India. Enzim yang berasal dari mikrob lebih
banyak digunakan di industri dibandingkan enzim dari tanaman maupun hewan.
Penggunaan mikrob sebagai penghasil enzim memiliki berbagai macam
keuntungan, yaitu mudah diproduksi dalam skala besar, keadaan lingkungan dapat
diatur, dan dapat diproduksi secara berkesinambungan dengan jangka waktu yang
relatif lebih pendek jika dibandingkan dengan tanaman maupun hewan.
Enzim protease ialah enzim yang dapat menghidrolisis protein menjadi
senyawa-senyawa yang lebih sederhana. Protease merupakan suatu enzim
komersial yang memiliki banyak manfaat dalam bidang industri, baik industri
pangan maupun nonpangan. Beberapa industri pangan yang menggunakan
protease, contohnya industri bir, susu, dan roti. Enzim dalam industri pangan
bermanfaat untuk mengonversi bahan baku menjadi bahan yang lebih mudah
diolah dan lebih aman. Pemanfaatan enzim dalam bidang nonpangan, contohnya
ialah industri detergen, pakan ternak, dan kulit (Sawat dan Nagendran 2014).
Pemanfaatan enzim protease yang beranekaragam ini telah membuat banyak
penelitian dilakukan untuk mendapatkan enzim protease salah satunya yaitu
dengan mengeksplorasi enzim dari mikrob, seperti dari bakteri asam laktat (BAL).
Enzim yang dihasilkan oleh BAL, dapat diisolasi dengan cara memisahkan
antara sel dan enzimnya. Enzim yang dihasilkan oleh setiap mikrob memiliki
tingkat kerja optimum masing-masing, sehingga perlu dilakukan karakterisasi
terhadap enzim agar diketahui tingkat kerja optimumnya. Aktivitas kerja enzim
akan semakin meningkat apabila dilakukan pemurnian. Tahap pemurnian enzim
yang paling sederhana ialah dengan menggunakan pemekatan amonium sulfat.
Pemekatan dengan cara ini lebih mudah dan tidak memerlukan biaya yang besar.
Penelitian yang dilakukan oleh Patel et al. (2006) menunjukkan bahwa aktivitas
spesifik enzim akan meningkat dari 46 U/mL menjadi 1545 U/mL setelah
dilakukan pemurnian. Ghafoor dan Hasnain (2010) juga menyatakan bahwa
aktivitas spesifik enzim dari 1115.4 U/mg meningkat menjadi 1477.1 U/mg
setelah ditambahkan amonium sulfat.
Bakteri asam laktat dapat diperoleh dari berbagai sumber seperti susu
(Yusmarini et al. 2009; Yelnetty et al. 2014), buah-buahan seperti buah berry
(Chen et al. 2010), hewan seperti rumen sapi (Sharmin et al. 2004), hewan laut
(Nanasombat et al. 2012), maupun makanan fermentasi (Desniar et al. 2013;
Suri et al. 2013). Indonesia sendiri merupakan salah satu negara yang memiliki
keanekaragaman yang tinggi dari segi makanan. Beberapa makanan khas

2
Indonesia dibuat dengan cara fermentasi salah satunya ialah bekasam. Bekasam
terbuat dari campuran ikan, nasi, dan garam. Makanan ini dapat ditemukan di
beberapa wilayah di Indonesia seperti, Kalimantan Selatan, Sumatera Selatan, dan
Jawa Barat (Desniar 2012).
Desniar (2012) telah mengisolasi dan mengidentifikasi beberapa BAL asal
bekasam. Salah satu bakteri yang berhasil diidentifikasi ialah Lactobacillus
plantarum (99.9%) dengan menggunakan API 50 CHL dan L. plantarum subsp.
plantarum NC 8 (93%) dengan menggunakan gen 16S rRNA. Bakteri
L. plantarum SK(5) telah ditumbuhkan dengan dua kondisi yang berbeda yaitu
dengan pengocokan (Kurniati et al. 2015) dan tanpa pengocokan (Desniar 2012)
untuk mengetahui kurva pertumbuhannya. Apabila dibandingkan maka akan
terlihat bahwa bakteri tumbuh lebih baik pada kondisi tanpa pengocokan yang
dibuktikan dengan jumlah sel yang lebih banyak. Bakteri ini juga telah diketahui
mampu menghasilkan enzim protease pada akhir fase log dan telah dioptimasi
dengan Response Surface Method (RSM) (Kurniati et al. 2015), namun
karakterisasi dan pemekatan enzim belum dilakukan sehingga penelitian ini perlu
dilakukan.

Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk memproduksi enzim protease dari
L. plantarum SK(5) dengan cara pengocokan dan tanpa pengocokan, selain itu
juga melakukan pemekatan enzim dengan amonium sulfat, dan karakterisasi
aktivitas protease.

Manfaat Penelitian
Penelitian ini, diharapkan dapat memberikan informasi mengenai peran
mikroorganisme khususnya potensi bakteri asam laktat sebagai salah satu agen
penghasil enzim protease. Hasil penelitian ini juga diharapkan dapat memberikan
informasi mengenai karakter enzim protease yang dihasilkan oleh bakteri asam
laktat tersebut.

