Isolasi dan karakterisasi enzim proteolitik dari ekstrak tape

ISOLASI DAN KARAKTERISASI ENZIM PROTEOLITIK
DARI EKSTRAK TAPE

PERIS PARIAMAN SITANGGANG

DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006

ISOLASI DAN KARAKTERISASI ENZIM PROTEOLITIK
DARI EKSTRAK TAPE

PERIS PARIAMAN SITANGGANG

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia

DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006

ABSTRAK

PERIS PARIAMAN SITANGGANG. Isolasi dan Pencirian Enzim Proteolitik dari Ekstrak Tape.
Dibimbing oleh IRMA H SUPARTO dan YANTI.
Tape ketan putih merupakan produk fermentasi beras ketan putih oleh bantuan ragi. Bakteri
di dalamnya diduga mengandung enzim protease fibrinolitik yang dapat membantu proses
penguraian darah beku. Penelitian ini bertujuan mengisolasi bakteri tersebut lalu mencirikan
enzim yang dihasilkannya. Ada 9 isolat yang diujikan, dan diketahui isolat TP-4 diketahui
memiliki aktivitas protease maksimum, yaitu 0.724 U/ml. Ektrak enzim protease yang dihasilkan
dimurnikan melalui beberapa tahapan: (1) presipitasi amonium sulfat 65%, (2) dialisis (cut off 10
kD), dan (3) pemekatan dengan poli(etilena glikol) (PEG). Hasil aktivitas spesifik dialisat adalah
0.881 U/mg dengan tingkat kemurnian 0.701 dibandingkan dengan ekstrak enzim kasar (1.257
U/mg). Analisis SDS-PAGE 10% pada enzim kasar, presipitat, dan dialisat mempunyai 1 buah
pita protein (11.60 kD). Uji zimografi menunjukkan bahwa enzim protease ini mempunyai

aktivitas kaseinolitik, fibrinolitik, dan gelatinolitik. Ekstrak enzim kasar dihambat secara spesifik
oleh etilenadiamina tetraasetat sehingga digolongkan ke dalam kelompok protease logam
sedangkan dialisat dihambat secara spesifik oleh N-p-tosil-L-lisinklorometil keton, dan
fenilmetilsulfonil fluorida sehingga digolongkan ke dalam protease serin.

ABSTRACT
PERIS PARIAMAN SITANGGANG. Isolation and Characterization of Proteolytic Enzyme from
Fermented Glutinous White Rice Extract. Supervised by IRMA H SUPARTO and YANTI.
Bacteria from yeast promoted in fermented glutinous white rice is presumed to contain
fibrinolytic protease enzyme that may support coagulated blood dissociation. The purpose of this
study was to isolate the bacteria and characterize its enzyme. There were 9 examined isolates and
isolate TP-4 was identified to have a maximum protease activity of 0.724 U/ml. Extract of
protease enzyme was then purified through several stages: (1) ammonium sulfate 65%
precipitation, (2) dialysis (cut off 10 kD), and (3) concentration with polyethylene glycol. The
result of dialysate specific activity was 0.881 U/mg with purity of 0.701 compared to crude
extract (1.257 U/mg). The result of crude enzyme, precipitate, and dialysate 10% SDS-PAGE
confirmed to have 1 band of protein (11.60 kD). Zymography test showed that the protease
enzyme has caseinolytic, fibrinolytic, and gelatinolytic activities. Crude enzyme extract was
inhibited specifically by ethylenediamine tetraacetiate. Thus it is classified into metallic protease,
whereas dialysate which was inhibited specifically by N-p-tosyl-L-lysinchloromethyl keton, and

phenylmethylsulphonyl fluoride, thus was classified into serine protease.

PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan dalam nama Yesus Kristus atas segala kasih-Nya sehingga
penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Penulis melakukan penelitian dari bulan Agustus
sampai dengan Desember di Universitas Katolik Atma Jaya, Jakarta.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada dr. Irma H Suparto, M.S dan Yanti, Msi selaku
pembimbing yang telah memberikan saran, bimbingan, pengarahan serta dorongan moral.
Demikian juga kepada Komar Sutriah, MSi selaku pembimbing akademik yang telah memberikan
semangat, saran, dan nasehat yang sangat berharga selama ini. Begitu juga kepada Mas Hery
yang telah banyak membantu penulis selama kuliah dalam hal administrasi.Penulis juga
mengucapkan terima kasih kepada Kak Budi Arifin yang telah banyak membantu penulis dalam
hal penulisan skripsi. Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan untuk keluarga tercinta
Ayah, Ibu, dan kakak yang telah memberikan bantuan baik material maupun spiritual dalam
membantu penulis menyelesaikan karya ilmiah ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih
kepada Mas Yudi, Mas Nurdin, Pak Bambang, dan Pak Ridwan yang telah banyak membantu
penulis selama penelitian, demikian juga rekan-rekan mahasiswa Atma Jaya. Ucapan terima kasih
juga ditujukan penulis kepada Andre,Dian, Selvi, Soli,Santi, dan Wiwit selaku rekan-rekan
seperjuangan selama penelitian. Terima kasih penulis ucapkan kepada teman-teman angkatan 36,
37 dan 38 atas masukan dan kebersamaannya. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada rekanrekan kosan C-2 atas saran dan masukannya.

Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.

Bogor, Maret 2006

Peris Pariaman Sitanggang

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Sait ni huta, Pulau Samosir Nauli pada tanggal 26 September 1982
dari Ayah P Sitanggang dan ibu S Naibaho merupakan putra bungsu (siampudan) dari delapan
bersaudara. Tahun 2001 penulis lulus dari SMU Negeri 1 Pangururan dan pada tahun yang sama
penulis masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis diterima di Program
Studi Kimia, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah melaksanakan praktik lapangan di
Laboratorium Kimia Agro yang berlokasi di Lembang Bandung, pada tahun 2004, mempelajari
tentang Validasi Metode Penentuan Fosfor Tersedia dengan Menggunakan Metode Olsen. Penulis
melaksanakan penelitian di Laboratorium Biokimia dan Teknologi Enzim, Fakultas
Teknobiologi, Universitas Katolik Atmajaya, Jakarta yang berlangsung selama lima bulan dari
Agustus sampai Desember 2005.

DAFTAR ISI

Halaman
DAFTAR TABEL ..................................................................................................... ....viii
DAFTAR GAMBAR .......................................................................................................ix
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................................... x
PENDAHULUAN
TINJAUAN PUSTAKA
Tape ............................................................................................................................ 1
Pangan Fermentasi .................................................................................................... 1
Pencirian Enzim Protease .......................................................................................... 1
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan .......................................................................................................... 3
Metode Penelitian...................................................................................................... 3
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penapisan Isolat Sampel Tape Ketan Putih................................................................ 6
Pemurnian Enzim....................................................................................................... 6
Penentuan Aktivitas Maksimum Enzim kasar ........................................................... 7
Pengaruh Suhu Terhadap Enzim .............................................................................. 8
Pengaruh pH Terhadap Enzim ................................................................................... 8
Pengaruh Inhibitor ..................................................................................................... 9
Pengaruh Pelarut ....................................................................................................... 10

Penentuan Bobot Molekul (SDS-PAGE).................................................................. 10
Zimografi .................................................................................................................. 11
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan ................................................................................................................... 12
Saran ......................................................................................................................... 12
DAFTAR PUSTAKA...................................................................................................... 12
LAMPIRAN ................................................................................................................... 14

