91
VII. ANALISIS MOLEKULER DAN UJI KEEFEKTIFAN GEN AV1
PADA TANAMAN TEMBAKAU TRANSGENIK UNTUK KETAHAHAN TERHADAP BEGOMOVIRUS
Abstrak
Transformasi genetik tanaman tembakau dengan gen AV1 Begomovirus telah dilakukan pada penelitian sebelumnya dan telah menghasilkan tanaman
tembakau transgenik putatif yang membawa gen ketahanan terhadap antibiotik kanamisin. Tujuan penelitian ini adalah 1 untuk memperoleh tanaman tembakau
transgenik generasi T0 yang membawa gen AV1 Begomovirus berdasarkan teknik PCR, 2 untuk mendapatkan informasi integrasi dan jumlah kopi gen AV1 pada
genom tanaman tembakau transgenik generasi T0 dengan teknik Southern blot dan korelasinya dengan respon ketahanan, 3 memperoleh tanaman tembakau
transgenik generasi T0 yang mempunyai ketahanan terhadap Begomovirus. Deteksi gen AV1 dengan PCR pada tanaman tembakau transgenik dilakukan
menggunakan primer spesifik untuk gen AV1-Begomovirus. Sedangkan untuk analisis Southern blot dilakukan dengan menggunakan pelacak probe untuk gen
AV1. Keefektifan gen AV1 pada tanaman tembakau transgenik diuji dengan skrining menggunakan virus target yang diinokulasikan dengan vektor kutu kebul.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat korelasi yang positif antara keberadaan atau integrasi gen AV1 Begomovirus pada tanaman tembakau
transgenik dengan fenotipe ketahanan terhadap infeksi virus. Integrasi gen AV1 yang bersifat kopi tunggal lebih tahan terhadap infeksi virus dibandingkan
integrasi gen yang multi-kopi. Ketahanan yang diperoleh dari ekspresi gen AV1 Begomovirus
diindikasikan dengan tidak adanya gejala dan akumulasi virus pada jaringan tanaman. Analisis hibridisasi Northern atau Western perlu dilakukan
untuk mengetahui ada tidaknya akumulasi mRNA atau protein, sehingga mekanisme ketahanan yang terjadi dapat dijelaskan lebih detail.
Kata kunci: Analisis molekuler, teknik PCR, Southern blot, gen AV1-
Begomovirus , tembakau transgenik
92
Abstract
Genetic transformation of tobacco plant using AV1 gene was conducted at the previously experiment and generated transgenic tobacco plants positively
carrying the selectable marker nptII gene. The objectives of this experiment were: 1 to analyze the presence of begomovirus AV1 gene in T0 generation putative
transgenic tobacco plants using PCR technique with specific primers and its correlation with resistance phenotype, 2 to analyze the integration and copy
number of the transgene in T0 generation putative transgenic tobacco plants and its correlation with resistance response, 3 to screen the T0 generation putative
transgenic tobacco plants with the target virus infection and to detect the presence of the virus in the transgenic plant tissue using universal primers. PCR detection
of AV1 gene in tobacco transgenic was conducted by using specific primer for Begomovirus AV1 gene. Meanwhile, Southern blot analysis was conducted by
using a AV1 gene probe. The effectiveness of AV1 gene in tobacco transgenic was tested by inoculation of target virus using Bemisia tabaci vector. Result of the
experiments showed that there was a positive correlation between the presence of the AV1 transgene in T0 generation putative transgenic tobacco plants and the
resistant phenotype. Transgenic plants with a single copy integration of the transgene exhibited more resistant than the multiple copy one. and non transgenic
plant. The resistance phenotype of AV1 gene expression was indicated with no symptom in T0 generation putative transgenic tobacco plants and the
accumulation of the virus in the transgenic plants tissue. Northern and Western hybridization analysis need to be perfomed for investigating the presence of
mRNA or protein accumulation so that the resistance mechanism of the AV1 gene could be explained more detail.
Keywords: molecular analysis, PCR technique, Southern blot, Begomovirus
AV1 gene, transgenic tobacco
93
Pendahuluan
Saat ini, penyakit keriting yang berasosiasi dengan infeksi Begomovirus telah menjadi ancaman yang cukup serius pada beberapa komoditas sayuran
seperti tomat dan cabai. Penyakit ini telah dilaporkan tersebar di banyak area produksi dua komoditas tersebut yang diindikasikan dengan teridentifikasinya
Begomovirus pada area-area tersebut Aidawati et al. 2005, Hidayat et al. 2006:
Santoso et al. 2008 belum dipublikasi. Teknik pengendalian penyakit keriting yang ada pada saat ini dirasakan belum efektif. Di samping karena memerlukan
biaya yang mahal, teknik yang ada terkadang tidak ramah terhadap lingkungan dan manusia. Penggunaan varietas tahan merupakan cara pengendalian yang
relatif lebih murah dan aman terhadap lingkungan. Namun demikian, sumber gen ketahanan terhadap penyakit keriting belum ditemukan di plasma nutfah baik
tanaman tomat maupun cabai. Berdasarkan kenyataan ini, pendekatan bioteknologi dapat membantu di dalam perakitan tanaman yang tahan terhadap
penyakit keriting ini. Ada dua pendekatan utama untuk pengembangan ketahanan genetik
terhadap virus yang tergantung pada sumber gen yang digunakan Dasgupta et al. 2003. Gen ketahanan dapat berasal dari virus itu sendiri atau berasal dari sumber
yang lain. Pendekatan yang pertama didasarkan pada konsep ketahanan yang berasal dari patogen pathogen-derived resistance, PDR. Pada pendekatan PDR
ini, bagian dari gen atau gen utuh dari virus diintroduksikan ke dalam tanaman, yang selanjutnya akan mempengaruhi satu atau beberapa tahap penting dalam
siklus hidup virus. Pemanfaatan gen selubung protein coat protein gene merupakan salah satu contoh dari pendekatan PDR ini Vidya et al. 2000;
Sinnisterra et al. 1999; Raj et al. 2005. Pendekatan yang kedua adalah ketahanan yang berasal bukan dari patogen non pathogen-derived resistance, tetapi
didasarkan pada pemanfaatan dari gen-gen ketahanan dari tanaman inang dan gen- gen lain yang bertanggungjawab untuk adaptasi tanaman inang dan respon
terhadap serangan patogen. Penggunaan tipe ketahanan non-PDR, diantaranya oleh Hanson et al. 2000, meskipun tidak sepopuler pendekatan PDR, telah
memberikan harapan yang besar untuk mengembangkan ketahanan yang durabel
94 dapat bertahan lama dan berkelanjutan.