3

2 TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri Asam Laktat
Bakteri asam laktat (BAL) ialah bakteri dengan ciri-ciri Gram positif,
berbentuk bulat atau batang, tidak membentuk spora, aerotoleran, dan merupakan
penghasil asam laktat sebagai produk utama hasil fermentasi (Lahtinen et al.
2012). Bakteri asam laktat terdiri atas 12 genus yang ditemukan pada produk
makanan. Genus tersebut yaitu Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus,
Lactobacillus,
Lactococcus,
Leuconostoc,
Oenococcus,
Pediococcus,
Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, dan Weissella. Bakteri asam laktat
dapat dibagi menjadi dua kelompok berdasarkan jalur fermentasinya, yaitu BAL
homofermentatif dan heterofermentatif. Bakteri asam laktat homofermentatif
merupakan kelompok bakteri yang menggunakan jalur glikolisis (EmbdenMeyerhof-Parnas pathway) untuk proses fermentasi glukosa, sedangkan BAL
heterofermentatif menggunakan jalur 6-fosfoglukonat/fosfoketolase (6-PG/PK).
Bakteri asam laktat homofermentatif hanya menghasilkan asam laktat sebagai
produk akhir, sedangkan BAL heterofermentatif selain menghasilkan asam laktat
juga menghasilkan senyawa lain, seperti CO2 dan etanol (Salminem et al. 2004).
Bakteri asam laktat merupakan mikroorganisme yang memegang peranan
penting pada produk makanan fermentasi. Keberadaan BAL pada produk
makanan fermentasi memiliki beberapa keunggulan, seperti dapat memperlama
waktu simpan suatu produk. Hal ini karena BAL mampu menghasilkan senyawa
antimikrob yang dapat menekan pertumbuhan bakteri patogen. Senyawa
antimikrob pada BAL ini dapat berupa bakteriosin dan asam organik.
Kivanc et al. (2011) telah berhasil mengisolasi BAL dari boza, yaitu sejenis
minuman khas Turki yang berbahan dasar sereal. Sebanyak 45 BAL berhasil
diisolasi dari 10 macam boza yang berbeda dan semua BAL yang diisolasi
tersebut memiliki kemampuan antimikrob. Sebagian besar BAL yang
mendominasi boza dari spesies Lactobacillus plantarum yaitu sebanyak 24 isolat.
Penelitian yang dilakukan oleh Lunggani (2007) menunjukkan bahwa BAL
mampu menghambat pertumbuhan Aspergillus flavus sebagai penghasil aflatoksin
pada produk makanan. Kemampuan BAL dalam menghasilkan asam laktat
sebagai hasil produk metabolitnya merupakan salah satu faktor yang membuat
BAL mampu menghambat pertumbuhan A. flavus. Bakteri asam laktat juga
menghasilkan bakteriosin yang dapat menghambat berbagai bakteri patogen.
Plantarisin merupakan salah satu contoh bakteriosin yang dihasilkan oleh
Lactobacillus platarum yang diisolasi dari bir sorgum. Plantarisin ini mampu
menghambat pertumbuhan beberapa patogen pada makanan, seperti Bacillus
cereus, Clostridium sporogenes, Enterococcus faecalis, Listeria spp., dan
Staphylococcus spp. (Reenen et al. 1998). Penelitian yang dilakukan oleh
Batdorj et al. (2006) juga telah berhasil mendapatkan bakteriosin dari
Enterococcus duran yang digolongkan ke dalam bakteriosin kelas II.
Bakteri asam laktat juga merupakan sumber berbagai macam enzim yang
dapat mengubah aroma, tekstur, rasa, dan dapat meningkatkan nilai gizi suatu
makanan. Enzim yang dihasilkan oleh BAL ini juga berbagai macam salah
satunya yaitu enzim protease. Pediococcus pentosaceus yang diisolasi dari proses

4
fermentasi sirsak diketahui mampu menghasilkan enzim protease. Hal ini
ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening pada medium susu skim. Enzim
protease yang dihasilkan oleh bakteri ini memiliki aktivitas maksimum pada suhu
50 oC dan pH 7 pada substrat kasein dengan waktu inkubasi 10 menit
(Suri et al. 2013).
Putri et al. (2012) telah berhasil mengisolasi BAL dari makanan hasil
fermentasi growol. Isolat bakteri yang ditemukannya telah berhasil diidentifikasi
dengan API 50 CHL yang menunjukkan bahwa isolat BAL yang diperolehnya
adalah dari genus Lactobacillus. Askari et al. (2012) telah melakukan penapisan
bakteri asam laktat yang diisolasi dari buah-buahan kering dan menunjukkan hasil
bahwa BAL dari genus Lactobacillus ditemukan sekitar 38%, genus Lactococcus
sebanyak 38%, genus Streptococcus sebanyak 16% dan genus Pediococcus
sebanyak 8%.
Bakteri asam laktat juga berhasil diisolasi dari produk susu. Yelnetti et al.
(2014) berhasil mengisolasi BAL dari susu yang terfermentasi spontan sebanyak
26 isolat. Sebanyak 16 isolat berbentuk batang dan 10 isolat berbentuk bulat.
Berdasarkan kemampuannya dalam menghasilkan enzim protease diperoleh dua
spesies yaitu Lactobacillus plantarum dan Lactobacillus pentosus. Keberadaan
BAL pada produk susu tersebut menyebabkan susu menjadi terfermentasi, hal ini
ditunjukkan dengan penurunan pH dan peningkatan jumlah sel mikrob.

Enzim
Enzim merupakan suatu katalis yang dapat meningkatkan laju reaksi kimia.
Tanpa adanya enzim, reaksi akan berjalan lebih lambat, dengan adanya enzim
kecepatan reaksi dapat meningkat. Kebanyakan proses reaksi dengan katalis
enzim akan berlangsung 103-108 kali lebih cepat dibanding reaksi tanpa katalis
enzim. Tiap-tiap molekul enzim mampu mengubah 100-1000 molekul substrat
menjadi produk tiap detiknya. Enzim memiliki spesivitas yang tinggi terhadap
substratnya. Molekul enzim memiliki situs aktif, pada situs aktif inilah substrat
akan terikat. Substrat yang telah terikat akan membentuk kompleks enzim substrat
yang kemudian dirubah menjadi suatu produk (Campbell dan Farrell 2006).
Enzim memperlihatkan sifat-sifat protein. Beberapa enzim hanya terdiri dari
polipeptida dan tidak mengandung gugus kimiawi selain residu asam amino,
contohnya ribonuklease pankreas. Akan tetapi pada enzim lain memerlukan
tambahan komponen, seperti kofaktor dan koenzim. Kofaktor merupakan unit
nonprotein yang dibutuhkan dalam jumlah yang sedikit. Kofaktor biasanya
merupakan ion-ion anorganik, seperti Fe2+, Mn2+, atau Zn2+. Koenzim merupakan
molekul organik kompleks, seperti tiamin pirofosfat, koenzim A, atau biositin.
Koenzim berfungsi sebagai pembawa sementara atom spesifik atau gugus
fungsional (Lehninger 1982)
Struktur protein enzim mempengaruhi aktivitas katalitiknya. Interaksi
nonkovalen yang menjaga struktur tiga dimensi enzim merupakan interaksi yang
lemah, sehingga sangat mudah terganggu. Kemampuan katalitik enzim dapat
hilang akibat denaturasi. Denaturasi merupakan kondisi putusnya stuktur tiga
dimensi enzim akibat rusaknya interaksi nonkovalen. Denaturasi dapat terjadi

