Hubungan Kadar Hepcidin dan Soluble Transferrin Receptor (sTfR) Chapter III VI
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1. Rancangan penelitian
Jenis penelitian ini adalah analitik observasional, rancangan
penelitian cross
sectional(potong lintang) dimana variabel bebas dan
tergantung diukur padawaktu yang bersamaan.
3.2. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Departemen Patologi Klinik Fakultas
Kedokteran Universitas Sumatera Utara (FK-USU)/RSUP Haji Adam Malik
Medan.
Penelitian dilakukan pada bulan Maret 2016 sampai dengan
akhir Mei 2016.Penelitian dihentikan bila jumlah sampel minimal tercapai
atau waktu pengambilan sampel telah mencapai tiga bulan.
3.3. Populasi dan SubjekPenelitian
3.3.1. Populasi Penelitian
Populasi Penelitian adalah pasien dewasa yang datang berobat
ke Hematologi di RSUP Haji Adam Malik Medan yang memeriksakan
darah lengkap di Departemen Patologi Klinik pada bulan Maret 2016 - Mei
2016.
Universitas Sumatera Utara
3.3.2SubjekPenelitian :
Subjek penelitian adalahpasien dewasa penderita β-thalassemia
trait yang memenuhi kriteria inklusi.
3.3.2.1. Kriteria Inklusi:
1. Usia reproduktif di atas 18 tahun.
2. Nilai MCV ≤ 80 fl , MCH ≤ 27 pg
3. Pemeriksaan denganHb Elektroforesis nilai HbA2 > 3,5 %
4. Penderita bersedia ikut dalam penelitian dengan menandatangani
inform consent.
3.3.2.2. Kriteria Eksklusi12 :
1. Penyakit Keganasan
2. Kehamilan
3. Penyakit infeksi
4. Penyakit kelainan hati
5. Penyakit kekurangan zat besi
3.4. Cara Pengambilan Sampel Penelitian
Pengambilan sampel dilakukan secara konsekutif terhadap semua
populasi. Jumlah sampel minimal sesuai perkiraan jumlah sampel atau
sampai batas waktu pengumpulan sampel yang ditentukan.
Universitas Sumatera Utara
3.4.1. Rumus Besar Sampel
Perkiraan besar sampel minimum dan sampel yang diteliti dipakai
rumus uji hipotesa untuk proporsi dengan subjek tunggal.
(Z
n≥
(1−α / 2 )
Po (1 − Po ) + Z (1− β ) ) Pa (1 − Pa )
(Po
− Pa )
)
2
2
Dimana :
Z (1−α / 2) = Deviat baku alpha, untuk α = 0,05
maka nilai baku normalnya 1,96
Z (1− β )
= Deviat baku β, untuk β = 0,10 maka nilai baku normalnya 1,282
P0
=Proporsi β-thalassemia traitsebesar 0,0407β. 7
Pa
=Perkiraan proporsi thalassemia yang diteliti,
ditetapkan sebesar0,25
P0 − P0 = Beda proporsi yang signifikan ditetapkan sebesar 0,2093
Maka subjek minimal untuk penelitian ini sebanyak 28orang.
Universitas Sumatera Utara
3.5. Variabel Penelitian
3.5.1. Variable Bebas
Hepcidin dan Soluble transferrin reseptor(sTfR)
3.5.2. Variabel Terikat
β-Thalassemiatrait
3.6. Ethical Clearance dan Informed Consent
Ethical
clearance
diperoleh
dari
Komite
Penelitian
Bidang
Kesehatan FK-USUdi RSUP-Haji Adam Malik Medan No: 315/TGL/KEPK
FK USU-RSUP HAM/2016. Inform consent diminta secara tertulis dari
subjek penelitian yang menyatakan bersedia ikut dalam penelitian setelah
mendapat penjelasan mengenai maksud dan tujuan dari penelitian ini.
3.7.Analisa Data
Analisa data untuk melihat korelasi antara kadar hepcidin dan
kadar
sTfR pada β-thalassemia trait menggunakan Uji Korelasi
Pearsonjika berdistribusi normal, atau Uji Spearman’s rho jika tidak
berdistribusi
normal.
Untuk
pemeriksaan
dengan
test
Normality
menggunakan cara Shapiro Wilk jika kecil dari 50 sampel dan cara
Kolmogrof smirnov jika lebih besar dari 50 sampel.
Universitas Sumatera Utara
3.8.Bahan dan Cara Kerja
3.8.1. Bahan yang diperlukan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah darah dengan
antikoagulan EDTA dan darah tanpa antikoagulan.
3.8.2. Anamnese dan Pemeriksaan Fisik
Anamnese dilakukan dengan wawancara berpedoman pada daftar
pertanyaan pada status dan keterangan yang ada pada status.
Pemeriksaan fisik dilakukan pada posisi penderita berbaring. Seluruh data
dan hasil pemeriksaan dicatat dalam status khusus penelitian.
3.8.3. Pengambilan dan Pengolahan Sampel
3.8.3.1. Pengambilan SampelDarah
Penelitian dilakukan di RSUP Haji Adam Malik Medan.Sampel
darah diambil dari vena mediana cubiti. Tempat punksi vena terlebih
dahulu dilakukan tindakan aseptik dengan alkohol 70% dan dibiarkan
kering, kemudian dilakukan punksi dengan menggunakan venoject.
Pegambilan darah dilakukan tanpa statis yang berlebihan. Sejumlah 7 ml
darah vena diambil dan dibagi kedalam tiga tabung masing – masing
vacutainer K2EDTA pertama 2 ml, vacutainer K2EDTA kedua 2 ml, dan
vacutainer Gel clot activator 3 ml.
Universitas Sumatera Utara
3.8.3.2. Pengolahan dan Pemeriksaan Sampel
Darah
dengan
antikoagulan
EDTA
pertama
dilakukan
pemeriksaan FBC dengan menggunakan hematology analyzer untuk
memperoleh nilai MCV≤80 fl dan MCH≤27pg. Vacutainer K2EDTA kedua
dilakukan
pemeriksaan
Hemoglobin
Elektroforesis.
Darah
tanpa
antikoagulan dibiarkan dalam suhu ruangan selama 30 menit, kemudian
disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit untuk
mendapatkan serum yang jernih.