Di dalam penelitian rekayasa genetik untuk menghasilkan tanaman transgenik biasanya melibatkan beberapa tahap dalam teknik biologi molekuler
atau seluler, salah satunya adalah karakterisasi atau identifikasi gen yang telah diintroduksi ke dalam jaringan tanaman Bennet, 1993. Keberhasilan teknik
transformasi genetik ditandai dengan keberhasilan menyisipkan rangkaian gen yang diintroduksikan ke dalam genom tanaman, dapat diekspresikan dan tetap
terpelihara dalam seluruh proses pembelahan sel berikutnya. Oleh karena itu, diperlukan upaya untuk mengkonfirmasi integritas gen yang diintroduksikan dan
menentukan jumlah kopi gen tersebut di dalam genom tanaman serta menentukan gen tersebut dapat berfungsi dengan benar. Identifikasi jaringan yang
tertransformasi dapat dilakukan dengan sejumlah teknik molekuler diantaranya adalah penggunaan teknik Polymerase Chain Reaction PCR Chee et al. 1991;
Nain et al. 2005 dan Southern blot Chee et al. 1991. Teknik PCR merupakan metode deteksi secara cepat untuk mengetahui keberadaan transgen di dalam
jaringan tanaman putatif transgenik. Selain itu, teknik Southern Blot juga merupakan teknik yang dapat digunakan untuk mendeteksi integrasi dan jumlah
kopi transgen yang terintegrasi. Beberapa penelitian rekayasa genetik untuk mendapatkan tanaman transgenik tahan virus selalu melibatkan teknik molekuler
PCR dan hibridisasi Southern untuk mendeteksi transgen yang diintroduksikan Pascal et al. 1993; Raj et al. 2005.
Pada percobaan sebelumnya, transformasi genetik tanaman tembakau dengan gen AV1-Begomovirus melalui vektor A. tumefaciens menghasilkan sekitar
1399 tanaman. Tanaman tembakau transgenik tersebut telah membawa gen ketahanan terhadap antibiotik kanamsin nptII. Namun demikian, analisis secara
molekuler untuk mendeteksi adanya gen AV1 pada tanaman tembakau transgenik putatif dan uji keefektifan dari gen tersebut untuk mendapatkan ketahanan
terhadap Begomovirus belum dilakukan. Oleh karena ini, perlu dilakukan analisis molekuler dan uji keefektifan dari gen AV1 terhadap Begomovirus dari tanaman-
tanaman tembakau transgenik putatif tersebut. Tujuan umum penelitian ini adalah untuk mendapatkan tanaman tembakau
transgenik T0 yang membawa gen AV1 dan tahan terhadap infeksi Begomovirus.
95 Tujuan khusus penelitian adalah i untuk menganalisis integrasi gen AV1 tanaman
tembakau transgenik putatif generasi T0 menggunakan teknik PCR, ii menentukan jumlah kopi dari transgen yang terintegrasi ke dalam genom
tembakau transgenik T0, iii menguji tanaman tembakau transgenik T0 yang membawa gen AV1 dengan infeksi Begomovirus.
Bahan dan Metode Isolasi DNA genom total tanaman tembakau transgenik putatif.
Isolasi DNA genom total tanaman temabakau transgenik putatif T0 menggunakan metode yang dikembangkan oleh Doyle Doyle 1990 yang telah
dimodifikasi dengan penambahan 2 polyvinil pyrolidone PVP. Sebanyak 3 g daun tanaman dilembutkan dan ditambahkan dengan 700
µl bufer ekstraksi 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1.4 M NaCl, 2 CTAB, 2 PVP, dan
0.2 Mercaptoetanol dan diinkubasi selama 15 menit pada penangas air 65 C.
Selanjutnya ditambahkan larutan fenol-kloroform-isoamilalkohol 25:24:1 vvv sebanyak 700
µl. Tabung dibolak-balik secara hati-hati selama 5 menit. Suspensi disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 12000 rpm. Supernatan diambil
dan ditambahkan dengan 110x volume 3M Natrium asetat dan 0.7x volume isopropanol dingin dan dibolak-balik perlahan-lahan. Untuk mengendapkan DNA
dilakukan sentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 12000 rpm. Endapan DNA dicuci dengan ethanol 70 dan disentrifugasi kembali selama 5 menit pada 12000
rpm. Setelah itu pelet DNA dikeringkan dan dilarutkan kembali dengan bufer TE 1x. Suspensi DNA yang sudah larut siap digunakan untuk cetakan dalam proses
PCR.
