SELEKSI IN VITRO TUMBUHAN ANDALAS (Morus macroura Miq.) YANG TOLERAN TERHADAP CEKAMAN KEKERINGAN MENGGUNAKAN POLIETILENA GLIKOL (PEG).

ARTIKEL ILMIAH

HIBAH STRATEGIS NASIONAL

SELEKSI IN VITRO TUMBUHAN ANDALAS (Morus macroura Miq.) YANG TOLERAN TERHADAP CEKAMAN KEKERINGAN

MENGGUNAKAN POLIETILENA GLIKOL (PEG)

Oleh

Drs. Suwirmen, MS

Dra. Zuraida Dawair, MSi

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENEGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS ANDALAS

SELEKSI IN VITRO TUMBUHAN ANDALAS (Morus macroura Miq.) YANG TOLERAN TERHADAP CEKAMAN KEKERINGAN MENGGUNAKAN

POLIETILENA GLIKOL (PEG)

Suwirmen dan Zuraida Dawair Laboratorium Fisiologi Tumbuhan,

Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Andalas, Padang – Sumatera Barat

Abstrak

Penelitian tentang seleksi in vitro tumbuhan Andalas (Morus macroura Miq.) yang toleran terhadap cekaman kekeringan menggunakan Polietilena Glikol (PEG) telah dilakukan dengan memanfaatkan daun dan tunas sebagai sumber eksplan yang berasal dari hasil perbanyakan secara in vitro. Induksi kalus eksplan daun yang toleran cekaman kekeringan dilakukan pada media MS + 2,0 mg/L BAP + 1,0 mg/L NAA dengan penambahan 1,0-4,0% PEG. Kemampuan eksplan tunas membentuk tunas aksilar akibat cekaman kekeringan 1,0-3,0% PEG diuji pada media MS + 1,0-3,0 mg/L BAP. Induksi perakaran tunas toleran cekaman kekeringan dilakukan pada media MS setengah komposisi + 2 g/L arang aktif yang mengandung 0,0-4,0% PEG. Kemampuan pembentukan kalus, perbanyakan tunas aksilar dan pembentukan serta pertumbuhan akar diamati pada akhir perlakuan. Analisis kandungan prolina dilakukan sebagai salah satu parameter dalam menilai cekaman kekeringan pada eksplan.

Hasil penelitian memberikan gambaran bahwa eksplan daun mampu menginisiasi pembentukan kalus dengan peningkatan konsentrasi PEG maksimal 3%. Multiplikasi tunas aksilar pada sampel tunas tidak dapat berlangsung dengan baik akibat adanya 1-3% PEG pada media yang menghalangi penyerapan BAP. Induksi pembentukan dan pertumbuhan akar terhambat akibat adanya 1-4% PEG pada media dimana semakin tinggi konsentrasi PEG semakin sedikit akar yang dihasilkan dan tunas mengalami kekerdilan. Kandungan prolina meningkat seiring dengan peningkatan cekaman kekeringan yang diberikan oleh 0-4% PEG pada media

IN VITRO SELECTION OF ANDALAS PLANT (Morus macroura Miq.) WHICH TOLERANT TO DROUGHT STRESS USING POLYETYLENE GLYCOL (PEG)

Suwirmen and Zuraida Dawair Plant Physiology Laboratory

Biology Department, Faculty of Mathematic and Natural Science Andalas University, Padang – West Sumatera

Abstract

The research about in vitro selection of Andalas plant (Morus macroura Miq.) which tolerant to drought stress using polyethylene glycol (PEG) had been done by using leaves and shoots from in vitro propagation explants. Callus initiation tolerant to drought stress from leaves explant planted in MS medium supplemented with 2 mg/L BAP and 1 mg/L NAA by addition of 1-4% PEG. The ability of of shoots explant to formed axillary shoots caused by drought stress 1-3% PEG observed in MS medium supplemented with 1-3 mg/L BAP. Root induction from shoots tolerant to drought stress planted in half composition of MS medium supplemented with 2 g/L active carbon and 0-4% PEG. Callus initiation, axillary shoots multiplication, formation and growth of roots observed in the last observation. Analyzing of Proline content as a parameter for assested drought stress in explants.

The result shows that leaves explants can initiated callus initiation by increasing PEG concentration maximum 3%. Axillary shoots multiplication on shoots explant can not growth well done due to the addition of 1-3% PEG in medium which can inhibited BAP absorbtion. Induction and growth of Roots being inhibited by addition of 1-4% PEG into medium which is higher concentration of PEG caused dwarf shoots and less root formed. Proline contain increased as increasing of drought stress by addition of 0-4% PEG into the medium.

1. Pengantar

Tumbuhan Andalas (Morus macroura Miq.) merupakan tumbuhan identitas (maskot flora) daerah Sumatera Barat. Pemilihan jenis ini sebagai maskot flora erat kaitannya dengan peranannya dalam kehidupan dan budaya masyarakat Minang. Dahulunya tiang rumah gadang (rumah adat) dibuat dari bahan kayu Andalas, karena kayu ini dikenal berkualitas baik, kuat dan tahan terhadap rayap dan tingginya dapat mencapai 30 meter lebih. Tumbuhan Andalas juga merupakan tumbuhan langka Indonesia yang hanya tersebar di wilayah Sumatera Barat (Dahlan, 1994). Selain itu, tumbuhan ini juga memiliki kandungan metabolit yang berguna sebagai senyawa anti mikroba dan anti tumor serta potensinya sebagai anti leukemia (Achmad et al, 2001).

Perbanyakan tumbuhan Andalas secara in vitro telah berhasil dilakukan dengan memanfaatkan eksplan tunas pucuk. Suwirmen (2007) telah melakukan inisiasi, multiplikasi dan induksi perakaran terhadap eksplan tunas pucuk Andalas dimana penambahan 0,5-1,5 mg/L BAP mampu menginisiasi pertumbuhan tunas pucuk, 3 mg/L BAP mampu memacu multiplikasi tunas dan media dasar MS dengan setengah komposisi dasar mampu memacu induksi dan pertumbuhan akar secara in vitro.

Peningkatan mutu plantlet Andalas yang dihasilkan secara in vitro amat penting dilakukan karena potensi yang dimilikinya agar mampu bertahan pada lingkungan yang ekstrim dilapangan terutama terhadap cekaman kekeringan. Teknik seleksi cekaman kekeringan secara in vitro merupakan alternatif peningkatan mutu planlet Andalas seperti yang telah dilakukan terhadap jenis Morus alba.