DAFTAR TABEL
Halaman
1

Komposisi gel pemisah dan gel penahan untuk SDS-PAGE dan zimografi ............. 5

2

Ringkasan tahap pemurnian enzim dari isolat ekstrak tape ketan putih .................... 7

3

Ciri biokimia protease dari isolat bakteri TP-4 ....................................................... 11

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1

Isolat TP-4 ................................................................................................................. 6

2

Pengaruh konsentrasi amonium sulfat terhadap kadar protein ................................. 7

3

Kurva penentuan aktivitas maksimum enzim kasar ................................................. 8

4

Kurva pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim dan aktivitas sisa enzim
ekstrak kasar dan dialisat........................................................................................... 8

5

Kurva pengaruh pH terhadap aktivitas enzim dan aktivitas sisa enzim
ekstrak kasar dan dialisat........................................................................................... 8

6

Diagram pengaruh inhibitor terhadap aktivitas sisa enzim ekstrak kasar dan
dialisat ........................................................................................................................ 9

7

Diagram pengaruh pelarut organik terhadap aktivitas sisa enzim eksrak kasar
dialisat....................................................................................................................... 10

8

Analisis SDS-PAGE 10% pada C, enzim kasar, P, endapan, dan D, dialisat............ 10

9

Zimogram kasein 12% pada enzim kasar (C), endapan (P) dan dialisat (D)............. 11

10 Zimogram fibrinogen 12% pada enzim kasar (C), endapan (P) dan dialisat (D) ..... 11
11 Zimogram gelatin 10% pada enzim kasar (C), endapan (P) dan dialisat (D) ........... 11

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman
1

Diagram alir penelitian ............................................................................................. 15

2

Prosedur pembuatan pereaksi kimia ......................................................................... 16

3

Data seleksi 9 isolat bakteri ..................................................................................... 19

4

Contoh perhitungan aktivitas enzim (U/ml) dan aktivitas enzim spesifik................ 20

5

Pembuatan kurva standar Bradford ........................................................................... 21

6

Data pengaruh suhu, pH, waktu, inhibitor, dan pelarut organik terhadap aktivitas
protease enzim kasar tape ketan putih ...................................................................... 22

7

Data pengaruh suhu, pH, waktu, inhibitor, dan pelarut organik terhadap aktivitas
protease dari dialisat tape ketan putih ...................................................................... 23

8

Kurva standar SDS-PAGE 10% ............................................................................... 24

1

PENDAHULUAN
Fermentasi merupakan proses berbantuan mikro-organisme yang salah satunya dimanfaatkan
dalam
pembuatan
dan
peningkatan cita rasa makanan. Keju, tempe,
tape, minuman anggur, dan tuak merupakan
beberapa contoh bahan pangan pangan produk
fermentasi. Salah satunya yang diteliti disini
ialah tape ketan putih. Tape tersebut
merupakan produk fermentasi dari beras ketan
putih dengan bantuan ragi. Bakteri yang
dihasilkan oleh tape berperan dalam
membentukan cita rasa dan aroma yang khas
dari tape. Sehubungan dengan hal ini, diduga
tape mengandung komponen enzim protease
tertentu yang bisa membantu proses
penguraian darah beku, yaitu protease
fibrinolitik.
Enzim fibrinolitik yang dihasilkan diharapkan dapat mengatasi masalah trombosis,
yaitu suatu keadaan yang menimbulkan
penggumpalan darah. Trombosis dapat terjadi
pada pembuluh koroner yang disebabkan oleh
pecahnya plak aterosklerosis yang labil.
Bakteri diisolasi dari tape ketan putih
lalu diseleksi isolat yang dianggap berpotensi
baik, untuk dicirikan pada tahap selanjutnya.
Isolat yang tertinggi aktivitas proteasenya
dipakai untuk produksi enzim protease kasar,
yang kemudian dimurnikan dan dicirikan
pada aktivitas protease tertinggi. Tahapan pemurnian yang dilakukan meliputi presipitasi,
dialisis, dan pemekatan. Penentuan bobot
molekul dan aktivitas enzim spesifik enzim
protease dilakukan dengan elektroforesis dan
zimografi.
Penelitian ini bertujuan mendapatkan
isolat dan mengetahui ciri enzim protease dari
isolat ekstrak tape terbaik. Data pencirian
enzim tersebut dapat dijadikan informasi
bahwa produk pangan fermentasi tradisional
Indonesia (khususnya tape) dapat bermanfaat
sebagai “nutraceutical” yang kaya enzim
untuk peningkatan kesejahteraan masyarakat,
baik dalam bidang pertanian, pangan maupun
kesehatan. Diagram alir penelitian secara
lengkap terdapat pada Lampiran 1.

TINJAUAN PUSTAKA
Tape
Tape merupakan salah satu produk
pangan tradisional Indonesia yang dihasilkan
melalui proses fermentasi dengan bantuan
ragi. Ragi yang berperan dalam pembuatan

tape merupakan populasi campuran spesies
genus Aspergillus, Saccharomyces, Candida,
Hansenula, dan Acetobacter. Genus−genus
tersebut hidup bersama secara sinergetik.
Aspergillus dapat menyederhanakan amilum,
sedangkan Saccharomyces, Candida dan
Hansenula dapat mengubah gula menjadi
alkohol dan bermacam-macam zat organik
lainnya. Acetobacter berperan mengubah
alkohol menjadi asam cuka (Dwidjoseputro
1977).
Pangan Fermentasi
Produk fermentasi meliputi (1) minuman
beralkohol seperti bir, sake, brem, dan
anggur; (2) produk fermentasi berbahan susu
seperti keju, dan yoghurt; (3) produk
fermentasi sayuran seperti acar kubis dan acar
timun; (4) produk serelia seperti roti, lalu (5)
produk kacang kedelai seperti tempe, oncom,
tauco, dan kecap; sementara (6) produk beras
ketan meliputi tape ketan putih dan tape ketan
hitam selain ada juga tape berbahan singkong
yang disebut peuyeum.
Mikrob yang bersifat fermentatif dapat
mengubah karbohidrat dan turunannya
menjadi alkohol, asam, dan karbon dioksida.
Mikrob proteolitik dapat memecah protein
dan komponen nitrogen lainnya sehingga
menghasilkan bau busuk yang tidak diinginkan. Sementara itu, mikrob lipolitik akan
menghidrolisis lemak, fosfolipid, dan
turunannya dengan menghasilkan bau tengik.
Bila alkohol dan asam yang dihasilkan mikrob
cukup tinggi, maka pertumbuhan mikrob
proteolitik dan lipolitik dapat dihambat. Jadi
pada prinsipnya, fermentasi adalah meningkatkan pertumbuhan mikrob pem-bentuk
alkohol dan asam, dan menekan pertumbuhan mikrob proteolitik dan lipolitik
(Afrianti 2005).
Fermentasi juga menurunkan kadar
senyawa beracun seperti anti-tirosin pada
kedelai sehingga kadarnya menurun ketika
dijadikan tempe. Fermentasi turut mempertinggi nilai gizi, karena mikrob memecah
senyawa
kompleks
menjadi
senyawa
sederhana. Misalnya, Rhizopus oligosporus
dapat meningkatkan vitamin B12 pada tempe.
Begitu pula dengan kandungan niasin dan
riboflavin (Afrianti 2005).
Pencirian Enzim Protease
Enzim protease atau disebut juga proteinase merupakan enzim yang menguraikan
golongan protein. Beberapa contohnya antara