5
karena beberapa hal, seperti suhu tinggi, keberadaan pelarut organik, asam dan
basa kuat, detergen, dan ion-ion logam berat (Campbell dan Farrell 2006)

Protease
Protease merupakan enzim yang mampu menghidrolisis ikatan peptida pada
suatu protein. Protease dapat diisolasi dari berbagai sumber seperti tumbuhan,
hewan, dan mikrob. Protease yang berasal dari mikrob merupakan enzim yang
paling banyak diproduksi dan beragam tipenya (Tabel 1).
Tabel 1 Tipe enzim protease dan sumbernya
Golongan protease
Jenis protease
Tripsin
Kimotripsin
Enterokinase
Endoproteinase
Elastase
Protease serin
Subtilisin
Proteinase K
Trombin
Faktor Xa
WNV protease
Bromelin
Papain
Fisin (ficain)
Protease sistein
Rhinovirus 3C
TEV protease
TVMV protease
Endoproteinase
Termolisin
Metaloprotease
kolagenase
Dispase
Pepsin
Protease aspartat
katepsin D
Protease serin*
Karboksipeptidase Y
katepsin C
Protease sistein*
DAPase
Karboksipeptidaase A
Metaloprotease*
Karboksipeptidase B

Sumber
Hewan
Hewan
Hewan
Mikrob
Hewan
Mikrob
Mikrob
Hewan
Hewan
Mikrob
Tumbuhan
Tumbuhan
Tumbuhan
Mikrob
Mikrob
Mikrob
Mikrob
Mikrob
Mikrob
Mikrob
Hewan
Hewan
Mikrob
Hewan
Hewan
Hewan
Hewan

*Tergolong ke dalam eksopeptidase Sumber : Motyan et al.(2013)

Enzim protease terbagi atas empat golongan, yaitu protease asam, protease
serin, protease sulfihidril (sistein), dan protease yang mengandung logam.
Protease asam merupakan kelompok enzim yang memiliki pH optimum relatif
rendah. Contoh enzim yang tergolong protease asam yaitu dari kelompok renin,
pepsin, dan sejumlah besar enzim protease yang dihasilkan oleh mikrob. Protease
serin merupakan enzim yang memiliki asam amino serin pada sisi aktifnya.

6
Beberapa contoh dari enzim ini yaitu tripsin, trombin, elastase, dan subtilisin.
Protease sulfihidril kebanyakan berasal dari tumbuhan. Contoh enzim ini adalah
ficain, papain, bromelin, dan beberapa enzim lain. Protease yang mengandung
logam memerlukan logam untuk aktivitasnya dan dihambat oleh senyawa yang
mengkelat logam (De Man 1997).

Pemekatan Enzim Protease
Purifikasi atau pemurnian merupakan tahapan untuk memperoleh senyawa
tertentu yang telah murni atau terbebas dari bahan-bahan lain yang tidak
diinginkan. Suatu protein tertentu seperti enzim dapat dimurnikan dengan satu
langkah saja maupun melalui beberapa tahapan. Tahapan dalam melakukan
pemurnian protein atau enzim dapat menggunakan kromatografi maupun
nonkromatografi. Beberapa metode nonkromatografi yaitu dengan melakukan
fraksinasi protein, membran ultrafiltrasi, sentrifugasi diferensial, elektroforesis
preparatif, dan isoelektrik preparatif (Ahmed 2005). Metode yang paling banyak
digunakan yaitu fraksinasi protein dengan cara mengendapkannya menggunakan
bahan kimia tertentu.
Pemekatan enzim biasanya merupakan tahap awal pada proses purifikasi
enzim. Amonium sulfat merupakan reagen yang sangat umum digunakan dalam
tahap ini. Penelitian yang dilakukan oleh Towatana et al. (1999) menggunakan
amonium sulfat sebagai tahap awal purifikasi enzim protease, begitu juga dengan
penelitian yang dilakukan oleh Kezia et al. (2011) yang menggunakan amonium
sulfat dengan konsentrasi 60% untuk mengendapkan enzim protease. Penggunaan
amonium sulfat pada tahap purifikasi sudah dapat meningkatkan aktivitas spesifik
enzim. Aktivitas spesifik enzim protease dari bakteri yang diisolasi dari tanah,
yaitu Bacillus lichniformis NMS-1 menunjukkan peningkatan setelah dilakukan
pemekatan dengan amonium sulfat dari 54 mU/mg meningkat menjadi
453 mU/mg (Mathew dan Gunathilaka 2015).
Pada saat melakukan tahapan purifikasi enzim sering terdapat kendala,
seperti hilangnya aktivitas enzim. Hal ini disebabkan karena enzim dikeluarkan
dari lingkungan alaminya, sehingga menyebabkan enzim lebih sensitif dan mudah
terdenaturasi. Untuk meminimalkan terjadinya penurunan aktivitas enzim
sebaiknya dilakukan karakterisasi enzim. Karakterisasi enzim berfungsi untuk
mengetahui kondisi optimum enzim. Enzim protease alkali dari
Aspergillus tamarii telah berhasil dikarakterisasi keadaan optimumnya. Enzim
bekerja aktif pada suhu 60 oC, pH 8-9. Aktivitas enzim ini dapat ditingkatkan
dengan menambahkan ion Zn2+ dan Mg2+. Aktivitas enzim dihambat oleh
phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) serta oleh keberadaan ion Hg2+, Co2+ dan
Ca2+ (Sharma dan De 2011).