Secara in vitro, polietilena glikol (PEG) merupakan senyawa yang banyak dimanfaatkan dalam uji peningkatan toleransi tumbuhan terhadap cekaman kekeringan. PEG merupakan polimer netral yang mudah larut dalam air dengan tingkat toksisitas yang sangat rendah atau tidak ada sama sekali bagi tumbuhan karena tidak diserap oleh akar. PEG memberikan efek menurunkan potensial air media tumbuh dan juga potensial air jaringan tumbuhan (Lawlor, 1970).

Dragiiska, Djilianov, Denchev dan Atanassov (1996) menggunakan PEG pada taraf 5-10% untuk seleksi in vitro cekaman kekeringan pada Alfalfa (Medicago sativa). Tirtoboma (1997) melakukan seleksi in vitro terhadap kalus kopi robusta yang toleran terhadap cekaman air pada konsentrasi PEG 0-10%. Tewary, Sharma, Raghunath dan Sarkar (2000) menggunakan PEG pada konsentrasi 5-10% dalam seleksi cekaman kekeringan varietas Morus alba.

Berdasarkan hal diatas dapat dilihat bahwa tumbuhan Andalas memiliki potensi yang sangat besar untuk dikembangkan menjadi tanaman industri melalui peningkatan toleransinya

terhadap kondisi ekstrim dilapangan terutama cekaman kekeringan pada lahan tandus. Melalui penelitian ini diharapakan mampu diperoleh klon-klon tumbuhan Andalas yang toleran terhadap cekaman kekeringan dengan menggunakan senyawa PEG sebagai agen pengatur cekaman kekeringan secara in vitro.

2. Bahan dan Metode

Penelitian dilakukan secara eksperimen dan menggunakan rancangan acak lengkap. Analisis data dilakukan secara deskriptif karena kemungkinan adanya sampel perlakuan yang mengalami kematian, tidak tumbuh yang menyebabkan data tidak bisa dianalisis secara statistik.

Persiapan Media Kultur

Media kultur yang dipakai pada penelitian ini adalah medium dasar Murashige-Skoog (MS), penambahan sukrosa dan agar sesuai dengan perlakuan yang diberikan pada tahapan penelitian. Pada medium ditambahkan zat pengatur tumbuh berupa KIN, BAP, NAA dan 2,4-D sesuai dengan perlakuan. Keasaman media kultur diatur hingga mencapai pH 5,5 ± 0,5.

Medium kultur kemudian dituang kedalam botol-botol kultur steril sebanyak 25 mL/botol dan ditutup dengan aluminum foil serta kertas penutup. Mulut botol diikat dengan karet gelang untuk memastikan keamanan medium pada botol kultur. Medium pada botol-botol kultur disterilisasi dengan menggunakan autoclave selama 15 menit pada suhu 121o_C

tekanan 15 lbs.

Persiapan Eksplan Jaringan Tumbuhan Andalas Secara In Vitro

Eksplan yang digunakan berasal dari pucuk tumbuhan Andalas yang telah diperbanyak secara in vitro pada medium MS dengan penambahan 3 mg/L BA dan 10 mg/L Biotin selama satu bulan. Bagian eksplan yang dimanfaatkan pada penelitian ini adalah daun, nodus dan tunas dengan ukuran proporsional.

Penanaman eksplan pada setiap tahap penelitian

Sebelum dilakukan penanaman, terlebih dahulu dilakukan sterilisasi terhadap Laminar Air Flow Cabinet dengan menyemprotkan alkohol 70%. Selanjutnya semua alat dan bahan yang diperlukan untuk transfer dan penanaman ditempatkan didalam LAFC dan disinari dengan lampu ultra violet (UV lamp) selama satu jam untuk kesterilan alat, bahan dan ruang tanam. Eksplan ditanam pada media tanam sesuai dengan perlakuan tahapan penelitian. Semua botol kultur yang berisi eksplan untuk setiap tahap penelitian dipelihara pada ruang inkubasi untuk pertumbuhan eksplan. Ruang inkubasi diatur suhunya pada kisaran 25o_{C ± 2}o_{C dengan}

Tahapan Penelitian

Tahapan penelitian yang dilakukan mencakup :

1. Inisiasi Kalus dan Induksi Cekaman Kekeringan Menggunakan beberapa Konsentrasi PEG: Eksplan yang telah dipersiapkan berupa daun ditanam pada medium inisiasi kalus berupa media MS yang mengandung 2 mg/L BAP dan 1 mg/L NAA dengan PEG pada kisaran konsentrasi 1-5% sebagai pengatur cekaman kekeringan. Pengamatan dilakukan setelah eksplan memberikan respon yaitu antara minggu ke 8-12 setelah penanaman.

2. Multiplikasi Tunas Aksilar pada beberapa Konsentrasi PEG sebagai Pengatur Cekaman Kekeringan: Tunas ditanam pada media multiplikasi berupa media MS yang mengandung 1-3 mg/L BAP dengan PEG pada kisaran konsentrasi 0-3% untuk melihat respon tunas dalam memperbanyak tunas aksilar dengan adanya PEG yang mengatur cekaman kekeringan. Pengamatan dilakukan setelah eksplan memberikan respon yaitu antara minggu ke 4-8 setelah penanaman.

3. Induksi pembentukan dan pertumbuhan akar tunas pada beebrapa konsentrasi PEG sebagai pengatur cekaman kekeringan: Tunas ditanam pada media induksi perakaran berupa MS setengah komposisi yang mengandung 2 g/L arang aktif dengan penambahan PEG pada konsentrasi 0-5%. Pengamatan dilakukan setelah eksplan memberikan respon yaitu antara minggu ke 8-12 setelah penanaman:

4. Analisa Kandungan Prolin pada Kalus Hasil seleksi cekaman kekeringan Menggunakan beberapa konsentrasi PEG: Kandungan prolin bebas pada jaringan ekplan (kalus dari potongan daun) dihitung dengan metoda spektrofotometrik berdasarkan reaksi kolorimetrik dengan ninhidrin yang mengacu pada metode yang dikembangkan Bates, Waldren dan Teare (1973).

