III. METODOLOGI PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan pada Bulan April sampai September 2008 di Laboratorium Pengolahan Pangan, Laboratorium Mikrobiologi Pangan dan
Biokimia Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
B. Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan antara lain : pulpa kakao yang diperoleh dari Perkebunan Kakao Liang Awaia Seram Bagian Barat
– Ambon, ragi roti Fermipan dan gula pasir yang diperoleh dari pasar tradisional di daerah
Bogor, bakteri A. aceti BTCC-618, media untuk pertumbuhan khamir dan A. aceti
yaitu PDB Potato Dextrose Broth, pepton, yeast ekstrak, glukosa, MgSO
4
.7H
2
O Magnesium Sulphate Heptahydrate dan agar, spiritus, kapas, kertas label, allumunium foil, tisu, aquades, NaOH, asam oksalat
C
2
H
2
O
4
. 2H
2
O, indikator PP Phenolphtalein, alkohol 70, alkohol 96 . Sedangkan Alat-alat yang digunakan erlenmeyer, gelas ukur, spatula, bunsen,
timbangan, blender, kain saring, sumbat karet yang dilengkapi dengan selang, autoklaf, aerator, refraktometer, alkohol meter, pH meter, labu destilasi, cawan
petri, hot plate, labu takar, gelas piala, buret dan pipet tetes.
C. Tahapan Penelitian 1. Penyegaran Kultur
Penelitian ini menggunakan kultur A. aceti BTCC-618, yang diperoleh dari Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI di Cibinong.
Sebelum dipergunakan, kultur A. aceti disegarkan terlebih dahulu dengan cara menumbuhkan pada media cair yang terdiri dari pepton, yeast ekstrak,
glukosa dan MgSO
4
.7H
2
O. Proses penyegaran kultur A. aceti dapat dilihat pada Gambar 2.
Biakan murni mikroba Diinokulasikan 1 mata ose ke dalam media cair pepton, yeast ekstrak,
glukosa, MgSO
4
.7H
2
O
Diinkubasi pada suhu ruang selama 2
– 3 hari Gambar 2. Penyegaran Kultur A. aceti pada Media Cair
2. Pembuatan Starter
Starter adalah media yang digunakan untuk memperbanyak sel-sel khamir penghasil alkohol dan bakteri penghasil asam asetat yang
selanjutnya akan diinokulasikan ke dalam media fermentasi. Dalam proses pembuatan asam asetat, starter yang perlu disiapkan
adalah starter khamir dan starter A. aceti. Dalam penelitian ini, khamir yang digunakan adalah ragi roti komersial.
2.1. Starter Khamir
Sebelum dipergunakan, ragi roti komersial tersebut terlebih dahulu ditumbuhkan atau diperbanyak dalam media cair PDB
Potato Dextrose Broth. Media PDB tersebut dilarutkan dengan aquades, kemudian disterilkan dan didinginkan. Setelah media tersebut
didinginkan, maka ragi roti ditambahkan ke dalam media PDB, kemudian diinkubasikan selama 24 jam pada suhu ruang, untuk
selanjutnya diinokulasikan dalam media pulpa kakao. Sebelum proses inokulasi berlangsung, terlebih dahulu
disiapkan kultur kerja dengan menggunakan media pulpa kakao
pengenceran 1 : 4, kemudian ditambahkan gula 10 dan disterilkan pada suhu 121
O
C selama 15 menit. Setelah melewati proses sterilisasi, media tersebut didinginkan dan diinokulasikan secara aseptis dengan
suspensi ragi roti umur 24 jam. Kemudian, media diinkubasi pada suhu ruang dan siap digunakan untuk proses fermentasi Gambar 3.
Inokulasi
Gambar 3. Diagram alir pembuatan starter khamir ragi roti
2.2. Starter Acetobacter aceti
Starter A. aceti dibuat dalam media cair yang terdiri dari campuran pepton, yeast ekstrak, glukosa dan MgSO
4
.7H
2
O. Setelah itu, tambahkan aquades dan dilarutkan. Setelah larut, media tersebut
disterilkan pada suhu 121
O
C selama 15 menit. Kemudian didinginkan dan diinokulasikan dengan A. aceti. Setelah itu, diinkubasikan pada
suhu ruang selama 2 – 3 hari Gambar 4.
Inkubasi 24 jam suhu ruang
Ragi Roti
PDB steril Tambahkan gula 10
dan dicampur - larut
Sterilisasi T 121
o
C - 15 menit
Media pulpa kakao
Inkubasi suhu ruang
Pulpa kakao
Tambahkan aquades Pengenceran 1 : 4
Gambar 4. Pembuatan starter A. aceti
3. Produksi Asam Asetat
Ada dua tahap fermentasi yang harus dilakukan untuk menghasilkan asam asetat. Tahap pertama adalah fermentasi alkohol, dimana khamir
mengubah kandungan glukosa pada pulpa kakao menjadi alkohol. Tahap kedua adalah fermentasi asam asetat, dimana dengan penambahan bakteri
A. aceti pada media yang beralkohol tinggi, maka dapat menghasilkan asam
asetat.