2

lain peptidase, yaitu enzim yang menguraikan
peptida menjadi asam-asam amino. Contoh
lainnya adalah gelatinase, yaitu enzim yang
menguraikan gelatin dan renin, yaitu enzim
yang menguraikan kasein dari susu.
Ada enzim yang dikeluarkan oleh sel
bakteri guna mengambil zat makanan di
sekelilingnya; enzim semacam ini disebut
eksoenzim atau enzim luar-sel. Sebaliknya, di
dalam sel sendiri terdapat juga banyak enzim
yang memegang peranan dalam proses
pencernaan dan pembongkaran zat makanan,
seperti pada peristiwa respirasi atau
fermentasi. Enzim-enzim ini telah ada di
dalam sel enzim dan disebut endoenzim atau
enzim dalam-sel. (Dwidjoseputro 1977).
Enzim yang dihasilkan oleh bakteri juga
dapat dibedakan menjadi enzim konstitutif
dan induktif. Enzim konstitutif jumlahnya
tetap dan tidak bergantung pada keadaan
metabolisme organisme tersebut, misalnya
enzim yang terlibat dalam lintasan glikolisis.
Di sisi lain, enzim induktif terdapat dalam
berbagai konsentrasi. Dalam keadaan normal
jumlahnya sedikit, tetapi konsentrasinya akan
meningkat dengan cepat bila substratnya
terdapat dalam medium, terutama jika substrat
tersebut merupakan sumber karbon satusatunya bagi sel Beberapa enzim mempunyai
spesifisitas yang tinggi terhadap substrat
tertentu dan tidak akan bekerja bahkan
terhadap senyawa yang mirip
secara
struktural (Lehninger 1993). Aktivitas enzim
terhadap substrat dipengaruhi oleh beberapa
faktor, yaitu pH, suhu, konsentrasi substrat,
dan aktivator (koenzim dan kofaktor) dan
inhibitor.
Nilai pH
Efek pH pada enzim berkaitan dengan
keadaan ionisasi dari sistem yang dikatalisis,
termasuk substrat dan enzim itu sendiri.
Perubahan pH dapat memengaruhi keadaan
ionisasi dari asam-asam amino pada sisi aktif
enzim sehingga memengaruhi interaksinya
dengan molekul substrat. Nilai pH yang
terlalu tinggi atau terlalu rendah akan
menyebabkan ketidakstabilan konformasi
enzim sehingga struktur enzim rusak. Enzim
mempunyai pH optimum yang khas yang
akan menyebabkan aktivitas maksimal.
Keadaan optimum ini dihubungkan dengan
saat gugus pemberi proton atau penerima
proton yang aktif pada sisi aktif enzim berada
pada kondisi ionisasi yang tepat. Keadaan
optimum tidak harus sama dengan pH
lingkungannya. Aktivitas enzim dalam sel

sebagian diatur oleh pH media kulturnya
(Lehninger 1993).
Suhu
Suhu mempunyai dua pengaruh yang
saling
bertentangan.
Suhu
dapat
meningkatkan aktivitas enzim, tetapi dapat
pula merusak struktur enzim. Suhu optimum
merupakan batas di antara keduanya.
Peningkatan suhu sebelum tercapainya suhu
optimum akan meningkatkan laju reaksi
katalitik enzim karena meningkatnya energi
kinetik molekul-molekul yang bereaksi.
Sebaliknya, jika suhu dinaikkan sesudah suhu
optimum kompleks enzim-substrat yang
melampaui energi aktivasi terlalu besar,
sehingga memecah ikatan sekunder pada
konformasi enzim dan sisi aktifnya. Hal ini
mengakibatkan enzim terdenaturasi dan
kehilangan sifat katalitiknya
Konsentrasi Substrat
Konsentrasi substrat sangat memengaruhi laju reaksi enzimatik. Laju
maksimum (vmaks) suatu enzim tercapai ketika
enzim telah jenuh oleh substratnya.
Konsentrasi substrat tertentu pada saat enzim
mencapai setengah laju maksimum disebut
Km atau tetapan Michaelis-Menten. Nilai Km
bersifat khas pada setiap enzim tertentu.
Hubungan antara Km dan vmaks dinyatakan
dalam
persamaan
Michaelis−Menten
(Lehninger 1993).
v
[S]
v 0 = maks
K m + [S]
Persamaan Michaelis–Menten merupa
kan dasar bagi segi kinetika kerja enzim.
Apabila nilai Km dan vmaks diketahui, maka
laju reaksi suatu enzim pada setiap
konsentrasi substrat dapat dihitung. Nilai Km
dan vmaks yang lebih tepat dapat diperoleh
dengan memetakan data yang ada ke dalam
persamaan Linewaver-Burk:

K 1
1
1
= m
+
v0 vmaks [ S ] vmaks
Aktivator (Kofaktor dan Koenzim) dan
Inhibitor
Beberapa enzim membutuhkan komponen tambahan bagi aktivitasnya. Bila komponen tambahan tersebut berupa senyawa
anorganik disebut kofaktor, sedangkan bila
berupa senyawa organik disebut koenzim.

3

Pada beberapa enzim, kofaktor dan koenzim
terlibat langsung pada proses katalitik, tetapi
ada juga yang berfungsi sebagai pembawa
gugus fungsional tertentu. Hampir semua
enzim dapat dihambat oleh senyawa kimia
tertentu misalnya ion logam, senyawa pengkelat, senyawa organik, atau bahkan substrat
enzim itu sendiri.
Elektroforesis dan Zimogram
Elektroforesis ialah pergerakan molekul
bermuatan di dalam medan listrik. Perpindahan partikel bermuatan ditentukan oleh
gugus-gugus yang terionisasi. Jenis dan besar
muatan
gugus-gugus
yang
terionisasi
bergantung pada permukaan partikel,
kekuatan ionik, dan pH medium. Ukuran dan
bentuk partikel juga akan memengaruhi
mobilitas.
Bahan hayati banyak yang bermuatan
listrik, yang besarnya bergantung pada jenis
molekul, pH, dan komponen medium
pelarutnya. Molekul-molekul ini dalam
larutan akan bergerak ke arah elektrode yang
polaritasnya berlawanan dengan muatan itu.
Prinsip inilah yang digunakan dalam
elektroforesis untuk memisahkan molekulmolekul dengan muatan berbeda.
Macam-Macam Elektroforesis
Ada beberapa macam teknik di dalam
elektroforesis antara lain elektroforesis pergerakan batas (moving boundary elektroforesis) dan elektroforesis zone. Metode
yang digunakan pada penelitian ini ialah
elektroforesis zone.
Metode elektroforesis pergerakan batas
pertama kali dikemukakan oleh ahli biokimia
Swedia, Tiselius, pada tahun 1973. Tiselius
menggunakan tabung berbentuk huruf U yang
ke dalamnya dimasukkan larutan protein yang
akan dianalisis. Larutan bufer dimasukkan ke
dalam tabung sedemikian rupa sehingga
diperoleh batas yang tajam antara kedua
larutan tersebut. Elektrode dipasang pada
kedua ujung kaki tabung, kemudian arus
listrik dialirkan sehingga terjadi pergerakan
molekul protein pada kedua batas larutan ke
arah elektrode. Pergerakan molekul dapat
diikuti dengan mengukur indeks bias larutan.
Apabila larutan protein mengandung asam
amino dari berbagai titik isoelektrik, maka
protein ini akan bergerak dengan laju yang
berbeda-beda sehingga dapat dipisahkan satu
dengan yang lain. Metode Tiselius ini tidak
dapat memisahkan protein dengan sempurna