3. Hasil dan Pembahasan

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan didapatkan hasil penelitian yang diuraikan sebagai berikut :

1. Inisiasi Kalus dan Induksi Cekaman Kekeringan Menggunakan beberapa Konsentrasi PEG

Pada Tabel 1 dan Gambar 1 (Lampiran) dapat dilihat bahwa potongan daun Andalas memberikan respon awal terhadap cekaman kekeringan berupa penebalan lapisan daun.

Tabel 1. Data pengamatan pembentukan kalus pada potongan daun Andalas dengan beberapa perlakuan konsentrasi PEG setelah 12 minggu perlakuan

o Perlakuan Pengamatan

1 MS + 2 mg/L BAP + 1 mg/L NAA

+ 0% PEG Terbentuk kalus berwarna kuning-hijau sampai kecoklatandimulai dari pinggiran daun dan pertulangan daun, pada medium terlihat fenolik yang menyebar di permukaan medium yang berasal dari daun yang menyebabkan warna medium menjadi kecoklatan

2 MS + 2 mg/L BAP + 1 mg/L NAA

+ 1% PEG Terbentuk kalus berwarna kekuningan-kecoklatan padapertulangan daun dan bagian yang kontak dengan medium, potongan daun mengalami penebalan, medium menjadi kecoklatan akibat fenolik yang dihasilkan oleh daun

3 MS + 2 mg/L BAP + 1 mg/L NAA

+ 2% PEG Terbentuk kalus dimulai dari permukaan bawah daun yangkontak dengan medium, kalus berwarna kekuningan-sedikit coklat, kalus berasal dari pertulangan daun dan pinggir daun, daun menebal, disekeliling potongan daun terlihat penyebaran fenolik yang menyebabkan warna medium mencoklat

4 MS + 2 mg/L BAP + 1 mg/L NAA

+ 3% PEG Terbentuk kalus, daun menebal, daun meng-hasilkan kaluspada permukaan bawah yang menempel pada medium, kalus berwana kuning kecoklatan, pada medium juga terjadi penumpukan fenolik

5 MS + 2 mg/L BAP + 1 mg/L NAA

+ 4% PEG daun, daun menjadi kecoklatan namun sebelumnya terjadiKalus tidak terbentuk disebabkan oleh kematian jaringan pemuluran jaringan daun dan penebalan lapisan daun, fenolik jga terlihat mengumpul dimedia

Respon tersebut dapat dikatakan sebagai bentuk awal pertahanan bagian tumbuhan terhadap cekaman kekeringan untuk mengurangi penguapan air. Pada konsentrasi PEG 1-3% terlihat bahwa walaupun potongan daun mengalami cekaman kekeringan namun kalus dapat terbentuk yang dimulai dari bagian pinggir daun. Adanya interaksi zat pengatur tumbuh NAA dengan BAP yang diberikan pada medium memacu pembentukan kalus walau pun pada medium terkandung senyawa PEG. Pada PEG konsentrasi 4%, potongan daun tidak lagi mampu mentolerir adanya senyawa tersebut sehingga pembentukan kalus tidak dapat berlangsung. Potongan daun yang semula telah mengalami penebalan, setelah beberapa waktu menjadi kecoklatan dan akhirnya mengalami kematian.

Tewary et al (2000) mendapatkan ketahanan Mulberry (Morus sp.) terhadap cekaman kekeringan maksimal pada konsentrasi 4%. Pada konsentrasi PEG 4% didapatkan pertumbuhan eksplan berupa tunas yang lebih lambat dibandingkan dengan perlakuan lainnya serta perlakuan PEG diatas 4% menyebabkan kematian pada eksplan yang ditanam tersebut.

Tirtoboma (1997) menggunakan konsentrasi PEG 5-10% untuk seleksi cekaman kekeringan pada kalus tanaman kopi yang terbentuk. Konsentrasi diatas 10% menyebabkan kematian pada kalus yang diseleksi. Namun, Dami dan Hughes (1997) mendapatkan eksplan anggur valiant hanya mampu bertahan terhadap cekaman kekeringan menggunakan PEG konsentrasi maksimal 2%.

2. Multiplikasi Tunas Aksilar pada beberapa Konsentrasi PEG sebagai Pengatur Cekaman Kekeringan

Pada Tabel 2 dapat dilihat bahwa tanpa pemberian PEG pada media, tingkat keberhasilan hidup eksplan mencapai 100% yang mengindikasikan bahwa pemberian BAP pada media memacu pertumbuhan tunas. Selain itu, terlihat bawah tunas yang diperlakukan mampu membentuk tunas aksilar baru. Pada pemberian konsentrasi PEG 1% didapatkan sedikit keanehan dimana pada pemberian BAP konsnetrasi 2 ppm terjadi peningkatan pertumbuhan tunas serta tunas-tunas tersebut mampu membentuk tunas-tunas aksilar baru. Pada perlakuan 1 mg/L BAP dan 3 mg/L BAP tidak didapatkan hanya dengan pemberian BAP 1 mg/L eksplan tunas yang mampu bertahan hidup sedangkan pada perlakuan lainnya mengalami kematian. Table 2. Persentase Eksplan Morus macroura Miq yang hidup dan membentuk tunas aksilar

dengan penambahan beberapa konsentrasi BAP (Benzyl Amino Purin) dan PEG (Polietilena Glikol) pada medium Murashige-Skoog dan inkubasi selama delapan minggu

No. Perlakuan Eksplan hidup_(%)

Eksplan membentuk tunas aksilar

(%)

Jumlah tunas

aksilar Jumlah Daun(Helai)

1 0% PEG + 1 mg/L BAP 100 100 6,3 15,3 2 0% PEG + 2 mg/L BAP 100 100 7,0 20 3 0% PEG + 3 mg/L BAP 100 100 5,6 16 4 1% PEG + 1 mg/L BAP 66,6 0 - -5 1% PEG + 2 mg/L BAP 100 33,3 0,33 0,66 6 1% PEG + 3 mg/L BAP 33,3 0 - -7 2% PEG + 1 mg/L BAP 33,3 0 - -8 2% PEG + 2 mg/L BAP 33,3 0 - -9 2% PEG + 3 mg/L BAP 33,3 0 - -10 3% PEG + 1 mg/L BAP 33,3 0 - -11 3% PEG + 2 mg/L BAP 0 0 - -12 3% PEG + 3 mg/L BAP 0 0 - -13 4% PEG + 1 mg/L BAP 33,3 0 - -14 4% PEG + 2 mg/L BAP 66,6 0 - -15 4% PEG + 3 mg/L BAP 33,3 33,3 0,33 0,33

Pada perlakuan pemberian PEG 4% didapatkan semakin rendahnya tingakt keberhasilan hidup dengan semakin tingginya konsnetrasi BAP pada media tanam tetapi pada BAP 3 mg/L didapatkan tunas-tunas yang tumbuh yang mampu membentuk tunas aksilar sedangkan pada perlakuan lainnya tidak didapatkan hal tersebut.