3.1. Fermentasi Alkohol
Media fermentasi yang digunakan adalah pulpa kakao yang sudah diblender dan diencerkan dengan perbandingan 1 : 4, kemudian disaring
Sterilisasi 121 °C : 15 ’
Inokulasi A. aceti Inkubasi 2
– 3 hari suhu ruang
Pepton, yeast ekstrak, glukosa dan MgSO
4
.7H
2
O dilarutkan dengan aquades
Didinginkan
menggunakan kain saring dan ditambahkan gula dengan konsentrasi 5 , 10 dan 15. Media tersebut kemudian disterilkan dengan menggunakan
autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit, dan kemudian didinginkan. Setelah dingin, ke dalam masing-masing media pulpa tersebut
diinokulasikan dengan suspensi ragi roti sebanyak 10 dan 20 dan diinkubasikan pada suhu ruang selama 12 hari Gambar 5. Untuk
menampung gas yang terbentuk selama fermentasi, maka labu erlenmeyer tersebut dilengkapi dengan pipa dan selang plastik yang bagian ujungnya
direndam dalam air. Pengamatan yang dilakukan pada tahap ini adalah pengukuran Total Padatan Terlarut TPT, nilai pH dan alkohol, yang
dilakukan pada hari ke- 0, 4, 8 dan 12.
3.2. Fermentasi Asam Asetat
Fermentasi asam asetat pada penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh lama fermentasi terhadap perubahan kadar alkohol,
total padatan terlarut, pH, dan kadar asam asetat. Starter yang digunakan adalah biakan A. aceti pada agar miring yang diinokulasikan dalam larutan
nutrient broth. Banyaknya starter yang ditambahkan adalah 10 vv. Setelah diinkubasi selama 12 hari dengan kadar alkohol tertentu,
kemudian fermentasi dilanjutkan dengan menambahkan suspensi A. aceti ke dalam media pulpa tersebut sebanyak 10 dan pemeraman dilakukan
selama 7 hari dalam wadah erlenmeyer dengan perlakuan aerasi dan tanpa aerasi Gambar 6. Analisis asam asetat dilakukan dengan metode titrasi
menggunakan NaOH 0.1 N yang telah distandarisasi. Pengukuran kadar alkohol, total padatan terlarut, pH dan kadar asam
asetat dilakukan pada hari ke- 0, 7, 14 dan 21. Produk utama dari fermentasi asam asetat adalah asam asetat. Selama fermentasi diharapkan
terjadi pembentukan asam asetat yang ditandai dengan penurunan kadar alkohol, total padatan terlarut dan pH substrat.
Inokulasi 10, 20
Gambar 5. Diagram alir fermentasi alkohol Pulpa kakao
pengenceran 1 : 4
Blender dan saring
Penambahan gula 5, 10, 15 ukur TPT
Sterilisasi T 121
o
C - 15 menit
Pendinginan Wadah
Analisa kadar alkohol Metode Destilasi
Inkubasi suhu ruang Pengamatan hari ke- 0, 4, 8, dan 12
Suspensi ragi roti
Gambar 6. Proses fermentasi asam asetat
4. Peubah yang Diukur
Pada fermentasi pulpa, dilakukan pengambilan sampel pada setiap empat hari selama 12 hari fermentasi kemudian dianalisis. Pengambilan
sampel fermentasi alkohol dilakukan setiap tujuh hari selama tiga minggu. Inokulasi A. aceti 10
alkohol tertinggi
Inkubasi
Analisis asam asetat metode titrasi
ASAM ASETAT
Perlakuan aerasi
Perlakuan tanpa aerasi
Analisis yang akan dilakukan dalam penelitian ini adalah kadar asam asetat, kadar alkohol, total padatan terlarut dan nilai pH.
Prosedur analisa dari masing-masing parameter adalah sebagai berikut :
4.1. Kadar Asam Asetat
10 ml sampel ditimbang, dimasukkan ke dalam labu takar, tambahkan aquades hingga volume menjadi 100 ml. Kemudian pipet 10 ml,
masukkan ke dalam erlenmeyer 100 ml, kemudian dititrasi dengan NaOH 0,1 N menggunakan indikator phenolphtalein 2-3 tetes sampai
berubah warna menjadi merah jambu. Sampel dititrasi dengan menggunakan buret.
Kadar Asam Asetat = ml titran x N.NaOH x Pengenceran x BM x 100 Berat Sampel x 1000
4.2. Kadar Alkohol
Pengukuran kadar alkohol dilakukan dengan menggunakan peralatan mikrodestilasi, selanjutnya destilat diukur dengan alkohol meter untuk
menentukan kadar alkohol. Seratus ml sampel didestilasi hingga didapatkan destilat 80 ml,
kemudian ditambahkan aquades ke dalam destilat sampai volume menjadi seratus ml. Larutan tersebut dikocok agar homogen lalu
alkohol meter dimasukkan. Kadar alkohol ditunjukkan oleh angka pada alkohol meter yang berhimpit dengan destilat.