Amplifikasi gen AV1 pada tanaman transgenik tembakau dengan PCR
Amplifikasi gen AV1 pada genom tanaman tembakau transgenik putatif T0 dilakukan dengan menggunakan primer spesifik untuk gen AV1-Begomovirus.
Amplifikasi PCR dilakukan pada volume total reaksi 25 µl yang mengandung 2-5
ul DNA genomik cetakan, dNTPs dengan konsentrasi 25 µM, sepasang primer
spesifik masing-masing dengan konsentrasi 0,2 uM, MgCl
2
dengan konsentrasi
96 1,5 mM, enzim Taq DNA polymerase 0.15 unit dalam larutan bufer 1X. Setiap
reaksi dilakukan pada tabung mikro 200 ul. Reaksi amplifikasi dilakukan dengan program sebagai berikut: denaturasi awal pada suhu 94
C selama 5 menit sebanyak 1 siklus, denaturasi pada suhu 94
C selama 30 detik, penempelan primer pada suhu 55
C selama 1 menit, dan pemanjangansintesis DNA pada suhu 72
C selama 2 menit. Tahapan PCR diulang sebanyak 35 kali. Pada tahap terakhir proses PCR dilakukan pemanjangan akhir pada suhu 72
C selama 5 menit sebanyak 1 siklus. Selain DNA sampel, juga digunakan DNA plasmid pBI-CP
sebagai kontrol positif + dan DNA tanaman tembakau non transgenik serta air tanpa DNA cetakan masing-masing digunakan sebagai kontrol negatif -.
Setelah proses PCR selesai, sampel produk PCR dielektroforesis dengan gel agarosa.
Analisis Southern Blot untuk menentukan jumlah kopi transgen
Analisis Southern Blot dilakukan sesuai dengan prosedur dari Panaud et al. 1993. DNA genom total yang diisolasi dari tanaman transgenik, dipotong
dengan enzim restriksi HindIII kemudian dipisahkan dalam gel agarosa dan dipindah ke membran nylon Hybond N+. Proses hibridisasi dilakukan dengan
menggunakan pelacak gen AV1 yang telah dilabel dengan pelabel non radioaktif dig-11-UTP
. Membran kemudian divisualisasi dengan pewarnaan NBT-BCIP.
Bioasai tanaman transgenik dengan menginfeksi Begomovirus
Tanaman tembakau transgenik putatif generasi T0 yang ditanam pada polibag dipindahkan ke kurungan kedap serangga untuk penularan Begomovirus
menggunakan isolat Segunung. Virus ditularkan ke tanaman melalui vektor serangga kutu kebul Bemisia tabaci. Sebelumnya di dalam kurungan telah
ditempatkan tanaman sumber inokulum tanaman yang telah terinfeksi oleh Begomovirus
yang sudah diinfestasi dengan serangga kutu kebul. Tanaman tembakau dibiarkan selama 3-7 hari agar kutu kebul dapat menularkan virus ke
tanaman tersebut. Setelah itu tanaman dikeluarkan dan dihilangkan kutu kebulnya dengan aplikasi insektisida. Selanjutnya tanaman tembakau dipindahkan ke rumah
kaca dan diamati gejala yang muncul pada 2 minggu setelah inokulasi.
97
Pengamatan gejala tanaman tembakau terinfeksi oleh begomovirus
dilakukan dengan kategori: - tidak terinfeksi, tidak ada gejala yang muncul dan + terinfeksi, muncul gejala pada tanaman yang diindikasikan dengan adanya
mosaik atau penggulungan daun seperti kerupuk. Untuk mengetahui keberadaan Begomovirus dalam tanaman tembakau yang
telah dibioasai, maka dikonfirmasi dengan teknik PCR menggunakan primer universal. Isolasi DNA total tanaman yang terinfeksi virus dilakukan dengan
menggunakan metode yang dikembangkan oleh Doyle Doyle 1990 seperti yang telah dilakukan sebelumnya. Amplifikasi PCR untuk mendeteksi adanya
Begomovirus dilakukan sesuai dengan prosedur dari Rojas et al. 1993. dengan
total reaksi 25 µl mengandung 2-5 ul DNA genomik cetakan dan sepasang primer
universal yaitu primer PAL1v1978 dan PAR1c715. Keberadaan Begomovirus dalam jaringan tanaman tembakau transgenik setelah bioasai diindikasikan dengan
teramplifikasinya fragmen DNA berukuran 1500 bp.
Hasil Analisis PCR untuk mendeteksi gen AV1
Analisis molekuler menggunakan teknik PCR dengan primer spesifik gen
AV1 dilakukan untuk mendeteksi keberadaan gen yang diinginkan di dalam jaringan tanaman yang ditransformasi. Di samping digunakan untuk mendeteksi
keberadaan transgen, analisis PCR juga dapat digunakan untuk skrining awal secara cepat terhadap tanaman hasil transformasi yang membawa transgen. Hasil
analisis PCR pada 46 tanaman tembakau transgenik putatif generasi T0 menggunakan primer spesifik gen AV1 menunjukkan bahwa terdapat 35 tanaman
yang mengandung gen AV1 Gambar 24. Hal tersebut diindikasikan dengan terbentuknya pita DNA berukuran 780 bp. Persentase tanaman yang positif PCR
mengandung gen AV1 dibandingkan dengan tanaman yang dianalisis adalah sebesar 76,1. Pada kedua kontrol negatif yang digunakan tanaman tembakau
yang tidak ditransformasi dan air tidak menunjukkan adanya pita tersebut.