3.8.3.2.1.Pemeriksaan Hematologi
Pemeriksaan darah lengkap sebanyak 2ml darah dalam vacutener
K2EDTA pertama di homogenkan perlahan. Analisa dengan pemeriksaan
full blood count( FBC ) dilakukan dengan menggunakan automatic cell
counting Sysmex XN-1000i untuk memperoleh nilai Hb, MCV, MCH dan
RDW.
3.8.3.2.2. Pemeriksaan Nilai Kuantitasi HbA2
Sejumlah 2 ml darah dalam vacutener K2EDTA dilakukan analisa
Hemoglobin Elektroforesis Kapiler untuk melihat nilai kuantitasi HbA2
dengan menggunakan alat Minicapilarry electrophoresis dari Sebia
(Sebia, Norcross, GA).Pada metode minicapilarry electrophoresis HbA2
dapat
dipisahkan
menggunakan
dari
HbE,
HbC
prinsipelektroforesis
dan
kapiler
HbS.
pada
Sistem
larutan
MINICAP
bebas.
Universitas Sumatera Utara
denganmolekul yang bermuatan dipisahkan berdasarkan mobilitas
elektroforesis pada larutan buffer alkali elektroosmotik yang bergerak
menuju katoda, sehingga akan menyebabkan aliran buffer dari anoda ke
katoda.
3.8.3.2.3. PemeriksaanHepcidin
Pemeriksaan hepcidin serum dengan alat Chemwell analyzer
menggunakan
metode
ELISA.Sampel
dikumpulkan
dan
dilakukan
sentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Supernatant
yang diperoleh segera disimpan pada suhu -200 C(2 bulan).Pengukuran
dilakukan dengan menggunakan spectrophotometer dengan panjang
gelombang 450 nm (warna biru).Kadar
normal hepcidin 27 – 158
ng/mL.56 Sebelum menjalankan sampel terlebih dahulu dilakukan kurva
kalibrasi dengan pengenceranstandard diluent dengan konsentrasi : 120;
60; 30; 15; 7,5; 0 ng/ml (gambar 3.1. grafik kalibrasi hepcidin).
hepcidin Cat No.Qy-E01240, Lot:04/2016(96T)
Universitas Sumatera Utara
Gambar 3.1.grafik kalibrasi hepcidin
Bahan yang digunakan pemeriksaan hepcidin
1. Reagen (2-80C)
2. 96 wells
3. Standard 120ng/ml
4. Standard diluent (ready to use)
5. Special diluent (ready to use)
6. HRP (Horseradish peroxidase)-Conjugate reagent (ready to use)
7. Wash solution
8. Chromogen Solution A&B (ready to use)
9. Stop Solution (ready to use)
10. Microplate Sealers
Cara kerja hepcidin :
1. Sebelum menggunakan sampel dan reagen tersebut terlebih
dahulu, bahan yang beku dibiarkan mencair sampai pada suhu
ruang, kemudian disama-ratakan dengan vortex. Larutan standard
juga disamakan dengan suhu ruang (20-25̊ C).
2. Persiapkan standard diluent dengan konsentrasi : 120; 60; 30; 15;
7,5; 0 ng/ml
3. Setelah
bahan
disiapkan,
siapkan
strip
mikroplat
untuk
pemeriksaan.
Universitas Sumatera Utara
4. Tambahkan 40μL special diluent, dan 10μL sampel dan 50μL HRP
60 menit.
5. Cuci mikroplat 5 kali dan tambahkan Chromogen Solution A dan B,
inkubasi selama 10 menit pada suhu 370C.
6. Tambahkan 50μL stop solution, tunggu selama 5 menit.
7. Kalkulasikan.
8. Tentukan densitas optiknya dalam 15 menit menggunakan
pembaca mikroplat sampai 450nm.
9. Semuanya dilakukan secara automatic oleh alat.
3.8.3.2.4. Pemeriksaan sTfR
Pemeriksaan sTfR serum dengan alat Chemwell analyzer
menggunakan metode ELISA. Sampel dikumpulkan dan dilakukan
sentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Supernatant
yang diperoleh segera disimpan pada suhu -20 0 C (2 bulan). Pengukuran
dilakukan dengan menggunakan spectrophotometer dengan panjang
gelombang 450 nm (warna biru).Kadar normal dewasa sTfR adalah 2800
– 8500 ng/mL.57Sebelum menjalankan sampel terlebih dahulu dilakukan
kurva kalibrasi dengan pengenceranstandard diluent dengan konsentrasi :
1000; 500; 250; 125; 62,5; 0 ng/ml(gambar 3.2. grafik kalibrasi sTfR)
Universitas Sumatera Utara
sTfR Cat No.Qy-E02439, Lot:04/2016(96T)
Gambar 3.2. Grafik kalibrasi sTfR
Bahan yang digunakan pemeriksaan sTfR :
1. Reagen (2-80C)
2. 96 wells
3. Standard 1000ng/ml
4. Standard diluent (ready to use)
5. Special diluent (ready to use)
6. HRP (Horseradish peroxidase)-Conjugate reagent (ready to use)
7. Wash solution
8. Chromogen Solution A&B (ready to use)
9. Stop Solution (ready to use)
10. Microplate Sealers
Universitas Sumatera Utara
Cara kerja sTfR :
1. Sebelum menggunakan sampel dan reagen tersebut terlebih
dahulu, bahan yang beku dibiarkan mencair sampai pada suhu
ruang, kemudian disama-ratakan dengan vortex. Larutan standard
juga disamakan dengan suhu ruang (20-25̊ C).
2. Persiapkan standard diluent dengan konsentrasi : 1000; 500; 250;
125; 62,5; 0 ng/ml
3. Setelah
bahan
disiapkan,
siapkan
strip
mikroplat
untuk
pemeriksaan.
4. Tambahkan 40μL special diluent, dan 10μL sampel dan 50μL HRP
60 menit.
5. Cuci mikroplat 5 kali dan tambahkan Chromogen Solution A dan B,
inkubasi selama 10 menit pada suhu 370C.
6. Tambahkan 50μL stop solution, tunggu selama 5 menit.
7. Kalkulasikan.
8. Tentukan densitas optiknya dalam 15 menit menggunakan
pembaca mikroplat sampai 450nm.