karena gaya gravitasi memengaruhi batas
tajam antara kedua larutan. Demikian pula,
terjadinya konveksi mengakibatkan kaburnya
batas larutan antara kedua daerah pemisahan.
Metode elektroforesis zone menggunakan
penyangga seperti kertas, selulosa asetat, pati,
atau
poliakrilamida
untuk
mengatasi
kelemahan elektroforesis pergerakan batas.
Berdasarkan penyangga yang digunakan
tersebut,
dikenal
beberapa
metode
elektroforesis zone yaitu elektroforesis kertas,
selulosa asetat, pati, gel agar, dan gel
poliakrilamida. Elektroforesis zone digunakan
untuk pemisahan sempurna suatu campuran
protein ataupun senyawa bermuatan lainnya,
sehingga sesuai untuk maksud analitik dan
preparatif. Semakin tipis zone yang terbentuk
maka akan semakin sensitif metodenya atau
proses pemisahan semakin sempurna.

BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Alat-alat
yang
digunakan
dalam
penelitian ini antara lain alat-alat kaca, neraca
analitik, inkubator, laminar air flow,
spektrofotometer UV/Vis, sentrifus mikro
berpendingin (Beckman), tabung Eppendorf,
deep freezer, pipet mikro pH, oven, tabung
mikro, kantung dialisis cut-off 10 kD (Sigma),
dan perangkat elektroforesis antara lain
perangkat listrik, kaca penyangga, sumur
injeksi, dan tip injeksi.Bahan-bahan yang
digunakan adalah tape ketan putih, media
kaldu Luria Bertani (LB), susu skim, kasein
Hammersten (Merck), media skim milk agar
(SMA) standar L-tirosin (Merck), pereaksi
Bradford, BSA Fraction V (Merk), amonium
sulfat teknis, poli(etilena glikol), bufer fosfat
pH 7,0, asam triklorosetat (TCA), pereaksi
Folin-Ciocalteu, garam NaCl, bufer tris HCl
pH 7,5, pH 6.8 1 M dan 2M, dan pH 8.8,
etilenadiamina tetraasetat (EDTA), inhibitor
fenilmetilsulfonil fluorida (PMSF), N-p-tosilL-lisinklorometil keton (TLCK) inhibitor
tripsin kedelai (STI), HCl 0,1M, sodium
dodesil sulfat (SDS) 10% (b/v), gliserol 15%
b/v, bromfenol biru 1%, (b/v) (in situ), glisin,
β-merkaptoetanol, penanda untuk bobot
molekul rendah (LMW), commassie brilliant
blue R−250, metanol, asam asetat glasial,
gliserol, bufer sampel, bufer elektroforesis,
larutan pewarna, dan larutan peluntur.
Pereaksi kimia selengkapnya dapat dilihat
pada Lampiran 2.

4

Metode Penelitian
Isolasi mikrob
Tape ketan diekstraksi (diblender)
secukupnya dengan bufer universal 50 mM.
Sebanyak 100 µl ekstrak tape ketan
diencerkan dengan 900 µl larutan garam
fisiologis (NaCl 0,85%) sebanyak 5 kali dari
keadaan awal. Kultur disebar pada media agar
yang telah dituang pada cawan petri,
kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama
2 hari dan diamati mikrob yang memiliki zone
bening. Koloni mikrob yang diperoleh digores
lagi pada media SMA yang baru sampai
diperoleh koloni bakteri tunggal. Isolat yang
terpilih dimasukkan ke dalam gliserol 15%
sebagai stok bakteri selanjutnya.
Produksi protease
Sebanyak 2 ose bakteri ditumbuhkan ke
dalam 200 ml campuran 130 ml media LB
steril dengan 70 ml susu skim steril, kemudian
diinkubasi pada inkubator bergoyang berlaju
150 rpm pada suhu 37 oC selama 2 hari.
Kemudian disentrifugasi berlaju 7500 rpm
selama 15 menit dengan suhu 4 oC untuk
memisahkan sel bakteri dengan enzim kasar.
Pengujian aktivitas dilakukan terhadap
supernatan yang mengandung enzim kasar.
Analisis aktivitas protease
Aktivitas
protease
diukur
secara
kuantitatif dengan modifikasi metode
Bergmeyer (1983) menggunakan substrat
kasein Hammarsten 2% (b/v). Terdapat tiga
perlakuan analisis yang dilakukan, yaitu
blangko, standar, dan sampel. Larutan enzim
50 µl yang sudah dipanaskan pada suhu dan
waktu inkubasi tertentu (yang menghasilkan
aktivitas maksimum) ditambahkan ke dalam
tabung Eppendorf yang berisi 250 µl kasein
2%,dan 250 µl bufer fosfat 50 mM dengan pH
7. Pada blangko dan standar, enzim
digantikan dengan akuades dan tirosin 50 µl.
Larutan diinkubasi pada suhu 37 oC
selama 10 menit (suhu dan inkubasi optimum
enzim). Reaksi hidrolisis dihentikan dengan
cara penambahan 500 µl TCA 0,1 M. Tabung
blangko dan standar ditambahkan 50µl
akuades, kemudian larutan diinkubasi kembali
pada suhu 37 oC selama 10 menit, kemudian
disentrifugasi pada laju 6000 rpm pada suhu
4 oC selama 10 menit.

Supernatan sebanyak 375 µl ditambahkan
ke dalam tabung yang berisi 1,25 ml Na2CO3
0,4 M dan 250 µl pereaksi Folin−Ciocalteu,
lalu diinkubasi kembali pada suhu 37 oC
selama 20 menit. Absorbans larutan diukur
pada panjang gelombang 578 nm. Aktivitas
enzim
protease
dihitung
berdasarkan
persamaan berikut:

(U /ml) =

A sampel
A standar

_
_

A blangko

×

faktor pengenceran
waktu inkubasi

A blangko

Analisis kadar protein
Kadar protein ditentukan dengan metode
Bradford (1976). Sebanyak 100 µL larutan
enzim ditambahkan dengan 1 mL akuades dan
1 mL pereaksi Bradford dalam tabung reaksi.
Pada perlakuan blangko, larutan enzim diganti
dengan akuades. Kemudian divorteks dan
didiamkan selama 20 menit pada suhu ruang
(tabung
reaksi
ditutup
dengan
foil
aluminium). Pengukuran absorbans dilakukan
pada panjang gelombang 595 nm. Konsentrasi
protein ditentukan dengan persamaan kurva
standar (standar protein BSA Fraction dengan
kisaran 0-250 µL)
Presipitasi
Enzim dalam filtrat diendapkan dengan
amonium sulfat. Pengujian aktivitas enzim
hasil pengendapan oleh garam dengann
konsentrasi 30−85%(b/v), untuk menentukan
konsentrasi garam yang optimal. Penambahan
dilakukan sedikit demi sedikit pada suhu 0−4
o
C sambil diaduk hingga larut, lalu dibiarkan
2 jam pada suhu rendah. Endapan enzim yang
dipisahkan dengan sentrifugasi dingin pada
7500 rpm selama 15 menit dilarutkan kembali
dalam bufer universal 50 mM pH 7.
Dialisis dan pemekatan
Potongan kantung dialisis direbus selama
10 menit (2 kali). Salah satu ujung kantung
diikat dan enzim dimasukkan. Pengisian tidak
boleh terlalu penuh karena volume larutan
akan
meningkat.
Kantong
kemudian
dimasukkan ke dalam larutan bufer universal
50 mM pH 7. Sambil digoyang secara
perlahan, dialisis dilakukan dalam ruang
dingin dengan pergantian larutan bufer setiap
2 jam sebanyak 3 kali. Setelah dialisis,
kantung
dipekatkan
dengan
serbuk
poli(etilena glikol) selama kurang lebih 1 jam.