Pada Tabel 2 juga terlihat bahwa penambahan PEG sebagai senyawa pengatur cekaman kekeringan menyebabkan tunas aksilar sangat sulit untuk terinisiasi pembentukannya. Pada perlakuan 2-3% PEG terlihat tidak adanya tunas aksilar yang terbentuk sama sekali sedangkan pada perlakuan 1% PEG terlihat ada perlakuan yang menghasilkan tunas aksilar yaitu pada penambahan 2 mg/L BAP. Pada perlakuan 4% PEG terlihat adanya pembentukan tunas aksilar pada media dengan penambahan 3 mg/L BAP yang berkemungkinan eksplan telah bisa beradaptasi dengan kondisi cekaman tersebut (Gambar 2 pada Lampiran).

Dragiiska et al (1996) memakai konsentrasi PEG 5-10% pada seleksi cekaman kekeringan tanaman Alfalfa (Medicago sativa). Pada umumnya untuk tumbuhan berkayu seperti kopi (Tirtoboma, 1997) Eucalyptus grandis, Picea mariana, Pinus banksiana (Fan dan Blake, 1997), Mulbery - Morus sp. (Tewary et al, 2000) dipakai konsentrasi PEG kisaran 1-10%, dengan konsentrasi rata-rata yang dapat ditolerir oleh tanaman tersebut berkisar antara 4-5%..

El-Rahman et al (2007) menyatakan bahwa penambahan konsentrasi PEG pada media pembentukan tunas akan menghalangi pembentukan tunas-tunas baru. Hal tersebut dikarenakan kemampuan eksplan untuk menyerap zat pengatur tumbuh dari golongan sitokinin terhalangi selain menghambat penyerapan air dan garam mineral oleh sel-sel yang berinteraksi langsung dengan media tanam. Hasil dari penambahan PEG pada media induksi pembentukan tunas baru adalah penghambatan pertumbugan tunas pucuk dan penurunan bahkan menghambat pembentukan tunas baru secara progresif.

3. Induksi pembentukan dan pertumbuhan akar tunas pada beebrapa konsentrasi PEG sebagai pengatur cekaman kekeringan

Pada Tabel 3 terlihat bahwa terjadi peningkatan persentase eksplan yang berhasil hidup dan membentuk akar pada media dengan pemberian PEG dengan kontrol yang tumbuh baik. Pada perlakuan PEG 1% hanya 8,33% sampel yang berhasil hidup dan membentuk akar seperti halnya perlakuan PEG 2% dengan keberhasilan hidup 33,33%. Pada perlakuan PEG 3% dan 4% terjadi peningkatan keberhasilan hidup dan pembentukan akar sebesar 41,66%. Peningkatan keberhasilan tersebut tidak diikuti dengan peningkatan pertumbuhan eksplan

yang ditanam pada media. Eksplan yang diperlakukan memperlihatkan pertumbuhan yang lambat dengan akar yang dihasilkan sedikit. Tunas yang ditumbuhkan mengalami kekerdilan.

Pada Gambar 3 (Lampiran) juga dapat dilihat perbedaan pertumbuhan antara eksplan kontrol yang tidak diberi perlakuan konsentrasi PEG dengan eksplan yang diberi perlakuan PEG. Pada kontrol terlihat pertumbuhan yang bagus dan daun keliahatn subur sedangkan pada perlakuan PEG tidak terliaht pertumbuhan daun yang bagus, bahkan daun mengalami kematian akibat kurangnya pasokan nutrisi untuk kehidupan dan pertumbuhan daun. Pertumbuhan akar pun cukup sulit dikarenakan keterbatasan pasokan energi dari pucuk sehingga akar tidak mampu melakuan tugasnya dengan baik. Pada kontrol pertumbuhan tunas sangat pesan karena tidak ada penghalang penyerapan nutrisi dan senyawa yang ada pada medium.

Tabel 3. Data pengamatan pembentukan akar pada tunas Morus pada beberapa konsentrasi PEG sebagai pengatur cekaman kekeringan setelah 12 minggu.

No Perlakuan _{membentuk akar}%eksplan hidup Pengamatan

1 MS(HS) + 2 mg/L NAA + 2 g/L arang aktif + 0% PEG

100,00 akar yang terebntuk tumbuh dengan baik, media tanam telah dipenuhi oleh akar yang telah mengeras yang menunjukkan bahwa planlet siap untuk diaklimatisasi dengan pertumbuhan yang optimum, tunas tumbuh dengan sempurna.

2 MS (HS) + 2 mg/L NAA + 2 g/L arang aktif + 1% PEG

8,33 akar tumbuh dengan baik dan telah terlihat memanjang dan mengeras pada media, tunas bertahan hidup namun tidak mengalami pertumbuhan yang cukup baik.

3 MS (HS) + 2 mg/L NAA + 2 g/L arang aktif + 2% PEG

33,33 akar tumbuh dengan baik dan telah terlihat memanjang dan mengeras pada media, tunas bertahan hidup namun tidak mengalami pertumbuhan yang cukup baik.

4 MS (HS) + 2 mg/L NAA + 2 g/L arang aktif + 3% PEG

41,66 akar telah tumbuh dengan baik dan mengalami pengerasan namun tidak begitu banyak serta tidak begitu panjang, pertumbuhan tunas terganggu dan mengalami kekerdilan. 5 MS (HS) + 2 mg/L

NAA + 2 g/L arang aktif + 4% PEG

41,66 akar telah tumbuh dengan baik dan mengalami pengerasan namun tidak begitu banyak serta tidak begitu panjang, pertumbuhan tunas terganggu dan mengalami kekerdilan.