4.3. Total Padatan Terlarut TPT
Total padatan terlarut diukur dengan refraktometer. Satu tetes sampel diteteskan, kemudian angka yang keluar dari alat refraktometer adalah
nilai TPT dari sampel tersebut, yang dinyatakan dalam persen brix.
4.4. Nilai pH
Pengukuran dilakukan dengan pH meter. Elektroda pH meter dicelupkan ke dalam sampel yang akan dianalisa. Nilai pH langsung
terbaca. Apabila nilai pH telah terbaca, kemudian elektroda dikeluarkan dari sampel dan dibersihkan dengan menggunakan
aquades, kemudian dikeringkan dengan tisu bersih.
D. Rancangan Percobaan
1. Rancangan percobaan untuk fermentasi alkohol Rancangan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap RAL dengan
tiga faktor dan dua kali ulangan. Faktor pertama adalah penambahan gula 5, 10 dan 15. Faktor kedua adalah konsentrasi starter ragi roti
10 dan 20 dan faktor ketiga adalah waktu fermentasi hari ke-0, 4, 8 dan 12.
Model matematis yang digunakan menurut Mattjik dan Sumertajaya 2006 adalah sebagai berikut :
Y
ijk
= + A
i
+ B
j
+ C
k
+
ijk
Keterangan : Yijk = Pengaruh konsentrasi gula ke-i, starter ragi roti taraf ke-j dan
lama fermentasi taraf ke-k µ = Rata-rata pengamatan sebenarnya
Ai = Pengaruh penambahan gula taraf ke-i Bj = Pengaruh konsentrasi ragi roti taraf ke-j
C
k
= Pengaruh lama fermentasi hari taraf ke-k 0, 4, 8, 12 ijk = Pengaruh acak
2. Rancangan percobaan untuk fermentasi asam asetat Rancangan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap RAL
dengan dua faktor dan dua kali ulangan. Faktor pertama adalah perlakuan aerasi dan tanpa aerasi. Faktor kedua adalah waktu
fermentasi hari ke-0, 7, 14 dan 21. Model matematis yang digunakan menurut Mattjik dan Sumertajaya
2006 adalah sebagai berikut :
Y
ijk
= + A
i
+ B
j
+
ijk
Keterangan : Yijk = Pengamatan pada ulangan ke-k dalam perlakuan aerasi atau
tanpa aerasi taraf ke-i dan lama fermentasi taraf ke-j µ = Rata-rata pengamatan sebenarnya
Ai = Pengaruh perlakuan taraf ke-i aerasi dan tanpa aerasi Bj = Pengaruh faktor lama fermentasi hari ke-j 0, 7, 14, 21
ijk = Pengaruh acak
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Fermentasi Alkohol
Fermentasi merupakan kegiatan mikroba pada bahan pangan sehingga dihasilkan produk yang dikehendaki. Mikroba yang umumnya terlibat dalam
fermentasi adalah bakteri, khamir dan kapang. Contoh bakteri yang digunakan dalam fermentasi adalah Acetobacter xylinum pada pembuatan nata de coco,
Acetobacter aceti pada pembuatan asam asetat. Contoh khamir dalam
fermentasi adalah Saccharomyces cerevisiae dalam pembuatan alkohol sedang contoh kapang adalah Rhizopus sp pada pembuatan tempe, Monascus
purpureus pada pembuatan angkak dan sebagainya.
Fermentasi dapat dilakukan dengan menggunakan kultur tunggal dan kultur campuran. Kultur tunggal adalah mikroorganisme yang telah diketahui
dengan pasti sifat dan karakteristiknya sehingga produk yang dihasilkan memiliki stabilitas dan kualitas yang jelas. Sedangkan kultur campuran adalah
kultur yang terdiri dari beberapa mikroorganisme yang belum diketahui sifat dan karakteristiknya, sehingga hasil yang diperoleh sering tidak stabil.
Penelitian ini menggunakan ragi roti yang merupakan khamir bersel tunggal Saccharomyces cerevisiae, dimana terdapat sejumlah enzim di dalam
cairan sel ragi salah satunya adalah enzim invertase dan enzim zimase. Enzim invertase yang berfungsi sebagai pemecah sukrosa menjadi monosakarida
glukosa dan fruktosa serta enzim zimase yang mengubah monosakarida tersebut menjadi alkohol pada proses fermentasi Romli, 1998.
Fermentasi alkohol merupakan salah satu tahap dalam menghasilkan asam asetat. Fermentasi alkohol dalam penelitian ini dilakukan dengan
menginkubasi substrat larutan pulpa kakao yang ditambahkan ragi roti 10 dan 20 selama 12 hari pada suhu ruang.
Menurut Young 1999, gula yang terkandung dalam substrat akan dipecah oleh sel-sel ragi roti menjadi alkohol. Pemecahan ini berkaitan,
Kategori