5

Pencirian protease ekstrak kasar
Uji kuantitatif untuk mencirikan enzim
protease
dilakukan
dengan
metode
spektrofotometri (Bergmeyer 1983), yang
meliputi pH dan suhu optimum, pengaruh
alkohol (pelarut organik), inhibitor, dan
spesifisitas substrat. Sementara uji kualitatif
dilakukan dengan SDS-PAGE dan zimografi.

ukuran bobot molekul rantai protein dan
rantai subunit protein. Sementara itu,
elektroforesis dengan teknik zimografi juga
merupakan bertujuan mendeteksi aktivitas
enzim proteolitik secara langsung.
Tahapan kerja pada analisis SDS-PAGE
dan zimografi meliputi: penyiapan gel
pemisah dan penahan, penyiapan sampel dan
pemuatan, kondisi running, pewarnaan gel,
dan pelunturan warna.

Penentuaan pH dan suhu optimum
Penyiapan gel pemisah dan penahan
Optimalisasi pH dilakukan dengan
menggunakan bufer universal dan substrat
kasein yang diatur pada pH 4−10. Pengujian
aktivitas dilakukan pada suhu optimum (50
o
C). Optimum suhu dilakukan dengan dengan
uji aktivitas enzim pada berbagai variasi suhu
yaitu; 27, 37, 50, 60, dan 70 oC. Aktivitas
tertinggi menunjukkan suhu optimum enzim.
Pengaruh spesifisitas substrat
Uji aktivitas protease pada suhu dan pH
optimum dilakukan pada berbagai substrat
protein dengan konsentrasi 2% (b/v). Substrat
yang digunakan adalah kasein, gelatin, fibrin,
fibrinogen dan albumin. Substrat dilarutkan
dalam bufer universal 50 mM.
Pengaruh pelarut
Uji aktivitas protease menggunakan
variasi jenis pelarut organik, yaitu: kloroform,
n-heksana, benzena, dan toluena. Pengujian
pengaruh pelarut dilakukan dengan cara
mencampur enzim dengan pelarut organik
[2% (v/v)], nisbah 1:1 setelah itu, ditempatkan
pada suhu 4 oC selama 1 jam. Kemudian
larutan divorteks, dan diuji sesuai dengan
metode Bergmeyer.
Pengaruh inhibitor
Pengaruh penambahan senyawa inhibitor
terhadap aktivitas protease ditentukan dengan
cara inkubasi 100 µL enzim dan 100 µL
larutan senyawa inhibitor yang diujikan
meliputi EDTA 0.01 mM, PMSF 0.01mM,
TLCK 0.1 mM dan STI 0.01 mg/ml selama
satu jam pada suhu ruang, lalu aktivitas
residunya dianalisis secara kuantitatif.

Pembuatan gel pemisah 12% dan gel
penahan 4% untuk SDS−PAGE dan zimografi
dilakukan dengan komposisi yang tertera pada
Tabel 1.
Tabel 1 Komposisi gel pemisah dan gel
penahan untuk SDS−PAGE dan
zimografi
Pereaksi

Larutan A
Larutan B
Larutan C
Kasein 5%
Fibrinogen
1%
Trombin
Albumin
0.1%
Gelatin
0.1%
Akuades
Amonium
persulfat
TEMED*
Total

Gel
penahan
4%

Gel pemisah 10 %
(ml)
SDS−PAGE
1670
1250
−

Zimografi
1670
1250
−
1.00

0.67
−
1.25

1.00
0.10

−

1.00
1.00
2080

2080

3.00

100

100

0.05

10
5.00

10
5.00

0.005
5.00

TEMED* = N,N,N`N`−tetrametilenadiamina

Penyiapan sampel dan pemuatan
Khusus SDS−PAGE, 20 µL sampel
ditambahkan dengan 5 µL bufer sampel yang
mengandung 2-merkaptoetanol, lalu dipanaskan pada suhu 100 oC selama 3−5 menit.
Sementara pada zimografi, sampel dilarutkan
ke dalam bufer yang tidak mengandung 2mer-kaptoetanol dan tidak memerlukan pemanasan. Tiap sampel dimuat ke dalam sumur
gel dengan kisaran volume 10−20 µL, sedangkan volume LMW yang digunakan sebanyak
5 µL, dengan menggunakan plasmin sebagai
standar.

Analisis SDS-PAGE dan zimografi

Kondisi
running,
pelunturan warna

pewarnaan,

dan

Kombinasi antara elektroforesis gel poliakrilamida dengan detergen SDS digunakan
untuk memisahkan dan meneliti jumlah dan

Gel dijalankan pada tegangan 100 V
selama 1,5 jam dalam bufer elektroforesis.

6

Pada SDS-PAGE, setelah elektroforesis
langsung diwarnai dengan menggunakan
larutan pewarna commassie brilliant blue
R−250 selama 15 menit. Pelunturan warna
pada gel dilakukan dengan larutan peluntur
berulang kali sampai diperoleh pita protein
berwarna biru dengan latar gel bening.
Sementara
pada
zimografi,
setelah
elektroforesis, gel didenaturasi terlebih dahulu
dalam larutan Triton X-100 2.5% (v/v)
sambil digoyang selama 1 jam. Kemudian gel
ditempatkan dalam bufer fosfat 50 mM pH
optimum selama 30 menit. Gel diwarnai
dengan larutan pewarna commassie brilliant
blue R-250) selama 15 menit. Pelunturan
warna gel dilakukan dengan peluntur berulang
kali sampai diperoleh pita enzim proteolitik
putih dengan latar gel biru.

garam. Ion garam yang ditambahkan
memengaruhi kelarutan protein. Pada
konsentrasi rendah, ion-ion ini akan
mengelilingi molekul protein dan mencegah
mereka bersatu sehingga protein melarut.
Peristiwa ini disebut salting in. Pada
konsentrasi tinggi, terjadi peningkatan muatan