Penelitian yang dilakukan oleh Ahmad et al (2007), mendapatkan hasil pertumbuhan eksplan Mulberry yang lebih baik pada media induksi perakaran tanpa pemakaian senyawa penyeleksi cekaman garam setelah eksplan diseleksi pada media cekaman garam sebelumnya. Pada penelitian tersebut, pembentukan dan pertumbuhan akar semakin menurun akibat tingginya cekaman garam yang diperoleh oleh eksplan. Selain itu, jika eksplan sebelumnya telah mengalami seleksi dengan senyawa yang sama akan tetap memberikan tingkat

keberhasilan pembentukan akar yang semakin rendah seiring dengan tingginya konsnetrasi garam pada media pembentukan akar.

Menurut Darmansyah (1993), tumbuhan Andalas memiliki kandungan auksin endogen yang cukup tinggi yang terbukti dari banyaknya akar yang terbentuk pada kultur jaringan daun pada media yang mengandung kinetin. Namun, dari hasil penelitian ini memperlihatkan bahwa terhambatnya pembentukan dan pertumbuhan akar akibat adanya senyawa PEG pada media yang menghambat aktifitas fisiologis tunas.

4. Analisa Kandungan Prolina pada Kalus Hasil seleksi cekaman kekeringan Menggunakan beberapa konsentrasi PEG

Kondisi cekaman yang dialami, dapat merangsang tumbuhan menghasilkan senyawa osmolit untuk mempertahankan keseimbangan tekanan turgor sel. Salah satu senyawa yang dihasilkan adalah prolin. Kandungan prolin pada kalus Andalas dengan pemakain PEG sebagai pengatur cekaman kekeringan dapat dilihat pada tabel dibawah ini .

Tabel 4. Kandungan prolina eksplan Andalas pada media induksi kalus dengan beberapa perlakuan konsentrasi PEG sebagai pengatur cekaman kekeringan secara in vitro.

No Konsentrasi PEG (%) Kandungan Prolina (µmol/g BB)

1 0 0,0022

2 1 0,0026

3 2 0,0030

4 3 0,0035

5 4 0,0039

Pada Tabel 4 terlihat bahwa kandungan prolina semakin tinggi dengan semakin besarnya kandungan PEG pada media induksi kalus, atau dengan kata lain peningkatan kandungan prolina pada eksplan berbanding lurus dengan peningkatan konsentrasi PEG pada media perlakuan. Kandungan prolina paling tinggi didapatkan pada perlakuan PEG 4% yaitu sebesar 0,0039 um/gBB dan terendah didapatkan pada kontrol yaitu 0,0022 um/gBB.

Tingginya kandungan prolina pada tumbuhan yang mengalami cekaman kekeringan terjadi sebagai akibat terhambatnya aktivitas enzim prolina dehidrogenase dan prolina oksidase (Harinasut at al, 2003). Akumulasi prolina bergantung pada lama waktu dan konsentrasi cekaman osmotik, tipe jaringan, umur tumbuhan, dan genotip. (Safarnejad, 2008). Prolina diduga merupakan senyawa yang bertindak sebagai penetralisir kondisi kekeringan sampai batas waktu tertentu sehingga tumbuhan mampu bertahan dengan aktivitas yang sangat

rendah (Muhammadkhani dan Heidari, 2008). Vajrabhaya, Kumpun dan Chadchawan (2001) mendapatkan peningkatan kandungan prolina sekitar 64% - 99% pada beberapa kultivar Oryza sativa L., melalui pemberian PEG 15%.

4. Kesimpulan

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa :

1. Eksplan daun mampu menginisiasi pembentukan kalus dengan peningkatan konsentrasi PEG mencapai 3% dimana diatas konsentrasi tersebut eksplan daun mengalami kematian setelah 12 minggu pada media tanam.

2. Multiplikasi tunas aksilar pada sampel tunas tidak dapat berlangsung dengan baik akibat adanya 1-3% PEG pada media yang menghalangi penyerapan BAP untuk merangsang aktifitas pembentukan tunas aksilar.

3. Induksi pembentukan dan pertumbuhan akar terhalangi akibat adanya 1-4% PEG pada media dimana semakin tinggi konsentrasi PEG semakin sedikit akar yang dihasilkan dan tunas mengalami kekerdilan.

4. Peningkatan kandungan prolin seiring dengan peningkatan kosentrasi PEG.

Kepustakaan

Achmad, S. A., N. Aimi, E. L. Ghisalberty, E. H. Hakim, Jasmansyah, L. D. Juliawaty, L. Makmur, Y. Manjang, U. Supratman, Suyanto, R. Tamin, dan A. Yelminda. 2001. Some New Compunds from Indonesian Moraceae. Proceedings, International Seminar on Tropical Rainforest Plants. Padang. 25 hal.

Ahmad, P., S. Sharma, and P. S. Srivastava. 2007. In Vitro Selection of NaHCO3 Tolerant Cultivars of Morus

alba (Local and Sujanpuri) in Response to Morphological and Biochemical Parameters. Hort. Sci. (Progue) 34 (3) : 114-122.

Bates, L. S., R. P. Waldren and I. D. Teare. 1973. Rapid Determination of Free Proline for Water Stress Studies.

Plant and Soil 39 (1) : 205-207.

Dahlan, S. 1994. Mengenal Morus macroura Miq. Maskot Flora Sumatera Barat. Jurnal Penelitian Andalas 15 : 17-20.

Dami, I., and H. Hughes. 1997. Effects of PEG-Induced Water Stress on In Vitro Hardening of Valianta Grape.

Plant Cell, Tissue and Org. Cult. 47 (2) : 97-101.

Darmansyah. 1993. Respon Pertumbuhan Potongan Daun Andalas (Morus macraura Miq.) dengan Penambahan IAA dan Kinetin pada Medium Murashige-Skoog. Skripsi Sarjana Biologi FMIPA Universitas Andalas. Padang.

Dragiiska, R., D. Djilianov, P. Denchev and A. Atanassov. 1996. In Vitro Selection for Osmotic Tolerance in Alfalfa (Medicago sativa L.). Bulg. J. Plant Physiol. 22 (3-4) : 30-39.

El-Rahman, A., M. F. Al-Ansary, A. A. Rizkalla and A. M. Badr-Elden. 2007. Micropropagation and Biochemical Genetic Markers Detection for Drought and Salt Tolerance of Pear Rootstock. Australian Journal of Basic and Applied Sciences 1 (4) : 625-636.