7

3 BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan utama yang digunakan ialah bakteri Lactobacillus plantarum SK(5)
merupakan koleksi Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Teknologi Hasil
Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor
(Desniar 2012).

Waktu danTempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan April 2015 sampai Oktober 2015, di
Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA IPB Bogor.

Prosedur Percobaan
Penelitian ini terdiri atas beberapa tahap, yaitu: peremajaan isolat bakteri,
verifikasi isolat bakteri penghasil proteolitik, produksi enzim, penentuan kadar
protein dan aktivitas enzim ektrak kasar, pemekatan dengan amonium sulfat,
karakterisasi enzim hasil pemekatan, dan penentuan bobot molekul dengan
menggunakan SDS-PAGE (Gambar 1).
Peremajaan dan Verifikasi Isolat Bakteri Asam Laktat
Isolat L. plantarum SK(5) yang disimpan pada gliserol ditumbuhkan
kembali pada medium de Man Rogosa Sharpe Agar (MRSA). Isolat diinkubasi
dalam keadaan kedap udara selama 24-48 jam pada suhu 37 oC. Isolat bakteri
yang sudah tumbuh selanjutnya disimpan sebagai stok kultur (Desniar 2012).
Isolat L. plantarum SK(5) diuji ulang untuk mengetahui kemampuannya dalam
menghasilkan enzim protease dengan cara menumbuhkan isolat bakteri pada
medium susu skim. Isolat bakteri diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam
(Kurniati et al. 2015).
Produksi Enzim
Produksi enzim diawali dengan membuat inokulum. Sebanyak dua ose
kultur bakteri diinokulasikan secara aseptik ke dalam media dengan volume
50 mL sebagai inokulum. Sebanyak 1% (108 CFU/mL) kultur inokulum
dipindahkan ke dalam 250 mL media produksi, kemudian diinkubasi dengan dua
kondisi yang berbeda dengan pengocokan dan tanpa pengocokan. Kondisi dengan
pengocokan menggunakan labu erlenmeyer (500 mL) sebagai wadah, sedangkan
kondisi tanpa pengocokan menggunakan botol bertutup ulir (250 mL). Inkubasi
dilakukan pada suhu 37 oC selama 12 jam untuk kondisi dengan pengocokan
(130 rpm) dan 16 jam dengan kondisi tanpa pengocokan (kedap udara). Setelah
inkubasi media diambil dan disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan
4000 xg. Bagian yang diambil dari hasil sentrifugasi ialah supernatan yang
mengandung ekstrak kasar enzim.

8
Isolat bakteri L. plantarum

Peremajaan bakteri

Verifikasi isolat bakteri proteolitik

Produksi enzim

Pengocokan

Penentuan
kadar protein

Tanpa pengocokan

Supernatan
(ekstrak kasar
enzim)

Karakterisasi ekstrak
kasar enzim (pH, suhu)
Pengujian
aktivitas enzim
dan kadar protein
pada tiap fraksi

Aktivitas
enzim

Pemekatan
dengan amonium
sulfat

Fraksi
terpilih
(Salting out)

SDSPAGE

Karakterisasi enzim hasil
pemekatan (pH, suhu)

Aktivitas
enzim

Perlakuan (pH, suhu)
terpilih

Uji
stabilitas

Gambar 1 Diagram alir tahapan penelitian

9
Pemekatan Enzim
Pemekatan enzim dilakukan dengan menambahkan amonium sulfat. Ekstrak
kasar enzim hasil sentrifugasi ditambahkan dengan amonium sulfat sedikit demi
sedikit sambil diaduk dengan menggunakan magnetic stirrer selama 1 jam dalam
keadaan dingin. Penambahan amonium sulfat dilakukan dengan tingkat kejenuhan
10-80% dengan rentang 10%. Campuran tersebut selanjutnya diambil dan
dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi dan didiamkan selama semalam dalam
keadaan dingin. Selanjutnya campuran dalam tabung tersebut disentrifugasi
dengan kecepatan 4000 xg selama 30 menit pada suhu 4 oC. Hasil sentrifugasi
berupa supernatan dipisahkan dari endapannya. Supernatan yang diperoleh akan
digunakan untuk tahap fraksinasi selanjutnya, sedangkan endapan yang terbentuk
dilarutkan dengan menggunakan bufer fosfat 0.1 M pH 7 dengan perbandingan
1:1. Sampel pada tiap fraksi yang diperoleh diukur aktivitas dan kadar protein.
Uji Aktivitas Enzim
Aktivitas enzim diukur dengan menggunakan Walter (1984). Ada tiga
perlakuan uji yang dilakukan yaitu blanko, standar, dan sampel. Sebanyak 40 µl
enzim ditambahkan ke dalam tabung mikro yang telah berisi 200 µl kasein 1%
dan 200 µl bufer fosfat 0.1 M. Khusus perlakuan blanko dan standar, larutan
enzim masing-masing diganti dengan akuades dan tirosin 5 mM. Larutan tersebut
selanjutnya diinkubasi pada suhu optimum enzim selama 10 menit.
Kerja enzim dihentikan dengan menambahkan 400 µl TCA
(Trichloroacetic acid) 0.3 M. Pada blanko dan standar ditambahkan dengan 40 µl
enzim, sedangkan pada sampel ditambahkan 40 µl akuades. Larutan diinkubasi
pada suhu 37 oC selama 10 menit, dan dilanjutkan dengan sentrifugasi dengan
kecepatan 2600 xg selama 10 menit. Sebanyak 300 µl supernatan dimasukkan ke
dalam tabung yang berisi 1 mL Na2CO3 0.4 M, dan ditambahkan dengan 200 µl
pereaksi Folin-Ciocalteau yang telah diencerkan dengan aquades (1:2). Larutan
diinkubasi selama 20 menit pada suhu 37 oC, dan selanjutnya diukur
absorbansinya pada panjang gelombang 578 nm (Lampiran 1). Aktivitas protease
diukur dengan persamaan berikut :
Aktivitas protease (U/mL) =

