• Ukuran sampel yang dianalisis terlalu besar. Jika sampel terlalu besar
maka fase gerak tidak mampu membawa solute dengan sempurna sehingga terjadi pengekoran atau tailing.
• Interaksi yang kuat antara solut dengan fase diam dapat menyebabkan
solut sukar terelusi sehingga dapat menyebabkan terbentuknya puncak yang mengekor.
• Adanya kontaminan dalam sampel yang dapat muncul terlebih dahulu
sehingga menimbulkan puncak mendahului fronting
2.4.5 Instrumen KCKT
Instrument KCKT tersusun atas 6 bagian dasar, yaitu wadah fase gerak reservoir, pompa pump, tempat injeksi sampel injector, kolom column,
detektor detector dan perekam recorder. Ilustrasi instrument dasar KCKT dapat
dilihat pada gambar 2 McMaster, 2007.
Gambar 2 . Instrumen Dasar KCKT McMaster, 2007. 2.4.5.1 Wadah Fase Gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan inert. Wadah pelarut kosong ataupun labu dapat digunakan sebagai wadah fase gerak dan biasanya dapat menampung
fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus
Universitas Sumatera Utara
dilakukan degassing penghilangan gas pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama pompa dan detektor sehingga akan
mengacaukan analisis Rohman, 2007. 2.4.5.2 Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni harus inert terhadap
fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang dgunakan sebaiknya mampu
memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mlmenit Rohman, 2007.
2.4.5.3 Injektor
Ada 3 jenis macam tempat injeksi sampel injektor, yakni syringe injector, sampling valve dan automatic injector. Syringe injector merupakan
bentuk injektor yang paling sederhana, terdapat dalam dua jenis antara lain stopflow injection dan septumless-syringe injector Snyder dan Kirkland, 1979.
Sampling valve atau manual injector mengandung 6 katup saluran dilengkapi dengan rotor, sample loop dan saluran jarum suntik needle port.
Larutan sampel akan disuntikkan dengan jarum suntik ke dalam sampel loop pada posisi “load” dan larutan sampel yang ada di sample loop kemudian akan
dialirkan ke kolom dengan memutar rotor ke posisi “inject”. Ukuran sample loop eksternal bervariasi antara 6 µL hingga 2 mL Dong, 2005. Automatic injector
atau disebut juga autosampler memiliki prinsip yang mirip, hanya saja sistem penyuntikannya bekerja secara otomatis, terbagi menjadi 3 tipe prinsip
Universitas Sumatera Utara
penyuntikan, yakni pullloop injection, push-loop injection dan integral-loop injection Meyer, 2004.
2.4.5.4 Kolom
Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok: a.
Kolom analitik: garis tengah-dalam 2-6 mm. Panjang bergantung pada jenis kemasan, untuk kemasn pelikel biasanya panjang kolom 50-100 cm,
untuk kemasan mikropartikel berpori biasanya 10-30 cm. b.
Kolom preparatif: umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar dari panjang 25-100 cm Johnson dan Stevenson, 1991.
2.4.5.5 Detektor
Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal dan detektor spesifik Rohman, 2007. Detektor yang paling banyak
digunakan dalam kromatografi cair modern kecepatan tinggi adalah detektor spektrofotometer UV 254 nm. Bermacam-macam detektor dengan variasi panjang
gelombang UV-Vis sekarang menjadi populer karena mereka dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa-senyawa dalam rentang yang luas. Detektor indeks
refraksi juga secara luas digunakan, terutama dalam kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif dari pada detektor spektrofotometer UV. Detektor
lainnya seperti detektor fluometer, detektor ionisasi nyala, dan detektor elektrokimia juga telah digunakan Johnson dan Stevenson, 1991.
2.4.5.6 Perekam
Alat pengumpul data seperti komputer, integrator, rekorder dihubungkan dengan detektor. Alat ini akan mengukur sinyal elektronik yang dihasilkan oleh
Universitas Sumatera Utara
detektor lalu mem-plotkannya sebagai suatu kromatogram yang selanjutnya dapat dievaluasi oleh seorang analis Brown dan DeAntonis, 1997.
2.6 Validasi Metode
Validasi metoda analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan
bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya Harmita, 2004.
Menurut USP Edisi Ketigapuluh, ada 8 karakteristik yang digunakan dalam validasi metoda yaitu akurasi, presisi, spesifisitas, batas deteksi, batas
kuantitasi, linearitas, rentang, dan ketahanan.
Tabel 2. Delapan Karakteristik Utama yang Digunakan dalam Validasi Metode
Analitik
Karakteristik Pengertian
Akurasi Kedekatan antara nilai hasil uji yang diperoleh lewat metode
analitik dengan nilai sebenarnya. Presisi
Ukuran keterulangan metode analitik, termasuk di antaranya kemampuan instrumen dalam memberikan hasil analitik yang
reprodusibel.
Spesifisitas Kemampuan untuk mengukur analit yang dituju secara tepat
dan spesifik dengan adanya komponen lain dalam matriks sampel seperti ketidakmurnian, produk degradatif dan
komponen matriks.
Batas deteksi Konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat
dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. Batas kuantitasi
Konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima
pada kondisi operasional metode yang digunakan.
Linieritas Rentang
Kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil uji yang secara langsung proposional dengan konsentrasi analit pada
kisaran yang diberikan. Konsentrasi terendah dan tertinggi yang mana suatu metode
analitik menunjukkan akurasi, presisi dan linieritas yang cukup.
Ketahanan Kapasitas metode untuk tidak terpengaruh oleh adanya
variasi parameter yang kecil.
Universitas Sumatera Utara