9. Semuanya dilakukan secara automatic oleh alat.
Universitas Sumatera Utara
Gambar 3.3.Skema Prosedur Kerja
3.9.
Pemantapan Kualitas
Pemantapan kualitas dilakukan untuk menjamin dan mendapatkan
hasil pemeriksaan yang baik. Sebelum dilakukan pemeriksaan terlebih
dahulu dilakukan persiapan yang cukup untuk menghindari kesalahan
dalam pemeriksaan. Prosedur yang harus diperhatikan adalah preanalitik,
analitik dan postanalitik.
Universitas Sumatera Utara
3.9.1. Pemantapan KualitasPemeriksaan FBC
Dilakukan dengan menjalankan program kontrol pada Sysmex XN1000imenggunakan bahan kontrol berbentuk cair yang sudah siap pakai
yang telah diketahui nilainya, yaitu bahan kontrol rendah, normal dan
tinggi.
Tabel.3.1. Kontrol kualitas Pemeriksaan Hematologi XN-1000-1-A
Tanggal
Bahan
Lot No.
Running
15 sampel
17/03/2016
Kontrol rendah
QC-60251101
s/d
Kontrol normal
QC-60251102
01/04/2016
Kontrol tinggi
QC-60251103
01/04/2016
Kontrol rendah
QC-60251101
s/d
Kontrol normal
QC-60251102
15/04/2016
Kontrol tinggi
QC-60251103
19/04/2016
Kontrol rendah
QC-60811101
s/d
Kontrol normal
QC-60811102
Kontrol tinggi
QC-60811103
03/05/2016
10 sampel
3 sampel
(Grafik hasil kontrol kualitas pemeriksaan hemaologi XN-1000-1-A
terlampir)
3.9.2. Pemantapan Kualitas Pada Pemeriksaan Hb Elektroforesis
Sebelum menjalankan sampel dijalankan bahan kontrol normal
berbentuk cair yang sudah siap pakai yang telah diketahui nilainya,
dimana HbA terletak pada zona 9 dengan nilai 96,8-97,8% dan HbA2
terletak pada zona 3 dengan nilai 2,2-3,2%.
Universitas Sumatera Utara
3.10. Batasan Definisi Operasional
β-thalassemia trait
: Kelainan herediter yang ditandai dengan
ketidak
seimbangan
sintesa
rantai
globin-β.7,31
Hepcidin
: Hormonyang disekresikan oleh sel hepar
atau hepatosit. Hepcidin bersirkulasi di
dalam plasma darah dan dieksresikan
melalui urin.14,15
Nilai normalHepcidin: 27 – 158 ng/mL.56
sTfR
: (Soluble transferrin reseptor)
Suatu glikoprotein dengan berat molekul
sekitar
95
kDa,
yang
merupakan
komponen ekstra membran dari reseptor
transferin yang terlepas dan terlarut
dalam
serum
dan
beredar
dalam
sirkulasi.46
Nilai normal sTfRdewasa : 2800 – 8500
ng/mL.57
Ineffektif
Eritropoiesis
: Sejumlah sel eritroid mati sebelum atau
segera
setelah
lepas
dari
sumsum
tulang.29
Universitas Sumatera Utara
3.11. Kerangka Kerja
Subjek Penelitian:
Dewasa β-thalassemia trait
di RSUP-Medan
Anamnesa
Insklusi :
Eksklusi :
Sampel penelitian
Hepcidin
sTfR
Universitas Sumatera Utara
BAB IV
HASIL PENELITIAN
4.1. Karakteristik Subjek Penelitian
Dari 28 penderita β-thalassemia trait yang datang memeriksakan
darah lengkap di Departemen Patologi Klinik pada bulan Maret 2016 - Mei
2016 ke RSUP - H. Adam Malik Medan. Pada penelitian ini didapati 28
penderita β-thalassemia trait dengan kisaran umur 24 – 57 tahun dan
rerata umur 34,5 tahun, menunjukan sebagian besar subjek penelitian
adalah laki-laki sebanyak 15 orang, dibanding perempuan sebanyak 13
orang (dapat dilihat pada tabel 4.1).
Tabel 4.1. Karakteristik subjek berdasarkan Jenis Kelamin dan Umur
Karakteristik
Satuan
Hasil
n
Orang
28
Umur
-
Min-Max
Tahun
24 - 57
-
Median
Tahun
34,5
− Laki-laki
Orang
15
− Perempuan
Orang
13
Jenis Kelamin
Universitas Sumatera Utara
4.2. Hasil pemeriksaan laboratorium Skrining Thalassemia
Pada penelitian ini, subjek β-thalassemia trait di dapati nilai rerata
Hb adalah 12,3±1,42 g/dl.Nilai rerata MCV adalah 70,4±6,89 fl, nilai rerata
MCH adalah 22,1±2,82 pg, dengan morfologi eritrositmikrositer hipokrom.
Nilai Median (Min - Max) RDW adalah 15,1 (13 - 22,50) % dan nilai rerata
HbA2 adalah 4,4 ± 0,37 % di dapati peningkatan HbA2 > 3,5%.
Tabel 4.2. Hasil Pemeriksaan Indeks Eritrosit Penderita
Karakteristik
Satuan
Hasil
Hb (Mean±SD)
g/dl
12,3±1,42
MCV (Mean±SD)
fl
70,4±6,89
MCH (Mean±SD)
pg
22,1±2,82
RDW Median (Min - Max)
%
15,1 (13 - 22,50)
HbA2 (Mean±SD)
%
4,4± 0,37
4.3.Hubungan antara kadar hepcidin dan kadar sTfR pada βthalassemia trait
Untuk mengetahui hubungan antara kadar hepcidin dan kadar sTfR
pada β-thalassemia trait dilakukan dengan Uji Spearman's rho. Diperoleh
hasil koefisien korelasi positif kuat yaitu(r=0,613),
yang signifikan
mempunyai nilai statistik p=0,001 (signifikan bila p< 0,01). Pada tabel 4.3
dapat dilihat dari subjek penelitian nilai Median (Min-Max) hepcidin adalah
Universitas Sumatera Utara
11,1(5,35-36,8)ng/mL, nilai Median (Min – Max) sTfR adalah 58,8(21,4239,9)ng/mL.