-

x FP x

Keterangan :
Abs = Absorbansi
FP = Faktor pengenceran
T = Waktu inkubasi
Uji Kadar Protein
Kadar protein diukur dengan menggunakan metode Bradford (1976).
Standar protein yang digunakan ialah Bovin serum albumin (BSA). Tahap awal
adalah pembuatan kurva standar BSA, dengan larutan stok BSA 1000 ppm.
Larutan stok BSA tersebut diambil masing-masing sebanyak 0; 0.1; 0.2; 0.3; 0.4;
0.5; 0.6; 0.7; 0.8; 0.9, dan 1 mL kemudian dimasukkan ke dalam tabung yang
berbeda. Pada masing-masing tabung ditambahkan dengan akuades hingga
volume menjadi 1 mL. Pada masing-masing tabung diambil sebanyak 0.05 mL

10
dan ditambahkan dengan 2.5 ml reagen Bradford, lalu dikocok kuat dengan
vortek dan diinkubasi pada suhu ruang selama 20 menit. Absorbansi diukur pada
panjang gelombang 595 nm. Kurva standar dibuat antara konsentrasi BSA
terhadap nilai absorbansi (Lampiran 2).
Pengujian kadar protein diawali dengan mereaksikan 0.05 mL enzim
ditambahkan dengan 2.5 mL Bradford, pada blanko larutan enzim diganti dengan
akuades. Larutan tersebut kemudian dikocok kuat dengan vortek dan diinkubasi
selama 20 menit pada suhu ruang. Absorbansi larutan diukur pada panjang
gelombang 595 nm. Data nilai absorbansi yang diperoleh dikonversikan pada
persamaan garis yang diperoleh dari kurva standar BSA sehingga diperoleh
konsentrasi kandungan protein enzim protease.
Karakterisasi Enzim Protease
Karakterisasi enzim protease meliputi penentuan pH dan suhu optimum,
serta pengukuran stabilitas enzim pada suhu optimum selama rentang waktu
tertentu. Penentuan pH optimum dilakukan dengan mereaksikan enzim dengan
substrat kasein pada pH 4, 5, 6, 7, 8, 9, dan 10. Larutan bufer yang digunakan,
yaitu bufer sitrat 0.1 M untuk pH 4, 5, dan 6. Bufer fosfat 0.1 M digunakan untuk
pH 7 dan 8, serta bufer glisin-NaOH 0.1 M untuk pH 9 dan 10. Sampel
selanjutnya diukur aktivitasnya dengan menggunakan metode Walter (1984).
Suhu optimum diperoleh dengan cara mereaksikan enzim dengan substrat
pada pH optimum yang telah diperoleh sebelumnya. Sampel selanjutnya
diinkubasi pada variasi suhu 30-80 oC dengan rentang suhu 10 oC. Selanjutnya
diukur aktivitas enzim. Stabilitas enzim terhadap waktu pemanasan diperoleh
dengan cara memanaskan enzim pada pH dan suhu optimumnya selama 3 jam.
Setiap 30 menit sekali sampel enzim diambil dan diuji aktivitasnya.
Penentuan Bobot Molekul Protein
Bobot molekul protein diukur pada kondisi protein terdenaturasi (SDSPAGE), mengikuti metode Bollag dan Edelstein (1991). Berat molekul protein
diukur dengan menggunkan standar berat molekul dari Thermo Scientific
(Rockford, USA). Elektroforesis dilakukan pada piranti elektroforesis vertikal
Mini Protean 3 (Bio-Rad).
Gel yang digunakan pada SDS-PAGE ada 2 yaitu 12% gel pemisah dan 4%
gel penahan (Lampiran 3). Sampel enzim dicampurkan dengan bufer sampel
(Lampiran 4) kemudian dipanaskan selama 5 menit. Sebanyak 5 µl campuran
tersebut dimasukkan ke dalam masing-masing sumur pada gel penahan
menggunakan pipet mikro. Setelah semua piranti terpasang, gel dielektroforesis
pada tegangan 110 volt selama 45 menit, atau sampai pewarna bromofenol biru
mencapai sekitar 1 cm dari tepi gel bagian bawah. Gel hasil elektroforesis
dilepaskan dari piranti dan direndam dalam larutan pewarna gel selama 2 jam
sambil digoyang konstan. Kelebihan warna pada gel dihilangkan dengan
menambahkan larutan peluntur, hingga diperoleh pita protein berwarna biru
dengan latar belakang jernih. Penghitungan bobot molekul protease dilakukan
dengan menghitung Rf dengan rumus sebagai berikut:
Rf =

11

4 HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil
Isolat Bakteri Asam Laktat
Hasil pewarnaan Gram bakteri Lactobacillus plantarum SK(5)
menunjukkan bahwa bakteri berbentuk batang pendek dan merupakan Gram
positif yang ditunjukkan dengan warna ungu yang terbentuk. Lactobacillus
plantarum SK(5) yang ditumbuhkan pada media susu skim mampu menghasilkan
enzim protease yang ditandai dengan terbentuknya zona bening. Hal ini sesuai
dengan hasil yang diperoleh oleh Kurniati et al. (2015) bahwa isolat L. plantarum
SK(5) mampu menghasilkan enzim protease ekstrasesuler (Gambar 2).
a

b

c

5 µm

Gambar 2 Isolat Lactobacillus plantarum SK(5). (a) Koloni bakteri pada media
agar-agar MRS, (b) Pewarnaan Gram, (c) zona bening pada media
susu skim
Produksi dan Karakteristik Ekstrak Kasar Enzim Protease
Enzim yang dihasilkan oleh bakteri L. plantarum SK(5) dipanen pada
akhir fase log. Aktivitas enzim yang dihasilkan sebesar 0.096 U/mg (dengan
pengocokan) dan 0.122 U/mg (tanpa pengocokan). Berdasarkan penelitian
sebelumnya fase log untuk kondisi dengan pengocokan dicapai pada jam ke-12
(Kurniati et al. 2015), sedangkan pada kondisi tanpa pengocokan pada jam ke-16
(Desniar 2012).
Aktivitas enzim ekstrak kasar bakteri L. plantarum SK(5) dengan
pengocokan maupun tanpa pengocokan dikarakterisasi berdasarkan pH dan suhu.
Penentuan pH maksimum dilakukan pada pH 4-10, sedangkan suhu pada 30-80 oC.
Aktivitas enzim tercapai maksimum dengan kondisi tanpa pengocokan
ditunjukkan pada pH 6 (0.1663 U/mL), dan suhu 50 oC (0.264 U/mL). Pada
kondisi dengan pengocokan aktivitas enzim maksimum ditunjukkan pada pH 7
(0.096 U/mL) dan suhu 60 oC (0.113 U/mL) (Gambar 3).