HASIL DAN PEMBAHASAN
Gambar 1 Isolat TP−4
Penapisan Isolat Sampel Tape Ketan Putih
Ekstrak tape diencerkan lebih dahulu
dengan garam fisiologis sebelum disebar
dalam media agar. Pengenceran yang
dilakukan berkisar dari 10 sampai 105 kali
dengan interval 10. Hasil pengamatan
menunjukkan bahwa semakin besar faktor
pengencerannya, jumlah isolat bakteri yang
memiliki koloni tunggal semakin banyak. Hal
ini disebabkan isolat memiliki ruang gerak
yang lebih luas pada pengenceran yang lebih
tinggi.
Terdapat 9 isolat tape (Lampiran 3) yang
diproduksi pada media LB yang aktivitasnya
diuji untuk mencari aktivitas enzim
maksimum. Jenis isolat dengan aktivitas
maksimum adalah TP-4 sebesar 0.724 U/ml
yang digunakan untuk pencirian selanjutnya.
Contoh perhitungan aktivitas enzim dapat
dilihat pada Lampiran 4. Sementara itu,
aktivitas spesifik dan kadar protein ekstrak
enzim kasar sebesar 1.257 U/mg dan 0.576
mg/ml. Nilai kadar protein tersebut diperoleh
melalui persamaan kurva standar BSA
(bovine serum albumin). Kurva standar BSA
terdapat pada Lampiran 5. Isolat TP-4 dapat
dilihat pada Gambar 1.
Pemurnian Enzim
Prinsip presipitasi adalah penggumpalan
protein non-enzim dengan penambahan

listrik di sekitar protein, yang akan menarik
mantel air dari koloid protein. Peristiwa
hidrofobik antarmolekul protein pada suasana
ionik tinggi akan menurunkan kelarutan
protein. Peristiwa tersebut dikenal dengan
salting out. Molekul air yang berikatan
dengan ion-ion garam yang semakin banyak
menyebabkan penarikan selubung air yang
mengelilingi permukaan protein. Peristiwa ini
mengakibatkan protein saling berinteraksi,
beragregasi, dan kemudian mengendap
(Harris 1989, Scopes 1989). Amonium sulfat
merupakan garam yang paling sering
digunakan untuk mengendapkan protein
karena memiliki daya larut tinggi di dalam air,
dan relatif tidak mahal (Scopes 1989).
Konsentrasi garam amonium sulfat
berkisar antara 30-85 %. Kadar protein
terkecil dari supernatan mengindikasikan
bahwa pelet mengandung endapan protein
yang maksimal. Selanjutnya bufer ditambahkan ke dalam pelet untuk menjaga stabilitas
enzim. Endapan yang diperoleh memiliki
aktivitas enzim sebesar 0.353 U/ml. Nilai ini
lebih kecil dari aktivitas enzim kasar.
Sebaliknya, kadar protein endapan lebih besar
dibandingkan dengan ekstrak kasar, yakni
sebesar 1.211 mg/ml, tetapi aktivitas spesifik
menurun menjadi 0.291U/mg. Sementara itu
tingkat kemurnian presipitat menurun dari 1
kali menjadi 0.232 kali (Tabel 2).

8

Tabel

2

Ringkasan

Tahapan

Volume
(ml)

Crude
Presipitat
Dialisat

200
12
10

tahap

pemurnian

Aktivitas
enzim
(U/ml)
0.724
0.353
0.796

[protein]
(mg/ml)
0.576
1.211
0.904

Penurunan tingkat kemurnian presipitat
disebabkan oleh kadar protein yang semakin
meningkat sementara aktivitas enzim
menurun. Hasil pengamatan menunjukkan
bahwa
penurunan
aktivitas
enzim
disebabkan oleh penambahan amonium
sulfat yang menyebabkan kelarutan protein
menurun. Selain itu menyebabkan protein
saling berinteraksi, beragregasi kemudian
mengendap.
Gambar 2 menunjukkan hubungan
antara kejenuhan amonum sulfat dan kadar
protein supernatan. Kadar protein supernatan
terkecil mengindikasikan kadar protein yang
terendapkan maksimal. Nilai tersebut dapat
dilihat pada titik terndah yang ditunjukkan
oleh kurva, yaitu protein untuk mendapatkan
titik terendah tersebut.pada konsentrasi 65%.
Uji pengendapan dilakukan dengan volume
total (enzim dengan amonium sulfat) kecil
yakni sebesar 10 ml. Setelah didapatkan
kadar protein terkecil supernatan (65%)
kemudian dilakukan presipitasi dalam
jumlah besar yakni sebesar 200 ml. Setelah
presipitasi dilanjutkan dengan dialisis.

0.70

K a da r pro tein (mg /ml)

0.60

enzim
Aktivitas
spesifik
(U/mg)
1.257
0.291
0.881

dari

isolat

Total
aktivitas
(U)
144.8
4.229
7.960

ekstrak
Total
Protein
(mg)
115.200
14.532
9.040

tape
Tingkat
kemurnian
(kali)
1
0.232
0.701

ketan

putih

Rendemen
(%)
100
2.92
5.50

Ukuran ini menunjukkan ukuran molekul
minimum yang dapat tertahan di dalam
membran. Dialisat yang diperoleh memiliki
aktivitas enzim sebesar 0.796 U/ml. Nilai ini
lebih besar daripada aktivitas enzim kasar dan
presipitat. Sebaliknya kadar protein dialisat
lebih kecil dibandingkan dengan presipitat
tetapi lebih besar dari aktivitas enzim kasar,
yakni sebesar 0.904 mg/ml. Di sisi lain
aktivitas spesifik meningkat menjadi 0.881
U/mg. Disamping itu tingkat kemurnian
dialisat juga meningkat terhadap presipitat,
tetapi masih lebih kecil dari enzim kasar.
Berdasarkan pengamatan dapat disimpulkan bahwa kenaikan aktivitas spesifik dialisat
tersebut disebabkan oleh kenaikan aktivitas
enzim.hal ini karena kelarutan enzim meningkat dengan bantuan bufer yang berdifusi
melalui membran sehingga enzim lebih leluasa
untuk melakukan aktivitasnya.aktivitas yang
dimaksud adalah kemampuan enzim untuk
menghidrolisis sumber karbon (substrat)
Sebaliknya kadar protein yang berkurang,
disebabkan adanya sebagian protein yang
keluar dari kantung dialisis. Protein yang dapat
bertahan di dalam kantung adalah ukurannya
yang lebih besar dari ukuran pori kantung
dialisis
Penentuan Aktivitas Maksimum
Enzim Kasar

0.50
0.40
0.30
0.20
0.10
0.00
0

20

40

60

80

100

kejenuhan amonium sulfat (%)

Gambar 2

Pengaruh konsentrasi amonium
sulfat terhadap kadar protein
supernatan.

Dialisis bertujuan lebih
memurnikan
enzim dengan menghilangkan sisa garam dan
ion−ion pengganggu lainnya. Pada tahap
dialisis, protein ditempatkan di kantung dialisis
berukuran besar akan tertahan didalamnya .
ukuran pori kantung dialisis yang terbuat dari
bahan selulosa asetat ini berdiameter 20 nm.

Dari kesembilan isolat diproduksi sebagai
enzim protease kasar dan ditentukan pada
variasi suhu, pH, dan waktu optimumnya..
Pada uji aktivitas enzim, setiap sampel,
blangko, dan standar ditambahkan bufer unuk
menjaga stabilitas pH-nya. Selanjutnya setelah
diinkubasi, diberi asam trikloro asetat (TCA).
Pemberian TCA bertujuan mengendapkan
protein (kasein) dan peptida yang belum
dipecah oleh enzim sekaligus untuk
menginaktifkan enzim. Setelah disentrifugasi,
supernatan diambil kemudian ditambah
dengan Na2CO3. Penambahan Na2CO3
bertujuan memberikan suasana basa pada
supernatan. Suasana basa diperlukan agar
pewarna Folin Ciocalteu dapat bereaksi
dengan asam amino dan mengubah warna
supernatan, sebab pereaksi Folin hanya dapat
bekerja pada suasana basa. Pereaksi Folin
digunakan karena pereaksi ini lebih mudah