Tabel 4.3. Hasil Pemeriksaan Hepcidin dan sTfR pada Subjek Penelitian
Karakteristik
Satuan
Hasil
hepcidin Median(Min-Max)
ng/mL
11,1 (5,35-36,8)
sTfR (Min-Max)
ng/mL
58,8(21,4-239,9)
Korelasi antara hepcidin dan sTfR pada penelitian ini dari subjek 28
penderita
β-thalassemia
trait
dapat
dilihat
pada
grafik
4.1
menunjukkankoefisien korelasi positif kuat antara kadar hepcidin dan sTfR
pada penderita β-thalassemia trait, dengan hasil Uji Spearman's rho
(r=0,613).yang signifikan dengan nilai statistik p=0,001 (signifikan bila p<
0,01)
Gambar 4.1. Grafik korelasi antara hepcidin dan sTfRpada penderitaβthalassemia trait
Universitas Sumatera Utara
BAB V
PEMBAHASAN
Dari penelitian didapati nilai rerata MCV adalah 70,4 fl, nilai rerata
MCH adalah 22,1 pg, nilai ini didukung penelitian dari Long X et all tahun
2014, dimanapada pemeriksaan darah lengkap di jumpai nilai MCV≤80 fl
dan nilai MCH≤27 pg, anemia mikrositer hipokrom. Dan nilai ini sesuai
dengan standard emas yang direkomendasikan oleh WHO (1994).7,39,40
Hepcidin
yang
ditemukan
pada
tahun
2000,
memperluas
pemahaman para ilmuwan mengenai gangguan homeostasis besi pada
anemia dengan iron-overload, seperti yang terjadi padathalassemia.
9,12
Penelitian tentang hepcidin oleh Origa R dan peneliti dari University of
California pada tahun 2007, kadar hepcidin pada β-thalassemiaintermedia
menurun oleh karena eritropoiesis inefektif. Sebaliknya kadar hepcidin
pada β-thalassemia mayor meningkat karena adanya transfusi darah yang
rutin maka akan menginduksi akumulasi besi di jaringan, tetapi
menghambat aktivitas eritropoiesis.12 Pada penelitian ini nilai kadar
hepcidinmenurun adalah Median (Min-Max) 11.1 (5,35-36,8)ng/mL, nilai
ini
berdistribusi
tidak
normal
dinilai
dengan
tests
of
Normality
menggunakan Shapiro-Wilk dengan sampel kecil dari 50, sesuai dengan
penilitian sebelumnya.
Pada β-thalassemiatraitdengan anemia dapat terjadi penumpukan
zat besi (iron-overload) dengan melihat kadarhepcidinyang menurun.
Peningkatan
aktivitas
eritropoietik
dan
penyesuaiannya
dengan
Universitas Sumatera Utara
berkurangnya hepcidin yang disebabkan oleh iron-overload menekan
signal
untuk
tidak
memproduksi
hepcidin.
Peningkatan
aktivitas
eritropoietik yang secara signifikanmengurangi kadar hepcidin. Iron serum
merupakan
suatu
signal
induksi
untuk
produksi
hepcidin
dan
mempengaruhi soluble transferrin reseptor.48,58
Kadar sTfR berhubungan langsung dengan peningkatan massa
precursor eritroid dibandingkan dengan ambilan (uptake) transferrin
eritroid. Ini menunjukan bahwa sTfR dapat dipakai sebagai ukuran
kuantitatif
eritropoesis
total.14,15Pada
penelitian
ini
nilai
sTfR
menurundengan Median (Min-Max) 58,8 (21,4- 239,9) ng/mL, nilai ini
berdistribusi tidak normal dinilai dengan tests of Normality menggunakan
Shapiro-Wilk nilai ini sesuai dengan penelitian sebelumnya yang
dilakukan oleh Zimmerman 2008. Ekspresi hepcidin diregulasi terutama
oleh peningkatan aktivitas eritropoesis daripada dibandingkan ironoverload dan hepcidin memainkan peran penting dalam mengatur
sirkulasi besi dan toksisitas besi pada penderita thalassemia. Dengan
kombinasi kedua parameter ini akan lebih tepat
untuk menentukan
hubungan eritropoesis inefektif pada thalassemia trait antara kadar
Hepcidin dan kadar sTfR.17
Manifestasi
klinis
β-thalassemia
trait
biasanya
ringan
dan
umumnya pasien memiliki kualitas hidup yang baik.39,58Pada penelitian ini
terdapat hubungan positif kuat antara kadar hepcidin dan sTfR pada
penderita β-thalassemia trait dengan hasil Uji Spearman's rho (r=0,613),
Universitas Sumatera Utara
dan menunjuk bahwa terdapat korelasi yang signifikan mempunyai nilai
statistik p=0,001 (signifikan bila p< 0,01).
Zat besi yang berlebihan di dalam tubuh akan membawa sejumlah
kerugian, antara lain adalah terbentuknya radikal bebas. Oleh karena itu
diperlukan mekanisme regulasi yang dapat mengatur jumlah zat besi yang
beredar. Salah satu protein yang bertanggung jawab untuk meregulasi
kadar zat besi adalah hepcidin.48
Pada penelitian ini menunjukkan bahwa pada β-thalassemia
traitterjadi iron-overload dapat dilihat dengan menurunnya kadar hepcidin
dan berkurangnya kadar sTfR terlebih dahulu yang diakibatkan oleh
aktivitas eritropoeisis yang inefektif.
Universitas Sumatera Utara
BAB VI
KESIMPULAN DAN SARAN
6.1. Kesimpulan
Pada penelitian ini terdapat hubungan positif kuat antara
kadarhepcidin dan sTfR pada penderita β-thalassemia trait. Dari
penelitian ini didapati median(Min-Max) Umur adalah 34,5(24-57). Ditinjau
dari karakteristik jenis kelamin didapati lebih besar jumlah penderita lakilaki dibanding jumlah penderita perempuan.Nilai median (Min-Max)
hepcidin adalah 11,1(5,35-36,8)ng/mL dan nilai median (Min-Max) sTfR
adalah 58,8(21,4-239,9) ng/mL.
6.2. Saran
Oleh karena penelitian tentang hepcidin dan sTfR masih sangat
sedikit maka dianjurkan untuk melakukan penelitian pada kasus – kasus
yang lain.