0,3

Aktivitas protease (U/mL)

Aktivitas protease (U/mL)

12

0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
4

5

6

7
pH

8

9

0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
30

10

37

40

50

Suhu

60

70

80

(oC)

(a)
(b)
Gambar 3 Aktivitas enzim protease L. plantarum SK(5), pada kondisi dengan
pengocokan ( ) dan tanpa pengocokan( ) pada berbagai pH (a) dan
suhu (b)
Pemekatan Enzim dan Penentuan Kadar Protein
Ekstrak kasar enzim yang telah diketahui karakteristik awalnya kemudian
dilakukan pemekatan dengan menggunakan amonium sulfat pada konsentrasi
10-80%. Salting out dicapai pada konsentrasi amonium sulfat 60% dengan
pengocokan maupun tanpa pengocokan (Gambar 4). Pada konsentrasi ini aktivitas
enzim meningkat lebih dari 2 kali lipat dibandingkan dengan ekstrak kasar enzim.
Pada kondisi pengocokan aktivitas ekstrak kasar enzim sebesar 0.104 U/mL
meningkat menjadi 0.205 U/mL setelah dilakukan pemekatan. Sama halnya
dengan kondisi tanpa pengocokan, ekstrak kasar enzim 0.199 U/mL meningkat
menjadi sebesar 0.408 U/mL (Lampiran 5). Oleh karena itu pemekatan dengan
amonium sulfat 60% dipilih sebagai konsentrasi yang sesuai untuk pemekatan
enzim protease L. plantarum SK(5).
0,5
Aktivitas protease(U/mL)

Aktivitas protease (U/mL)

0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0

Konsentrasi amonium sulfat (%)

0,4
0,3
0,2
0,1
0

Konsentrasi amonium sulfat (%)

(a)
(b)
Gambar 4 Pemekatan enzim protease L. plantarum SK (5) menggunakan
amonium sulfat pada endapan ( ) dan supernatan ( ) dengan
pengocokan (a) dan tanpa pengocokan (b).

13

0,8

0,8

Kadar protein (mg/mL)

Kadar protein (mg/mL)

Selama tahap pemekatan juga dilakukan pengukuran kadar protein. Kadar
protein diukur dengan menggunakan metode Bradford (1976). Berdasarkan
pengukuran kadar protein pada dua kondisi yang berbeda, ternyata menunjukkan
pola yang hampir sama. Pola tersebut yaitu kadar protein tertinggi hasil
pemekatan ditunjukkan pada konsentrasi amonium sulfat 30% (Gambar 5). Kadar
protein supernatan lebih rendah dibandingkan dengan endapannya. Pada kondisi
menggunakan pengocokan kadar protein supernatan sebesar 0.289 mg/mL,
sedangkan endapan sebesar 0.665 mg/mL. Pada kondisi tanpa pengocokan kadar
protein supernatan sebesar 0.368 mg/mL, sedangkan endapannya sebesar
0.689 mg/mL (Lampiran 6).

0,6
0,4
0,2
0

Konsentrasi amonium sulfat (%)

0,6
0,4
0,2
0

Konsentrasi amonium sulfat (%)

(a)
(b)
Gambar 5 Kadar protein hasil pemekatan dengan amonium sulfat pada endapan
( ) dan supernatan ( ). (a) Pengocokan dan (b) tanpa pengocokan.
Hasil pemekatan enzim protease dengan amonium sulfat 60%
menunjukkan bahwa dengan kondisi pengocokan aktivitas meningkat dari
0.36 U/mg menjadi 0.75 U/mg. Pada kondisi tanpa pengocokan aktivitas spesifik
enzim juga meningkat dari 0.54 U/mg menjadi 1.21 U/mg (Tabel 2). Tingkat
kemurnian enzim semakin tinggi setelah dilakukan pemekatan enzim, yaitu
2.08 kali dan 2.29 kali.
Tabel 2 Perolehan enzim protese L. plantarum SK(5) yang diproduksi dengan
cara pengocokan dan tanpa pengocokan
Total
Total
Aktivitas
Tahap
Perolehan
Tingkat
Perlakuan
protein aktivitas spesifik
pemurnian
(%)
kemurnian
(mg)
(U)
(U/mg)
Ekstrak
63.73
22.84
0.36
100
1
kasar
Pengocokan Pemekatan
amonium
0.82
0.61
0.75
2.69
2.08
sulfat 60%
Ekstrak
81.02
43.98
0.54
100
1
kasar
Tanpa
Pemekatan
pengocokan
1.01
1.22
1.21
2.78
2.29
amonium
sulfat 60%

14
Penentuan Bobot Molekul
Penentuan bobot molekul dilakukan dengan menggunakan SDS-PAGE.
Enzim hasil pemekatan pada kondisi tanpa pengocokan menghasilkan dua pita
protein yaitu 30.88 kDa dan 25.54 kDa, sedangkan pada kondisi dengan
pengocokan hanya diperoleh satu pita protein yaitu 25.54 kDa (Lampiran 7). Hasil
SDS-PAGE untuk ekstrak kasar tidak menunjukkan adanya pita protein pada
kedua kondisi produksi enzim (Gambar 6).
M

1

2

3

4

30.88 kDa
25.54 kDa

Gambar 6 Hasil SDS-PAGE protease isolat L. plantarum SK(5). M = marker,
1 = enzim hasil pemekatan (pengocokan), 2 = ekstrak kasar enzim
(pengocokan), 3 = ekstrak kasar enzim (tanpa pengocokan), 4 = enzim
hasil pemekatan (tanpa pengocokan).