Fan, S., and T. J. Blake. 1997. Comparison of Polyethylene Glycol 3350 Induced Osmotic Stress and Soil Drying for Drought Simulation in Three Woody Species. Tree-Structure and Function 11 (6) : 342-348.

Harinasut, P., D. Poonsopa, K. Roengmongkol, and R. Charoensataporn. 2003. Salinity Effects on Antioxidant Enzymes in Mulberry Cultivar. Science Asia 29: 109-113.

Lawlor, D. W. 1970. Absorption of Polyethylene Glycols By Plants and Their Effects on Plant Growth. New Phytol. 69 : 501-513.

Mohammadkhani, N., and R. Heidari. 2008. Drought-Induced Acumulation of Soluble Sugars and Proline in Two Maize Varieties. World Applied Science Journal 3 (3): 448-453.

Safarnejad, A. 2008. Morphological and Biochemical Response to Osmotic Stress In Alfalfa (Medicago sativa

L.). Pak. J. Bot. 40(2): 735-746

Suwirmen. 2007. Produksi Bibit Pohon Andalas (Morus macroura Miq.) secara In Vitro dalam Upaya Pelestarian Maskot Flora Sumatera Barat. Laporan Research Grand Technological and Profesional Skill Development Sector Project (TPSDP) Batch III/2006 Universitas Andalas. Padang.

Tewary, P. K., A. Sharma, M. K. Raghunath and A. Sarkar. 2000. In Vitro Response of Promosing Mulberry (Morus sp.) Genotypes for Tolerance to Salt and Osmotic Stresses. Plant Growth Regulation 30 (1) : 17-21.

Tirtoboma. 1997. In vitro Selection and Acclimatization of Robusta Coffee Tolerant to Water Stress. Menara Perkebunan(Indonesian Journal of Biotechnology Research on Estate Crops) 65 (1) : 9-16.

Vajrabhaya, M., W. Kumpun, and S. Chadchawan. 2001. The Solute Accumulation : The Mechanism for Drought Tolerance in RD23 Rice (Oryza sativa L.) Lines. Science Asia 27: 93-97.

LAMPIRAN

Gambar 1. Respon potongan daun Andalas dengan pemberian beberapa konsentrasi PEG sebagai pengatur cekaman kekeringan pada medium induksi kalus yang mengandung 2 mg/L BAP dan 1 mg/L NAA. A.) 1% PEG; B.) 2% PEG; C.) 3% PEG dan D.) 4% PEG.

Gambar 2. Kombinasi PEG dan BAP yang dapat ditolerir oleh tunas Andalas untuk hidup dan menghasilkan tunas aksilar ; A). 1% PEG + 2 mg/L BAP dan B). 4% PEG + 3 mg/L BAP (tanda panah menunjukkan tunas aksilar yang terbentuk)

Gambar 3. Induksi perakaran pada media induksi akar dengan penambahan beberapa konsentrasi PEG sebagai pengatur cekaman kekeringan, A) kontrol tunas Andalas tanpa perlakuan PEG, B). Kontrol tunas hasil seleksi pada media tanpa PEG, C). 1% PEG; D) 2% PEG; E) 3% PEG dan F) 4% PEG

A B C D

A B

B C

D E F

Pada perlakuan pemberian PEG 4% didapatkan semakin rendahnya tingakt keberhasilan hidup dengan semakin tingginya konsnetrasi BAP pada media tanam tetapi pada BAP 3 mg/L didapatkan tunas-tunas yang tumbuh yang mampu membentuk tunas aksilar sedangkan pada perlakuan lainnya tidak didapatkan hal tersebut.

Pada Tabel 2 juga terlihat bahwa penambahan PEG sebagai senyawa pengatur cekaman kekeringan menyebabkan tunas aksilar sangat sulit untuk terinisiasi pembentukannya. Pada perlakuan 2-3% PEG terlihat tidak adanya tunas aksilar yang terbentuk sama sekali sedangkan pada perlakuan 1% PEG terlihat ada perlakuan yang menghasilkan tunas aksilar yaitu pada penambahan 2 mg/L BAP. Pada perlakuan 4% PEG terlihat adanya pembentukan tunas aksilar pada media dengan penambahan 3 mg/L BAP yang berkemungkinan eksplan telah bisa beradaptasi dengan kondisi cekaman tersebut (Gambar 2 pada Lampiran).

Dragiiska et al (1996) memakai konsentrasi PEG 5-10% pada seleksi cekaman kekeringan tanaman Alfalfa (Medicago sativa). Pada umumnya untuk tumbuhan berkayu seperti kopi (Tirtoboma, 1997) Eucalyptus grandis, Picea mariana, Pinus banksiana (Fan dan Blake, 1997), Mulbery - Morus sp. (Tewary et al, 2000) dipakai konsentrasi PEG kisaran 1-10%, dengan konsentrasi rata-rata yang dapat ditolerir oleh tanaman tersebut berkisar antara 4-5%..

El-Rahman et al (2007) menyatakan bahwa penambahan konsentrasi PEG pada media pembentukan tunas akan menghalangi pembentukan tunas-tunas baru. Hal tersebut dikarenakan kemampuan eksplan untuk menyerap zat pengatur tumbuh dari golongan sitokinin terhalangi selain menghambat penyerapan air dan garam mineral oleh sel-sel yang berinteraksi langsung dengan media tanam. Hasil dari penambahan PEG pada media induksi pembentukan tunas baru adalah penghambatan pertumbugan tunas pucuk dan penurunan bahkan menghambat pembentukan tunas baru secara progresif.

3. Induksi pembentukan dan pertumbuhan akar tunas pada beebrapa konsentrasi PEG sebagai pengatur cekaman kekeringan

Pada Tabel 3 terlihat bahwa terjadi peningkatan persentase eksplan yang berhasil hidup dan membentuk akar pada media dengan pemberian PEG dengan kontrol yang tumbuh baik. Pada perlakuan PEG 1% hanya 8,33% sampel yang berhasil hidup dan membentuk akar seperti halnya perlakuan PEG 2% dengan keberhasilan hidup 33,33%. Pada perlakuan PEG 3% dan 4% terjadi peningkatan keberhasilan hidup dan pembentukan akar sebesar 41,66%. Peningkatan keberhasilan tersebut tidak diikuti dengan peningkatan pertumbuhan eksplan

yang ditanam pada media. Eksplan yang diperlakukan memperlihatkan pertumbuhan yang lambat dengan akar yang dihasilkan sedikit. Tunas yang ditumbuhkan mengalami kekerdilan.