Universitas Sumatera Utara
METODE PENELITIAN
3.1. Rancangan penelitian
Jenis penelitian ini adalah analitik observasional, rancangan
penelitian cross
sectional(potong lintang) dimana variabel bebas dan
tergantung diukur padawaktu yang bersamaan.
3.2. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Departemen Patologi Klinik Fakultas
Kedokteran Universitas Sumatera Utara (FK-USU)/RSUP Haji Adam Malik
Medan.
Penelitian dilakukan pada bulan Maret 2016 sampai dengan
akhir Mei 2016.Penelitian dihentikan bila jumlah sampel minimal tercapai
atau waktu pengambilan sampel telah mencapai tiga bulan.
3.3. Populasi dan SubjekPenelitian
3.3.1. Populasi Penelitian
Populasi Penelitian adalah pasien dewasa yang datang berobat
ke Hematologi di RSUP Haji Adam Malik Medan yang memeriksakan
darah lengkap di Departemen Patologi Klinik pada bulan Maret 2016 - Mei
2016.
Universitas Sumatera Utara
3.3.2SubjekPenelitian :
Subjek penelitian adalahpasien dewasa penderita β-thalassemia
trait yang memenuhi kriteria inklusi.
3.3.2.1. Kriteria Inklusi:
1. Usia reproduktif di atas 18 tahun.
2. Nilai MCV ≤ 80 fl , MCH ≤ 27 pg
3. Pemeriksaan denganHb Elektroforesis nilai HbA2 > 3,5 %
4. Penderita bersedia ikut dalam penelitian dengan menandatangani
inform consent.
3.3.2.2. Kriteria Eksklusi12 :
1. Penyakit Keganasan
2. Kehamilan
3. Penyakit infeksi
4. Penyakit kelainan hati
5. Penyakit kekurangan zat besi
3.4. Cara Pengambilan Sampel Penelitian
Pengambilan sampel dilakukan secara konsekutif terhadap semua
populasi. Jumlah sampel minimal sesuai perkiraan jumlah sampel atau
sampai batas waktu pengumpulan sampel yang ditentukan.
Universitas Sumatera Utara
3.4.1. Rumus Besar Sampel
Perkiraan besar sampel minimum dan sampel yang diteliti dipakai
rumus uji hipotesa untuk proporsi dengan subjek tunggal.
(Z
n≥
(1−α / 2 )
Po (1 − Po ) + Z (1− β ) ) Pa (1 − Pa )
(Po
− Pa )
)
2
2
Dimana :
Z (1−α / 2) = Deviat baku alpha, untuk α = 0,05
maka nilai baku normalnya 1,96
Z (1− β )
= Deviat baku β, untuk β = 0,10 maka nilai baku normalnya 1,282
P0
=Proporsi β-thalassemia traitsebesar 0,0407β. 7
Pa
=Perkiraan proporsi thalassemia yang diteliti,
ditetapkan sebesar0,25
P0 − P0 = Beda proporsi yang signifikan ditetapkan sebesar 0,2093
Maka subjek minimal untuk penelitian ini sebanyak 28orang.
Universitas Sumatera Utara
3.5. Variabel Penelitian
3.5.1. Variable Bebas
Hepcidin dan Soluble transferrin reseptor(sTfR)
3.5.2. Variabel Terikat
β-Thalassemiatrait
3.6. Ethical Clearance dan Informed Consent
Ethical
clearance
diperoleh
dari
Komite
Penelitian
Bidang
Kesehatan FK-USUdi RSUP-Haji Adam Malik Medan No: 315/TGL/KEPK
FK USU-RSUP HAM/2016. Inform consent diminta secara tertulis dari
subjek penelitian yang menyatakan bersedia ikut dalam penelitian setelah
mendapat penjelasan mengenai maksud dan tujuan dari penelitian ini.
3.7.Analisa Data
Analisa data untuk melihat korelasi antara kadar hepcidin dan
kadar
sTfR pada β-thalassemia trait menggunakan Uji Korelasi
Pearsonjika berdistribusi normal, atau Uji Spearman’s rho jika tidak
berdistribusi
normal.
Untuk
pemeriksaan
dengan
test
Normality
menggunakan cara Shapiro Wilk jika kecil dari 50 sampel dan cara
Kolmogrof smirnov jika lebih besar dari 50 sampel.
Universitas Sumatera Utara
3.8.Bahan dan Cara Kerja
3.8.1. Bahan yang diperlukan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah darah dengan
antikoagulan EDTA dan darah tanpa antikoagulan.
3.8.2. Anamnese dan Pemeriksaan Fisik
Anamnese dilakukan dengan wawancara berpedoman pada daftar
pertanyaan pada status dan keterangan yang ada pada status.
Pemeriksaan fisik dilakukan pada posisi penderita berbaring. Seluruh data
dan hasil pemeriksaan dicatat dalam status khusus penelitian.
3.8.3. Pengambilan dan Pengolahan Sampel
3.8.3.1. Pengambilan SampelDarah
Penelitian dilakukan di RSUP Haji Adam Malik Medan.Sampel
darah diambil dari vena mediana cubiti. Tempat punksi vena terlebih
dahulu dilakukan tindakan aseptik dengan alkohol 70% dan dibiarkan
kering, kemudian dilakukan punksi dengan menggunakan venoject.
Pegambilan darah dilakukan tanpa statis yang berlebihan. Sejumlah 7 ml
darah vena diambil dan dibagi kedalam tiga tabung masing – masing
vacutainer K2EDTA pertama 2 ml, vacutainer K2EDTA kedua 2 ml, dan
vacutainer Gel clot activator 3 ml.
Universitas Sumatera Utara
3.8.3.2. Pengolahan dan Pemeriksaan Sampel
Darah
dengan
antikoagulan
EDTA
pertama
dilakukan
pemeriksaan FBC dengan menggunakan hematology analyzer untuk
memperoleh nilai MCV≤80 fl dan MCH≤27pg. Vacutainer K2EDTA kedua
dilakukan
pemeriksaan
Hemoglobin
Elektroforesis.
Darah
tanpa
antikoagulan dibiarkan dalam suhu ruangan selama 30 menit, kemudian
disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit untuk
mendapatkan serum yang jernih.