8

dapat menyebabkan semakin meningkatnya aktivitas
katalitik enzim dan semakin bertambahnya
kerusakan enzim.
Gambar 4 juga menunjukkan bahwa pada enzim
kasar aktivitas residu hilang sebesar 90% pada suhu
50 dan 70 oC. Sementara pada dialisat
hilang sebesar 98% pada suhu 50 oC dan 82% pada
suhu 70oC. Berdasarkan rata-rata aktivitas residu,
daya tahan enzim kasar cenderung lebih besar
dibandingkan dengan dialisat enzim. Hal ini
disebabkan aktivitas spesifik dari enzim kasar lebih
besar dari dialisatnyameskipun kadar protein dari
dialisat enzim lebih besar.
1,20

0,80

120
Aktivitas enzim dialisat (U/ml)
Aktivitas enzim crude (U/ml)

1,00

0,40
0,20
0,00
0

10

20
Waktu (menit)

30

40

Gambar 3 Kurva penentuan aktivitas
maksimum enzimkasar.
Pengaruh Suhu Terhadap Enzim
Suhu merupakan salah satu faktor
yang
memengaruhi
kinerja
enzim.
Penentuan suhu optimum dilakukan
dengan mereaksikan enzim pada pH 7.
berbagai suhu: 27, 37, 50, 60, dan 70oC.
Gambar 4 menunjukkan bahwa suhu
optimum enzim dari ekstrak kasar dan
dialisat dicapai pada suhu 37 oC, dengan
nilai aktivitas berturut-turut sebesar 0.724
U/ml dan 0.729 U/ml. Tabel lengkap
pengaruh suhu, pH, waktu, pelarut, dan
inhibitor terhadap enzim kasar dapat
terdapat pada Lampiran 6).
Pada suhu di bawah 37 oC, aktivitas
enzim
meningkat
karena
terjadi
peningkatan
energi
kinetik
yang
mempercepat gerak vibrasi, translasi, serta
rotasi enzim dan substrat sehingga
memperbesar peluang keduanya untuk
saling bertumbukan (Suhartono 1989).
Pada suhu di atas suhu optimum, aktivitas
enzim menurun karena enzim adalah
molekul protein yang dapat terdenaturasi
pada suhu tinggi. Menurut Palmer (1991),
peningkatan suhu hingga batas tertentu

100

Aktivitas residual crude (%)
Aktivitas residual dialisat (%)

0,80

80

0,60

60

0,40

40

0,20

20

0,00

Aktiviatas residual

0,60

Aktivitas enzim (U/m l)

Ak tivitas enzim (U/ml)

didapat, dan warna biru yang dihasilkannya
lebih bagus dan bersih. Semakin pekat
warna biru yang terbentuk mengindikasikan bahwa larutan tersebut
mengandung banyak asam amino.
Perlakuan sentrifugasi dilakukan pada
laju 6000 rpm dengan suhu 4 oC selama 10
menit. Sentifugasi pada suhu rendah
bertujuan mencegah kerusakan enzim
akibat panas yang ditimbulkan. Dengan ini,
sel yang berbobot molekul lebih besar dari
enzim akan mengendap karena gaya
gravitasi sedangkan enzim tetap berada
pada cairan atau supernatannya.

0
27

37

50

60

70

o

Suhu ( C)

Gambar 4

Kurva pengaruh suhu terhadap
aktivitas
enzim dan aktivitas
residual enzim ekstrak kasar dan
dialisat.

Enzim yang diisolasi dari Bacillus sp. galur CK
11-4 (Kim et al. 1996) dilaporkan memiliki kisaran
suhu optimal sebesar 70oC dan pH 10,5. Enzim
fibrinolitik hasil fermentasi Bacillus firmus NA-1
stabil pada suhu 40 oC, tetapi aktivitas residunya
hilang pada suhu 50 oC (Seo J dan Lee 2004).
Pengaruh pH Terhadap Enzim
Reaksi enzim dipengaruhi oleh
pH.
Peningkatan
pH
sebelum
titik
optimum
menyebabkan terusnya meningkatnya aktivitas
enzim,sampai seluruh tapak enzim berikatan dengan
substrat membentuk kompleks enzim-substrat.
Sebaliknya peningkatan pH di atas batas
optimum kerja enzim menyebabkan kerja enzim
menurun, karena terjadi denaturasi enzim atau
perubahan struktur tiga dimensi molekul enzim.
Denaturasi ini akan menyebabkan menurunnya
fungsi katalitik enzim karena struktur enzim tidak
sesuai lagi dengan molekul substrat (Girindra 1993)

9

1,20

120
Aktiviatas enzim dialisat (U/ml)
100

Aktivitas enzim crude (U/ml)
Aktivitas residual crude (%)
Aktiviatas residual dialisat (%)

0,80

80

0,60

60

0,40

40

0,20

20

0,00

A ktiv ita s r e sidu a l (% )

A k tiv ita s e n z im (U /m l)

1,00

0
4

5

6

7

8

9

10

12

pH

Gambar 5 Kurva pengaruh pH terhadap
aktivitas enzim dan aktivitas
residual enzim ekstrak kasar dan
dialisat.
Aktivitas residu rata-rata pada dialisat
cenderung lebih besar dibandingkan
dengan aktivitas enzim kasar. Data tersebut
me-nunjukkan bahwa masih banyak enzim
pada ekstrak kasar yang tidak mampu
mendegradasi substrat sehingga kompleks
yang terbentuk antara enzim dengan
substrat tidak maksimal. Sementara itu,
pada dialisat, enzim sudah dimurnikan
sehingga pembentukan kompleks antara
enzim dan substrat sudah maksimal,
sehingga daya tahan terhadap pH di bawah
maupun di atas pH optimum cenderung
lebih besar. Tabel lengkap pengaruh suhu,
pH, waktu, pelarut, dan inhibitor terhadap
dialisat enzim terdapat pada Lampiran 7).
Hasil pemurnian dan pencirian enzim
Alkaligenes
faecalis
protease
dari
(Thangam & Rajkumar 2002) memiliki
aktivitas optimal pada pH 9. Enzim
protease yang diisolasi dari Bacillus
subtilis galur 38 memiliki pH optimum
pada 6.5 (Chantawannakul et al. 2002).

Pengaruh Inhibitor
Ikatan inhibitor (atau aktivator) dengan enzim
dapat mengubah kemampuan enzim dalam mengikat
substrat sehingga mengubah daya katalisisnya. Hal
ini disebabkan karena struktur enzim mengalami
perubahan fisik dan kimia sedemikian rupa sehingga
aktivitas hayatinya pun berbeda. (Suhartono 1989).
Jenis atau nama protease ditentukan dari jenis
inhibitor yang menghambat enzim tersebut. PMSF
dan TLCK termasuk jenis protease serin yang
dicirikan kehadiran gugus serin pada sisi aktifnya.
Protein serin aktifnya pada kondisi pH netral dan
basa (pH 7−11) (Rao et al.1998). Gambar 6
menunjukkan bahwa PMSF dan TLCK menghambat
aktivitas dialisat, sehingga dapat disimpulkan bahwa
dialisat enzim termasuk enzim protease serin.
EDTA merupakan senyawa pengkelat yang
dapat menstabilkan enzim. Cara kerjanya ialah
dengan mengikat logam penganggu dan mencegah
interaksi enzim dengan asam atau golongan –SH
(Schwimmer 1981). Pengaruh EDTA (Gambar 6)
menghambat aktivitas enzim kasar (0.01 mM),
sehingga enzim kasar digolongkan sebagai protease
logam.
120
crude

dialisat

100
Aktivita s residual (% )

Pada Gambar 5 diperlihatkan bahwa
pada kondisi mendekati pH 7 (pH 4,5, dan
6), aktivitas enzim kasar dan dialisat
cenderung meningkat dan mencapai
optimum pada pH 7 dengan nilai aktivitas
sebesar 0.724 U/ml dan 0.729 U/ml. Pada
kondisi pH tersebut tapak aktif enzim
sudah seluruhnya berikatan dengan substrat
membentuk kompleks enzim-substrat.