98 Gambar 24 Deteksi PCR gen AV1 pada 46 tanaman tembakau transgenik putatif
generasi T0 menggunakan primer spesifik. 1-46=sampel tanaman tembakau transgenik putatif generasi T0, K-=tanaman tembakau non
transforman, A=Air, P=Plasmid, M=1 Kb plus ladder In vitrogen
Bioasai tanaman tembakau transgenik dengan Begomovirus
Bioasai dilakukan terhadap 46 tanaman transgenik putatif generasi T0 dengan
menginokulasi tanaman-tanaman
tersebut dengan
Begomovirus menggunakan vektor serangga kutu kebul Gambar 25. Bioasai dari 46 tanaman
14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 K- A P M
Gen AV1 780 bp
1000 bp 850
650 500
100
27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 K- A P M
Gen AV1 780 bp
1000 bp 850
650 500
100
Gen AV1 780 bp
1000 bp 850
650 500
100
40 41 42 43 44 45 46 K- A P M 1 2
3 4
5 6 7 8
9 10 11 12 13 K- A P M
Gen AV1 780 bp
1000 bp 850
650 500
100
99 transgenik putatif generasi T0 dengan Begomovirus di rumah kaca menunjukkan
adanya variasi respon setelah inokulasi Tabel 8. Sebanyak 15 tanaman tembakau transgenik putatif positif menunjukkan gejala terinfeksi Begomovirus dan ada 2
tanaman yang mati sebelum dilakukan pengamatan. Untuk melihat korelasi hasil bioasai dengan hasil PCR dari masing-masing individu tanaman tembakau
transgenik putatif maka kedua hasil pengujian dibandingkan. Terdapat kecenderungan bahwa tanaman tembakau yang positif PCR tidak menunjukkan
adanya gejala terinfeksi Begomovirus Tabel 8. Tabel 8 Deteksi PCR gen AV1 dan bioasai tanaman tembakau transgenik putatif
generasi T0 dengan Begomovirus di rumah kaca
No. Kode tanaman
Hasil PCR
Hasil bioasai
No. Kode tanaman Hasil
PCR Hasil
Bioasai 1.
CP8II.1.2.1 -
+ 27.
CP8II.1.3.1 +
- 2.
CP11I.2.1.3 +
- 28.
CP8II.1.3.2 +
- 3.
CP11I.2.4.1.A +
- 29.
CP8II.2.1.1 +
+ 4.
CP11I.2.4.1.B -
mati 30.
CP8II.2.3.1 +
- 5.
CP11I.3.2.1 +
- 31.
CP8II.2.3.2 -
+ 6.
CP11I.4.2 +
+ 32.
CP8II.5.1.1 +
- 7.
CP11I.4.2.2 +
- 33.
CP8II.5.1.2 -
+ 8.
CP11I.4.3.1 +
- 34.
CP8II.13.1.1 +
+ 9.
CP11I.4.3.2 +
- 35.
CP8II.13.2.1 +
- 10.
CP8II.1.1 -
+ 36.
CP8II.13.3.1 +
- 11.
CP8II.1.3.1 +
- 37.
CP8II.14.1.1 +
- 12.
CP8II.4.1 +
- 38.
CP8II.1.5.x +
+ 13.
CP8II.4.1.2 +
mati 39.
CP8III.2.3.1 +
- 14.
CP8II.4.2 +
- 40.
CP8III.3.1.1 +
- 15.
CP8III.1.4.2 +
- 41.
CP8III.3.1.2 +
- 16.
CP8III.2.1.1 +
- 42.
CP8III.3.3.1 +
- 17.
CP8III.2.1.2 -
+ 43.
CP8III.3.3.2 +
- 18.
CP8III.2.4.1 -
- 44.
CP8III.11.1.1 -
- 19.
CP8III.3.2.1 +
- 45.
CP11IV.5.1.1 +
- 20.
CP8III.7.1.1 -
+ 46.
CP11IV.9.1.1 +
- 21.
CP11I.2.1.1 +
+ 47.
Kontrol 1 -
+ 22.
CP11I.2.1.2 -
+ 48.
Kontrol 2 -
+ 23.
CP11I.2.2.2 +
+ 49.
Kontrol 3 -
+ 24.
CP11I.3.4.1 +
- 50.
Kontrol 4 -
+ 25.
CP11I.6.1.1 -
+ 51.
Kontrol 5 -
+ 26.
CP11I.6.3.1 +
+ Hasil PCR: +=menghasilkan fragmen DNA berukuran 780 bp,
−=tidak menghasilkan
Hasil bioasai: +=muncul gejala terinfeksi Begomovirus, −=tidak muncul gejala
mati=tanaman mati sebelum dilakukan pengamatan
100 Proses penularan virus dilakukan dengan menempatkan sampel tanaman
ke dalam suatu kurungan yang di dalamnya sudah ada tanaman yang sakit terinfeksi virus dan serangga kutukebul sebagai vektor untuk menularkan
Gambar 25a dan 25b. Indikasi tanaman tembakau yang terinfeksi oleh begomovirus adalah munculnya gejala yang diawali dengan mosaik pada daun
dan selanjutnya helaian daun akan menggulung, bergelombang tidak beraturan seperti bentuk kerupuk Gambar 25c-f.