3.8.3.2.1.Pemeriksaan Hematologi
Pemeriksaan darah lengkap sebanyak 2ml darah dalam vacutener
K2EDTA pertama di homogenkan perlahan. Analisa dengan pemeriksaan
full blood count( FBC ) dilakukan dengan menggunakan automatic cell
counting Sysmex XN-1000i untuk memperoleh nilai Hb, MCV, MCH dan
RDW.
3.8.3.2.2. Pemeriksaan Nilai Kuantitasi HbA2
Sejumlah 2 ml darah dalam vacutener K2EDTA dilakukan analisa
Hemoglobin Elektroforesis Kapiler untuk melihat nilai kuantitasi HbA2
dengan menggunakan alat Minicapilarry electrophoresis dari Sebia
(Sebia, Norcross, GA).Pada metode minicapilarry electrophoresis HbA2
dapat
dipisahkan
menggunakan
dari
HbE,
HbC
prinsipelektroforesis
dan
kapiler
HbS.
pada
Sistem
larutan
MINICAP
bebas.
Universitas Sumatera Utara
denganmolekul yang bermuatan dipisahkan berdasarkan mobilitas
elektroforesis pada larutan buffer alkali elektroosmotik yang bergerak
menuju katoda, sehingga akan menyebabkan aliran buffer dari anoda ke
katoda.
3.8.3.2.3. PemeriksaanHepcidin
Pemeriksaan hepcidin serum dengan alat Chemwell analyzer
menggunakan
metode
ELISA.Sampel
dikumpulkan
dan
dilakukan
sentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Supernatant
yang diperoleh segera disimpan pada suhu -200 C(2 bulan).Pengukuran
dilakukan dengan menggunakan spectrophotometer dengan panjang
gelombang 450 nm (warna biru).Kadar
normal hepcidin 27 – 158
ng/mL.56 Sebelum menjalankan sampel terlebih dahulu dilakukan kurva
kalibrasi dengan pengenceranstandard diluent dengan konsentrasi : 120;
60; 30; 15; 7,5; 0 ng/ml (gambar 3.1. grafik kalibrasi hepcidin).
hepcidin Cat No.Qy-E01240, Lot:04/2016(96T)
Universitas Sumatera Utara
Gambar 3.1.grafik kalibrasi hepcidin
Bahan yang digunakan pemeriksaan hepcidin
1. Reagen (2-80C)
2. 96 wells
3. Standard 120ng/ml
4. Standard diluent (ready to use)
5. Special diluent (ready to use)
6. HRP (Horseradish peroxidase)-Conjugate reagent (ready to use)
7. Wash solution
8. Chromogen Solution A&B (ready to use)
9. Stop Solution (ready to use)
10. Microplate Sealers
Cara kerja hepcidin :
1. Sebelum menggunakan sampel dan reagen tersebut terlebih
dahulu, bahan yang beku dibiarkan mencair sampai pada suhu
ruang, kemudian disama-ratakan dengan vortex. Larutan standard
juga disamakan dengan suhu ruang (20-25̊ C).
2. Persiapkan standard diluent dengan konsentrasi : 120; 60; 30; 15;
7,5; 0 ng/ml
3. Setelah
bahan
disiapkan,
siapkan
strip
mikroplat
untuk
pemeriksaan.
Universitas Sumatera Utara
4. Tambahkan 40μL special diluent, dan 10μL sampel dan 50μL HRP
60 menit.
5. Cuci mikroplat 5 kali dan tambahkan Chromogen Solution A dan B,
inkubasi selama 10 menit pada suhu 370C.
6. Tambahkan 50μL stop solution, tunggu selama 5 menit.
7. Kalkulasikan.
8. Tentukan densitas optiknya dalam 15 menit menggunakan
pembaca mikroplat sampai 450nm.
9. Semuanya dilakukan secara automatic oleh alat.
3.8.3.2.4. Pemeriksaan sTfR
Pemeriksaan sTfR serum dengan alat Chemwell analyzer
menggunakan metode ELISA. Sampel dikumpulkan dan dilakukan
sentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Supernatant
yang diperoleh segera disimpan pada suhu -20 0 C (2 bulan). Pengukuran
dilakukan dengan menggunakan spectrophotometer dengan panjang
gelombang 450 nm (warna biru).Kadar normal dewasa sTfR adalah 2800
– 8500 ng/mL.57Sebelum menjalankan sampel terlebih dahulu dilakukan
kurva kalibrasi dengan pengenceranstandard diluent dengan konsentrasi :
1000; 500; 250; 125; 62,5; 0 ng/ml(gambar 3.2. grafik kalibrasi sTfR)
Universitas Sumatera Utara
sTfR Cat No.Qy-E02439, Lot:04/2016(96T)
Gambar 3.2. Grafik kalibrasi sTfR
Bahan yang digunakan pemeriksaan sTfR :
1. Reagen (2-80C)
2. 96 wells
3. Standard 1000ng/ml
4. Standard diluent (ready to use)
5. Special diluent (ready to use)
6. HRP (Horseradish peroxidase)-Conjugate reagent (ready to use)
7. Wash solution
8. Chromogen Solution A&B (ready to use)
9. Stop Solution (ready to use)
10. Microplate Sealers
Universitas Sumatera Utara
Cara kerja sTfR :
1. Sebelum menggunakan sampel dan reagen tersebut terlebih
dahulu, bahan yang beku dibiarkan mencair sampai pada suhu
ruang, kemudian disama-ratakan dengan vortex. Larutan standard
juga disamakan dengan suhu ruang (20-25̊ C).
2. Persiapkan standard diluent dengan konsentrasi : 1000; 500; 250;
125; 62,5; 0 ng/ml
3. Setelah
bahan
disiapkan,
siapkan
strip
mikroplat
untuk
pemeriksaan.
4. Tambahkan 40μL special diluent, dan 10μL sampel dan 50μL HRP
60 menit.
5. Cuci mikroplat 5 kali dan tambahkan Chromogen Solution A dan B,
inkubasi selama 10 menit pada suhu 370C.
6. Tambahkan 50μL stop solution, tunggu selama 5 menit.
7. Kalkulasikan.
8. Tentukan densitas optiknya dalam 15 menit menggunakan
pembaca mikroplat sampai 450nm.