Pada Gambar 3 (Lampiran) juga dapat dilihat perbedaan pertumbuhan antara eksplan kontrol yang tidak diberi perlakuan konsentrasi PEG dengan eksplan yang diberi perlakuan PEG. Pada kontrol terlihat pertumbuhan yang bagus dan daun keliahatn subur sedangkan pada perlakuan PEG tidak terliaht pertumbuhan daun yang bagus, bahkan daun mengalami kematian akibat kurangnya pasokan nutrisi untuk kehidupan dan pertumbuhan daun. Pertumbuhan akar pun cukup sulit dikarenakan keterbatasan pasokan energi dari pucuk sehingga akar tidak mampu melakuan tugasnya dengan baik. Pada kontrol pertumbuhan tunas sangat pesan karena tidak ada penghalang penyerapan nutrisi dan senyawa yang ada pada medium.

Tabel 3. Data pengamatan pembentukan akar pada tunas Morus pada beberapa konsentrasi PEG sebagai pengatur cekaman kekeringan setelah 12 minggu.

No Perlakuan _{membentuk akar}%eksplan hidup Pengamatan 1 MS(HS) + 2 mg/L

NAA + 2 g/L arang aktif + 0% PEG

100,00 akar yang terebntuk tumbuh dengan baik, media tanam telah dipenuhi oleh akar yang telah mengeras yang menunjukkan bahwa planlet siap untuk diaklimatisasi dengan pertumbuhan yang optimum, tunas tumbuh dengan sempurna.

2 MS (HS) + 2 mg/L NAA + 2 g/L arang aktif + 1% PEG

8,33 akar tumbuh dengan baik dan telah terlihat memanjang dan mengeras pada media, tunas bertahan hidup namun tidak mengalami pertumbuhan yang cukup baik.

3 MS (HS) + 2 mg/L NAA + 2 g/L arang aktif + 2% PEG

33,33 akar tumbuh dengan baik dan telah terlihat memanjang dan mengeras pada media, tunas bertahan hidup namun tidak mengalami pertumbuhan yang cukup baik.

4 MS (HS) + 2 mg/L NAA + 2 g/L arang aktif + 3% PEG

41,66 akar telah tumbuh dengan baik dan mengalami pengerasan namun tidak begitu banyak serta tidak begitu panjang, pertumbuhan tunas terganggu dan mengalami kekerdilan. 5 MS (HS) + 2 mg/L

NAA + 2 g/L arang aktif + 4% PEG

41,66 akar telah tumbuh dengan baik dan mengalami pengerasan namun tidak begitu banyak serta tidak begitu panjang, pertumbuhan tunas terganggu dan mengalami kekerdilan.

Penelitian yang dilakukan oleh Ahmad et al (2007), mendapatkan hasil pertumbuhan eksplan Mulberry yang lebih baik pada media induksi perakaran tanpa pemakaian senyawa penyeleksi cekaman garam setelah eksplan diseleksi pada media cekaman garam sebelumnya. Pada penelitian tersebut, pembentukan dan pertumbuhan akar semakin menurun akibat tingginya cekaman garam yang diperoleh oleh eksplan. Selain itu, jika eksplan sebelumnya telah mengalami seleksi dengan senyawa yang sama akan tetap memberikan tingkat

keberhasilan pembentukan akar yang semakin rendah seiring dengan tingginya konsnetrasi garam pada media pembentukan akar.

Menurut Darmansyah (1993), tumbuhan Andalas memiliki kandungan auksin endogen yang cukup tinggi yang terbukti dari banyaknya akar yang terbentuk pada kultur jaringan daun pada media yang mengandung kinetin. Namun, dari hasil penelitian ini memperlihatkan bahwa terhambatnya pembentukan dan pertumbuhan akar akibat adanya senyawa PEG pada media yang menghambat aktifitas fisiologis tunas.

4. Analisa Kandungan Prolina pada Kalus Hasil seleksi cekaman kekeringan Menggunakan beberapa konsentrasi PEG

Kondisi cekaman yang dialami, dapat merangsang tumbuhan menghasilkan senyawa osmolit untuk mempertahankan keseimbangan tekanan turgor sel. Salah satu senyawa yang dihasilkan adalah prolin. Kandungan prolin pada kalus Andalas dengan pemakain PEG sebagai pengatur cekaman kekeringan dapat dilihat pada tabel dibawah ini .

Tabel 4. Kandungan prolina eksplan Andalas pada media induksi kalus dengan beberapa perlakuan konsentrasi PEG sebagai pengatur cekaman kekeringan secara in vitro.

No Konsentrasi PEG (%) Kandungan Prolina (µmol/g BB)

1 0 0,0022

2 1 0,0026

3 2 0,0030

4 3 0,0035

5 4 0,0039

Pada Tabel 4 terlihat bahwa kandungan prolina semakin tinggi dengan semakin besarnya kandungan PEG pada media induksi kalus, atau dengan kata lain peningkatan kandungan prolina pada eksplan berbanding lurus dengan peningkatan konsentrasi PEG pada media perlakuan. Kandungan prolina paling tinggi didapatkan pada perlakuan PEG 4% yaitu sebesar 0,0039 um/gBB dan terendah didapatkan pada kontrol yaitu 0,0022 um/gBB.

Tingginya kandungan prolina pada tumbuhan yang mengalami cekaman kekeringan terjadi sebagai akibat terhambatnya aktivitas enzim prolina dehidrogenase dan prolina oksidase (Harinasut at al, 2003). Akumulasi prolina bergantung pada lama waktu dan konsentrasi cekaman osmotik, tipe jaringan, umur tumbuhan, dan genotip. (Safarnejad, 2008). Prolina diduga merupakan senyawa yang bertindak sebagai penetralisir kondisi kekeringan sampai batas waktu tertentu sehingga tumbuhan mampu bertahan dengan aktivitas yang sangat

rendah (Muhammadkhani dan Heidari, 2008). Vajrabhaya, Kumpun dan Chadchawan (2001) mendapatkan peningkatan kandungan prolina sekitar 64% - 99% pada beberapa kultivar

Oryza sativa L., melalui pemberian PEG 15%.