Gambar 25 Bioasai tanaman tembakau transgenik menggunakan vektor serangga kutukebul: a Proses penularan virus oleh vektor kutu kebul pada
kurungan kedap serangga, b Kutu kebul yang menempel pada daun tanaman untuk menularkan virus tanda panah, c Gejala yang mulai
muncul pada daun muda setelah inokulasi virus 2 minggu setelah inokulasi, d Penampilan tanaman tembakau yang tahan dan rentan
setelah inokulasi virus, e dan f Gejala infeksi virus pada daun tembakau yang menyerupai sepeti kerupuk
a a
b
c d
e f
Tahan Rentan
101 Tabel 9 Kategori respon tanaman tembakau transgenik putatif setelah dianalisis
PCR dan bioasai
Kategori Analisis PCR
Bioasai Jumlah tanaman
1 +
- 28
2 +
+ 7
3 -
+ 8
4 -
- 3
Kontrol -
+ 5
Hasil PCR: +=menghasilkan fragmen DNA berukuran 780 bp, -=tidak menghasilkan Bioasai: +=menunjukkan gejala terinfeksi Begomovirus, -=tidak menunjukkan
Berdasarkan hasil analisis PCR dan bioasai, respon tanaman tembakau transgenik putatif generasi T0 dapat dibedakan menjadi empat kategori Tabel 9.
Kategori 1 adalah respon tanaman yang tidak menunjukkan gejala 28 tanaman dan positif PCR, kategori 2 adalah respon tanaman yang menunjukkan gejala dan
positif PCR 7 tanaman, kategori 3 adalah respon tanaman yang menunjukkan gejala dan negatif PCR 8 tanaman, dan kategori 4 adalah respon tanaman yang
tidak menunjukkan gejala dan negatif PCR 2 tanaman. Pada kontrol, semuanya menunjukkan gejala dan negatif PCR 5 tanaman.
Analisis Southern Blot dan Konfirmasi Keberadaan Virus
Teknik Southern blot digunakan untuk mengetahui keberadaan atau integrasi dari transgen yang diintroduksikan, dan juga digunakan untuk
menentukan jumlah kopi dari transgen yang terintegrasi ke dalam genom tanaman tembakau. Hasil analisis Southern blot pada tanaman transgenik tembakau
menggunakan pelacak gen AV1 menunjukkan bahwa dari 11 tanaman transgenik putatif generasi T0 yang diuji, diperoleh 5 tanaman yang menunjukkan integrasi
gen dengan kopi tunggal dan 6 tanaman mempunyai integrasi gen lebih dari satu kopi atau multi kopi Gambar 26. Lima tanaman tembakau transgenik yang
mempunyai kopi tunggal adalah tanaman no. 2, 24, 27, 32 dan 35, sedangkan 6 tanaman dengan integrasi multi-kopi adalah tanaman no. 21, 23, 26, 34, 45 dan
46. Dua tanaman tembakau hasil transformasi generasi T0 yang negatif ketika dilakukan analisis PCR tanaman no. 10 dan 20 juga disertakan dalam analisis
Southern Blot . Kedua tanaman tersebut juga tidak menunjukkan adanya pita DNA
102 setelah hibridisasi dengan pelacak gen AV1. Demikian juga dengan dua tanaman
yang tidak ditransformasi NT, pita DNA tidak dihasilkan. Untuk kontrol positif P berupa plasmid yang mengandung gen AV1, menghasilkan satu pita DNA.
Hasil deteksi keberadaan Begomovirus dengan teknik PCR pada beberapa sampel
tanaman tembakau transgenik menggunakan primer universal menunjukkan pita DNA spesifik Gambar 27. Virus terdeteksi pada enam
tanaman yaitu sampel tanaman no 21, 23, 26, 34, 35 dan 45. Sedangkan pada tanaman no. 2, 24, 27, 32, dan 46, virus tidak berhasil terdeteksi. Sebagai kontrol
disertakan tiga tanaman yang terdiri dari tanaman yang tidak ditransformasi, tetapi diinfeksi dengan virus NT-I, tanaman yang tidak ditansformasi tetapi tidak
diinfeksi oleh virus NT-NI dan tanaman yang terinfeksi oleh Begomovirus K+. Dari ketiga tanaman kontrol, tanaman NT-I terdeteksi adanya virus di dalam
jaringan tanaman. Pada tanaman NT-NI tidak terdeteksi adanya virus di dalam jaringan sementara untuk tanaman K+ terdeteksi dengan jelas.
Gambar 26 Analisis hibridisasi Southern Blot pada sampel tanaman tembakau
trasngenik putatif generasi T0 yang positif PCR dan 2 tanaman yang negatif PCR no.10 20 dengan pelacak gen AV1. NT=tanaman
non transformasi, P=Plasmid dan M=1 Kb plus ladder. A. Hasil analisis Southern blot yang asli, B. Hasil analisis Southern blot
replika
A
B
2 21 23 24 26 27 32 34 35 45 46 10 20 NT NT P
M
12,0 kb 4,0
3,0 2,0
1,6 1,0
2 21 23 24 26 27 32 34 35 45 46 10 20 NT NT P
M
12,0 kb 4,0
3,0 2,0
1,6 1,0
103 Dari data analisis PCR, bioasai, Southern blot dan keberadaan virus dari
tanaman-tanaman tembakau transgenik generasi T0 maka dapat ditentukan hubungan antara data-data dari keempat parameter tersebut Tabel 10. Dari
hubungan antar parameter ini maka akan dapat ditentukan tingkat ketahanan
tanaman tembakau transgenik generasi T0 terhadap infeksi Begomovirus.