80

60

40
20

0
EDTA

PMSF

TLCK

STI

kontrol

Inhibitor

Gambar 6 Diagram pengaruh inhibitor terhadap
aktivitas residual enzim ekstrak kasar
dan dialisat.
Inhibitor STI menghambat logam, sistein,
protease aspartat, atau protease serin. STI tersebut
memiliki sifat sensitif terhadap suhu tinggi dan pH
basa. STI (Gambar 6) lebih berpengaruh pada
dialisat dengan menurunkan aktivitas residu sebesar
94% sedangkan aktivitas residu enzim kasar hanya
64%. Dalam isolasi protease alkali dari A. faecalis
yang dilakukan Thangam & Rajkumar (2002)
dilaporkan bahwa inhibitor PMSF sangat
menghambat aktivitas enzim tersebut, dilihat dari

10

Pengaruh pelarut organik yang berbeda pada enzim
kasar dan dialisat disebabkan jenis enzim Enzim
kasar termasuk jenis enzim protease logam
sedangkan dialisat termasuk enzim protease serin.
120
crude

dialisat

100
Aktivitas residual (%)

aktivitas sisa sebesar 15% pada konsentrasi
1.0 mM, 7% pada konsentrasi 2.5 mM dan
0 % pada konsentrasi 5 mM.
Pada penelitian lain (Kim et al.1996)
enzim fibrinolitik yang diisolasi dari
Bacillus sp. galur CK 11-4 diturunkan
aktivitas residunya sebesar 2.9% dan
58.6% pada konsentrasi 0.1 mM berturutturut untuk inhibitor EDTA dan PMSF.
Lebih lanjut pada konsentrasi 1.0 mM
aktivitas tersebut diturunkan 21.4% dan
100 % berturut-turut oleh inhibitor dan
EDTA dan PMSF. Berdasarkan data yang
diperoleh dapat disimpulkan bahwa
konsentrasi inhibitor berbanding lurus
dengan daya hambat inhibitornya.

80
60
40
20
0
cloroform

n-heksana

benzena

toluena

kontrol

Pelarut organik

Pengaruh Pelarut
Dalam penggunaan pelarut organik,
peubah yang harus diperhatikan adalah
konsentrasi pelarut, protein, pH, kekuatan
ionik, dan suhu (Harris 1989). Penambahan
pelarut organik ke dalam larutan protein
akan menurunkan tetapan dielektrik dan
menyebabkan medium kurang sesuai bagi
permukaan enzim yang polar. Berdasarkan
teori kelarutan, hal ini akan menurunkan
kelarutan protein. Adanya residu asam
amino hidrofobik kadang-kadang akan
menyebabkan terjadinya pelipatan molekul
baru dan enzim menjadi tidak aktif. Oleh
karena itu, penambahan pelarut organik
dapat menginduksi proses inaktivasi
enzim. Disamping itu, pelarut ini dapat
memperbesar kemungkinan terjadinya
denaturasi terutama pada suhu yang agak
tinggi.
Kelemahan
utama
dalam
penggunaan pelarut organik adalah sifatnya
yang mudah terbakar dan mahal.
Pada suhu diatas 10 oC, konformasi
protein akan berubah yang memungkinkan
molekul-molekul
pelarut
organik
mendapatkan jalan masuk ke dalam
struktur protein, kemudian merusak
interaksi hidrofobik dan akhirnya terjadi
denaturasi (Harris 1989; Scopes 1987).
Pada Gambar 7 dapat dilihat bahwa rata rata aktivitas sisa enzim kasar lebih besar
dibandingkan dengan aktivitas residual
dialisat. Hal ini menunjukkan bahwa
penambahan
pelarut
organik
lebih
berpengaruh terhadap enzim kasar.

Gambar 7 Diagram pengaruh pelarut organik
terhadap aktivitas residual enzim
eksrak kasar dan dialisat.
Penentuan Bobot Molekul (SDS−PAGE)
Elektroforesis dengan berbagai jenis gel telah
banyak dimanfaatkan dalam teknik preparatif, di
antaranya gel pati, agarosa, dan poliakrilamida.
Polimer ini disusun oleh akrilamida dan N N’metilena bis-akril amida yang berpolimerisasi
dengan bantuan suatu katalis atau sistem radikal
bebas, seperti amonium persulfat dan N,N,N’,N’tetrametilena diamina (TEMED). Penggunaan SDS
berfungsi untuk memisahkan dan mengetahui
jumlah dan ukuran rantai protein atau rantai subunit
protein dan membuat keseluruhan protein diselimuti
muatan negatif. SDS merupakan detergen lemah
yang akan mengikat protein dan memutuskan ikatan
antarsubunit protein. Dalam hal ini dipergunakan
juga suatu pereaksi tiol seperti β-merkaptoetanol
untuk mereduksi semua ikatan disulfida yang ada
pada protein.
Metode elektroforesis SDS-PAGE
10% digunakan untuk menentukan bobot molekul ekstrak
kasar enzim protease dari tape ketan putih.
Perlakuan dilakukan pada enzim kasar, presipitat,
dan dialisat. Gambar 8 menunjukkan nilai bobot
molekul dari enzim kasar, presipitat, dan dialisat
dari enzim protease tape ketan putih. Nilai BM yang
diperoleh sebesar 11.60 kD. Nilai diperoleh dari
protein baku yang telah diketahui bobot molekulnya
dan dengan membandingkan nilai Rf yang diperoleh.
Berdasarkan pengamatan, preparat protein dapat

11

segera dianalisis sifat kehomo-genannya.
Protein homogen menghasilkan satu pita
(Gambar 8), sedangkan sub unit yang
ukurannya berbeda menghasilkan lebih
dari satu pita. Kurva standar SDS-PAGE
dapat dilihat pada Lampiran 8).
LMW

C

P

diperoleh dapat disimpulkan bahwa enzim yang
diisolasi dari tape ketan putih mampu menghidolisis
substrat kasein, fibrinogen, dan gelatin.
Kemampuan enzim untuk menghidrolisis
substrat dapat dilihat dari pita putih dengan latar gel
biru. Berdasarkan hasil zimogram, substrat kasein
menunjukkan satu buah pita (Gambar 9), berbeda
dengan substrat fibrinogen dan gelatin (Gambar 10
dan 11).

—29
20—
6.50—

Gambar

—24

11.60—

—14.20

8

Analisis SDS−PAGE 10%
pada C,
enzim kasar,P,
presipitat, dan D, dialisat.

Dari pemurnian dan pencirian enzim
protease dari A. faecalis (Thangam &
Rajkumar 2002), dilaporkan bahwa bobot
molekul yang diperoleh sebesar 67 kDa.
Bobot molekul tersebut sekitar 6 kali lebih
besar dari bobot molekul enzim protease
yang diisolasi dari ekstrak tape.
Zimografi
Prinsip kerja