Karakteristik Enzim Protease Hasil Pemekatan
Enzim hasil pemekatan dengan amonium sulfat 60% selanjutnya
dikarakterisasi untuk mengetahui pH dan suhu maksimum serta stabilitasnya.
Aktivitas enzim maksimum pada kondisi pengocokan maupun tanpa pengocokan
diperoleh pada pH 7, masing-masing sebesar 0.344 U/mL dan 0.843 U/mL. Hasil
karakterisasi suhu, menunjukkan bahwa enzim tahan terhadap pemanasan hingga
80 oC, dengan aktivitas maksimum pada suhu 50 oC, yaitu sebesar 0.596 U/mL
pada kondisi pengocokan dan 0.859 U/mL pada kondisi tanpa pengocokan
(Gambar 7).

1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
4

5

6

7

8

9

10

Aktivitas protease(U/mL)

Aktivitas protease (U/mL)

15
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0

pH

30

37

40 50 60
Suhu(oC)

(a)

70

80

(b)

Gambar 7 Aktivitas enzim protease L. plantarum SK(5) hasil pemekatan
amonium sulfat, dengan pengocokan ( ) dan tanpa pengocokan
( ) pada berbagai pH (a) dan suhu (b)

Aktivitas protease relatif (%)

Setelah diketahui pH dan suhu maksimum, dilakukan pengukuran
stabilitas enzim terhadap waktu pemanasan pada suhu 50 oC. Hasil stabilitas
enzim terhadap waktu pemanasan menunjukkan bahwa aktivitas enzim semakin
menurun seiring dengan lamanya waktu inkubasi (Gambar 8). Enzim protease
dengan kondisi pengocokan maupun tanpa pengocokan pada 60 menit pertama
enzim relatif lebih stabil, pada 30 menit berikutnya aktivitas enzim mengalami
penurunan secara bertahap (Lampiran 8).
120
100
80
60
40
20
0
0

30

60
90
120
150
Waktu pemanasan (menit)
Pengocokan
Tanpa pengocokan

180

Gambar 8 Stabilitas enzim protease L. plantarum SK(5) terhadap lamanya waktu
pemanasan

Pembahasan
Tahap verifikasi isolat merupakan tahapan untuk memastikan bahwa isolat
bakteri L. plantarum SK(5) masih dalam keadaan murni dan masih memiliki
aktivitas enzim protease. Hasil pengujian secara kualitatif ditunjukkan dengan
zona bening yang terbentuk disekitar koloni bakteri. Zona bening
mengindikasikan kemampuan L. plantarum SK(5) dalam menghasilkan enzim

16
protease (Gambar 2c). Menurut Suri et al. (2013) zona bening terbentuk akibat
hilangnya partikel kasein di dalam media susu skim. Susu skim merupakan media
yang sesuai untuk pertumbuhan bakteri proteolitik. Kasein memiliki molekul
besar (12.8-375 kDa), dan dapat menginduksi produksi protease untuk
mendegradasi substrat menjadi bentuk yang tersedia dan dapat dimanfaatkan oleh
organisme (Sharma dan De 2011).
Enzim protease yang dihasilkan oleh L. plantarum SK(5) diproduksi
dengan menggunakan dua kondisi yang berbeda, yaitu dengan dan tanpa
pengocokan. Perbedaan produksi enzim ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas
enzim yang dihasilkan. Enzim protease juga dipanen pada waktu yang berbeda.
Pemilihan waktu pemanenan ini didasarkan pada penelitian yang telah dilakukan
oleh Kuniati et al. (2015) dan Desniar (2012). Enzim dipanen pada akhir fase log.
Akhir fase log pada kondisi dengan pengocokan dicapai pada jam ke-12
(Kurniati et al. 2015), sedangkan pada kondisi tanpa pengocokan dicapai pada jam
ke-16 (Desniar 2012).
Produksi enzim oleh bakteri sangat dipengaruhi oleh kondisi pertumbuhan
bakteri tersebut. Pengocokan yang dilakukan akan menghomogenkan medium
sehingga oksigen dan nutrisi yang terdapat dalam medium akan tersebar merata.
Keberadaan oksigen dan nutrisi akan membuat L. plantarum SK(5) tumbuh
dengan cepat, dan cepat pula kehabisan nutrisi, hal inilah yang menyebabkan fase
log lebih pendek. Kondisi tanpa pengocokan keberadaan oksigen paling banyak
pada daerah permukaan medium, sedangkan bakteri akan tumbuh pada bagian
dasar. Hal ini menyebabkan kontak antara bakteri dan oksigen semakin kecil,
sehingga fase log akan lebih panjang.
Kondisi produksi enzim yang berbeda ternyata akan menghasilkan
aktivitas enzim yang berbeda. Aktivitas enzim pada kondisi dengan pengocokan
lebih kecil dibandingkan dengan kondisi tanpa pengocokan. Hal ini diduga karena
L. plantarum SK(5) tumbuh lebih baik pada kondisi sedikit oksigen (tanpa
pengocokan). Desniar (2012) membuktikan bahwa jumlah sel bakteri lebih
banyak saat ditumbuhkan pada kondisi tanpa pengocokan dibandingkan dengan
kondisi pengocokan yang dilakukan oleh Kurniati et al. (2015). Hal ini dapat
terjadi karena BAL tergolong ke dalam bakteri aerotoleran. Aerotoleran diartikan
sebagai organisme anaerob, akan tetapi saat ada udara sel bakteri tetap dapat
hidup (tapi tidak tumbuh) atau tumbuh dibawah laju pertumbuhan optimalnya
(Singleton dan Sainsbury 2006).
Hasil produksi enzim selanjutnya dilakukan pemekatan dengan amonium
sulfat. Pemekatan enzim dengan amonium sulfat merupakan salah satu cara
pemurnian protein melalui proses pengendapan dengan garam. Pemekatan enzim
dengan menambahkan garam amonium sulfat dapat menurunkan kelarutan protein
(Fatoni et al. 2008). Menurut Oke dan Onilude (2014) penggunaan amonium
sulfat dalam memisahkan molekul-molekul protein merupakan metode yang
mudah dan efektif. Pemekatan enzim menggunakan garam berdasarkan pada
kelarutan protein yang berinteraksi polar dengan molekul air, interaksi ionik
protein dengan garam, dan daya tolak menolak protein yang bermuatan sama
(Scopes 1987).
Enzim protease yang dihasilkan oleh L. plantarum SK(5) mengendap pada
konsentrasi amonium sulfat 60%, yang ditandai dengan aktivitas enzim yang
semakin meningkat (Gambar 4). Beberapa protease yang juga mengendap dengan