9. Semuanya dilakukan secara automatic oleh alat.
Universitas Sumatera Utara
Gambar 3.3.Skema Prosedur Kerja
3.9.
Pemantapan Kualitas
Pemantapan kualitas dilakukan untuk menjamin dan mendapatkan
hasil pemeriksaan yang baik. Sebelum dilakukan pemeriksaan terlebih
dahulu dilakukan persiapan yang cukup untuk menghindari kesalahan
dalam pemeriksaan. Prosedur yang harus diperhatikan adalah preanalitik,
analitik dan postanalitik.
Universitas Sumatera Utara
3.9.1. Pemantapan KualitasPemeriksaan FBC
Dilakukan dengan menjalankan program kontrol pada Sysmex XN1000imenggunakan bahan kontrol berbentuk cair yang sudah siap pakai
yang telah diketahui nilainya, yaitu bahan kontrol rendah, normal dan
tinggi.
Tabel.3.1. Kontrol kualitas Pemeriksaan Hematologi XN-1000-1-A
Tanggal
Bahan
Lot No.
Running
15 sampel
17/03/2016
Kontrol rendah
QC-60251101
s/d
Kontrol normal
QC-60251102
01/04/2016
Kontrol tinggi
QC-60251103
01/04/2016
Kontrol rendah
QC-60251101
s/d
Kontrol normal
QC-60251102
15/04/2016
Kontrol tinggi
QC-60251103
19/04/2016
Kontrol rendah
QC-60811101
s/d
Kontrol normal
QC-60811102
Kontrol tinggi
QC-60811103
03/05/2016
10 sampel
3 sampel
(Grafik hasil kontrol kualitas pemeriksaan hemaologi XN-1000-1-A
terlampir)
3.9.2. Pemantapan Kualitas Pada Pemeriksaan Hb Elektroforesis
Sebelum menjalankan sampel dijalankan bahan kontrol normal
berbentuk cair yang sudah siap pakai yang telah diketahui nilainya,
dimana HbA terletak pada zona 9 dengan nilai 96,8-97,8% dan HbA2
terletak pada zona 3 dengan nilai 2,2-3,2%.
Universitas Sumatera Utara
3.10. Batasan Definisi Operasional
β-thalassemia trait
: Kelainan herediter yang ditandai dengan
ketidak
seimbangan
sintesa
rantai
globin-β.7,31
Hepcidin
: Hormonyang disekresikan oleh sel hepar
atau hepatosit. Hepcidin bersirkulasi di
dalam plasma darah dan dieksresikan
melalui urin.14,15
Nilai normalHepcidin: 27 – 158 ng/mL.56
sTfR
: (Soluble transferrin reseptor)
Suatu glikoprotein dengan berat molekul
sekitar
95
kDa,
yang
merupakan
komponen ekstra membran dari reseptor
transferin yang terlepas dan terlarut
dalam
serum
dan
beredar
dalam
sirkulasi.46
Nilai normal sTfRdewasa : 2800 – 8500
ng/mL.57
Ineffektif
Eritropoiesis
: Sejumlah sel eritroid mati sebelum atau
segera
setelah
lepas
dari
sumsum
tulang.29
Universitas Sumatera Utara
3.11. Kerangka Kerja
Subjek Penelitian:
Dewasa β-thalassemia trait
di RSUP-Medan
Anamnesa
Insklusi :
Eksklusi :
Sampel penelitian
Hepcidin
sTfR
Universitas Sumatera Utara
BAB IV
HASIL PENELITIAN
4.1. Karakteristik Subjek Penelitian
Dari 28 penderita β-thalassemia trait yang datang memeriksakan
darah lengkap di Departemen Patologi Klinik pada bulan Maret 2016 - Mei
2016 ke RSUP - H. Adam Malik Medan. Pada penelitian ini didapati 28
penderita β-thalassemia trait dengan kisaran umur 24 – 57 tahun dan
rerata umur 34,5 tahun, menunjukan sebagian besar subjek penelitian
adalah laki-laki sebanyak 15 orang, dibanding perempuan sebanyak 13
orang (dapat dilihat pada tabel 4.1).
Tabel 4.1. Karakteristik subjek berdasarkan Jenis Kelamin dan Umur
Karakteristik
Satuan
Hasil
n
Orang
28
Umur
-
Min-Max
Tahun
24 - 57
-
Median
Tahun
34,5
− Laki-laki
Orang
15
− Perempuan
Orang
13
Jenis Kelamin
Universitas Sumatera Utara
4.2. Hasil pemeriksaan laboratorium Skrining Thalassemia
Pada penelitian ini, subjek β-thalassemia trait di dapati nilai rerata
Hb adalah 12,3±1,42 g/dl.Nilai rerata MCV adalah 70,4±6,89 fl, nilai rerata
MCH adalah 22,1±2,82 pg, dengan morfologi eritrositmikrositer hipokrom.
Nilai Median (Min - Max) RDW adalah 15,1 (13 - 22,50) % dan nilai rerata
HbA2 adalah 4,4 ± 0,37 % di dapati peningkatan HbA2 > 3,5%.
Tabel 4.2. Hasil Pemeriksaan Indeks Eritrosit Penderita
Karakteristik
Satuan
Hasil
Hb (Mean±SD)
g/dl
12,3±1,42
MCV (Mean±SD)
fl
70,4±6,89
MCH (Mean±SD)
pg
22,1±2,82
RDW Median (Min - Max)
%
15,1 (13 - 22,50)
HbA2 (Mean±SD)
%
4,4± 0,37
4.3.Hubungan antara kadar hepcidin dan kadar sTfR pada βthalassemia trait
Untuk mengetahui hubungan antara kadar hepcidin dan kadar sTfR
pada β-thalassemia trait dilakukan dengan Uji Spearman's rho. Diperoleh
hasil koefisien korelasi positif kuat yaitu(r=0,613),
yang signifikan
mempunyai nilai statistik p=0,001 (signifikan bila p< 0,01). Pada tabel 4.3
dapat dilihat dari subjek penelitian nilai Median (Min-Max) hepcidin adalah
Universitas Sumatera Utara
11,1(5,35-36,8)ng/mL, nilai Median (Min – Max) sTfR adalah 58,8(21,4239,9)ng/mL.