Gambar 27 Deteksi keberadaan begomovirus dengan teknik PCR menggunakan
primer universal pada tanaman tembakau transgenik generasi T0 setelah bioasai. Sampel tanaman diindikasikan dengan nomor. NT-
I=Tanaman non transgenik yang diinokulasi virus, NT-NI=Tanaman non transgenik yang tidak diinokulasi, K+=Tanaman terinfeksi virus,
A=Air dan M=1 Kb ladder In vitrogen.
Tabel 10 Hubungan antara analisis PCR, bioasai, jumlah kopi dan keberadaan virus target dalam tanaman transgenik
No. Kode tanaman
PCR Bioasai
Jumlah kopi Adatidaknya
virus Kategori
1. 2 CP11I.2.1.3
+ -
1 satu -
Tahan 2.
21 CP11I.2.1.1 +
+ 3 tiga
+ Rentan
3. 23 CP11I.2.2.2
+ +
2 dua +
Rentan 4.
24 CP11I.3.4.1 +
- 1 satu
- Tahan
5. 26 CP11I.6.3.1
+ +
4 empat +
Rentan 6.
27 CP8II.1.3.1 +
- 1 satu
- Tahan
7. 32 CP8II.5.1.1
+ -
1 satu -
Tahan 8.
34 CP8II.13.1.1 +
+ 2 dua
+ Rentan
9. 35 CP8II.13.2.1
+ -
1 satu +
Toleran 10.
45 CP11IV.5.1.1 +
- 2 dua
+ Toleran
11. 46 CP11IV.9.1.1
+ -
4 empat -
Rentan
PCR: +=menghasilkan fragmen DNA berukuran 780 bp, -=tidak menghasilkan Bioasai: +=menunjukkan gejala terinfeksi Begomovirus, -=tidak menunjukkan
Adatidaknya virus: +=menghasilkan fragmen DNA spesifik berukuran 1500 bp,
-=tidak menghasilkan fragmen DNA
2 21 23 24 26 27 32 34 35 45 46 N
T -I
N T
-N I
K+ A M
104
Pembahasan
Untuk mempelajari ekspresi gen AV1 yang menyandikan protein selubung di dalam hubungannya dengan ketahanan terhadap penyakit keriting daun yang
disebabkan oleh infeksi Begomovirus maka gen AV1 diintroduksikan ke dalam genom tanaman tembakau yang bertindak sebagai tanaman model. Informasi
mengenai integrasi dan jumlah kopi serta uji ekspresi gen AV1 pada tanaman model ini diharapkan akan diketahui keefektifan gen tersebut untuk
mengendalikan penyakit keriting daun yang disebabkan oleh infeksi virus sehingga gen tersebut dapat digunakan untuk pengembangan varietas tomat atau
cabai yang tahan terhadap Begomovirus. Pemanfaatan gen-gen virus untuk mendapatkan sifat ketahanan telah dilakukan oleh beberapa peneliti, diantaranya
adalah gen BL1 dari Begomovirus bipartite yang menyandikan movement protein Pascal et al. 2003, gen AV2 dari Begomovirus monopartit yang menyandikan
movement protein Mubin et al. 2007, gen CP dari Tobamovirus Bendahmane et
al . 1997.
Analisis PCR untuk mengidentifikasi transgen menggunakan primer spesifik gen AV1 terhadap 46 tanaman transgenik putatif tembakau T0
menunjukkan bahwa diperoleh sebanyak 35 tanaman yang positif mengandung gen AV1 yang diindikasikan oleh teramplifikasinya fragmen DNA berukuran 780
bp Gambar 24. Ini berarti bahwa dari 46 calon tanaman tembakau transgenik yang lolos seleksi dengan antibiotik kanamisin 100 mgl tidak semuanya
mengandung gen AV1. Jadi, sebanyak 11 tanaman bukan merupakan tanaman transgenik namun tanaman yang escape atau terhindar dari faktor seleksi
kanamisin selama proses regenerasi secara in vitro. Skrining dengan Begomovirus menunjukkan adanya korelasi yang positif
antara keberadaan gen AV1 dalam tanaman dengan respon ketahanan meskipun korelasi tersebut tidak menunjukkan angka 100. Tanaman tembakau transgenik
yang positif PCR membawa gen AV1 sebagian besar memberikan respon tahan ketika tanaman-tanaman tersebut diinokulasi dengan Begomovirus dibandingkan
dengan tanaman yang bukan transgenik. Dari 35 tanaman yang positif PCR diperoleh 28 tanaman tidak menunjukkan gejala terinfeksi oleh Begomovirus
Tabel 8. Tujuh tanaman yang positif PCR namun menunjukkan adanya gejala
105 diduga disebabkan oleh tidak efektifnya gen AV1 yang telah terintegrasi ke dalam
genom tanaman dan disebut dengan istilah pembungkaman gen gene silencing. Pada penelitian ini juga diamati adanya tanaman-tanaman yang tidak membawa
gen AV1 analisis PCR-nya negatif menunjukkan gejala ketika terinfeksi oleh virus. Namun, terdapat 3 tanaman yang tidak positif PCR memberikan respon
negatif yaitu tidak terdeteksi adanya gejala terinfeksi virus. Hal ini diduga disebabkan oleh tidak terjadinya proses penularan virus oleh serangga kutukebul
pada ketiga tanaman tersebut. Salah satu kelemahan teknik bioasai dalam penelitian ini adalah proses penularan virus sangat tergantung dari mobilitas
serangga kutukebul yang diinfestasikan, sehingga kemungkinan tidak terjadinya proses infeksi virus oleh kutukebul atau escape bisa terjadi.