17
baik pada konsentrasi amonium sulfat 60%, contohnya protease yang dihasilkan
oleh Bacillus subtilis mengendap dengan baik pada konsentrasi amonium sulfat
60% (Bundela dan Mandal 2013). Protease dari Bacillus licheniformis juga akan
mengendap pada konsentrasi amonium sulfat 60-70% (Nadeem et al. 2013).
Selain protease dari mikrob yang mengendap pada konsentrasi 60%, protease
yang dihasilkan oleh tumbuhan juga dapat mengendap dengan baik pada
konsentrasi 60%. Beberapa contohnya yaitu protease dari biji Cucumis melo var
agrestis (Devi dan Hemalatha 2014) dan enzim protease (papain) dari buah
pepaya (Putri et al. 2013).
Selama proses pemekatan enzim, selain diukur aktivitas enzim, juga
dilakukan pengukuran kadar protein. Kadar protein tertinggi diperoleh pada
konsentrasi amonium sulfat 30% baik pada kondisi dengan dan tanpa pengocokan
(Gambar 5). Kadar protein yang tinggi ternyata tidak menunjukkan aktivitas
enzim yang tinggi. Hal ini karena pada konsentrasi amonium sulfat 30%, protein
yang terdapat pada endapan bukan hanya enzim yang dikehendaki, melainkan
juga protein-protein lain, seperti susu skim yang terdapat dalam media. Protein
yang diinginkan diduga masih dalam jumlah yang sedikit. Pada konsentrasi
amonium sulfat 60%, protein dari enzim yang diinginkan telah mengendap
sempurna (salting out), yang ditunjukkan dengan aktivitas enzim yang meningkat.
Aktivitas spesifik enzim dan jumlah perolehan protease dari L. plantarum
SK(5) meningkat setelah melalui tahap pemekatan. Tingkat kemurnian enzim juga
meningkat (Tabel 2). Pada konsentrasi garam amonium sulfat rendah, ion-ion
garam akan mengelilingi molekul protein, dan mencegah terjadinya pemekatan.
Apabila konsentrasi telah tinggi, maka molekul air yang berada pada lapisan luar
protein akan ditarik keluar. Hal ini menyebabkan protein beragregasi dan
mengendap (Suri et al. 2013). Endapan enzim yang terbentuk akan menyebabkan
peningkatan aktivitas enzim. Hal ini terjadi karena penurunan jumlah kontaminan
yang menghalangi sisi aktif enzim untuk berikatan dengan substrat (Sulthoniyah
et al. 2015).
Hasil SDS PAGE pada enzim ekstrak kasar tidak menunjukkan adanya
pita protein. Pewarnaan protein dengan menggunakan Coomasie blue
mensyaratkan kisaran protein 0.1-1µg per pita untuk bisa diwarnai (Bollag dan
Edelstein 1991). Hal ini diduga pada ekstrak kasar enzim dengan pengocokan
(0.76 µg/mL) dan tanpa pengocokan (1.15 µg/mL) sebenarnya menghasilkan
banyak pita, akan tetapi karena konsentrasi protein yang rendah menyebabkan saat
dilakukan pewarnaan pada tiap pita protein tidak terwarnai dengan sempurna yang
menyebabkan pita protein tidak terlihat. Hasil yang diperoleh Sulthoniyah et al.
(2015) L. plantarum yang diisolasi dari shrimp paste memiliki beberapa pita
protein dengan bobot molekul berkisar 25.35-69.64 kDa. Pada SDS-PAGE ukuran
protein menjadi faktor penentu pemisahan molekul protein. Protein dengan ukuran
yang lebih kecil akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul protein yang
berukuran besar (Campbell dan Farell 2006).
Enzim protease dari L. plantarum SK(5) dikarakterisasi untuk mengetahui
sifat-sifatnya. Karakter yang digunakan ialah pH, suhu, dan stabilitas. Menurut
Naiola dan Widhyastuti (2007), aktivitas suatu enzim dipengaruhi oleh banyak
faktor, antara lain pH, suhu, dan lamanya waktu inkubasi. Protease yang
dihasilkan oleh L. plantarum SK(5) memiliki kisaran pH yang luas yaitu dari pH 4
hingga 10.

18
Produksi enzim pada kondisi dengan dan tanpa pengocokan memiliki
aktivitas maksimum yang sama setelah dilakukan pemekatan. Pemekatan dengan
amonium sulfat dapat mengurangi kontaminan yang dapat mempengaruhi kerja
enzim. pH optimum diperoleh pada pH 7 (Gambar 7a). Berdasarkan pH
optimumnya, enzim protease dari L. plantarum SK(5) digolongan ke dalam
protease netral. Penurunan dan kenaikan pH dapat mempengaruhi aktivitas enzim.
Selisih pH yang kecil dari pH optimum enzim akan menyebabkan turunnya
aktivitas enzim. Hal ini karena terjadi perubahan ionisasi gugus-gugus fungsi pada
situs aktif enzim. Selisi