4. Kesimpulan

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa :

1. Eksplan daun mampu menginisiasi pembentukan kalus dengan peningkatan konsentrasi PEG mencapai 3% dimana diatas konsentrasi tersebut eksplan daun mengalami kematian setelah 12 minggu pada media tanam.

2. Multiplikasi tunas aksilar pada sampel tunas tidak dapat berlangsung dengan baik akibat adanya 1-3% PEG pada media yang menghalangi penyerapan BAP untuk merangsang aktifitas pembentukan tunas aksilar.

3. Induksi pembentukan dan pertumbuhan akar terhalangi akibat adanya 1-4% PEG pada media dimana semakin tinggi konsentrasi PEG semakin sedikit akar yang dihasilkan dan tunas mengalami kekerdilan.

4. Peningkatan kandungan prolin seiring dengan peningkatan kosentrasi PEG.

Kepustakaan

Achmad, S. A., N. Aimi, E. L. Ghisalberty, E. H. Hakim, Jasmansyah, L. D. Juliawaty, L. Makmur, Y. Manjang, U. Supratman, Suyanto, R. Tamin, dan A. Yelminda. 2001. Some New Compunds from Indonesian Moraceae. Proceedings, International Seminar on Tropical Rainforest Plants. Padang. 25 hal.

Ahmad, P., S. Sharma, and P. S. Srivastava. 2007. In Vitro Selection of NaHCO3 Tolerant Cultivars of Morus alba (Local and Sujanpuri) in Response to Morphological and Biochemical Parameters. Hort. Sci. (Progue) 34 (3) : 114-122.

Bates, L. S., R. P. Waldren and I. D. Teare. 1973. Rapid Determination of Free Proline for Water Stress Studies.

Plant and Soil 39 (1) : 205-207.

Dahlan, S. 1994. Mengenal Morus macroura Miq. Maskot Flora Sumatera Barat. Jurnal Penelitian Andalas 15 : 17-20.

Dami, I., and H. Hughes. 1997. Effects of PEG-Induced Water Stress on In Vitro Hardening of Valianta Grape.

Plant Cell, Tissue and Org. Cult. 47 (2) : 97-101.

Darmansyah. 1993. Respon Pertumbuhan Potongan Daun Andalas (Morus macraura Miq.) dengan Penambahan IAA dan Kinetin pada Medium Murashige-Skoog. Skripsi Sarjana Biologi FMIPA Universitas Andalas. Padang.

Dragiiska, R., D. Djilianov, P. Denchev and A. Atanassov. 1996. In Vitro Selection for Osmotic Tolerance in Alfalfa (Medicago sativa L.). Bulg. J. Plant Physiol. 22 (3-4) : 30-39.

El-Rahman, A., M. F. Al-Ansary, A. A. Rizkalla and A. M. Badr-Elden. 2007. Micropropagation and Biochemical Genetic Markers Detection for Drought and Salt Tolerance of Pear Rootstock. Australian Journal of Basic and Applied Sciences 1 (4) : 625-636.

Fan, S., and T. J. Blake. 1997. Comparison of Polyethylene Glycol 3350 Induced Osmotic Stress and Soil Drying for Drought Simulation in Three Woody Species. Tree-Structure and Function 11 (6) : 342-348.

Harinasut, P., D. Poonsopa, K. Roengmongkol, and R. Charoensataporn. 2003. Salinity Effects on Antioxidant Enzymes in Mulberry Cultivar. Science Asia 29: 109-113.

Lawlor, D. W. 1970. Absorption of Polyethylene Glycols By Plants and Their Effects on Plant Growth. New Phytol. 69 : 501-513.

Mohammadkhani, N., and R. Heidari. 2008. Drought-Induced Acumulation of Soluble Sugars and Proline in Two Maize Varieties. World Applied Science Journal 3 (3): 448-453.

Safarnejad, A. 2008. Morphological and Biochemical Response to Osmotic Stress In Alfalfa (Medicago sativa

L.). Pak. J. Bot. 40(2): 735-746

Suwirmen. 2007. Produksi Bibit Pohon Andalas (Morus macroura Miq.) secara In Vitro dalam Upaya Pelestarian Maskot Flora Sumatera Barat. Laporan Research Grand Technological and Profesional Skill Development Sector Project (TPSDP) Batch III/2006 Universitas Andalas. Padang.

Tewary, P. K., A. Sharma, M. K. Raghunath and A. Sarkar. 2000. In Vitro Response of Promosing Mulberry (Morus sp.) Genotypes for Tolerance to Salt and Osmotic Stresses. Plant Growth Regulation 30 (1) : 17-21.

Tirtoboma. 1997. In vitro Selection and Acclimatization of Robusta Coffee Tolerant to Water Stress. Menara Perkebunan(Indonesian Journal of Biotechnology Research on Estate Crops) 65 (1) : 9-16.

Vajrabhaya, M., W. Kumpun, and S. Chadchawan. 2001. The Solute Accumulation : The Mechanism for Drought Tolerance in RD23 Rice (Oryza sativa L.) Lines. Science Asia 27: 93-97.

LAMPIRAN

Gambar 1. Respon potongan daun Andalas dengan pemberian beberapa konsentrasi PEG sebagai pengatur cekaman kekeringan pada medium induksi kalus yang mengandung 2 mg/L BAP dan 1 mg/L NAA. A.) 1% PEG; B.) 2% PEG; C.) 3% PEG dan D.) 4% PEG.

Gambar 2. Kombinasi PEG dan BAP yang dapat ditolerir oleh tunas Andalas untuk hidup dan menghasilkan tunas aksilar ; A). 1% PEG + 2 mg/L BAP dan B). 4% PEG + 3 mg/L BAP (tanda panah menunjukkan tunas aksilar yang terbentuk)

Gambar 3. Induksi perakaran pada media induksi akar dengan penambahan beberapa konsentrasi PEG sebagai pengatur cekaman kekeringan, A) kontrol tunas Andalas tanpa perlakuan PEG, B). Kontrol tunas hasil seleksi pada media tanpa PEG, C). 1% PEG; D) 2% PEG; E) 3% PEG dan F) 4% PEG

A B C D

A B

B C

D E F