Analisis jumlah kopi dengan teknik Southern blot mengindikasikan bahwa integrasi gen AV1 menggunakan vektor A. tumefaciens pada tanaman tembakau
dapat terjadi hanya satu kopi atau lebih Gambar 26. Korelasi jumlah kopi gen AV1
dengan respon gejala mengindikasikan bahwa tanaman dengan integrasi gen hanya satu kopi mempunyai respon tidak menunjukkan gejala ketika diinokulasi
virus. Hasil ini didukung oleh analisis deteksi keberadaan virus dengan PCR pada tanaman-tanaman tersebut dimana tidak terdeteksi adanya fragmen DNA spesifik
dari Begomovirus, sehingga dikateorikan sebagai tanaman tahan Gambar 27, Tabel 10. Sebaliknya, tanaman dengan integrasi gen AV1 lebih dari satu kopi
menunjukkan adanya gejala terinfeksi virus dan didukung oleh terdeteksinya Begomovirus
dalam tanaman sehingga dikategorikan rentan Gambar 27, Tabel 10. Jumlah kopi gen lebih dari satu diduga akan menginduksi terjadinya
pembungkaman gen gene silencing sehingga transgen menjadi tidak terkespresi dan tanaman menjadi tidak tahan serta virus dapat berkembang di dalam tanaman.
Pembungkaman gen yang disebabkan oleh adanya transgen multikopi kemungkinan berhubungan dengan fenomena homology-dependent gene silencing
dimana tidak terkespresinya satu atau lebih gen karena adanya kesamaan susunan nukleotida homologi Meyer Saedler 1996. Namun demikian, dugaan ini
mungkin tidak terjadi pada sampel no 46 dimana tanaman mempunyai gen sebanyak 4 kopi namun tidak memperlihatkan respon gejala dan tidak ditemukan
adanya virus di dalam jaringan tanaman. Kemungkinan ada mekanisme lain pada
106 tanaman tersebut sehingga tanaman menjadi tahan meskipun integrasinya lebih
dari satu. Pada penelitian ini juga diamati adanya sampel tanaman nomor 45 dengan integrasi gen AV1 multikopi 2 kopi gen dan tidak menunjukkan gejala
namun terdeteksi adanya virus di dalam jaringan tanaman tersebut. Hal ini diduga berhubungan dengan adanya respon toleran atau penyembuhan recovery dari
tanaman tersebut. Gen-gen protein selubung dari virus telah dimanfaatkan secara luas di
dalam teknik rekayasa genetik untuk perakitan tanaman tahan virus dengan genom RNA Bendahmane et al. 1997; Chowrira et al. 1998; Srivastava Raj 2008.
Penelitian untuk memperoleh ketahanan terhadap Begomovirus menggunakan gen protein selubung juga telah dilakukan Kunik et al. 1994 dan hasil penelitian
menunjukkan bahwa ketahanan terhadap TYLCV berasosiasi dengan keberadaan dari produk transgen tersebut. Ketahanan yang diperoleh diindikasikan dengan
tidak adanya keparahan gejala dan akumulasi virus pada jaringan tanaman. Pada penelitian ini, tanaman tembakau transgenik yang tahan Begomovirus
mengindikasikan adanya fenomena yang sama seperti penelitian sebelumnya. Gen protein selubung yang digunakan dalam penelitian ini merupakan gen yang
dikonstruksi secara utuh full-length. Berdasarkan pola hubungan antara analisis PCR, bioasai, jumlah kopi dan keberadaan virus di dalam jaringan tanaman
terlihat bahwa tanaman tembakau transgenik yang mengandung gen AV1 yang terintegrasi satu kopi memperlihatkan respon tahan yang diindikasikan dengan
tidak adanya gejala yang terdeteksi dan akumulasi virus pada jaringan. Hal ini berbeda dengan ketahanan mendasarkan pada RNA RNA-mediated resistance
dimana ketahanan ini sering berasosiasi dengan adanya integrasi multi-kopi dari transgen atau pengulangan tandem dari transgen Sijen et al. 1996. Berdasarkan
hal ini maka mekanisme ketahanan pada penelitian ini diduga bukan ketahanan yang mendasarkan pada RNA namun berasosiasi dengan keberadaan produk dari
gen AV1. Jadi gen AV1 terintegrasi ke dalam genom tanaman tembakau dan mengekspresikan
protein selubung
terbentuk produk
protein yang
mempengaruhi siklus hidup dari virus dan tanaman memberikan respon ketahanan. Dengan kata lain bahwa gen AV1 terekspresi ke dalam tanaman dan
terjadi akumulasi protein pembungkus sehingga ketika terjadi infeksi, virus akan
107 dibungkus oleh protein pembungkus tersebut dan virus tidak dapat berkembang.