Tabel 4.3. Hasil Pemeriksaan Hepcidin dan sTfR pada Subjek Penelitian
Karakteristik
Satuan
Hasil
hepcidin Median(Min-Max)
ng/mL
11,1 (5,35-36,8)
sTfR (Min-Max)
ng/mL
58,8(21,4-239,9)
Korelasi antara hepcidin dan sTfR pada penelitian ini dari subjek 28
penderita
β-thalassemia
trait
dapat
dilihat
pada
grafik
4.1
menunjukkankoefisien korelasi positif kuat antara kadar hepcidin dan sTfR
pada penderita β-thalassemia trait, dengan hasil Uji Spearman's rho
(r=0,613).yang signifikan dengan nilai statistik p=0,001 (signifikan bila p<
0,01)
Gambar 4.1. Grafik korelasi antara hepcidin dan sTfRpada penderitaβthalassemia trait
Universitas Sumatera Utara
BAB V
PEMBAHASAN
Dari penelitian didapati nilai rerata MCV adalah 70,4 fl, nilai rerata
MCH adalah 22,1 pg, nilai ini didukung penelitian dari Long X et all tahun
2014, dimanapada pemeriksaan darah lengkap di jumpai nilai MCV≤80 fl
dan nilai MCH≤27 pg, anemia mikrositer hipokrom. Dan nilai ini sesuai
dengan standard emas yang direkomendasikan oleh WHO (1994).7,39,40
Hepcidin
yang
ditemukan
pada
tahun
2000,
memperluas
pemahaman para ilmuwan mengenai gangguan homeostasis besi pada
anemia dengan iron-overload, seperti yang terjadi padathalassemia.
9,12
Penelitian tentang hepcidin oleh Origa R dan peneliti dari University of
California pada tahun 2007, kadar hepcidin pada β-thalassemiaintermedia
menurun oleh karena eritropoiesis inefektif. Sebaliknya kadar hepcidin
pada β-thalassemia mayor meningkat karena adanya transfusi darah yang
rutin maka akan menginduksi akumulasi besi di jaringan, tetapi
menghambat aktivitas eritropoiesis.12 Pada penelitian ini nilai kadar
hepcidinmenurun adalah Median (Min-Max) 11.1 (5,35-36,8)ng/mL, nilai
ini
berdistribusi
tidak
normal
dinilai
dengan
tests
of
Normality
menggunakan Shapiro-Wilk dengan sampel kecil dari 50, sesuai dengan
penilitian sebelumnya.
Pada β-thalassemiatraitdengan anemia dapat terjadi penumpukan
zat besi (iron-overload) dengan melihat kadarhepcidinyang menurun.
Peningkatan
aktivitas
eritropoietik
dan
penyesuaiannya
dengan
Universitas Sumatera Utara
berkurangnya hepcidin yang disebabkan oleh iron-overload menekan
signal
untuk
tidak
memproduksi
hepcidin.
Peningkatan
aktivitas
eritropoietik yang secara signifikanmengurangi kadar hepcidin. Iron serum
merupakan
suatu
signal
induksi
untuk
produksi
hepcidin
dan
mempengaruhi soluble transferrin reseptor.48,58
Kadar sTfR berhubungan langsung dengan peningkatan massa
precursor eritroid dibandingkan dengan ambilan (uptake) transferrin
eritroid. Ini menunjukan bahwa sTfR dapat dipakai sebagai ukuran
kuantitatif
eritropoesis
total.14,15Pada
penelitian
ini
nilai
sTfR
menurundengan Median (Min-Max) 58,8 (21,4- 239,9) ng/mL, nilai ini
berdistribusi tidak normal dinilai dengan tests of Normality menggunakan
Shapiro-Wilk nilai ini sesuai dengan penelitian sebelumnya yang
dilakukan oleh Zimmerman 2008. Ekspresi hepcidin diregulasi terutama
oleh peningkatan aktivitas eritropoesis daripada dibandingkan ironoverload dan hepcidin memainkan peran penting dalam mengatur
sirkulasi besi dan toksisitas besi pada penderita thalassemia. Dengan
kombinasi kedua parameter ini akan lebih tepat
untuk menentukan
hubungan eritropoesis inefektif pada thalassemia trait antara kadar
Hepcidin dan kadar sTfR.17
Manifestasi
klinis
β-thalassemia
trait
biasanya
ringan
dan
umumnya pasien memiliki kualitas hidup yang baik.39,58Pada penelitian ini
terdapat hubungan positif kuat antara kadar hepcidin dan sTfR pada
penderita β-thalassemia trait dengan hasil Uji Spearman's rho (r=0,613),
Universitas Sumatera Utara
dan menunjuk bahwa terdapat korelasi yang signifikan mempunyai nilai
statistik p=0,001 (signifikan bila p< 0,01).
Zat besi yang berlebihan di dalam tubuh akan membawa sejumlah
kerugian, antara lain adalah terbentuknya radikal bebas. Oleh karena itu
diperlukan mekanisme regulasi yang dapat mengatur jumlah zat besi yang
beredar. Salah satu protein yang bertanggung jawab untuk meregulasi
kadar zat besi adalah hepcidin.48
Pada penelitian ini menunjukkan bahwa pada β-thalassemia
traitterjadi iron-overload dapat dilihat dengan menurunnya kadar hepcidin
dan berkurangnya kadar sTfR terlebih dahulu yang diakibatkan oleh
aktivitas eritropoeisis yang inefektif.
Universitas Sumatera Utara
BAB VI
KESIMPULAN DAN SARAN
6.1. Kesimpulan
Pada penelitian ini terdapat hubungan positif kuat antara
kadarhepcidin dan sTfR pada penderita β-thalassemia trait. Dari
penelitian ini didapati median(Min-Max) Umur adalah 34,5(24-57). Ditinjau
dari karakteristik jenis kelamin didapati lebih besar jumlah penderita lakilaki dibanding jumlah penderita perempuan.Nilai median (Min-Max)
hepcidin adalah 11,1(5,35-36,8)ng/mL dan nilai median (Min-Max) sTfR
adalah 58,8(21,4-239,9) ng/mL.
6.2. Saran
Oleh karena penelitian tentang hepcidin dan sTfR masih sangat
sedikit maka dianjurkan untuk melakukan penelitian pada kasus – kasus
yang lain.
Universitas Sumatera Utara