Mekanisme ketahanan ini berperan pada tingkat awal proses replikasi virus dengan menghalangi proses replikasi secara tidak terkendali dari partikel virus
Aswidinnoor 1995. Namun demikian, mekanisme ketahanan ini masih perlu dibuktikan lebih lanjut dengan melakukan analisis hibridisasi Northern atau
Western untuk mempelajari ada tidaknya akumulasi mRNA atau protein, sehingga
mekanisme ketahanan yang terjadi dapat dijelaskan lebih detail.
Simpulan
1. Telah diperoleh tanaman-tanaman tembakau transgenik yang membawa gen
AV1 Begomovirus berdasarkan amplifikasi PCR
2. Analisis hibridisasi Southern blot menunjukkan bahwa integrasi gen AV1 pada
genom tanaman tembakau yang bersifat satu kopi atau multi-kopi. Tanaman dengan integrasi gen satu kopi menunjukkan respon tahan terhadap infeksi
virus dibandingkan integrasi gen yang multi-kopi. 3.
Ketahanan yang diperoleh dari ekspresi gen AV1 Begomovirus pada tanaman tembakau transgenik diindikasikan dengan tidak adanya gejala dan akumulasi
virus pada jaringan tanaman.
Daftar Pustaka
Aidawati N, Hidayat SH, Suseno R, Hidayat P, Sujiprihati S. 2005. Identifikasi geminivirus yang menginfeksi tomat berdasarkan pada teknik Polymerase
Chain Raction-Restriction Fragment Length Polymorphism . J Mikrobiol
Indones 10:29-32 Aswidinnoor, H. 1995. Transformasi gen: sumber baru keragaman genetik dalam
pemuliaan tanaman . Zuriat. Vol. 6. No. 2:56-65. Bendahmane M, Fitchen JH, Zhang G, Beachy RN. 1997. Studies of coat protein-
Mediated Resistance to tobacco mosaic Tobamovirus: Correlation between assembly of mutant coat proteins and resistance. J Virol 7110: 7942-
7950
Bennet J. 1993. Genes for crop improvements. Genet. Eng. 16 : 93-113 Chee PP, Drong RF, Slightom. 1991. Using polymerase chain reaction to identify
transgenic plant. Plant Mol Biol Manual C3:1-28 Chowrira GM, Cavileer TD, Gupta SK,Lurquin PF, Berger PH. Coat protein-
mediated resistance to pea enation mosaic virus in transgenic Pisum sativum
L. Transg Res 7:265-271
108 Doyle JJ, Doyle JL. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12: 13-
15 Dasgupta I, Malathi VG, Mukherjee. 2003. Genetic engineering for virus
resistance. Current Scim 83: 341-354
Hidayat SH, Chatchawankanpanich O, Rusli E, Aidawati N. 2006. Begomovirus
associated with pepper yellow leaf curl disease in west Java, Indonesia. J Indon Microbiol 11 2: 87-90
Kunik T, Salomon R, Zamair D, Zeidan M, Michelson L, Gafni Y, Czosnek H. 1994. Transgenic tomato plants expressing the tomato yellow leaf curl
virus capsid protein are resistant to the virus. BioTech 12:500-504
Meyer P, Saedler H. 1996. Homology-dependent gene silencing in plants. Ann Rev Plant Physiol Mol Biol.
47:23-48 Mubin M, Mansoor S, Hussain M, Zafar Y. 2007. Silencing of the AV1 gene by
antisense RNA protects transgenic plants against a bipartite begomovirus. Virol J
410:1-4 Nain V, Jaiswal R, Dalal M, Ramesh B, Kumar PA. 2005. Polymerase Chain
Reaction Analysis of Transgenic contaminated by Agrobacterium. Plant Mol Biol Rep
23:59-65 Panaud O, Magpantay G, McCouch SR. 1993. A protocol for non-radioactive
DNA labelling and detection in the RFLP analysis of rice and tomatoes using single copy probes. Plant Mol Biol. 111
Pascal E, Goodlove PE, Wu LC, Lazarowitz. 1993. Transgenic tobacco plants expressing the Geminivirus BL1 protein exhibit symptoms of viral disease.
Plant Cell 5: 795-807
Raj SK, Singh R, Pandey SK and Singh BP. 2005. Agrobacterium-mediated tomato transformation and regeneration of transgenic lines expressing
Tomato leaf curl virus coat protein gene for resistance against TLCV infection. Current Sci 88 10: 1674-1679
Rojas MR, Gilbertson RL, Russel DR, Maxwell DP. 1993. Use of degenerate primers in the polymerase chain reaction to detect whitefly-transmitted
geminivirus. Plant Dis 77:340-347 Sinisterra XH, Polston JE, Abourized AM, Hiebert E. 1999. Tobacco plants
transformed with a modified coat protein of tomato mottle Begomovirus show resistance to virus infection. Phytopathol 89:701-706
Srivastava A, Raj SK. 2008. Coat protein-mediated resistance against an Indian isolates of the Cucumber mosaic virus subgroup IB in Nicotiana
benthamiana . J Biosci 33:00-00
Vidya CSS, Manoharan M, Kumar CTR, Savithri HS, Sita GL. 2000. Agrobacterium-mediated
transformation of
tomato Lycopersicon
esculentum var. Pusa Ruby with coat protein gene of Physalis mottle
tymovirus. J Plant Physiol 156: 106-110
109
VIII. PENDEKATAN KONVENSIONAL UNTUK KETAHANAN TOMAT TERHADAP BEGOMOVIRUS YANG DIKOMBINASIKAN